專利名稱：Ii型膠原蛋白口服胃溶制劑的制作方法
類風濕關節炎屬于免疫性疾病，已證明病人關節炎軟骨中的Ⅱ型膠原蛋白是免疫系統針對的致病性抗原之一。病人體內可以測出抗Ⅱ型膠原蛋白的抗體存在。隨著口服免疫耐受治療自身性免疫疾病的進展，國內外應用口服低劑量的Ⅱ型膠原蛋白來治療類風濕性關節炎已初見效果。口服蛋白質引起機體對該種蛋白質的一種免疫低反應狀態稱為口服耐受(mucosaltolerance,MT)。口服耐受屬于粘膜耐受的一種。大多數食物中含有可溶性抗原，與腸道粘膜接觸的過程中并不發生過敏反應，主要有以下兩種原因(1)腸道內活性抗原誘導腸壁局部產生分泌型IgA，引起免疫排斥。(2)抗原引起MT。MT影響免疫反應的多個方面，如IgM、IgG、IgE抗體反應的抑制，淋巴細胞增殖、遲發性過敏反應等細胞介導免疫反應的抑制。口服耐受的產生和維持是一個非常復雜的過程，其基本機制包括克隆清除、失能和主動抑制，口服抗原是其中的決定性因素。
不同動物來源的Ⅱ型膠原蛋白在治療上顯示出相當大的差異。國內外已有較多文獻報道，用雞CⅡ治療RA，對患者的關節腫脹數和指數、關節壓痛數和指數、15米行走時間和血清學指標的改善程度明顯優于牛CⅡ，即雞CⅡ的臨床療效觀察結果較牛CⅡ具有明顯的優勢。
由于雞軟骨來源的Ⅱ型膠原蛋白與人軟骨中的Ⅱ型膠原蛋白差異最小，有抗原同源性。經過實驗驗證，牛Ⅱ型膠原蛋白雖在分子量、純度和被Ⅱ型膠原蛋白酶酶解等方面與雞Ⅱ型膠原蛋白一致，但其氨基酸組成與雞Ⅱ型膠原蛋白比較有明顯不同，牛Ⅱ型膠原蛋白不與抗人Ⅱ型膠原蛋白單抗結合，提示牛Ⅱ型膠原蛋白與人Ⅱ型膠原蛋白的免疫原性有一定差異。而雞Ⅱ型膠原蛋白可與抗人Ⅱ型膠原蛋白單抗結合，說明雞和人Ⅱ型膠原蛋白有相同和相似的免疫原性。雖然兩者的來源不同，但同屬Ⅱ型膠原蛋白，都具有明確的藥效作用，并已明確雞Ⅱ型膠原蛋白的藥效作用優于牛Ⅱ型膠原蛋白。
本專利中使用的雞Ⅱ型膠原蛋白，是由以下制備工藝而得。首先，將雞劍突軟骨粉碎、蛋白酶消化、雜質硫酸軟骨素的除去、Ⅱ型膠原蛋白的精純化、降解成份的除去。以上方法制備的雞Ⅱ型膠原蛋白純度在95％，硫酸軟骨素含量低于3％的水平。中試放大制備工藝主要針對Ⅱ型膠原蛋白得率的工業化流程，確定了適合于每次十公斤到數十公斤軟骨的提取方法。中試生產工藝和制劑工藝操作方便，無特殊設備要求，成本低，工業化生產放大容易，操作人員無需特殊技能培訓。此工藝與國內外文獻報道方法比較，有較大的改進。如省除了DEAE纖維素純化的步驟，用非揮發性酸代替乙酸，用酶法除去軟骨膜，改用口服凍干粉為口服胃溶制劑等。
由于Ⅱ型膠原蛋白只能溶于酸性溶液，再加上在水溶液中不穩定性，在Ⅱ性膠原蛋白的藥物制劑方面一直是較難解決的問題。國內外的資料顯示，在進行Ⅱ型膠原蛋白的制劑方面，主要采用純化的Ⅱ型膠原蛋白先凍干成粉劑，服用時用0.01-0.1M乙酸溶液溶解后再口服。此種劑型保證了Ⅱ型膠原蛋白的穩定性，但給病人的服用帶來了極大的不便，如需配置專門的乙酸溶液，乙酸有較強的刺激性和不良口感等。同時凍干制劑的成本很高，保存和運輸不方便。根據在純化制備Ⅱ型膠原蛋白過程中的蛋白酶解特性，即用胰蛋白酶除去硫酸軟骨素，用胃蛋白酶媒介釋放Ⅱ型膠原蛋白。因此將Ⅱ型膠原蛋白制成胃溶制劑，在胃酸溶液中達到完全溶解后，不會被胃蛋白酶和胰蛋白酶消化。本專利的創新之處在于將Ⅱ型膠原蛋白用非揮發性酸(符合藥典要求)調節pH值，進行凍干成凍干粉狀半成品，能在普通水溶液和人工胃液中迅速溶解。為了增加其保護作用在凍干時按比例加入相應的賦形保護劑，如甘露醇或明膠等。此種凍干半成品具有良好的溶解性和穩定性，可與相應的胃溶制劑輔料(淀粉類、糖類、纖維素類等)混合，經加工制成膠囊、微粒或普通片劑、包衣片劑等劑型。本專利發明的Ⅱ型膠原蛋白胃溶制劑，經動物藥效學證明有良好的治療效果。
動物藥效學實驗證明雞Ⅱ型膠原蛋白胃溶制劑給藥后對大鼠棉球肉芽腫、原發性和繼發性關節炎出現后其足爪腫脹體積、多發性關節炎的評分具有顯著的治療作用。同時，致炎后升高了的L3T4+/Lyt-2+T淋巴細胞亞型比值有所降低；血清抗Ⅱ型膠原抗體水平出現下降趨勢，脾淋巴細胞增殖反應有進一步抑制作用，提示脾臟Thl細胞功能有抑制；口服胃溶制劑雞Ⅱ型膠原蛋白可明顯抑制動物佐劑型關節炎的腹腔巨噬細胞(PMφ)白細胞介素-1(IL-1)和腫瘤壞死因子(TNF-α)活性。
實例說明1．雞Ⅱ型膠原蛋白的提取工藝從食品加工廠購回經檢疫的美國AA雞劍突軟骨-20℃保存不超過半年→解凍去硬骨和肉組織→0.6M乙酸溶液中每升加入400mg胃蛋白酶攪伴48小時除去殘余的肉和軟骨膜→粉碎軟骨塊成直徑小于2mm的粉狀物→在0.05MTris(PH8.0)溶液中每升加入0.2克胰蛋白酶4℃消化24小時去除雜質→沉淀用0.5M乙酸懸浮后每升加入10克胃蛋白酶(PH2.5)4℃中攪伴消化48小時→酶解軟骨離心保留上清，加入NaCl至終濃度2M后4℃放置2小時→沉淀再用0.5M乙酸溶解后進行透析(對0.02M Na2HPO4溶液)至透析袋中出現白色沉淀→離心收集沉淀即半成品。半成品能溶解于0.1M乙酸溶液，最終Ⅱ型膠原蛋白濃度大于1.5mg/ml。經多種指標檢測，半成品雞膠原蛋白Ⅱ型純度可達到95％，硫酸軟骨素含量低于3％，無降解片段存在，無殘留胃蛋白酶和胰蛋白酶活性。2．雞Ⅱ型膠原蛋白口服胃溶膠囊的制備成品口服制劑是半成品溶液加入賦形劑以及用非揮發性酸的凍干，Ⅱ型膠原蛋白∶甘露醇∶酒石酸的比例為1∶40∶9，可很好地凍干成白色粉末狀。凍干后半成品在水溶液和人工胃液中溶解良好。由于膠原蛋白Ⅱ型經口服后主要由腸粘膜吸收，在制備過程中加入了大量的胃蛋白酶和胰蛋白酶消化，再加上Ⅱ型膠原蛋白在酸性條件下溶解性好，口服后能迅速在胃液中溶解，且不被其消化酶破壞。口服胃溶膠囊劑型是將半成品凍干粉與乳糖按1∶19混合后，每顆4號膠囊裝量125毫克，其中含有125微克的雞Ⅱ型膠原蛋白。成品膠囊經水份測定以及HPLC含量和純度測定，溶出度和崩解度測定，均符合膠囊劑型的標準。按每次用10公斤AA雞劍突軟骨進行以上工藝的制備，可得每公斤1.4克的雞Ⅱ型膠原蛋白的半成品，制成口服胃溶膠囊(0.125mg/顆)的總顆數為12000顆左右。3．雞Ⅱ型膠原蛋白胃溶膠囊對動物關節炎模型的治療和預防作用3．1 灌胃雞Ⅱ型膠原蛋白5、25、50μg/Kg/d(微克/千克/天)對大鼠棉球肉芽腫均有明顯的抑制作用。
3．2 預防給藥對大鼠佐劑性關節炎(AA)有顯著抑制作用。5μg/Kg/d劑量組和50μg/Kg/d劑量組均能明顯抑制AA大鼠原發和繼發性足爪腫脹，其中5μg/Kg/d劑量組最佳，病理學檢查支持此結果。對AA大鼠腹腔巨噬細胞(PMφ)白細胞介素-1(IL-1)和腫瘤壞死因子(TNF-α)活性有顯著抑制作用(均有P＜0.01)。
3．3 造模前5天到制模后第16天灌胃雞Ⅱ型膠原蛋白預防治療給藥，對小鼠Ⅱ型膠原蛋白性關節炎(CIA)有明顯的治療作用。其中5μg/Kg/d劑量組評分有顯著減輕(P＜0.01),50μg/Kg/d劑量組有一定改善(P＜0.05)。同時發現CIA模型小鼠升高了的L3T4+/Lyt-2+T淋巴細胞亞型比值有所降低，5μg/Kg/d劑量組最為明顯。同時可使各劑量組血清抗Ⅱ型膠原抗體水平出現下降趨勢，也以5μg/Kg/d劑量組顯著(P＜0.01)。
權利要求
1．Ⅱ型膠原蛋白加入甘露醇和酒石酸后凍干，再與α-乳糖混均，裝胃溶膠囊而成Ⅱ型膠原蛋白的口服胃溶膠囊制劑。
2．條款1中的Ⅱ型膠原蛋白凍干配方為Ⅱ型膠原蛋白∶甘露醇∶酒石酸的比例=1∶40∶9。
3．條款1中的α-乳糖混均比例為半成品凍干粉α-乳糖=1∶19。
4．條款1，中的胃溶膠囊可用片劑代替。
5．條款2中的甘露醇用白蛋白、明膠等其它賦形劑和/或保護劑替代同樣適用，酒石酸也可用其它非揮發性的酸性物質代替。
6．條款3中的α-乳糖可用其它輔料代替，如淀粉類的淀粉、羧甲基淀粉鈉、預膠化淀粉，糖類的蔗糖粉、葡萄糖、甘露醇、山梨醇，纖維素類的微晶纖維素、甲基纖維素、羧甲基纖維素鹽、乙基纖維素、羧丙基甲基纖維素、低取代羧丙基纖維素等。
7．條款1中的Ⅱ型膠原蛋白主要指雞軟骨來源的Ⅱ型膠原蛋白，牛或豬等哺乳動物來源的Ⅱ型膠原蛋白同樣適用。
8．條款1中的劑型具有治療和預防類風濕性關節炎或強直性關節炎的藥物價值。
全文摘要
關節軟骨的Ⅱ型膠原蛋白是類風濕性關節炎的主要致病抗原,通過口服Ⅱ型膠原蛋白由腸道粘膜產生免疫耐受,可以有效地預防和治療類風濕性關節炎或強直性關節炎。本發明采用將Ⅱ型膠原蛋白制備成口服胃溶制劑,能更好地被腸粘膜吸收和利用,達到臨床上治療和預防的效果。
文檔編號A61K38/39GK1303714SQ00100269
公開日2001年7月18日 申請日期2000年1月13日 優先權日2000年1月13日
發明者范開, 王立兵, 黃洪濤, 田峰 申請人:重慶多泰制藥有限公司