制備煙草浸出液的兩步微生物發酵法的制作方法

專利名稱：制備煙草浸出液的兩步微生物發酵法的制作方法
技術領域：
本發明涉及煙草加工技術領域，具體涉及一種煙草浸出液的微生物制備方法。
背景技術：
煙草薄片(tabacco sheet)又稱為重組煙葉，主要由煙末、煙葉碎片、煙梗或者低次煙葉制備而成，現有的煙草薄片生產方法，包括輥壓法、稠漿法和造紙法等，其中造紙法最為流行。造紙法是煙草原料先用水萃取，不溶性物質制成漿后進入造紙機，初步形成紙網；水溶性萃取物經濃縮后與添加劑一并加入紙網中，干燥后得到成品。因此，造紙法薄片工藝技術是包括有廢水處理工藝在內的濕法造紙工藝與化工生產中萃取濃縮工藝相結合的工藝流程。現有的煙草薄片原料萃取工藝條件包括萃取劑種類的選擇、萃取方式、萃取時間、 萃取條件等；為改善萃取液的質量，還采取萃取成分的富集、外加非薄片生產過程中的煙草萃取液等措施。在造紙法煙草薄片的生產過程中，常采用水作為溶劑，各種煙草原料(以煙梗為主)通過浸取，再通過壓濾、濃縮制備煙草浸出濃縮液。濃縮液通過涂布或浸漬法施予薄片紙基上。為更充分地提取煙草原料中的香味物質，也有的采用有機溶劑萃取。目前一般認為進口薄片品質優于國產薄片，由于進口薄片中的香味成分含量要遠遠高于國產薄片，引入的雜氣(木質氣、枯焦氣)少，刺激性小，余味舒適。影響國產薄片品質的因素被認為是煙草的浸取技術不過關，導致煙草浸取液質量不佳。在以水為溶劑的浸取過程中，雖然煙草原料中的大部分小分子物質可直接溶于水中，但大分子物質(如蛋白質、果膠、淀粉等)不能直接溶于水溶液，需采用磨漿法對煙草濾渣再次進行打漿(機械磨漿)。但在機械磨漿過程中，蛋白質、果膠、淀粉等大分子物質大部分仍無法有效降解成水溶性物質，有的與纖維素類物質緊密結合從而殘留于片基中，殘留在煙草薄片中的高含量蛋白質使得煙氣有燒焦的蛋白味，使煙氣帶有不良氣味。因此，現有的以物理-化學處理方法為特征的造紙法，導致煙草原料中蛋白質、果膠、淀粉等大分子物質的殘留從而影響煙草薄片的質量，造成煙草薄片香氣不足，雜氣較大。另外，造紙法煙草薄片生產過程中還需采用動力消耗極大的壓輥式機械擠壓式磨漿設備和浸提、濃縮工藝，不僅能耗較高，增加生產成本，還對環境有污染。

發明內容
本發明的目的在于克服現有技術的缺陷，提供一種以煙草原料為反應物，采用生物法制備煙草浸出液的兩步微生物發酵法。本發明一方面公開了一種制備煙草浸出液的兩步微生物發酵法，所述的兩步微生物發酵，包括第一步微生物酶解發酵和第二步微生物增香發酵，具體步驟如下1.酶解發酵酶解型微生物對煙草原料的微生物發酵及酶解；2.固液分離除去酶解產物中的不溶性固形物質，取酶解液進行濃縮，獲得濃縮酶解液；
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3.增香發酵增香型微生物對濃縮酶解液進行微生物發酵，獲得煙草浸出液。較優的，所述煙草原料選自煙梗、煙葉和煙末中的一種或多種；更優的，所述煙草原料選自粉碎后的煙梗粉末、粉碎后的煙葉粉末和煙末中的一種或多種；最優的，所述煙草原料的煙梗粉末、煙葉粉末和煙末經過篩處理，選擇粒度為36 60目的煙草原料，即煙草原料的粒度大于等于60目，小于等于36目。所述煙末是煙草企業的下腳料，是在整個煙草加工過程中篩分下來的細粒或粉末狀的煙草物料，包括煙梗加工過程中的顆粒或粉末狀物料。進一步的，步驟1所述的酶解發酵，包括以下兩步A.酶解型微生物的菌種活化，利用煙草原料制備的種子培養基逐級擴大培養酶解型微生物種子；B.采用固態或液態發酵法，將步驟A制備的酶解型微生物種子接種于煙草原料制備的發酵培養基中，在適宜條件下進行發酵和煙草原料的酶解，獲得酶解產物。較優的，所述酶解型微生物可以選自黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉 (Aspergillus oryzae)、黃抱原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)、或者木霉 (Trichoderma spp.)中的一種；更優的，所述酶解微生物為黑曲霉(Aspergillus niger) 0較優的，酶解型微生物的菌種活化的方法為采用PDA斜面培養基活化酶解型微生物，待培養結束后，制備酶解型微生物孢子懸浮液，其中，酶解型微生物孢子懸浮液中孢子的濃度不低于IO7個/ml。較優的，酶解型微生物種子培養基由煙草原料加水配置而成，其中煙草原料干基的重量百分比為6-8%。更優的，一級種子培養基是由煙葉粉末加水配置而成，其中煙葉粉末的重量百分比為6-8%，所述重量百分比是以培養基總重量為基數的重量百分比。配制好的一級種子培養基滅菌后，以一定的接種量將酶解型微生物孢子懸浮液接入到所述一級種子培養基中，在適宜的溫度下培養，獲得一級種子液。更優的，二級種子培養基干基包括煙葉粉末和煙梗粉末，兩者的質量比為煙葉粉末煙梗粉末=3 4 1 ；所述二級種子培養基配料的煙葉粉末和煙梗粉末混合干基為自然粒度，或者也可將混合干基過篩，選擇粒度為36目 60目之間的混合干基，即采用粒度大于等于60目小于等于36目的煙葉粉末和煙梗粉末混合配置二級種子培養基干基。較優的，將二級種子培養基干基以6-8% (以培養基總重量為基數的重量百分比) 的加入量加入到70°C的水中，保溫30min制得二級種子培養基。將用于配置二級種子培養基的反應容器預先進行滅菌處理，在滅菌后的容器中制備得到二級種子培養基，以一定的接種量將一級種子液接入到所述二級種子培養基中，在適宜的條件下培養，獲得二級種子液。較優的，步驟B所述的發酵培養基干基配料比(質量比)為煙葉粉末煙梗粉末=1 9;更優的，發酵培養基干基配料比(質量比)為煙葉粉末煙末煙梗粉末= 0.5 0.5 9 ；最優的，所述發酵培養基干基粒度為36 60目。采用固態法發酵時，可采用三角瓶發酵法、淺盤發酵法或者固態通風發酵池法；較優的，采用通風發酵池法時，通風量為1 3vvm，且無需攪拌。較優的，固態發酵時，發酵培養基的料水比(質量比)為發酵培養基干基水=10 9 12。采用固態法發酵時，發酵結束后，分離除去發酵產生的大量酶解型微生物的孢子， 然后向發酵培養基中加入一定量水，在適宜溫度下保溫，酶解一定時間獲得酶解產物。較優的，固態發酵結束后向發酵培養基加入的水量是培養基(濕基)重量的1 3倍；較優的，酶解條件為45 50°C保溫，酶解16 34h。所述液態發酵法可采用分批發酵法或補料分批發酵法；液體發酵的設備可采用三角瓶搖瓶發酵、氣升式發酵罐、機械攪拌通風發酵罐。較優的，所述液態培養基的料水比(質量比)為發酵培養基干基水=1 8 14，優選 1 10 12。采用液態發酵法時，在適宜條件下進行發酵反應，發酵結束后直接獲得酶解產物。較優的，所述液態發酵法時，培養溫度為30 33°C，培養4 6天。酶解產物中的不溶性固形物質可以通過過濾、離心、抽濾或者壓濾等方法除去。進一步的，所述濃縮可采用真空濃縮或者超濾濃縮；較優的，濃縮酶解液中可溶性固形物含量(質量百分比)為8 50%，優選10-30%。進一步的，步驟3所述的增香發酵，具體包括如下步驟a.種子的制備增香型微生物菌種活化，利用煙草原料制備的種子培養基逐級擴大培養增香型微生物種子，收集細胞沉淀；b.發酵增香型微生物在適宜條件下對濃縮酶解液的生物轉化；c.分離發酵結束后，分離增香型微生物菌體與發酵液，收集增香后的發酵液；d.再次發酵向分離的增香型微生物菌體中加入新鮮煙草濃縮酶解液，重復步驟 b和c的操作；e.發酵液合并不同批次增香后的發酵液合并得到煙草浸出液。較優的，所述增香型微生物為酵母菌；更優的，所述增香型微生物為酵母屬微生物(Saccharomyces spp·),可以選自面包酵母(Saccharomyces cerevisiae)、啤酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae Hansen)或酉良酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中的一種；最優的，所述增香型微生物為釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。較優的，所述增香型微生物種子培養基由麥芽汁和煙草原料溶液配制而成，其組成及配比為煙草原料溶液8%麥芽汁=1 1(體積比)。較優的，所述煙草原料溶液的原料組成及配比為煙葉粉末煙末水= 0.5 0.5 9(重量比)；更優的，所述煙葉粉末和煙末粒度為36 60目。較優的，所述種子培養基的制備方法如下(1)制備8%麥芽汁取一份麥芽加入其四倍的水(質量比)，在65°C水浴鍋中保溫3 4h，使其自行糖化直至糖化完全。糖化液用4 6層紗布過濾，將過濾液用水稀釋到麥芽汁中可溶性固形物質濃度為8%，調？!1至6. 4，制備成8%麥芽汁；(2)制備煙葉粉末溶液向煙葉粉末及煙末構成的粉末中加入溫度為65 75°C的水，萃取30min獲得所述的煙草原料溶液；(3)制備種子培養基按照煙草原料溶液(可溶性固形物質濃度含量)8%的麥芽汁=1 1(體積比)的配比制備種子培養基。向滅菌后的種子培養基中接入斜面種子，在適宜條件下培養獲得一級種子和二級種子。培養規模較大時，還可以繼續培養三級種子或采用發酵罐培養。種子培養成熟后離心收集細胞沉淀，獲得增香型微生物濕細胞沉淀(酵母泥)， 4°C冰箱保存備用。進一步的，增香型微生物種子的要求為種子液中增香型微生物細胞數達到IO7-IO8 個/mL。較優的，步驟b的發酵是向所述濃縮酶解液中加入增香型微生物濕細胞沉淀(酵母泥)，制備成細胞懸液后進行生物轉化。較優的，增香型微生物濕細胞沉淀的加入量為酶解濃縮液的5 25% (質量百分比)；較優的，增香微生物的轉化時間為0. 5 他。步驟c是在發酵結束后，待細胞自然沉降，分離并收集增香后發酵液，增香型微生物細胞仍然留在反應容器中；步驟d是向酵母濕細胞沉淀中再次加入新鮮的濃縮酶解液進行發酵、分離，循環5 10次。以不染菌，并能持續進行微生物轉化為度；最終，將不同批次增香后的發酵液合并，得到煙草浸出液。本發明另一方面公開了一種煙草薄片，該煙草薄片中添加了本發明所述兩步微生物發酵法制備的煙草浸出液。本發明的有益效果為本發明所采用的制備煙草浸出液的二步微生物發酵方法是通過兩種不同功能的微生物對煙草原料進行發酵第一步是采用產水解酶豐富的酶解微生物對煙草原料進行發酵和酶解；第二步發酵是利用具有增香作用的酵母菌對第一步發酵所獲得的發酵濾液進行再次發酵。本發明的兩步微生物發酵法，首先利用黑曲霉等酶解型微生物在發酵過程中合成的蛋白酶、果膠酶、木質素酶、半纖維素酶、淀粉酶等復合酶，將煙草原料中的蛋白質、木質素、淀粉、果膠質等大分子物質降解成易溶于水的氨基酸、還原糖、半乳糖醛酸等小分子物質，減少了蛋白質、果膠、淀粉等物質的殘留對煙草薄片質量的影響， 使燃燒時雜氣更少，香氣更佳；進一步的，增香微生物對發酵酶解濃縮液進行生物轉化，在發酵過程中產生少量的醇類及酯類物質，進一步增加發酵液的香氣，提高煙草浸出液的品質。本發明的兩步微生物發酵法所制備的煙草浸出液比現有的造紙法煙草浸出液水溶性低分子量物質的總收率要高，綜合質量更好；并且該生物處理的新方法比現有的煙草薄片的造紙法更加節能，工藝相對簡單、設備投資較小，且與其它技術相配合可提高煙草薄片的綜合質量。


圖1造紙法煙草薄片生產工藝流程
圖2酶解型微生物種子擴大培養流程
圖3增香型微生物種子擴大培養流程
圖4先固后液發酵法生產煙草浸出液
圖5兩步液態發酵法生產煙草浸出液
具體實施例方式
下面結合具體實施例進一步闡述本發明，應理解，以下實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的保護范圍。
實施例1先固后液兩步微生物發酵法一、酶解發酵1.黑曲霉種子的制備1)斜面培養黑曲霉(Aspergillus niger，中國工業微生物菌種保藏管理中心(China Center of Industrial Culture Collection)保藏并提供的40431-黑曲霉)劃線接種于PDA斜面，30°C培養5天，4°C冰箱保存。2)黑曲霉孢子懸浮液的制備在黑曲霉斜面中加入事先滅菌的無菌水，用接種鏟將孢子刮下，轉移到已滅菌的三角瓶中，玻璃珠震蕩打散。其中孢子懸浮液中的孢子濃度不低于IO7個/mL。3)黑曲霉一級種子液的制備在2個IOOOmL三角瓶中各加入粉碎后的煙葉粉末干基10g，加水150mL，12rC滅菌20min，冷卻至30°C備用。接入黑曲霉孢子懸浮液10mL，搖瓶160r/min，30°C培養2天， 獲得黑曲霉一級種子液。2.固態發酵在121 V滅菌20min的IL三角瓶中(棉塞同時滅菌)，分別加入煙梗粉末(干基)90g，煙葉粉末(干基)5g，煙末(干基)5g，選擇粒度大于等于60目，小于等于36目的上述煙草原料，加入70°C水90mL，攪拌均勻，保溫30min，冷卻至30°C后接入黑曲霉一級液體種子，接種量為30mL。30°C發酵5天。固態發酵平行樣6個。3.酶解固態發酵結束后，通過吸塵器分離收集孢子。將發酵后的煙草原料浸泡于水中進行酶解，加水量是發酵后的物料(濕基)重量的3倍，在45°C的保溫條件下，浸泡并酶解 28h。二、固液分離酶解后的煙草原料用4層紗布粗過濾后，得到不溶性固形物與液體，液體經抽濾后得到600mL，200mL液體留樣檢測，400mL液體經濃縮，得到200mL可溶性固形物含量10% 的濃縮酶解液，用于后續的微生物轉化增香。三、增香發酵1.釀酒酵母種子的制備(1)8%麥芽汁的制備取一份麥芽加入其四倍的水，在65°C水浴鍋中保溫3_4h，使其自行糖化直至糖化完全。糖化液用4-6層紗布過濾，根據要求將過濾液用水稀釋到麥芽汁中的可溶性固形物質含量為8%，調pH至6. 4，制備成8%麥芽汁。(2)煙草原料溶液的制備按照煙葉粉末煙末水=0. 5 0.5 9 (重量比)的配料比，在65°C的溫度下萃取30min，自然過濾，制得煙草原料溶液。(3)斜面培養基及斜面種子培養方法6%麥芽汁瓊脂培養基，將釀酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae，中國工業微生物菌種保藏管理中心(China Center of Industrial Culture Collection)編號為 31477)劃線接種后，30°C培養 Mh，4°C冰箱保藏
(4)釀酒酵母液體種子培養基及培養方法種子培養基上述煙草原料溶液50mL，再加入等體積的8%的麥芽汁。一級種，500mL三角瓶中，加入種子培養基100mL，121°C滅菌20min。冷卻至30°C 備用。接入斜面菌種1環，搖瓶1501~/1^11，301培養對11。二級種，以一級種為種子液，在10個IL三角瓶中各加入200mL種子培養基，分別接入液體種子10mL，搖瓶200r/min，32°C培養Mh，酵母細胞數應達到IO7個/mL。酵母菌經擴大培養后，轉移到滅菌后的離心管中，在無菌條件下離心，收集細胞沉淀，細胞沉淀在4°C冰箱低溫保存備用。2.發酵采用懸浮細胞轉化法在500mL三角瓶中，加煙草濃縮酶解液200mL，其可溶性固形物含量為10%，再加入IOg釀酒酵母濕細胞沉淀，攪拌勻成細胞懸浮液，進行微生物轉化。轉化期間間歇攪拌，轉化溫度為32°c，轉化時間為2小時。3.分離轉化后待細胞自然沉降，收集增香后發酵液。4.再次發酵將通過步驟3分離獲得的釀酒酵母泥(釀酒酵母濕細胞沉淀)中再加入新鮮的煙草濃縮酶解液180mL。如此循環5次，以不染菌，并能持續進行微生物轉化為度。5.發酵液合并將不同批次的增香發酵液合并，制備得到煙草浸出液。實施例2先固后液兩步微生物發酵法(150L固態發酵罐)一、酶解發酵1.黑曲霉種子的制備1)斜面培養黑曲霉劃線接種于PDA斜面，30°C培養5天，4°C冰箱保存。2)黑曲霉孢子懸浮液的制備在黑曲霉斜面中加入事先滅菌的無菌水，用接種鏟將孢子刮下，轉移到已滅菌的三角瓶中，玻璃珠震蕩打散。其中孢子懸浮液中的孢子濃度不低于IO7個/mL。3)黑曲霉一級種子液的制備在6個IOOOmL三角瓶中加入粉碎后的煙葉粉末干基10g，加水115mL，12rC滅菌 20min,冷卻至30°C備用。接入黑曲霉孢子懸浮液10mL，搖瓶160r/min，32°C培養2天，獲得黑曲霉一級種子液。4)黑曲霉二級種子液的制備將黑曲霉一級種子液接入到二級培養基中擴大培養黑曲霉二級種子液。種子罐為 2個5L發酵罐。在每個發酵罐中(預先121°C滅菌20min)中加入粒度大于等于60目，小于等于36目的碎煙葉粉末140g、36目篩的煙梗粉末35g，加入2.75L水。接入黑曲霉一級種子液400mL，攪拌160r/min，通氣量為lvvm，30°C培養2天。2個發酵罐共獲得黑曲霉二級種子液約7L。2.固態發酵
在一蒸汽滅菌過的容器內，加入混合的煙草原料作為發酵培養基，其配料(干基計)為粒度為36目 60目的煙梗粉末Wkg，粒度為36目 60目的煙葉粉末和煙末各 Ikgo在混合煙草原料中加入100°C水ML，攪拌均勻，維持30min，冷卻至30°C后加入二級液體種子7L，拌勻。在蒸汽滅菌30min的150L固體發酵罐的不銹鋼篩板上鋪上4層紗布，其上加入上述接種后的煙草物料，其厚度約為15cm。30°C，發酵5天。發酵期間經罐底不銹鋼篩板下的氣室，向不銹鋼篩板上的發酵物料中通入無菌空氣，通風量150L/min。壓力lkg/cm2。3.酶解固態發酵結束后，通過吸塵器分離收集發酵物料上的黑曲霉孢子。將發酵后的煙草物料浸泡于水中進行酶解，加水量是發酵后的物料(濕基)重量的2. 5倍，在50°C的保溫條件下，浸泡并酶解16h。浸泡期間，間歇地將發酵罐底部氣室內的濾液循環返回到不銹鋼篩板上的發酵煙草物料中。二、固液分離發酵并酶解后的煙草原料用4層紗布在發酵罐內進行粗過濾，發酵殘渣再經壓濾，分離得到不溶性固形物與液體，所得到的液體再經多層紗布過濾后得到IlOL酶解液， 酶解液再經濃縮得到30L可溶性固形物含量為30%的濃縮酶解液。濃縮酶解液用于后續的微生物轉化增香。三、增香發酵1.釀酒酵母種子的制備(1)8%麥芽汁的制備取一份麥芽加入其四倍的水，在65°C水浴鍋中保溫3_4h，使其自行糖化直至糖化完全。糖化液用4-6層紗布過濾，根據要求將過濾液用水稀釋到麥芽汁中的可溶性固形物質含量為8%，調pH至6. 4，制備成8%麥芽汁。(2)煙草原料溶液的制備按照煙葉粉末煙末水=0.5 0.5 9(重量比)的配料比，在75°C的溫度下萃取30min，自然過濾，制得煙草原料溶液。(3)斜面培養基及斜面種子培養方法6%麥芽汁瓊脂培養基，將釀酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae，中國工業微生物菌種保藏管理中心(China Center of Industrial Culture Collection)編號為 31477)劃線接種后，30°C培養 Mh，4°C冰箱保藏(4)釀酒酵母液體種子培養基及培養方法種子培養基上述煙草原料溶液50mL，再加入等體積的8%的麥芽汁。一級種，500mL三角瓶中，加入種子培養基100mL，121°C滅菌20min，冷卻至30°C備用。接入斜面菌種1環，搖瓶150r/min，31°C培養Mh，酵母細胞數應達到IO8個/mL。二級種子培養，在10個IL三角瓶中各加入200mL培養基，121°C滅菌20min滅菌并冷卻后，分別接入一級液體種子6mL，，搖瓶150r/min，3(TC培養Mh，酵母細胞數應達到 IO7個/mL。酵母菌經擴大培養后，轉移到滅菌后的離心管中，在無菌條件下離心，收集細胞沉淀。40C冰箱低溫保存備用。三級種，在30L發酵罐中加入20L上述煙草原料溶液和麥芽汁混合而制成的培養
10基，121°C滅菌20min滅菌并冷卻后，接入液體種子IOOOmL,攪拌轉速150r/min，通氣量為 lVVm，3(TC培養Mh。酵母菌經擴大培養后，在無菌條件下離心，收集細胞沉淀。4°C冰箱低溫保存備用。2.發酵懸浮細胞轉化法在2L可溶性固形物含量為30%的煙草濃縮酶解液加入0. 2kg 濕細胞沉淀，制備成懸浮液，置于容器中，進行微生物轉化。轉化溫度為31°C，轉化時間為 2. 5小時。3.分離轉化后待細胞自然沉降，從溢流口放出增香后發酵液體并收集發酵液。4.再次發酵將通過步驟3分離獲得的釀酒酵母泥(釀酒酵母濕細胞沉淀)中再加入新鮮的煙草濃縮酶解液2L，循環10次，以不染菌，并能持續進行微生物轉化為度。5.發酵液合并將不同批次的增香發酵液合并，制備得到煙草浸出液。實施例3先固后液兩步微生物發酵法一、酶解發酵1.米曲霉種子的制備1)斜面培養米曲霉劃線接種于PDA斜面，30°C培養4天，4°C冰箱保存。2)米曲霉孢子懸浮液的制備在米曲霉斜面中加入事先滅菌的無菌水，用接種鏟將孢子刮下，轉移到已滅菌的三角瓶中，玻璃珠震蕩打散。其中孢子懸浮液中的孢子濃度不低于IO7個/mL。3)米曲霉一級種子液的制備在2個IOOOmL三角瓶中加入粉碎后的煙葉粉末干基10g，加水157mL，12rC滅菌 20min,冷卻至30°C備用。接入米曲霉孢子懸浮液12mL，搖瓶160r/min，30°C培養2天，獲得米曲霉一級種子液。2.固態發酵在121°C滅菌20min的6個IL三角瓶中(棉塞同時滅菌)，分別加入煙梗粉末(干基)72g，煙葉粉末(干基)4g，煙末(干基)4g，加入70°C水80mL，攪拌均勻，保溫30min，冷卻至30°C后接入米曲霉一級液體種子，接種量為24mL。32°C發酵5天。3.酶解固態發酵結束后，通過吸塵器分離收集孢子。將發酵后的煙草原料浸泡于水中進行酶解，加水量是發酵后的物料(濕基)重量的1倍，在48°C的保溫條件下，浸泡并酶解 34h。二、固液分離發酵并酶解后的的煙草原料用攪拌器打成含纖維渣的漿液，通過壓濾分離出煙草纖維素和煙草浸出液，液體經2層濾紙抽濾后得到6X500mL，6X IOOmL液體留樣檢測， 6X400mL液體經濃縮得到6 X 160mL可溶性固形物含量為20%濃縮酶解液，用于后續的微生物轉化增香。
三、增香發酵1.啤酒酵母種子的制備(1)8%麥芽汁的制備取一份麥芽加入其四倍的水，在65°C水浴鍋中保溫3_4h，使其自行糖化直至糖化完全。糖化液用4-6層紗布過濾，根據要求將過濾液用水稀釋到麥芽汁中的可溶性固形物質含量為8%，調pH至6. 4，制備成8%麥芽汁。(2)煙草原料溶液的制備按照煙葉粉末煙末水=0. 5 0. 5 9(重量比)的配料比，在65°C的溫度下萃取30min，自然過濾，制得煙草原料溶液。(3)斜面培養基及斜面種子培養方法6%麥芽汁瓊脂培養基，將啤酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae Hansen，中國工業微生物菌種保藏管理中心(China Center of Industrial Culture Collection)編號為 31362)，劃線接種后，30°C培養 Mh，4°C冰箱保藏備用。(4)啤酒酵母液體種子培養基及培養方法種子培養基上述煙草原料溶液50mL，再加入等體積的8%的麥芽汁。一級種，500mL三角瓶中，加入種子培養基100mL，121°C滅菌20min，冷卻至30°C備用。接入斜面菌種1環，搖瓶150r/min，32°C培養Mh。酵母細胞數應達到IO8個/mL。二級種，以一級種為種子液，在10個IL三角瓶中各加入200mL培養基，分別接入液體種子10mL，搖瓶180r/min，31°C培養Mh，酵母細胞數應達到IO8個/mL。酵母菌經擴大培養后，轉移到滅菌后的離心管中，在無菌條件下離心，收集細胞沉淀，細胞沉淀在4°C冰箱低溫保存備用。2.發酵采用懸浮細胞轉化法在500mL三角瓶中，加煙草濃縮酶解液IOOmL,其可溶性固形物含量為20%，再加入IOg啤酒酵母濕細胞沉淀，攪拌勻成細胞懸浮液，進行微生物轉化。轉化溫度為30°C，轉化時間為3. 5小時。3.分離轉化后待細胞自然沉降，收集增香后發酵液。4.再次發酵向步驟3分離獲得的啤酒酵母泥(啤酒酵母濕細胞沉淀)中再加入新鮮的濃縮酶解液100mL。如此循環7次繼續進行增香發酵。5.發酵液合并將不同批次的增香發酵液合并，制備得到煙草浸出液。實施例4兩步液態微生物發酵法(一次性投料)一、酶解發酵1.黃孢原毛平革菌種子液的制備1)斜面培養黃孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium，中國工業微生物菌種保藏管理中心(China Center of Industrial Culture Collection)編號為 40719)劃線接種于PDA 試管斜面，30°C培養5天，4°C冰箱保存。
2)孢子懸浮液的制備在黃孢原毛平革菌試管斜面中加入事先滅菌的無菌水，用接種鏟將孢子刮下，轉移到已滅菌的三角瓶中，玻璃珠震蕩打散。其中孢子懸浮液中的孢子濃度不低于IO7個/mL。3)黃孢原毛平革菌一級種子液的制備在3個1000m L三角瓶中加入粉碎后的煙葉粉末干基10g，加水150mL，121°C滅菌 20min。冷卻至30°C備用。接入黃孢原毛平革菌孢子懸浮液15mL，搖瓶160r/min，32°C培養 3天，獲得黃孢原毛平革菌一級種子液。2.液態發酵及酶解在121°C滅菌20min的IL三角瓶中(棉塞同時滅菌)，加入混合的煙草原料作為發酵培養基，其配料(36 60目，干基計)為煙梗粉末18g，煙葉粉末lg，煙末lg。加入 ^0mL70°C水，保溫30min，接入一級液體種子40mL。搖瓶160r/min，33°C發酵4天，得煙草發酵酶解液。液態發酵平行樣共6個。二、固液分離煙草發酵液用4層紗布粗過濾后，得到不溶性固形物與液體，液體經抽濾后得到 210mL液體濃縮得到IOOmL可溶性固形物含量為8%的濃縮酶解液，用于后續的微生物轉化增香。三、增香發酵1.面包酵母種子的制備(1)8%麥芽汁的制備取一份麥芽加入其四倍的水，在65°C水浴鍋中保溫3_4h，使其自行糖化直至糖化完全。糖化液用4-6層紗布過濾，根據要求將過濾液用水稀釋到麥芽汁中的可溶性固形物質含量為8%，調pH至6. 4，制備成8%麥芽汁。(2)煙草原料溶液的制備按照煙葉粉末煙末水=0.5 0.5 9(重量比)的配料比，在70°C的溫度下萃取30min，自然過濾，制得煙草原料溶液。(3)斜面培養基及斜面種子培養方法6%麥芽汁瓊脂培養基，將面包酵母 (Saccharomyces cerevisiae，中國工業微生物菌種保藏管理中心(China Center of Industrial Culture Collection)編號為 30326)劃線接種后，30°C培養 Mh，4°C冰箱保藏(4)面包酵母液體種子培養基及培養方法種子培養基上述煙草原料溶液50mL，再加入等體積的8%的麥芽汁。一級種，500mL三角瓶中，加入種子培養基100mL，121°C滅菌20min。冷卻至30°C 備用。接入斜面菌種1環，搖瓶1501~/1^11，301培養對11。二級種，以一級種為種子液，在10個IL搖瓶200mL培養基中分別接入液體種子 IOmL(接種量為5% )，搖瓶150r/min，3(TC培養Mh，酵母細胞數應達到IO7個/mL。酵母菌經擴大培養后，轉移到滅菌后的離心管中，在無菌條件下離心，收集細胞沉淀。4°C冰箱低溫保存備用。2.發酵懸浮細胞轉化法在IOOmL可溶性固形物含量為8%的煙草濃縮酶解液加入20g濕細胞沉淀，制備成懸浮液，置于500mL三角瓶中，進行微生物轉化。轉化溫度為30°C，轉化時間為0. 5小時。3.分離細胞自然沉降后，倒出增香后發酵液體并收集增香后發酵液。4.再次發酵向步驟3分離獲得的面包酵母泥(面包酵母濕細胞沉淀)中，再加入新鮮的濃縮酶解液IOOmL,如此循環5次，繼續進行增香發酵。5.發酵液合并不同批次的增香發酵液合并成本專利所述的發酵煙草浸出液。實施例5兩步液態微生物發酵法(補料分批發酵)一、酶解發酵1.木霉種子液的制備1)斜面培養木霉劃線接種于PDA試管斜面，30°C培養5天，4°C冰箱保存。2)孢子懸浮液的制備在木霉試管斜面中加入事先滅菌的無菌水，用接種鏟將孢子刮下，轉移到已滅菌的三角瓶中，玻璃珠震蕩打散。其中孢子懸浮液中的孢子濃度不低于IO7個/mL。3)木霉一級種子液的制備G個三角瓶)在IOOOmL三角瓶中加入粉碎后的煙葉粉末干基10g，加水150mL，12rC滅菌 20min。冷卻至30°C備用。接入木霉孢子懸浮液10mL，搖瓶160r/min，30°C培養3天，獲得木霉一級種子液。2.液態發酵及酶解在121°C滅菌20min的IL三角瓶中(棉塞同時滅菌)，加入煙梗粉末、煙葉粉末和煙末(均為干基)各15g、1.5g和1.58，加入701水2161^。冷卻至30°C后接入一級液體種子40mL。搖瓶160r/min，3(TC發酵2天。在瓶內加入上述煙梗粉末7. 5g(預先加15mL 水浸潤)，30°C再發酵2天。再在瓶內加入上述煙梗粉末4. 5g(預先加9mL水浸潤)，30°C 再發酵6天，得到煙草發酵液。表1液態發酵分批加料量及加水量
權利要求
1.一種制備煙草浸出液的兩步微生物發酵法，具體步驟為(1)酶解發酵酶解型微生物對煙草原料的微生物發酵及酶解；(2)固液分離除去酶解產物中的不溶性固形物質，取酶解液進行濃縮，獲得濃縮酶解液；(3)增香發酵增香型微生物對濃縮酶解液進行微生物發酵，獲得煙草浸出液。
2.如權利要求1所述的兩步微生物發酵法，其特征在于，所述煙草原料選自煙梗、煙葉和煙末中的一種或多種。
3.如權利要求2所述的兩步微生物發酵法，其特征在于，所述煙草原料經粉碎、過篩處理，且處理后的煙草原料粒徑為大于等于60目，小于等于36目。
4.如權利要求1-3所述的兩步微生物發酵法，其特征在于，步驟(1)的酶解發酵步驟為A.酶解型微生物的菌種活化，利用煙草原料制備的種子培養基逐級擴大培養酶解型微生物種子；B.采用固態或液態發酵法，將步驟A制備的酶解型微生物種子接種于煙草原料制備的發酵培養基中，在適宜條件下進行發酵和煙草原料的酶解，獲得酶解產物。
5.如權利要求4所述的兩步微生物發酵法，其特征在于，所述酶解型微生物為黑曲霉、 米曲霉、黃孢原毛平革菌或木霉中任一。
6.如權利要求4所述的兩步微生物發酵法，其特征在于，步驟A中所述種子培養基是由煙草原料加水配置而成，其中煙草原料干基的重量百分比為6-8%。
7.如權利要求4所述的兩步微生物發酵法，其特征在于，步驟B所述的發酵培養基干基由煙葉粉末、煙末和煙梗粉末的干基組成，且三者的質量比為0.5 0.5 9。
8.如權利要求4所述的兩步微生物發酵法，其特征在于，步驟B所述的固態發酵法發酵培養基的料水比為發酵培養基干基質量水質量=10 9 12 ；所述液態發酵法發酵培養基的料水比為發酵培養基干基質量水質量=1 8 14。
9.如權利要求4所述的兩步微生物發酵法，其特征在于，步驟B所述的液態發酵法采用分批發酵法或補料分批發酵法。
10.如權利要求4所述的兩步微生物發酵法，其特征在于，步驟B固態發酵法發酵結束后，分離除去發酵產生的大量酶解型微生物的孢子，向發酵培養基中加入培養基濕基重量 1 3倍的水進行酶解，酶解條件為45 50°C，酶解16 34h。
11.如權利要求4所述的兩步微生物發酵法，其特征在于，步驟B液態發酵法發酵培養條件為溫度30 33°C，培養4 6天。
12.如權利要求1所述的兩步微生物發酵法，其特征在于，步驟( 所述濃縮酶解液中可溶性固形物質含量的質量百分比為8 50%。
13.如權利要求1-3所述的兩步微生物發酵法，其特征在于，步驟(3)的增香發酵步驟為a.種子的制備增香型微生物菌種活化，利用煙草原料制備的種子培養基逐級擴大培養增香型微生物種子，收集細胞沉淀；b.發酵增香型微生物在適宜條件下對濃縮酶解液的生物轉化；c.分離發酵結束后，分離增香型微生物菌體與發酵液，收集增香后的發酵液；d.再次發酵向分離的增香型微生物菌體中加入新鮮煙草濃縮酶解液，重復步驟b和c 的操作；e.發酵液合并不同批次增香后的發酵液合并得到煙草浸出液。
14.如權利要求13所述的兩步微生物發酵法，其特征在于，所述增香型微生物為酵母菌。
15.如權利要求13所述的兩步微生物發酵法，其特征在于，步驟a的種子培養基由麥芽汁和煙草原料溶液配制而成。
16.如權利要求13所述的兩步微生物發酵法，其特征在于，步驟a的增香型微生物種子的要求為種子液中增香型微生物細胞數達到IO7 IO8個/mL。
17.如權利要求13所述的兩步微生物發酵法，其特征在于，步驟b的發酵是向所述濃縮酶解液中加入增香型微生物濕細胞沉淀，制備成細胞懸液后進行生物轉化，且增香型微生物濕細胞沉淀在酶解濃縮液中的質量百分比為5 25%。
18.如權利要求17所述的兩步微生物發酵法，其特征在于，步驟b增香微生物的轉化時間為0. 5 6h。
19.如權利要求13所述的兩步微生物發酵法，其特征在于，步驟d是向增香型微生物濕細胞沉淀中再次加入新鮮的濃縮酶解液進行發酵、分離，循環5 10次。
20.一種煙草薄片，其特征在于，所述煙草薄片中添加了權利要求1所述兩步微生物發酵法制備的煙草浸出液。
全文摘要
本發明涉及煙草加工技術領域，具體公開了一種制備煙草浸出液的兩步微生物發酵法以及添加了該煙草浸出液的煙草薄片。兩步微生物發酵法為酶解型微生物對煙草原料進行微生物發酵及酶解；除去酶解產物中的不溶性固形物質，取酶解液進行濃縮，獲得濃縮酶解液；增香型微生物對濃縮酶解液進行微生物發酵，獲得煙草浸出液。本發明的制備方法以煙梗和煙葉等煙草原料為原材料，通過微生物酶解和微生物增香兩步微生物發酵處理，將煙草原料中的大分子物質降解成易溶于水的小分子物質，得到含大量水溶性組分的、高質量的煙草浸出液，該兩步微生物發酵法所制備的煙草浸出液比現有的造紙法煙草浸出液水溶性低分子量物質的總收率要高，綜合質量更好。
文檔編號A24B15/20GK102440432SQ20111026795
公開日2012年5月9日 申請日期2011年9月8日 優先權日2011年9月8日
發明者于興偉, 張晨, 施林燕, 湯朝起, 盛科, 許贛榮 申請人:上海煙草集團有限責任公司, 江南大學