專利名稱：人白細胞介素－2用于與抗結核藥聯合用作藥物的新適應癥的制作方法
技術領域：
本發明涉及重組人自然白細胞介素-2(interleukin-2，IL-2)與抗結核藥聯合，用于治療免疫低下狀態中的結核病人的藥物的新用途。最重要的是，提出對免疫低下結核病人，低劑量的重組人自然IL-2與傳統的抗結核藥物聯用即可達到甚至優于大劑量抗結核藥物的療效。
IL-2是由T細胞在受抗原刺激后分泌的一種15kD糖蛋白，它對維持機體的正常免疫反應是必需的。IL-2又稱T細胞生長因子。雖然只有T細胞分泌IL-2，但它可以剌激所有的類淋巴細胞，通過與細胞表面的特異性IL-2受體的結合，發揮促使細胞增殖和分化的功能。NK細胞可以組成性地表達這些受體，而大多數T和B細胞的IL-2受體的表達則依賴于抗原刺激。IL-2不論對細胞免疫和體液免疫，還是原始和再次免疫反應都是極為重要的。
成熟的人IL-2由133個氨基酸組成，第58和105位的半胱氨酸間形成二硫鍵，此二硫鍵為維持IL-2的生物學活性所必需；在美國藥物市場上，美國FDA批準的是人IL-2突變體(IL-2/125S)。由于IL-2突變體雖較穩定，但終非人體內原有的天然分子，制劑注入人體后易于產生抗體，使藥物失效。在本發明中，人IL-2是由正常人淋巴細胞中克隆而來，具有天然分子的生物學功能，稱為重組人自然IL-2與美國投放市場的IL-2/125S不同，因此具有物質新穎性。
在結核桿菌感染機體的免疫反應過程中，T淋巴細胞具有重要作用。結核病患者細胞因子基因表達情況研究結果表明，Th1細胞因子(IL-2和IFNγ＞mRNA的表達明顯降低；結核病患者血清中，sIL-2R的濃度升高。在抗結核藥物治療后，血清中sIL-2R的水平恢復正常。
曾有學者探討過IL-2/125S對抗結核免疫的重要性，他們用小劑量IL-2/125S結合常規多種抗結核藥物(MDT)治療20例肺結核患者，后者包括3種情況1，新診斷的結核病患者，剛開始進行MDT；2，已進行45天MDT的結核病患者，并有治療反應；3，抗藥的結核病患者，已進行MDT至少7個月，但臨床無明顯改善。IL-2/125S的劑量為12.5微克，每日2次，皮下注射，療程30天。結果表明，在IL-2/125S和MDT聯合治療30天后全部病人的臨床癥狀改善。所有第一組病人以及第3組7例中有5例的痰液菌檢陰轉。由此認為，IL-2/125S結合MDT治療方案是安全的，可以促進抗結核細胞免疫反應。本研究的治療對象為免疫功能低下的結核病人，與國外報道的不同而具有用途的新穎性。
發明人使用重組人自然IL-2(商品名遠策欣，北京遠策藥業有限公司生產)進行了治療實驗性小鼠結核的研究。結果表明，單純自然重組IL-2組未見療效，但與小劑量抗結核藥異煙肼與重組人自然1L-2并用，與單純異煙肼組比較，可顯著提高免疫低下小鼠結核的療效。具體的兩批試驗情況描述如下。
一，試驗的目的觀察重組人自然白介素-2單獨應用和與異煙臍并用。對正常和免疫低下小鼠結核的治療作用。
二，受試藥物1.重組人自然IL-2由中國預防醫學科學院生物技術新藥研究中心提供，粉針，每支10萬單位，臨用前以注射用水溶解和稀釋。
2.異煙肼純藥粉北京第二制藥廠產品，用蒸餾水溶解。
3.強的松(醋酸潑尼松片)為浙江仙居制藥股份有限公司產品(批號970711)，用5％CMC制成混懸液。
4.鹽酸左旋咪唑為湖南洞庭制藥廠生產的片劑(批號970710)，用5％CMC制成混懸液。
三，試驗動物用昆明種小鼠，體重17-19g，雌雄各半，均勻分組，每組20只。北京結核病胸部腫瘤研究所動物房合格證號部發，醫動字第01-2043號。
四，試驗方法選擇選擇體內的動物實驗性結核病治療試驗。實驗一為正常小鼠，實驗二為免疫低下小鼠。
五，試驗主要方法和步驟(一)實驗一(小鼠實驗性結核的治療實驗)1.感染取在改良羅氏培養基上生長兩周的人型結核分支桿菌H37Rv培養物，用瑪瑙乳缽磨成5mg/ml的均勻菌懸液(含0.05％吐溫80的滅菌生理鹽水溶液)，每只小鼠尾靜脈內注射0.2ml(每只小鼠感染菌量為1mg)。
2.給藥方法于感染后次日開始，每日給藥一次，重組人自然IL-2皮下注射給藥，異煙肼灌胃給藥，按每只小鼠給藥劑量計算，給藥體積均為0.3ml。直至空白對照組(給相同體積的水)半數死亡為止3.觀察指標和時間及時記錄各組動物死亡數，觀察8周求得各組的半數動物存活時間(ST50)和8周的存活率，用新藥數據處理軟件NDST程序進行統計學處理。
4.試驗對照除空白對照外，選擇異煙肼為已知陽性對照藥，并與其并用，進行比較。
5.試驗結果各組半數動物存活時間和8周的存活率如表1。
表1各組半數動物存活時間(ST50，天)及8周的存活率組別藥物 劑量 途徑 ST50(天) p 存活率(％)1 IL-2 0.65萬IUIH 10- 02 IL-2 1.30萬IUIH 10- 03 IL-2 2.60萬IUIH 10- 04 INH0.01mg 灌胃 19＋# 155 INH0.01mg 灌胃 ＞56 * 956 INH0.01mg 灌胃 ＞56 * 957 IL－2＋INH 1.30萬IU＋0.01mg IH/灌胃 23+- 258 IL－2＋INH 1.30萬IU＋0.02mg IH/灌胃 ＞56 * 859 IL－2＋INH 1.30萬IU＋0.04mg IH/灌胃 ＞56 * 9510 水 0.3ml＋0.3ml IH/灌胃 11# 0注-代表p＞0.05+代表P＜0.05*代表P＜0.01#代表參比組實驗一結果表明(正常小鼠，大劑量結核菌)1.在本實驗條件下未見重組人自然白介素-2對小鼠結核呈顯著性治療作用。
2.異煙肼0.01mg并用重組人自然IL-2 1.30萬IU比單異煙肼0.01mg延長了小鼠半數動物存活時間和提高了第8周的存活率，但未呈顯著性差別(p＞0.05)本實驗動物結核模型是用較大菌量感染，呈急性病變過程。作用于菌體的抗結核化療藥均呈顯著性防治作用。但對于免疫增強劑不易呈抗結核活性。對于免疫調節藥物可考慮用其它模型和方法進行抗結核實驗。
(二)實驗二(免疫低下小鼠，小劑量結核菌)
1.感染取在改良羅氏培養基上生長兩周的人型結核分支桿菌H37Rv培養物，用瑪瑙乳缽磨成3.5mg/ml的均勻菌懸液(含0.05％吐溫80的滅菌生理鹽水溶液)，每只小鼠尾靜脈內注射0.2ml(每只小鼠感染菌量為0.7mg)。
2.給藥方法免疫抑制劑(強的松)、免疫調節劑(重組人自然IL-2)和化療藥(異煙肼)同時給藥，同時停藥。于感染后次日開始。每日給藥一次，各實驗組均給予相同劑量的強的松(0.25mg/只)。重組人自然IL-2皮下注射給藥，異煙肼、強的松和左旋咪唑灌胃給藥，按每只小鼠的給藥劑量計算。皮下注射的體積為0.3ml，灌胃的總體積為0.5ml。共給藥20天。
3.觀察指標和時間及時記錄各小鼠死亡時間，感染后8周(56天)結束實驗，以動物存活率為指標。用新藥數據處理軟件NDST程序進行統計學處理。
4.試驗對照除空白對照外，選擇異煙肼為已知陽性對照藥，并與其并用，進行比較。免疫調節劑陽性對照藥為左旋咪唑。
5.試驗結果各組動物第56天的存活率如表2。
表2各組半數動物存活率組別藥物劑量途徑 存活率(％) p1 IL-2 2.6萬IU IH0-2 IL-2 5.2萬IU IH0-3 INH0.005mg 灌胃 5+#4 INH0.01mg 灌胃 40 *5 INH0.02mg 灌胃 80 *6IL－2＋INH5.2萬IU＋0.005mg IH/灌胃 40 ++7IL－2＋INH2.6萬IU＋0.005mg IH/灌胃 40 ++8IL－2＋INH2.6萬IU＋0.01mgIH/灌胃 60 *9IL－2＋INH2.6萬IU＋0.02mgIH/灌胃 90 * 11 水0.3ml 0.5mlIH/灌胃 5# 注1.-表p＞0.05；＋代表P＜0.05；*代表P＜0.01；#代表參比組2.第1至第12組均同時給予強的松。3.除第12組外均感染。4.第13組不給任何藥物實驗二結果表明1.在本實驗條件下單純重組人自然IL-2給藥組與空白對照組(不給治療藥)比較，對免疫低下結核小鼠的存活率有所提高，但未呈顯著性差別(p＞0.05)。
2.單純異煙肼小劑量(0.005mg/只)未提高免疫低下結核小鼠的存活率，但該小劑量異煙肼與重組人自然IL-2并用則顯著提高小鼠的存活率(重組人自然IL-2提高了異煙肼的療效)(p＜0.05)。
3.中劑量和大劑量異煙肼與重組人自然IL-2并用后。與單純異煙肼比較，對結核小鼠的存活率均有所提高。但未呈顯著性差別(p＞0.05)。
4.陽性對照藥左旋咪唑顯著提高免疫低下結核小鼠的存活率(p＜0.05)六.試驗結論1.單純重組人自然IL-2未呈現明顯的抗結核化療藥效果。
2.小劑量異煙肼與重組人自然IL-2并用，與單純異煙肼比較。顯著提高對免疫低下的小鼠結核的療效。
權利要求
1.自然重組人白細胞介素2(interleukin-2，IL-2)與抗結核藥聯合，用于針對免疫低下狀態的結核病人的藥物的新用途。
全文摘要
本發明涉及重組人自然白細胞介素－2(inter,leukin－2,IL－2)與抗結核藥聯合,用于治療免疫低下狀態中的結核病人的藥物的新用途。提出對免疫低下結核病人,低劑量重組人自然IL－2與抗結核藥物聯用即可達到甚至優于大劑量抗結核藥物的療效。
文檔編號A61P31/00GK1326783SQ0010936
公開日2001年12月19日 申請日期2000年6月2日 優先權日2000年6月2日
發明者侯云德, 張麗蘭 申請人:侯云德, 北京東康龍病毒生物技術工程研究中心