專利名稱：：一種用于煙草發酵的發酵劑及應用的制作方法
技術領域：
：本發明涉及用于煙草發酵的發酵劑配方及應用，特別涉及一種能夠利用煙草廢次物或煙草生產天然煙用香料及用于煙葉發酵的發酵劑。
背景技術：
：在煙草制品中，煙草的香氣和吸味是至關重要的，吸煙與健康也一直是人們關注的熱點。隨著巻煙中焦油和煙堿的含量的不斷降;f氏，這往往會導致巻煙煙味不足和香味減弱。因此，在降低焦油和煙堿的前提下，如何彌補香味的損失和提高煙氣香味質量是煙草行業的重要任務。目前，巻煙工業中使用的香料有化學合成和天然香料，后者多為香料植物的精油或浸膏類物質。我國煙草中添加的煙用香料大多是采用傳統的方法配制的，即以天然提取物單體和合成單體混合調配而成，這樣所制得的煙用香料雖然生產操作簡單，但存在香氣單調、對煙草改善性不足，容易被模仿，而且改善巻煙抽吸品質效果不明顯等缺點。利用微生物發酵、酶解等生物技術制備的煙用香料以其安全性，香氣自然豐富等特點，正逐漸成為近年來研究的熱點。Inglixy(1999)報道用枯草桿菌(B.sutills)的三個菌和芽孢桿菌(B.sp)另一種的一個菌株，采用單獨接種或混合接種于貯藏期煙葉，煙葉香氣明顯提高。Wentiligy(1999)等人研究發現，酵母菌(Yeast)有些菌株接種至烤煙儲藏期煙葉上，3d后可誘發煙葉產生誘人的香氣。微生物在增殖過程中可產生龐大的高活性酶系，在酶促作用、化學作用及微生物體內復雜代謝的協同作用下形成醇類、醛類、酮類、酸類、酯類、酚類、呋喃類、吡嗪類、吡啶類和萜烯類等香味物質。朱大恒等以煙末、秸桿、頂芽、腋芽和豆粕為原料，接種煙葉上分離的產香菌，經發酵、萃取、濃縮得煙草生物香料，可用于中高檔巻煙加香。不同的微生物組成、不同的發酵原料可制備不同風格的天然煙用香料。因此，利用適宜的微生物發酵制備高品質的煙用香料，具有誘人的市場前景。煙葉發酵是指煙葉通過烘烤(或晾曬)后經過自然發酵或人工發酵達到吸食品質明顯增強的一個過程。自然發酵后的煙葉品質改善較大，效果好，但時間長，發酵成本高。人工發酵可大大縮短發酵時間，但發酵后煙草品質改善效果不如自然發酵。越來越多的研究表明，微生物在煙草發酵過程中起重要作用。國內外煙草工作者在煙草微生物分離和利用微生物發酵改善煙草品質、改進煙葉發酵進程、縮短煙葉發酵周期等方面做了較多工作，特別是通過施加微生物制劑于煙葉中增加煙草吃味、提高煙草質量等研究。Koller最早在雪茄煙中接種酵母菌，可大大加快發酵進程，使發酵更為徹底，但同時也會促進細菌和霉菌的生長。韓錦峰等將分離篩選到的幾株優勢菌混合配制成生物制劑，噴灑于復烤后未發酵烤煙煙葉上，可加速烤煙發酵，提高發酵煙葉品質。謝和等從烤煙上分離一株枯草芽孢桿菌，將其噴酒于煙葉上發酵，發酵后的煙葉青雜氣基本消除，刺激性降低。邱立友等從烤煙煙葉表面分離選出3株菌株接種于煙葉表面進行人工發酵，加快發酵過程中煙葉內物質的分離與轉化，提高煙葉品質是有利的。周瑾等將從烤煙葉上分離篩選得到的微生物菌懸液接種于低次烤煙碎片上，發酵后的煙葉可溶性還原糖含量明顯降低，有機酸成分增多。雷麗萍等選用4個自選菌株在白肋煙晾制初期噴灑在煙草表面，結果表明，菌劑對煙葉化學成分和評吸品質均有影響。上述研究表明微生物制劑組成對改善煙葉整體品質的影響較大。而目前微生物制劑的作用效果較單一，在煙葉大分子化合物消耗、改善吸食品質方面有較大的突破而香氣改善不大，較少存在一種在改善煙葉吸食品質縮短發酵時間的同時，提高香氣，降低雜氣提高煙葉品質的微生物制劑。'
發明內容為解決現有技術不足，本發明旨在提供一種利用煙草廢次物或煙葉發酵制備天然煙用香料及用于煙葉發酵，縮短發酵時間、提高煙葉品質的發酵劑。本發明的目的在于發酵劑在煙用香料制備中的應用，并提供發酵劑在煙葉發酵中的應用。為達到本發明的目的，本發明提供的用于煙草發酵的發酵劑，其特征在于包含枯草芽孢桿菌、乳酸菌、酵母菌，其活菌數比例為1050:230:230。本發明發現，利用自然發酵的煙葉表面優勢菌株枯草芽孢桿菌與產香菌株乳酸菌、酵母菌三種菌株組成的發酵劑應用到煙草發酵上，具有明顯改善煙葉質量、提高香氣的特點。以三菌株活菌數之比為1050:230:230。優選活菌數之比為2040:1030:1030。其中乳酸菌可為保加利亞乳桿菌、德氏乳酸桿菌、瑞士乳桿菌、植物乳桿菌、干酪乳桿菌、嗜酸乳桿菌、乳酸乳球菌、乳酸鏈球菌、丁二酮乳酸鏈球菌、乳酪鏈球菌、嗜熱鏈球菌和腸膜狀明串珠菌中的一種或多種。酵母菌為生香酵母或釀酒酵母。上述用于煙用香料及煙草發酵的發酵劑的制備分別將菌株在各自適宜的液體培養基中培養至對數生長期晚期，直接離心后收集菌泥，按三株菌活菌數的比例混合菌泥，加入保護劑進行冷凍干燥制得粉末狀發酵劑。本發明還提供上述發酵劑在天然煙用香料及煙葉發酵上的應用。(1)在制備天然煙用香料的應用。由煙草廢料、煙草組成的單一或混合基質經粉碎加水、滅菌后，加入0.1-5%上述的發酵劑，15-60'C下發酵1-30d。發酵醪經萃取濃縮后即得天然煙用香料成品。-上述煙草廢料包括煙葉碎片、煙絲、煙梗、廢煙渣，煙草包括烤煙、香料煙、白肋煙、馬里蘭煙。一般完全以煙草廢料為原料較經濟，也可根據需要加入少許糧食作物及一些具有特色香氣的植物原料。原料配置好后，在加入發酵劑之前或同時加入一些酶制劑，如纖維素酶、蛋白酶、j定粉酶或果膠酶，可加速發酵和提高原料的利用率。'發酵醪經以水或水與乙醇的混合物為溶劑萃取，將萃取液濃縮，用醇沉淀，除去沉淀物，蒸發回收醇得膏狀煙用香料成品或經萃取后直接濃縮得膏狀煙用香料；或用石油醚、乙酸乙酯等脂溶性溶劑萃取發酵醪，將萃取液濃縮得流體狀煙用香料成品。(2)在煙葉發酵的應用將上述發酵劑用無菌水混勻后，按0.05-5%噴霧在經烘烤(或晾曬)后的煙葉上或發酵過程中的煙葉上，打包后在自然或15—6(TC，相對濕度40%—70%的恒溫恒濕條件下醇化ld730d。煙葉可以為任意需發酵醇化的煙葉品種，如烤煙、香料煙、白肋煙、馬里蘭煙。本發明的發酵劑由自然醇化煙葉表面上的優勢菌及產香菌組成，對煙葉人工發酵及煙葉自然發酵均有明顯的增質、增香的效果，能明顯縮短發酵時間。本發明具有如下優點本發明提供的發酵劑由自然發酵煙葉上的優勢菌株及產香菌株組成，能直接發酵煙草廢次物或煙草制備天然煙用香料，使用方便，所制備的煙用香料用于巻煙中可明顯增加香氣、降低雜氣、降低刺激性、煙氣綿長順暢。同時應用到煙葉發酵中能明顯縮短煙葉醇化時間，經發酵劑處理的煙葉香氣增加，雜氣降低及消除，吸食品質提高。具體實施例方式以下通過實施例更詳細的介紹本發明的實施。但是本發明并不僅僅局限于這些實施例，這些實施例不以任何方式限制本發明的范圍。實施例1將枯草芽孢桿菌(購自山東輕工業學院，菌種編號1007)接種至牛肉膏蛋白胨培養基，經充分活化后培養至對數生長期晚期。培養液經離心后棄去上清液收集菌泥，加入10%離心前培養液體積的18%蔗糖溶液作保護劑，冷凍干燥至粉狀即得發酵劑1。將100g煙葉碎片粉碎至100目，加入4倍煙葉重量的水，混合后9(TC滅菌30min，冷卻后加入2%煙葉重量的發酵劑1，3(TC恒溫箱中發酵4d，發酵醪加入6倍煙葉重量的水回流萃取1.5h，萃取液經減壓濃縮得天然煙用香料l。實施例2將德氏乳桿菌(購自山東輕工業學院，菌種編號1026)在MRS培養基中充分活化后培養至對數生長期晚期。培養液經離心后棄去上清液收集菌泥，加入10%離心前培養液體積的18%蔗糖溶液作保護劑，冷凍干燥至粉狀即得發酵劑2。按實施例1制備天然煙用香料的方法加入發酵劑2制得天然煙用香料2。實施例3將生香酵母(購自山東輕工業學院，菌種編號2041)在麥芽汁培養基中充分活化后培養至對數生長期晚期。培養液經離心后棄去上清液收集菌泥，加入10%離心前培養液體積的l挑蔗糖溶液作保護劑冷凍干燥至粉狀即得發酵劑3。按實施例1制備天然煙用香料的方法加入發酵劑3制得天然煙用香料3。實施例4按實施例1、2的方法分別制備枯草芽孢桿菌、德氏乳桿菌的菌泥。按兩株菌活菌數之比為50:30混合菌泥，加入10%離心前總培養液體積的18%蔗糖溶液作保護劑，冷凍干燥至粉狀即得發酵劑4。按實施例1制備天然煙用香料的方法加入發酵劑4制得天然煙用香料4。實施例5按實施例1、3的方法分別制備枯草芽孢桿菌、生香酵母的菌泥。按兩株菌活菌數之比為50:30混合菌泥，加入10%離心前總培養液體積的18%蔗糖溶液作保護劑，冷凍干燥至粉狀即得發酵劑5。按實施例1制備天然煙用香料的方法加入發酵劑5制得天然煙用香料5。實施例6按實施例2、3的方法分別制備德氏乳桿菌、生香酵母的菌泥。按兩株菌活菌數之比為30:30混合菌泥，加入10%離心前總培養液體積的18%蔗糖溶液作保護劑，冷凍干燥至粉狀即得發酵劑6。按實施例1制備天然煙用香料的方法加入發酵劑6制得天然煙用香料6。''實施例7按實施例1、2、3的方法分別制備枯草芽孢桿菌、德氏乳桿菌、生香酵母菌泥，按三株菌活菌數之比為50:2:2混合菌泥，加入10%離心前總培養液體積的18%蔗糖溶液作保護劑，冷凍干燥至粉狀即得發酵劑7。按實施例1制備天然煙用香料的方法加入發酵劑7制得天然煙用香料7。實施例8按實施例l、2、3所述方法分別制備枯草芽孢桿菌〗德氏乳桿菌、生香酵母的菌泥，按活菌數之比為50:10:10混合菌泥，加入10%離心前總培養液體積的18%蔗糖溶液作保護劑，冷凍干燥至粉狀即得發酵劑8。按實施例l制備天然煙用香料的方法加入發酵劑8制得天然煙用香料8。實施例9按實施例l、2、3所述方法分別制備枯草芽孢桿菌、德氏乳桿菌、生香酵母的菌泥，按活菌數之比為50:30:30混合菌泥，加入10%離心前總培養液體積的l鄉蔗糖溶液作保護劑，冷凍干燥至粉狀即得發酵劑9。按實施例l制備天然煙用香料的方法加入發酵劑9制得天然煙用香料9。實施例10按實施例l、2、3所述方法分別制備枯草芽孢桿菌、干酪乳桿菌(購自山東輕工業學院，菌株編號1022)、釀酒酵母(購自山東輕工業學院，菌株編號2029)的菌泥。按活菌數之比為40:30:30混合菌泥，加入10%離心前總培養液體積的18%蔗糖溶液作保護劑，冷凍干燥至粉狀即得發酵劑10。按實施例1制備天然煙用香料的方法加入發酵劑10得天然煙用香料10。實施例11按實施例l、2、3所述方法分別制備枯草芽孢桿菌、植物乳桿菌(購自山東輕工業學院，菌株編號1023)、釀酒酵母(購自山東輕工業學院，菌株編號2029)的菌泥，按活菌數之比為40:30:30混合菌泥，加入10%離心前總培養液體積的18%蔗糖溶液作保護劑，冷凍干燥至粉狀即得發酵劑10。加入10%離心前總培養液體積的18%蔗糖溶液作保護劑加入發酵劑10得天然煙用香料10。實施例12按實施例1所述方法分別制備枯草芽孢桿菌的菌泥。按實施例2所述的方法分別制備丁二酮乳鏈球菌(菌種編號為ATCC13675)、腸膜明串珠球菌(菌株編號為ATCC19254)的菌泥。按實施例3所述的方法制備生香酵母的菌泥。按活菌數之比為40:15:15:30混合上述菌泥，加入'10%離心前總培養液體積的18%蔗糖溶液作保護劑，冷凍干燥至粉狀即得發酵劑12。按實施例1制備天然煙用香料的方法加入發酵劑12制得天然煙用香料12。實施例13按實施例1所述方法分別制備枯草芽孢桿菌的菌泥。按實施例2所述的方法分別制備植物乳桿菌(購自山東輕工業學院，菌株編號1023)、丁二酮乳鏈球菌(菌種編號為ATCC13675)、腸膜明串珠球菌(菌株編號為ATCC19254)的菌泥。按實施例3所述的方法制備釀酒酵母的菌泥。按活菌數之比為40:10:10:10:30混合上述菌泥，加入10%離心前總培養液體積的18%蔗糖溶液作保護劑，冷凍干燥至粉狀即得發酵劑13。按實施例1制備天然煙用香料的方法加入發酵劑13制得天然煙用香料13。實施例14按實施例l、2、3所述方法分別制備枯草芽孢桿菌、丁二酮乳鏈球菌(菌種編號為ATCC13675)、腸膜明串珠球菌(菌株編號為ATCC19254)、釀酒酵母(購自山東輕工業學院)的菌泥，按活菌數之比為40:15:15:30混合菌泥，加入10%離心前總培養液體積的18%蔗糖溶液作保護劑，，冷凍干燥至粉狀即得發酵劑14。按實施例1的方法加入發酵劑14制得天然煙用香料14。實施例15按實施例1所述方法分別制備枯草芽孢桿菌的菌泥。按實施例2所述方法制備保加利亞乳桿菌(購自山東輕工業學院，菌株編號1021)菌泥，按實施例3制備釀酒酵母的菌泥。按活菌數之比為30:15:20混合菌泥，加入10%離心前總培養液體積的18%蔗糖溶液作保護劑，冷凍干燥至粉狀即得發酵劑14。將煙葉碎片、煙梗、廢煙渣、薯粉干燥后粉碎至IOO目，加入8份煙葉重量的水，混合后9(TC滅菌30min后冷卻，按原料重量加入2%發酵劑15，30°C恒溫箱中發酵3d，發酵醪加入6份煙葉重量的水回流萃取1.5h，萃取液減壓濃縮得膏狀天然煙用香料15。按煙絲重量的0.2%分別稱取實施例1-15制備的天然煙用香料1-15號樣品，加水溶解，噴加到煙絲上，在80'C下烘干，控制煙絲含水率為12%左右(用手感覺)打成煙支，放入恒溫恒濕箱(溫度:25'C，相對^度:6(F。)平衡水分48h注豐富性根據添加的保潤劑或香料單體經燃吸后對巻煙香氣特性的影響程度，分為變差、不明顯、變好。，香氣質巻煙香氣的質越好分值越高，香氣的質越差分值越低。香氣質分為五由12位專家評吸。以原料未經發酵制得的浸膏為對照，評級結果如表l所示。表l天然煙用香料l-7號樣品評吸結果樣品^12345678910111213<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>個檔次l即為差，2為較差，3為中等，4為較好，5為好。香氣量巻煙香氣的量越足分值越高，香氣的量越少分值越低。香氣量分為五個檔次l即為少，2為較少，3為中等，4為較足，5為充足。透發性巻煙香氣越透發分值越高，香氣越沉悶分值越低。香氣的透發性分為五個檔次l為沉悶，2為較沉悶，3為中等，4為較透發，5為透發。細膩柔和程度巻煙煙氣越細膩柔和分值越高，煙氣越粗糙分值越低。煙氣細膩柔和程度分為五個檔次l為粗糙，2為較粗糙，3為中等，4為較細膩柔和，5為細膩柔和。剌激程度巻煙的刺激性越小分值越高，刺激性越大分值越低。剌激性程度分為五個檔次l為大，2為較大，3為中等，4為較小，5為小。由表l可以看出，經枯草芽孢桿菌、乳酸菌、酵母菌單獨發酵制得的煙草香料加香評吸與未發理處理制得的浸膏相比，香氣變化不明顯，刺激性和雜氣改善效果不明顯。以上述三種菌株兩兩混合發酵制得的煙草香料與未發酵處理的浸膏相比，香氣、刺激性、雜氣稍有改善。以上述三株菌活菌數1050:230:230比例混合發酵制備的煙草香料與未發酵處理的浸膏相比，香氣豐富、質優，雜氣、刺激性改善效果較好。以三菌株活菌數之比2040:1030:1030發酵制備的煙草香料經評吸香氣豐富、質優，煙氣細膩，雜氣、刺激性改善效果最佳。實施例15分別取lg實施例1-10制備的發酵劑1-10，用50mL無菌水混勻后，分別均勻噴霧至1000g同一等級皖南BTFF打葉復烤煙葉并編號為B1-B10,打包放入倉庫之中進行自然醇化。180天后取出經發酵劑處理的樣品Bl-B10與未處理自然醇化樣品(對照)，分別切絲巻制樣品煙，在相對濕度為60%條件下平衡水分24小時，進行感官評吸。評級結果如表2所示，經發酵劑8、9、10處理的煙葉樣品品質較好，以發酵劑IO處理樣品的品質最佳，表現為香氣豐富、質優，煙氣細膩，刺激性、雜氣降低，煙葉品質提高。表2發酵劑處理煙葉樣品B1-B10與對照評吸結果<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>實施例16取烤煙打葉復烤煙葉1000g，取lg實施例10制備的發酵劑10，用50mL無菌水混勻后，均勻噴霧至烤煙葉上，然后打包并放入倉庫之中進行自然醇化。12個月后取出經發酵劑處理的樣品與未處理自然醇化2年的同一等級樣品，分別切絲巻制樣品煙，在相對濕度為60%條件下平衡水分24小時，進行感官評吸。評吸結果表明發酵劑處理的樣品煙氣品質優于對照，表現為香氣豐富，煙氣細膩，刺激性和雜氣消除。實施例17取晾曬后的白肋煙葉1000g，取lg實施例10制備fej發酵劑10，用50mL無菌水混勻后，均勻噴霧至煙葉上，然后打包并放入倉庫之中進行自然醇化。8個月后取出經發酵劑處理的樣品與未處理自然醇化2年的同一等級樣品，分別切絲巻制樣品煙，在相對濕度為60%條件下平衡水分24小時，進行感官評吸。評吸結果表明經發酵劑處理的樣品煙氣品質明顯優于對照，表現為香氣濃郁，吸味醇和，刺激性和雜氣消除。實施例18取自然醇化3個月的烤煙葉1000g，取0.5g實施例10制備的發酵劑10，用50mL無菌水混勻后，均勻噴霧至煙葉中，繼續醇化，8個月后取出加入發酵劑的煙葉樣品與未處理自然醇化2年的同一等級樣品進行對照，分別切絲制樣品煙，在相對濕度為60%，溫度25'C條件下平衡水^;24小時，進行感官評吸。評吸結果表明發酵劑處理的樣品煙氣品質優于對照，表現為煙氣醇和，刺激性和雜氣明顯降低。實施例19取烤煙打葉復烤煙葉1000g，取lg實施例10制備的發酵劑10，用50mL無菌水混勻后，均勻噴霧至烤煙葉上，然后打包并放入恒溫恒濕室中，45°C、相對濕度609TF醇化8d取出，以同一等級煙葉樣品未經發酵劑處理，相同條件下人工發酵15d作為對照。分別切絲巻制樣品煙，在相對濕度為60%條件下平衡水分24小時，進行感官評吸。評吸結果表明發酵劑處理的樣品煙氣品質優于對照，表現為香氣變好，刺激性和雜氣降低。權利要求1、一種用于煙草發酵的發酵劑，其特征在于包含枯草芽孢桿菌、乳酸菌、酵母菌；枯草芽孢桿菌、乳酸菌和酵母菌的活菌數比例為10～502～302～30。2、根據權利要求1所述的用于煙草發酵的發酵劑，其特征在于所述包含枯草芽孢桿菌、乳酸菌和酵母菌的活菌數比例為2040:1030:1030。3、根據權利要求1或2所述的用于煙草發酵的發酵劑，其特征在于所述的乳酸菌為保加利亞乳桿菌、德氏乳酸桿菌、瑞士乳桿菌、植物乳桿菌、干酪乳桿菌、嗜酸乳桿菌、乳酸乳球菌、乳酸鏈球菌、丁二酮乳酸鏈球菌、乳酪鏈球菌、嗜熱鏈球菌和腸膜狀明串珠菌中的一種或多種。4、根據權利要求1或2所述的用于煙草發酵的發酵劑，其特征在于所述的酵母菌為生香酵母和/或釀酒酵母。.5、權利要求1或2所述的發酵劑在煙用香料制備中的應用，其特征在于由煙草廢料和/或煙草組成的單一或混合基質，經粉碎后加入基質0.5-20倍重量的水，滅菌后，加入O.1_5%基質重量的權利要求1或2所述的發酵劑，15-60'C下發酵l-30d，發酵醪經萃取濃縮后即得天然煙用香料成品。6、根據權利要求5所述的發酵劑在煙用香料中的應用，其特征在于所述的煙草廢料為煙葉碎片、煙絲、煙梗或廢煙渣。7、根據權利要求5所述的發酵劑在煙用香料中的應用，其特征在于所述的煙草為烤煙、香料煙、白肋煙或馬里蘭煙。8、權利要求1或2所述的發酵劑在煙葉發酵中的應用，其特征在于稱取煙葉重量0.01%-5%權利要求1或2所述的發酵劑，加入1%-10%煙葉重量的無菌水混均后，噴霧于煙葉表面，打包后在自然或15—6(TC，相對濕度40%—70%的恒溫恒濕條件下醇化ld730d。9、根據權利要求8所述的發酵劑在煙葉發酵中的應用，其特征在于所述的煙葉為經烘烤、晾曬后的或發酵過程中的烤煙、香料煙、白肋煙或馬里蘭煙。全文摘要本發明公開了一種用于煙草發酵的發酵劑及其應用。該發酵劑特征在于包含枯草芽孢桿菌、乳酸菌、酵母菌三種菌株，其活菌數之比為10～50∶2～30∶2～30。該發酵劑可發酵煙草廢料或煙草生產天然煙用香料及用于煙葉發酵。利用本發明發酵劑制備的天然煙用香料香氣醇和，用于卷煙中可明顯增加香氣、降低雜氣、降低刺激性、煙氣綿長順暢。本發明發酵劑用于煙葉發酵可明顯縮短醇化時間、改善煙葉品質。文檔編號A24B3/18GK101416778SQ20081021964公開日2009年4月29日申請日期2008年11月30日優先權日2008年11月30日發明者于鐵妹,博楊,王小寧,王永華申請人:華南理工大學