硒化多糖化合物及其制備方法

專利名稱：硒化多糖化合物及其制備方法
技術領域：
本發明涉及海洋多糖新型分子結構的硒化多糖及其制備方法，以及其在醫藥方面的應用，即海洋多糖和無機硒結合，發揮彼此協同的預防和治療腫瘤及提高機體免疫力的作用，其屬于海洋生物技術和海洋藥物技術領域。
自1957年Schwarz，k.等發現缺乏維生素E的飲食中添加微量硒可以防止營養性肝壞死以來，有許多出色的工作揭示了硒在人類防癌抗癌，抗老化，預防和治療心血管疾病，克山病和大骨節病以及家畜白肌病等方面的重要作用。對硒作為生命必需微量元素的認識正日益深入。同時硒又是一個極毒元素，動物對硒的營養需要范圍是0.1～0.3ppm，2～10ppm將引起慢性中毒，而超過10ppm時會引起急性中毒以致突然死亡。但人類社會趨勢的當今是食物鏈中硒含量在減少，動物和人體缺硒病增加，缺硒情況正在加劇。顯然，尋求低毒而生物利用度好的硒化物對于進一步揭示硒的生化行為及其在人類保健事業上的應用是十分有意義的。國外未見有硒多糖的報導，國內有兩篇硒多糖制備方面的專利。第一篇專利公告號為CN1038454A，發明名稱硒化卡拉膠的制法。該方法是硒粉以濃硝酸溶解后，用無離子水制備成濃度為0.5-1.0mg Se/ml的硒液，而后按0.5-1.0mg Se/m硒液加0.5-5％的卡拉膠的比例(即1∶0.1-50重量比)加入Kappa-角叉菜膠或Lambda-角叉菜膠溶膠液，硒化反應后，經乙醇沉析，乙醇洗滌后得到硒化角叉菜膠粗品。該方法制備的硒化卡拉膠，其硒含量最高為2512ppm。該硒化產物分子結構仍然是保持硫酸多糖酯的基本構型，其中硒是以兩個不同價態存在的。即角叉菜膠中部分硫酸根為硒取代形成硒酸酯；而末端單元的3，6-內醚-D-半乳糖在C1開環形成C-Se-H結構。該方法制備的硒化卡拉膠，其硒含量較低。該制備方法中使用硒粉與濃硝酸反應，其中硒粉和反應生成的硒化氫等副產物都是劇毒化合物，以致使該劇毒副產物即使是微量也可造成人員的生命危險；此外，該硒化產物產品中的硒是+6價的，其生物利用度低，卡拉膠多糖本身無抗腫瘤作用。制備的硒化卡拉膠不僅抗腫瘤活性不強，而且該硒化卡拉膠雖然毒性較低，但仍然是有毒性的。該硒化卡拉膠的分子量太大，不易被人體機體吸收利用。然而幾乎所有的藥理實驗都是用亞硒酸鈉進行的，這其中硒是+4價的，并證實其具有顯著的防癌抗癌，抗老化，預防和治療心血管疾病，克山病和大骨節病以及家畜白肌病等方面的作用，Combs等發現亞硒酸鈉的生物利用度也顯著高于硒酸鈉。該方法制備的硒化卡拉膠對小鼠的LD50為2.92g/kg，亞硒酸鈉的LD50為12.7mg/kg，顯然該硒化卡拉膠還具有相當的毒性。第二篇專利公開號為CN1069495，發明名稱硒多糖及其制造方法。該方法是“富硒酵母→提取→分離→加堿勻漿→中和→濃縮→加乙醇沉淀→精制→成品。提取在反應鍋中進行，分離在離心機中進行，加堿勻漿在勻漿機中進行，中和時pH值為8-10，然后靜止分離所得的清液減壓濃縮，加乙醇沉淀后烘干得粗制品，進一步精制得精制品。”該方法制備的每克硒多糖的硒含量為400微克/克以上。該文獻中沒有對硒多糖的分子結構的分析。
本發明的目的是要提供海洋新藥產品-硒化多糖化合物及其制備方法，以及其在醫藥方面的應用，即海洋多糖和無機硒結合，發揮彼此協同的預防和治療腫瘤及提高機體免疫力的作用，將兩者優勢互補，起協同作用，同時該硒化多糖化合物要成為低毒甚至無毒藥物。
本發明的任務是由以下技術方案完成的，研制了一種硒化多糖化合物。該化合物包括其本身及其鹽，加成鹽或藥用鹽，該化合物的單元分子通式為 其中x1，x3為亞硒酸根及其鹽，C1-C4烷基，或羥基；x2為亞硒酸根及其鹽，或亞硒酰胺基，或羥基；x4為C1-C4羥烷基；x5為亞硒酸根及其鹽；n為自然數。
本硒化多糖化合物，所設計的 其可以是2位硒化褐藻多糖和3位硒化褐藻多糖，即 化合物；該化合物的物化性質如下(1)外觀灰白色或淺黃色粉末；(2)溶解性能溶于水，而不溶于乙醇、丙酮有機溶劑；
(3)粘度該化合物1％水溶液在25℃時的特性粘度為1-100；(4)pH值該化合物1％水溶液在25℃時的pH值為6.8-7.0；(5)平均分子量3000-30000道爾頓；(6)平均含硒量10-125mg/g；(7)穩定性該化合物及其鹽、加成鹽或藥用鹽常溫存放一年后，含硒量不變；(8)旋光度-30--80度；(9)光譜①紫外光譜在波長255nm附近處有弱特征吸收峰②紅外光譜在波長1255-1260cm-1或820cm-1處有中強度的伸縮振動特征吸收峰；③氫譜在化學位移3.906ppm和3.929ppm兩處有特征吸收峰；④碳譜在化學位移75ppm和76ppm兩處有特征吸收峰。
本硒化多糖化合物，所設計的 其可以是硒化殼聚糖，即 化合物；該化合物的物化性質如下(1)外觀灰褐色粉末；(2)溶解性微溶于水，而不溶于乙醇、丙酮有機溶劑；(3)粘度該化合物1％水溶液在25℃時的特性粘度為30-500；(4)pH值該化合物1％水溶液在25℃時的pH值為6.6-7.0；(5)平均分子量100-20000道爾頓；(6)平均含硒量15-125mg/g；(7)穩定性該化合物及其鹽、加成鹽或藥用鹽常溫存放一年后，含硒量不變；(8)旋光度-5--30度；(9)光譜①紫外光譜在波長281nm附近處有明顯的特征吸收峰；②紅外光譜在波長1538.39cm-1和1091.05cm-1處有很寬的伸縮振動特征吸收峰；③氫譜在化學位移3.830ppm處有一個多重特征吸收峰；④碳譜在化學位移76.090ppm和58.710ppm兩處有兩個特征吸收峰。
本硒化多糖化合物，所設計的 化合物；該化合物的物化性質如下(1)外觀灰白色，或淺褐色粉末；(2)溶解性易溶于水，而不溶于乙醇、丙酮有機溶劑；(3)粘度該化合物1％水溶液在25℃時的特性粘度為10-200；(4)pH值該化合物1％水溶液在25℃時的pH值為6.7-7.0；(5)平均分子量100-20000道爾頓；(6)平均含硒量15-125mg/g；(7)穩定性該化合物及其鹽、加成鹽或藥用鹽常溫存放一年后，含硒量不變；(8)旋光度+30-+90度；(9)光譜①紫外光譜在波長281nm附近處有明顯的特征吸收峰；②紅外光譜在波長1263.54cm-1處有明顯的特征吸收峰，并在704.11cm1和771.62cm-1處有兩個特征吸收峰；③氫譜在化學位移4.834ppm和4.794ppm處有兩個特征吸收峰；④碳譜在化學位移73.002ppm和72.546ppm處有兩個特征吸收峰。
本硒化多糖化合物的制備方法，所述的硒化多糖化合物是由下列步驟制成的(1)硒化反應將多糖類化合物與亞硒酸及其鹽在酸性溶液中經鋇離子、氫離子的催化作用下，并加熱10-100℃，恒溫反應5-10小時，該反應是在吡喃己糖單元的C2或C3或/和C5位上的取代反應，或在3，6-內醚-D-半乳糖單元的C3和C6位上的加成反應，而生成硒化多糖化合物；該反應式如下多糖類化合物+亞硒酸根 硒化多糖化合物，反應完畢，降溫反應液至室溫；(2)除去催化劑將降溫的反應液逐步滴加0.1-1N的硫酸溶液，使反應液中的Ba2+離子成為硫酸鋇沉淀；(3)除去未反應的亞硒酸根離子將(2)中的帶有硫酸鋇沉淀的反應液抽濾，取濾液，再加入氯化鐵溶液，之后用NH3-NH4HCl溶液調節pH值3-12，攪拌促反應，再放置過夜，之后用離心機分離，取濾液；(4)乙醇分級沉淀將(3)中的濾液用15％的醋酸鈉溶液調節pH值3-9，再用乙醇溶液分級沉淀，并分別抽濾，得分子量分級的粗產品-硒化多糖；(5)烘干將(4)中的分級的粗產品-硒化多糖，分別烘干，并在真空度大于0.09Pa的條件下，烘干溫度30-60℃下，進行，可得烘干的分級的粗產品-硒化多糖，該粗產品的硒含量為20-100mg.Se/g硒化多糖；(6)精制將(5)中的該粗產品采用超濾儀按需要精制成各級分子量的硒化多糖精品。
本硒化多糖化合物的制備方法，所述的(1)中的多糖類化合物，其是褐藻多糖，或殼聚糖，或紅藻多糖，或其它海藻多糖；所述的(1)中的亞硒酸及其鹽，其與多糖類化合物的投料重量比為1∶0.1-10；所述的(1)中的硝酸溶液，其濃度范圍是0.5-5％(w/v)。
本硒化多糖化合物的制備方法，所述的(1)中的鋇離子，其可以是氯化鋇，也可以是碳酸鋇，也可以是硝酸鋇，還可以是可溶性鋇鹽；其中鋇離子的投料重量比為0.1-10.0。
本硒化多糖化合物的制備方法，所述的(3)中的氯化鐵溶液，其溶液濃度為10-30％，以除去未反應的亞硒酸根離子為準。
本硒化多糖化合物的制備方法，所述的(4)中的乙醇溶液分級沉淀并分別抽濾所得的不同分級分子量的粗產品-硒化多糖，其中乙醇在整個溶液的終點濃度沉淀的硒化多糖的分子量的對應關系如下，(1)乙醇在整個溶液的終點濃度85-95％，對應沉淀的硒化多糖的分子量為100-3500道爾頓；(2)乙醇在整個溶液的終點濃度70-85％，對應沉淀的硒化多糖的分子量為3500-8000道爾頓；(3)乙醇在整個溶液的終點濃度30-70％，對應沉淀的硒化多糖的分子量為8000以上道爾頓。
本硒化多糖化合物的制備方法，所述的(6)中的采用超濾儀按需要精制成各級分子量的硒化多糖精品，其各級分子量的硒化多糖精品對應的硒含量如下(1)分子量為100-3500道爾頓的硒化多糖精品的硒含量為50-100mg·Se/g；(2)分子量為3500-8000道爾頓的硒化多糖精品的硒含量為40-80mg·Se/g；(3)分子量為8000以上道爾頓的硒化多糖精品的硒含量為20-60mg·Se/g。
本發明的硒化多糖化合物及其制備方法，其優點之一在于在催化劑鋇離子和氯離子、硝酸根的作用下，將亞硒酸與在吡喃己糖單元的C2或C3或/和C5位上的硫酸根發生取代反應，或亞硒酸根將在3，6-內醚-D-半乳糖單元的醚鍵打開而連接在該單元的C3位，而在D-半乳糖單元的醚鍵打開的C6位上加成亞硒酸根的加成反應，而生成本專利的硒化多糖化合物。本專利的硒化多糖化合物是一種新的化合物，通過對本專利的硒化多糖化合物的光譜分析，可以證實硒化多糖化合物真實存在。本專利的硒化多糖化合物的物化性質既有共性，又有個性。本硒化多糖化合物的分子結構的構型、光譜分析、物化性質等在國內外還未見報導。
本發明的硒化多糖化合物及其制備方法，其優點之二在于利用本發明的硒化多糖化合物的制備方法技術，制備的硒化多糖化合物，其最高硒含量可達125mgSe/g。然而，目前有文獻報道硒化多糖的最高硒含量為16mgSe/g。本發明制備的硒化多糖化合物的技術與其它的方法相比，避免了硒粉和硝酸反應這一有劇毒物產生的操作，而以亞硒酸這一穩定性的化合物作為硒化劑，用氯化鋇和硝酸作為催化劑，操作對人體無害，產品得率和質量均比其它的方法高。在分子結構中引入亞硒酸根，其中硒是正四價，硒是處于中間價態，既可以被氧化也可以被還原，因此本發明的硒化多糖化合物在人體內具有廣泛的生理功能。
本發明的硒化多糖化合物及其制備方法，其優點之三在于本發明的硒化多糖化合物及其制備方法，制備的硒化多糖化合物是測不出LD50，MTD＞16g/kg，屬于無毒物質。有文獻報道，同類硒化多糖的LD50為2.92g/kg，因此是有毒物質。本發明的硒化多糖化合物及其制備方法所制備的硒化多糖化合物，其抑瘤率為67.77％和70.17％。而文獻報道，目前硒化物的最高抑瘤率為40.12％。
本發明的硒化多糖化合物毒性試驗，藥理實驗，臨床應用的效果如下一、硒化褐藻多糖的極性毒性試驗摘要對小鼠以能允許的最大濃度10％的硒化褐藻多糖混懸液0.4ml/10gig，測不出LD50，故根據新藥審批辦法中對急性毒性的要求，進行了最大耐受量(MTD)的測定。當給予小鼠硒化褐藻多糖16g/kg.24h，對小鼠未見明顯毒性反應，表明其MTD＞16g/kg。
1)材料，受試藥物硒化褐藻多糖，本實驗室制備，純度大于95％，含硒量為50.3mg/g，用時用水配成0.1g/ml(即濃度為10％)的濃藥液。試驗動物昆明種健康小鼠，由山東醫科大學實驗動物中心提供，動物合格證號為魯動質字980102。
2)試驗方法與結果預試驗選取18-20g小鼠，給予10％的硒化褐藻多糖混懸液0.4ml/10gig，觀察24h，10只小鼠均無中毒死亡，故本品難以求測LD50，其本品10％濃度其粘稠度已很大，已達最大允許濃度。故根據新藥審批辦法中關于急性毒性的要求，進行了最大耐受量(MTD)的測定，選18-22g小鼠40只，♂♀各20只，隨機分為2組，每組♂♀各10只，禁食8h，分別給予10％的硒化褐藻多糖懸液0.4ml/10gig，對照組給予水0.4ml/10gig，24h內給4次，結果除給藥組有8只小鼠出現稀便外，用藥組小鼠與對照組比較其進食、活動、糞便、毛澤等均未見明顯差異，觀察7天，40只小鼠無一死亡，于第7日再次稱體重，藥前藥后兩組小鼠體重如下表。
表1 藥物對小鼠體重的影響組別鼠數(只) 藥前(X±S)g藥后(X±S)g對照組20 18.69±0.4721.00±1.36試驗組20 18.71±0.4521.63±1.47從表1可知兩組小鼠體重藥前藥后比較無明顯差異，P＞0.05。
3)結果對小鼠以能允許的最大濃度灌胃給藥，測不出LD50，故根據衛生部新藥審批辦法中急性毒性的實驗要求，進行了最大耐受量(MTD)的測定，當小鼠給予硒化褐藻多糖達16g/kg·24h時，對小鼠無明顯毒性反應，表明其MTD＞16g/kg，根據毒性物質的分級標準，本品應屬無毒物質。
二、硒化褐藻多糖抗腫瘤作用的實驗研究摘要對小鼠S180肉瘤按4.0/kg、3.0g/kg和2.0g/kg的劑量連續灌胃給藥9天，各劑量組小鼠均表現出明顯的抑瘤作用，其中以中劑量組(3.0g/kg)為最佳，其抑瘤率達67.77％，與陽性對照藥物FT-207的抑瘤率(70.37％)接近，低劑量組抑瘤率為40.77％，高劑量組為31.48％。
1)材料受試藥物硒化褐藻多糖為灰白色粉末(純度大于95％，含硒量為50.3mg/g)，有本實驗室提供，用時根據用藥劑量的需要分別配成濃度為0.0667g/ml(4.0g/kg)，0.05g/ml(3.0g/kg和0.0334g/ml(2.0g/kg)的混懸液備用。陽性對照藥物替加氟片(FT-207)，為濟南制藥廠產品，生產文號為魯衛藥準字(1995)第024020，產品批號為980605。
試驗動物昆明種健康小鼠，由山東醫科大學實驗動物中心提供，動物合格證號為魯動質字980102。
2)方法與結果選19-21g小鼠，左腋下接種S180腹水小鼠腹水稀釋液，S180腹水瘤種鼠由山東省醫科院藥物研究所引進，在無菌條件下抽出腹水，用無菌生理鹽水稀釋3倍，每鼠接種0.1ml。于接種18h后將小鼠隨機分為5組，試驗組每組♂♀各6只，共12只，對照組根據n=12×(試驗組數)1/2=12×41/2=24，分別給硒化褐藻多糖4.0g/kg、3.0g/kg、2.0g/kg·日ig，陽性對照組給予FT-207 150mg/kgig，陰性對照組給予生理鹽水0.6ml/10gig，給藥組和陰性對照組為每日分兩次給藥，分別于8Am、6Pm、陽性對照組為8Am給藥一次。連續給藥9天，禁食12h，于末次給藥24h后稱體重后，剖殺各組小鼠，剝離瘤體，于電子天平下稱瘤體，分別稱體重、瘤重，計算抑瘤率和瘤體系數(瘤體/體重×100％)，結果見下表2表2 硒化卡拉膠抗S180的抑瘤實驗結果組別鼠數 體重 瘤重 抑瘤率 瘤體系數(％)(只)(X±S) (X±S) (％) (瘤重/100g體重)N S組2422.98±3.091.085±0.380 4.89±1.832g/kg1222.16±1.640.64±0.482***40.77 2.95±2.05***3g/kg1222.77±2.590.352±0.1*** 67.77 2.53±1.50***4g/kg1222.83±2.390.742±0.288*** 31.48 3.13±1.15***FT-207 1217.08±1.20*** 0.318±0.150*** 70.37 2.06±0.79***與陰性組比***P＜0.001，NS對照組最大瘤重2.392g，試驗組最大為1.706g3)討論對硒化褐藻多糖以4.0/kg、3.0g/kg和2.0g/kg的劑量灌胃給藥，進行小鼠抗S180的抑瘤試驗，結果表明三劑量組小鼠均具有明顯的抑瘤作用，其中以中劑量組3.0g/kg抑瘤效果最佳，其抑瘤率達67.77％，與FT-207的抑瘤作用(70.37％)接近，低劑量組(2.0g/kg)抑瘤作用次之，為40.77％，高劑量組(4.0/kg)抑瘤作用最低，為31.48％，這可能與藥物在高濃度下粘度較大，影響吸收，使生物利用度降低有關。
本試驗僅對S180進行抑瘤試驗，對其它瘤譜的抑瘤作用及臨床的抗癌效果尚有待于深入研究。
三、初步臨床應用情況在經過極性毒性試驗和藥效試驗后，經過1年多的臨床應用，已直接觀察病例100例，其中腫瘤、肝病、心血管疾病、抗衰老和提高免疫力的有90例，年齡在40-87之間，口服硒化褐藻多糖每次10ml(口服液)每日兩次，服藥后，無不良反應，也沒有胃腸道反應，無任何毒副作用，均有不同療效，自感癥狀頭痛、頭暈明顯減輕，食欲增加，自感有力，頭腦清醒，記憶恢復。
例1、陳×，干部，男，51歲，患脂肪肝，近年來常感煩燥，脾氣不好，且經常頭昏，也有健忘、易疲勞等癥狀，肝區也偶爾隱隱作痛，醫院檢查后說除了肝病外，還有腦供血不足等問題。服用硒化褐藻多糖一段時間后，感覺精神情況等大有改善，而且過年這一段時間喝酒也沒有什么大影響，脾氣也好多了。特別是記憶力見明顯改善，晚上看書，第二天能記住了。體力也比以前好一些，以前回家上個五層樓就1氣喘吁吁，用了硒化褐藻多糖后，現在感覺上樓很輕松。
例2、張××，女，86歲，退休，患有反應遲緩，語速變慢等衰老現象，有老年癡呆癥的傾向。且有竇性心律過緩，血壓偏低，多年稀便(七、八次/天)等病史。服用了10瓶硒化褐藻多糖，感覺明顯精神，氣色都較以前好，而且說話語速、反應都明顯好轉等，另外感覺稀便逐漸減少，大便趨向正常。
例3、劉××，女，60歲，退休，前幾年患鼻咽癌，做了手術切除，有轉移；一年后又做了手術切除，放化療三個余月。近兩年診斷為冠心病，先后發作十余次心絞痛、胸悶、憋氣等，去醫院急救過幾次。前不久冠心病發作，急救治療出院后兒子的同學來看望，買了4瓶硒化褐藻多糖口服液，用完后感覺睡眠很好，精神也很好，而且自從服用后到現在冠心病一直未發作，吃飯也好，感覺生活輕松了許多。
例4、孫××，男，74歲，退休，確診為擴散性肝癌，在山大醫院做了一次介入療法，醫生建議去做全身化療，但老人74歲了，哪能受得了全身化療呢？沒辦法只做了一般性治療。后來買了8盒硒化褐藻多糖口服液，當時老人發燒，誰知老人服用1瓶后，發燒竟然好了。家人信心大增，一直堅持服用。從那開始，病人情況一天比一天好，基本上和正常人一樣，也不痛了，吃飯也正常人一樣。目前，老人仍在山大醫院治療。
例5、張××，女，76歲，退休，去年10月份的一天疼痛難忍，到山大醫院一查，是淋巴瘤晚期。醫院采用化療，一個療程沒做完，老人病情開始惡化，嘔吐、無法入睡，體質極弱。買了四盒硒化褐藻多糖口服液。服用4盒，老人病情明顯好轉，可以吃飯了。現在，老人不但飲食和睡眠恢復到了發病前的良好狀態，而且生活習慣也和正常人一樣。
例6、趙××，男，65歲，退休，在一次例行體檢中被診斷為前列腺癌，老人住進了市人民醫院12病房28號，進行了手術及放、化療治療，治療期間老人明顯消瘦，體重由160斤下降到140斤，無食欲口味差，小便失禁、尿急，在服用硒化褐藻多糖口服液兩個療程以后，老人的病情得到了有效的控制，體重增加到150多斤，面容紅潤，癥狀減輕。
例7、高×，男，62歲，98年11月經CT診斷為肝血管瘤，采用四次介入治療，頭發幾乎脫光，食欲下降，口內反酸無味，食欲全無，老人由160斤下降到不足90斤，整個人骨瘦如柴，身體極度虛弱，而腫瘤卻仍然在不停的生長。老人于2000年2月1日開始服用硒化褐藻多糖口服液，5天后患者食欲明顯增加，精神得到改善，睡眠質量好，服用一個月后患者食量等方面基本正常。臉部出現紅潤，頭發重新長出來，3月29日到人民醫院檢查，腫瘤縮小1公分。
例8、徐××，男，70歲，徐老在99年11月6號在醫院查出來是胰腺癌，11月8號做化療，二個療程沒下來，病人便臥床不起，滴食不進，奄奄一息，只好停止化療，12月8號，他買了2盒硒化褐藻多糖口服液，還沒吃完，病人開始好轉，可以吃飯了，又買了2盒，吃完后，病人可以下床在室內活動了。
本發明的實施例不僅局限在以下實施例中，結合附圖進一步說明如下

圖1為硒化褐藻多糖(a)、褐藻多糖(b)紫外圖。圖2為硒化褐藻多糖(a)和褐藻多糖(b)紅外光譜。圖3為硒化褐藻多糖(a)和褐藻多糖(b)的氫譜。圖4為硒化褐藻多糖(a)和褐藻多糖(b)的碳譜。圖5為硒化殼聚糖(a)、磺化殼聚糖(b)和殼聚糖(c)的紫外光譜。圖6為硒化殼聚糖(a)、磺化殼聚糖(b)和殼聚糖(c)的紅外光譜圖7為硒化殼聚糖(a)和磺化殼聚糖(b)氫譜。圖8為硒化殼聚糖(a)和磺化殼聚糖(b)的碳譜。圖9為硒化紅藻多糖(a)和紅藻多糖(b)紫外光譜。圖10為硒化紅藻多糖(a)和紅藻多糖(b)的紅外光譜。圖11為硒化紅藻多糖(a)和紅藻多糖(b)的氫譜。圖12為硒化紅藻多糖(a)和紅藻多糖(b)的碳譜。
一、硒化褐藻多糖的光譜測定結果1)紫外光譜測定結果褐藻多糖(b)的紫外光譜圖與有關的文獻報道基本相同。從硒化褐藻多糖(a)和褐藻多糖(b)的紫外光譜圖可以清楚地看出，硒化褐藻多糖只在255nm左右有很弱的吸收峰，而褐藻多糖在265nm左右有較強的吸收峰。因此，褐藻多糖分子中含硒而使紫外光譜有明顯的區別。結合褐藻多糖所經歷的化學反應機理，可以初步肯定褐藻多糖分子中的部分硫酸根已被亞硒酸根所取代。
2)硒化褐藻多糖的紅外光譜測定結果硒化褐藻多糖和褐藻多糖的紅外光譜圖見圖11，其中褐藻多糖的紅外光譜圖與文獻報道基本相同。褐藻多糖的結構比較復雜，一般來說，在1100～1010cm-1區間的吸收峰表明含有呋喃糖苷健；在1250～1260cm-1的峰為S=O伸縮振動峰；810～850cm-1的吸收峰是C-O-S伸縮振動峰，它的位置與硫酸根在糖上的連接位置有關，連接在褐藻多糖的C4位處于自立鍵位置的硫酸根，在850cm-1有吸收，連接在巖藻聚糖的C2或C3位處于平伏健位置的硫酸根，它的吸收峰在820cm-1左右。
從本文得到的褐藻多糖的紅外光譜來看，褐藻多糖在1255～1260cm-1有S=O伸縮振動峰，說明含有硫酸根，而且在820cm-1處有吸收，表明硫酸根連在C2或C3的位置上。
從硒化褐藻多糖的紅外光譜來看，與褐藻多糖的紅外光譜基本相同，但是硒化褐藻多糖在1255～1260cm-1處的S=O伸縮振動峰已變得非常弱，這表明，硫酸根大部分已被亞硒酸根所取代；此外，硒化褐藻多糖在820cm-1處的C-O-S伸縮振動峰強明顯變弱，也可證實硫酸根被亞硒酸根所取代。
3)、硒化褐藻多糖和褐藻多糖的1H-NMR測定結果硒化褐藻多糖和褐藻多糖的氫譜見圖，從硒化褐藻多糖(a)和褐藻多糖(b)的氫譜對照可以看出，兩者基本相同，所以兩者的骨架結構和基本構型相同。但是，硒化褐藻多糖的氫譜上出現褐藻多糖氫譜上所沒有的兩個新峰，即3.906ppm和3.929ppm。這兩個峰可能是連在C2或C3位上的亞硒酸根的氫產生的吸收峰，或者是C2或C3上的氫產生的吸收峰。
4)、硒化褐藻多糖和褐藻多糖的13C-NMR的測定結果硒化褐藻多糖和褐藻多糖的碳譜見圖4，從硒化褐藻多糖和褐藻多糖的碳譜對比可以清楚地看出，褐藻多糖在77.383ppm和77.076ppm處有明顯的吸收峰，而硒化褐藻多糖在此位移具有很弱的吸收峰，但在75ppm和76ppm附近處出現兩個褐藻多糖碳譜中沒有的新峰。亞硒酸根與硫酸根相比，電子云更多地偏向氧原子，因而相比較而言，與亞硒酸根相連的碳原子的化學位移在高場，與硫酸根相連的碳原子的化學位移在地場。據此，根據褐藻多糖和硒化褐藻多糖的C2位或C3位移變化可以證實，褐藻多糖的C2位或C3位的硫酸根被亞硒酸根所取代。
5)結論利用紫外光譜和紅外光譜證實了硒化褐藻多糖中確實含有有機硒；結合氫譜和碳譜基本確定亞硒酸根是取代褐藻多糖C2位或C3的硫酸根而連接在褐藻多糖的C2位或C3位。
二、硒化殼聚糖的光譜測定結果1)硒化殼聚糖的紫外光譜測定結果硒化殼聚糖和磺化殼聚糖及殼聚糖紫外光譜見圖5，可以清楚地看出，硒化殼聚糖除了在200nm左右有末端吸收外，在281nm左右有明顯的吸收峰；而磺化殼聚糖在200nm左右有末端吸收，在255nm左右有很強的吸收峰；殼聚糖只在200nm左右有吸收峰。這可以清楚地表明通過磺化反應殼聚糖分子中引入了磺酸根，又通過硒化反應磺化殼聚糖分子中的硫酸根又被亞硒酸根取代，生成硒化殼聚糖。
2)硒化殼聚糖的紅外光譜測定結果硒化殼聚糖、磺化殼聚糖和殼聚糖的紅外光譜見圖6，殼聚糖的紅外光譜與文獻報道(周赤，1997)基本相同，從磺化殼聚糖與殼聚糖的紅外光譜數據和圖形對比可以看出，可能磺酸根連接在C2位的氨基上和連接在C6位的羥基上，主要是因為有以下的光譜圖形和光譜數據變化得到證明殼聚糖C2位的氨基被磺化后，氨基和羥基在3400cm-1附近的峰形變尖銳；殼聚糖C2位氨基上未脫干凈的乙酰基的羰基振動峰位為1663.21cm-1而磺化殼聚糖C2位氨基上未脫干凈的乙酰基的羰基振動峰位為1637.77cm-1，可能是受到C6位的羥基上磺酸基的影響；同樣由于磺化殼聚糖C2位氨基上和C6位羥基上磺酸基的影響，對應于殼聚糖C-O伸縮振動的峰由1074.49cm-1變為磺化殼聚糖的1086.06cm-1；殼聚糖C2位的氨基磺化后，NH的彎曲振動峰位由1558.68cm-1變為相對應的磺化殼聚糖的1522.03cm-1。
從磺化殼聚糖和硒化殼聚糖的紅外光譜數據和光譜圖可以看出，磺化聚糖經過硒化取代后，C2位氨基上的磺酸根一部分被亞硒酸根取代，另一部分被水解成游離氨基，這可以由磺化殼聚糖的氨基和羥基伸縮振動的峰形很窄，而硒化殼聚糖的氨基和羥基伸縮振動的峰形很寬得到證實；磺化殼聚糖C2位氨基上的磺酸根一部分被亞硒酸根取代后，其N-H彎曲振動峰位由1522.03cm-1變為相對應的硒化殼聚糖的1538.39cm-1；由于磺化殼聚糖C2位氨基上的磺酸根一部分被亞硒酸根取代后，以及可殼能還有C6位的磺酸根被亞硒酸根取代，使得磺化殼聚糖C-O伸縮振動的峰位由1086.06cm-1變為硒化殼聚糖相對應的1091.85cm-1，而且峰形變寬。
3)硒化殼聚糖的1H-NMR測定結果硒化殼聚糖和磺化殼聚糖的氫譜見圖7，磺酸根的化學位移參考了有關的文獻報道(于德泉，1989)。磺化殼聚糖在δ8.954ppm和δ8.821ppm處的吸收峰，可能是鏈節上C2位氨基上和C6位羥基上同時連有兩個磺酸根時，連在C2位羥基和連在C6氨基上的磺酸根上的氫產生的吸收峰；δ8.271ppm可能是一個鏈節上只在氨基上連有一個磺酸根時該磺酸根上的氫產生的吸收峰。而硒化殼聚糖在氫譜上沒有這三個峰，但在3.830ppm出現磺化殼聚糖碳譜中沒有的一個多重峰，可能是磺酸根已被亞硒酸根所取代所致。
4)硒化殼聚糖和磺化殼聚糖的13C-NMR測定結果硒化殼聚糖和磺化殼聚糖的碳譜見圖8。從圖中可以看出，硒化殼聚糖的碳譜中出現磺化殼聚糖碳譜中沒有的兩個新峰，即76.090ppm和58.710ppm，它們分別是磺化殼聚糖C2位氨基上和C6位羥基上的磺酸根被亞硒酸根取代后C2位和C6位碳產生的吸收峰。
5)結論對制備的硒化殼聚糖用原子熒光光譜法進行了測定，證實其含有較高的硒含量。對硒化殼聚糖的理化性質進行了測定，并與殼聚糖和磺化殼聚糖的理化性質進行了對比，對三者具有不同理化性質的原因作了分析分子中引入了不同的基團從而具有不同的理化性質，這是主要原因；分子量的不同對理化性質也有影響。通過紫外和紅外光譜分析，確認了硒化殼聚糖含有硒，而且是有機硒。通過氫譜和碳譜基本確認硒化殼聚糖中的亞硒酸根是連在C2和C6位。
三、硒化紅藻多糖的光譜測定結果1)硒化紅藻多糖和紅藻多糖的紫外光譜測定結果硒化紅藻多糖和紅藻多糖的紫外光譜見圖9。可以明顯看出，硒化紅藻多糖除了200nm的末端吸收外，在281nm處有明顯的吸收峰；而紅藻多糖只有200nm的末端吸收峰。281nm峰的出現，正是紅藻多糖分子中引入了亞硒酸根的結果。因此，紫外光譜的測定結果可以證實硒化紅藻多糖含有有機硒。
2)硒化紅藻多糖和紅藻多糖的紅外光譜測定結果硒化紅藻多糖和紅藻多糖的紅外光譜見圖10。紅藻多糖的紅外光譜與文獻報道的基本相同。比較兩者的紅外光譜，硒化紅藻多糖中，在1263.54cm-1處有吸收峰，這是由于紅藻多糖存在Se=O的伸縮振動所致；在1271.25cm-1處有一吸收峰，該峰是S=O伸縮振動的特征峰。說明，由于紅藻多糖分子中半乳糖單元的硫酸根被亞硒酸根取代以及3，6-內醚-D-半乳糖單元的C3位引入亞硒酸根導致兩者分子結構不同，使對應于紅藻多糖的硒化紅藻多糖的該峰產生位移。另外，紅藻多糖硒化后生成的硒化紅藻多糖出現了704.11cm-1和771.62cm-1兩個新峰，這兩個峰是亞硒酸根的特征吸收峰。因此，從紅外光譜圖也可以證實硒化紅藻多糖中含有有機硒。
3)硒化紅藻多糖和紅藻多糖的氫譜的測定結果硒化紅藻多糖和紅藻多糖的氫譜見圖11。可以看出，硒化紅藻多糖和紅藻多糖的氫譜基本是相同的，并且它們的C1質子的δ值均超過了5.0ppm，所以它們的糖苷鍵構型均為α型，說明硒化紅藻多糖仍然保持紅藻多糖硫酸酯多糖的基本構型。但與紅藻多糖的氫譜相比，硒化紅藻多糖氫譜中在4.834ppm和4.794ppm出現兩個新峰。這兩個新峰，一個是紅藻多糖半乳糖單元的C4位上硫酸根被亞硒酸根取代后的亞硒酸根上的氫，或者是紅藻多糖半乳糖單元的C4位上硫酸根被亞硒酸根取代后亞硒酸根所連結的C4位上的氫產生的吸收峰；另一個是紅藻多糖3，6-內醚-D-半乳糖單元的內醚鍵被亞硒酸根打開而連在該單元C3位上的亞硒酸根上的氫，或者是紅藻多糖3，6-內醚-D-半乳糖單元的內醚鍵被亞硒酸根打開而連在該單元C3位上的C3上的氫所產生的吸收峰。氫譜主要解決多糖結構中糖苷鍵構型問題。由于多糖的信號大多堆積在δ4.0-5.5ppm的狹小范圍內，除C1上的質子信號在δ4.8-5.5ppm范圍易解析外，其它C2-C6上的質子信號均集中在δ4.0-4.8范圍，互相重疊交叉，解析困難。所以1H-NMR的測定結果通常作為13C-NMR分析結果的補充資料。通常α型吡喃己糖C1質子的δ值超過5.0ppm，而β型吡喃己糖C1質子的δ值則小于5.0ppm。
4)硒化紅藻多糖和紅藻多糖的碳譜的測定結果硒化紅藻多糖和紅藻多糖的碳譜見圖12。硒化紅藻多糖和紅藻多糖各碳的位移參考了有關的文獻報道。紅藻多糖硒化后生成硒化紅藻多糖，各碳化學位移的變化數據，詳見表3。13C-NMR譜表明硒化紅藻多糖仍保持硫酸酯多糖的基本構型；在紅藻多糖D-半乳糖硫酸酯單元中硒化紅藻多糖的C4位較的C4位顯著向高場位移(紅藻多糖的77.465ppm變為硒化紅藻多糖72.546ppm)，是因為-SeO32-取代了-SO42-所致；同時，與紅藻多糖的碳譜相比，硒化紅藻多糖的碳譜上在73.002ppm處出現新峰，這是因為紅藻多糖在3，6-內醚-D-半乳糖單元可能發生了下列反應。由此可以證實，紅藻多糖在3，6-內醚-D-半乳糖單元的C3位引入了-SeO32-，使得該碳位移由分子中的79.188ppm變為硒化紅藻多糖分子中的73.002ppm，顯著向高場方向移動。
表3硒化紅藻多糖和紅藻多糖的碳譜數據對比 注(1)碳譜的化學位移是，以二甲亞砜為對照。(2)該峰是新峰。(3)該碳譜在73.002ppm處有新峰。
5)結論硒化紅藻多糖的理化性質與紅藻多糖的理化性質相比，有差異不顯著的方面，也就是硒化后的紅藻多糖，仍基本保持紅藻多糖的分子鏈長度，保持原有的穩定性，保持基本相同的溶解度，保持紅藻多糖硫酸酯多糖的基本構型；差異顯著之處有，兩者的特性粘度相差較大，旋光度差異明顯，硒化紅藻多糖的紫外光譜在281nm處有明顯的吸收峰而卡拉膠則沒有，硒化紅藻多糖的氫譜與紅藻多糖的相比在4.834ppm和4.794ppm處出現兩個新峰，硒化紅藻多糖的碳譜與紅藻多糖的相比在72.546ppm和73.002ppm處出現兩個新峰。分析造成這些不同的原因，一是在硒化反應過程中，紅藻多糖分子中半乳糖單元的硫酸根被亞硒酸根取代以及3，6-內醚-D-半乳糖單元的C3引入亞硒酸根導致兩者分子結構不同所致，這可能是主要原因；二是硒化紅藻多糖的分子量比紅藻多糖的小些。
對硒化紅藻多糖的結構進行的光譜測定，紫外和紅外光譜可以證實硒化紅藻多糖含有有機硒；氫譜和碳譜則可以確認硒化紅藻多糖中的亞硒酸根是取代紅藻多糖中D-半乳糖硫酸酯單元中的硫酸根而連接在C4位，同時有些亞硒酸根將紅藻多糖中3，6-內醚-D-半乳糖單元的醚鍵打開而連接在C3位。從硒化紅藻多糖中的實際含硒量和紅藻多糖中硫酸根完全被亞硒酸根取代后的理論含硒量比較可知硒化紅藻多糖中還含有部分硫酸根，這一點在光譜中也表現得很明顯，即硫酸根和亞硒酸根在光譜中都同時存在。
本發明的硒化多糖化合物的制備方法，是按下列步驟組成的(1)硒化反應；(2)除去催化劑；(3)除去未反應的亞硒酸根離子；(3)除去未反應的亞硒酸根離子；(5)烘干；(6)精制。按照上述步驟，本發明的制備實施例如下列表4-表6所列反應條件和產品質量數據。(轉下頁三表)
硒化褐藻多糖制備實施例見下表4 硒化殼聚糖制備實施例見下表5 硒化紅藻多糖制備實施例見下表6
權利要求
1.一種硒化多糖化合物，其特征在于該化合物包括其本身及其鹽，加成鹽或藥用鹽，該化合物的單元分子通式為 其中x1，x3為亞硒酸根及其鹽，C1-C4烷基，或羥基；x2為亞硒酸根及其鹽，或亞硒酰胺基，或羥基；x4為C1-C4羥烷基；x5為亞硒酸根及其鹽；n為自然數。
2.根據權利要求1所述硒化多糖化合物，其特征在于所述的 其可以是2位硒化褐藻多糖和3位硒化褐藻多糖，即或 的化合物；該化合物的物化性質如下(1)外觀灰白色或淺黃色粉末；(2)溶解性能溶于水，而不溶于乙醇、丙酮有機溶劑；(3)粘度該化合物1％水溶液在25℃時的特性粘度為1-100；(4)pH值該化合物1％水溶液在25℃時的pH值為6.8-7.0；(5)平均分子量3000-30000道爾頓；(6)平均含硒量10-125mg/g；(7)穩定性該化合物及其鹽、加成鹽或藥用鹽常溫存放一年后，含硒量不變；(8)旋光度-30--80度；(9)光譜①紫外光譜在波長255nm附近處有弱特征吸收峰②紅外光譜在波長1255-1260cm-1或820cm-1處有中強度的伸縮振動特征吸收峰；③氫譜在化學位移3.906ppm和3.929ppm兩處有特征吸收峰；④碳譜在化學位移75ppm和76ppm兩處有特征吸收峰。
3.根據權利要求1所述硒化多糖化合物，其特征在于所述的 其可以是硒化殼聚糖，即 化合物；該化合物的物化性質如下(1)外觀灰褐色粉末；(2)溶解性微溶于水，而不溶于乙醇、丙酮有機溶劑；(3)粘度該化合物1％水溶液在25℃時的特性粘度為30-500；(4)pH值該化合物1％水溶液在25℃時的pH值為6.6-7.0；(5)平均分子量100-20000道爾頓；(6)平均含硒量15-125mg/g；(7)穩定性該化合物及其鹽、加成鹽或藥用鹽常溫存放一年后，含硒量不變；(8)旋光度-5--30度；(9)光譜①紫外光譜在波長281nm附近處有明顯的特征吸收峰；②紅外光譜在波長1538.39cm-1和1091.05cm-1處有很寬的伸縮振動特征吸收峰；③氫譜在化學位移3.830ppm處有一個多重特征吸收峰；④碳譜在化學位移76.090ppm和58.710ppm兩處有兩個特征吸收峰。
4 根據權利要求1所述硒化多糖化合物，其特征在于所述的 其可以是硒化紅藻多糖，即 化合物；該化合物的物化性質如下(1)外觀灰白色，或淺褐色粉末；(2)溶解性易溶于水，而不溶于乙醇、丙酮有機溶劑；(3)粘度該化合物1％水溶液在25℃時的特性粘度為10-200；(4)pH值該化合物1％水溶液在25℃時的pH值為6.7-7.0；(5)平均分子量100-20000道爾頓；(6)平均含硒量15-125mg/g；(7)穩定性該化合物及其鹽、加成鹽或藥用鹽常溫存放一年后，含硒量不變；(8)旋光度+30-+90度；(9)光譜①紫外光譜在波長281nm附近處有明顯的特征吸收峰；②紅外光譜在波長1263.54cm-1處有明顯的特征吸收峰，并在704.11cm1和771.62cm-1處有兩個特征吸收峰；③氫譜在化學位移4.834ppm和4.794ppm處有兩個特征吸收峰；④碳譜在化學位移73.002ppm和72.546ppm處有兩個特征吸收峰。
5.根據權利要求1或2或3或4所述硒化多糖化合物的制備方法，其特征在于所述的硒化多糖化合物是由下列步驟制成的(1)硒化反應將多糖類化合物與亞硒酸或其鹽在酸性溶液中經鋇離子、氫離子的催化作用下，并加熱10-100℃，恒溫反應5-10小時，該反應是在吡喃己糖單元的C2或C3或/和C5位上的取代反應，或在3，6-內醚-D-半乳糖單元的C3和C6位上的加成反應，而生成硒化多糖化合物；該反應式如下多糖類化合物+亞硒酸根 硒化多糖化合物，反應完畢，降溫反應液至室溫；(2)除去催化劑將降溫的反應液逐步滴加0.1-1N的硫酸溶液，使反應液中的Ba2+離子成為硫酸鋇沉淀；(3)除去未反應的亞硒酸根離子將(2)中的帶有硫酸鋇沉淀的反應液抽濾，取濾液，再加入氯化鐵溶液，之后用NH3-NH4HCl溶液調節pH值3-12，攪拌促反應，再放置過夜，之后用離心機分離，取濾液；(4)乙醇分級沉淀將(3)中的濾液用15％的醋酸鈉溶液調節pH值3-9，再用乙醇溶液分級沉淀，并分別抽濾，得分子量分級的粗產品-硒化多糖；(5)烘干將(4)中的分級的粗產品-硒化多糖，分別烘干，并在真空度大于0.09Pa的條件下，烘干溫度30-60℃下，進行，可得烘干的分級的粗產品-硒化多糖，該粗產品的硒含量為20-100mg.Se/g硒化多糖；(6)精制將(5)中的該粗產品采用超濾儀按需要精制成各級分子量的硒化多糖精品。
6.根據權利要求5所述硒化多糖化合物的制備方法，其特征在于所述的(1)中的多糖類化合物，其是褐藻多糖，或殼聚糖，或紅藻多糖，或其它海藻多糖；所述的(1)中的亞硒酸及其鹽，其與多糖類化合物的投料重量比為1∶0.1-10；所述的(1)中的硝酸溶液，其濃度范圍是0.5-5％(w/v)。
7.根據權利要求5所述硒化多糖化合物的制備方法，其特征在于所述的(1)中的鋇離子，其可以是氯化鋇，也可以是碳酸鋇，也可以是硝酸鋇，還可以是可溶性鋇鹽；其中鋇離子的投料重量比為0.1-10.0。
8.根據權利要求5所述硒化多糖化合物的制備方法，其特征在于所述的(3)中的氯化鐵溶液，其溶液濃度為10-30％，以除去未反應的亞硒酸根離子為準。
9.根據權利要求5所述硒化多糖化合物的制備方法，其特征在于所述的(4)中的乙醇溶液分級沉淀并分別抽濾所得的不同分級分子量的粗產品-硒化多糖，其中乙醇在整個溶液的終點濃度沉淀的硒化多糖的分子量的對應關系如下，(1)乙醇在整個溶液的終點濃度85-95％，對應沉淀的硒化多糖的分子量為100-3500道爾頓；(2)乙醇在整個溶液的終點濃度70-85％，對應沉淀的硒化多糖的分子量為3500-8000道爾頓；(3)乙醇在整個溶液的終點濃度30-70％，對應沉淀的硒化多糖的分子量為8000以上道爾頓。
10.根據權利要求5所述硒化多糖化合物的制備方法，其特征在于所述的(6)中的采用超濾儀按需要精制成各級分子量的硒化多糖精品，其各級分子量的硒化多糖精品對應的硒含量如下(1)分子量為100-3500道爾頓的硒化多糖精品的硒含量為50-100mg·Se/g；(2)分子量為3500-8000道爾頓的硒化多糖精品的硒含量為40-80mg·Se/g；(3)分子量為8000以上道爾頓的硒化多糖精品的硒含量為20-60mg·Se/g。
全文摘要
本發明公開了三種海洋新藥產品及制備方法。該新藥對腎衰和血管病和腫瘤具有顯著療效,是低毒甚至無毒的藥物。其中有抗病毒、抗HIV、抗腫瘤和提高機體免疫等廣泛功能的硒化褐藻多糖,硒化殼聚糖,硒化紅藻多糖,其中硒化紅藻多糖還對淋巴細胞的分裂有顯著的促進作用,具有抑制皰疹病毒復制作用。本發明的硒化多糖化合物是新的化合物,通過對本硒化多糖的光譜分析,可以證實該化合物真實存在。其物化性質既有共性,又有個性。其分子結構的構型、光譜分析、物化性質等在國內外還未見報導。
文檔編號A61K31/715GK1288899SQ0011126
公開日2001年3月28日 申請日期2000年8月4日 優先權日2000年8月4日
發明者李光友, 繆錦來, 劉發義 申請人:國家海洋局第一海洋研究所