專利名稱：一種以節桿菌as－2菌株制備的生物制劑及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種以節桿菌AS-2菌株制備的生物制劑及其應用，屬微生物技術領域。
背景技術：
煙草作為人們吸食的一種嗜好品，煙堿在燃燒過程中揮發使煙氣呈堿性而產生刺激性氣味，刺激性對煙葉質量有負面效應。煙堿含量的高低對煙草產品的質量起著相當重要的作用，煙葉煙堿含量的高低直接影響到品質的好壞，但不同類型煙葉的煙堿含量均有一個適中的指標。煙堿含量增加，對煙葉質量產生負面影響，這就是高品質煙葉需要化學成分協調的原因之一。
好的烤煙上部葉在現代混合型卷煙和低焦油烤煙型卷煙葉組配方中起著主導作用，對卷煙香味及其風格具有很大貢獻，在國際市場上十分暢銷。相比之下，那些質量水平不高、風格不突出或不利工業降本增效的上部煙葉，對煙草工商業永遠都沒有吸引力。人們也已經看到，在WTO和WHO的影響下，烤煙上部葉將大有用武之地。上部煙葉在可用性上存在的問題首要問題是煙葉煙堿含量過高。因此降低煙葉煙堿含量，有助于提高上部煙葉的可用性、提高吸食安全性、提高國內煙葉的市場競爭能力有重要意義。
不同類型煙草、同一類型煙草不同土壤和施肥、灌溉條件等栽培技術水平對煙葉煙堿的影響不同，煙堿含量也隨葉片著生部位的變化而變化，葉位由下而上煙堿含量逐步提高。目前降低煙堿的途徑為1.調整煙草生長的環境條件，應用有效的綜合農業措施如適量施用氮磷肥、增加鉀肥的使用量、用石灰和適當使用餅肥，調節pH值、按煙株生長發育規律澆水、適時移栽、依據實際情況，適時打頂、適當留葉、應用生長調節劑、適熟采收，優化調制條件和利用陳化及發酵等來綜合降低煙堿含量，該方法存在年度間降煙堿效果不穩定、操作環節過多、農戶分散不易操作等缺點。2.在卷煙中通過提高過濾效率，稀釋煙氣等，這些措施雖然可以任意調節煙氣中煙堿，但往往沒有合適的選擇性，使消費者難以接受。3.利用陳化和發酵降解煙堿以及利用微生物降解倉儲期煙葉煙堿已有報道，已經報道能夠降低煙堿的微生物包括Alcaligenes paradoxus爭論產堿菌，Arthrobacter globiformils球形節桿菌，Arthrobacter nicotianae煙草節桿菌，Arthrobacter nicotinovoran噬煙堿節桿菌，Arthrobacter oxydans氧化節桿菌，Bac illus megaterium巨大芽孢桿菌，Bacillus mycoides蕈狀芽孢桿菌，Bacilluspumilus短小芽孢桿菌，Bacillus subtilis枯草芽孢桿菌，Cellulomonas sp.纖維單胞菌，Corynebacterium sp.棒桿菌屬，Enterobacter cloacae陰溝腸桿菌，Micrococcusnicotianae煙草微球菌，Pseudomonas sp.假單胞桿菌，Pseudomonas nicotianae煙草假單胞菌，Pseudomonas putida惡臭假單胞桿菌，Deharyomyces nicotianae，Cunninghamella echinulata刺孢小克汗霉菌，Pellicularia filamentosa絲核薄膜草菌，yeast酵母。但該措施難以解決菌株的使用時期、施用后煙葉水分含量提高容易引起煙葉霉變等問題，工廠中一直沒有采用。隨著人們對煙氣中有害成分的日益關注，降低煙堿的同時香味仍能為消費者接受，是煙草業多年來面臨的技術難題。
發明內容
本發明的目的是基于微生物代謝產物降解煙堿的機理，研究和發現了一種可以降解煙葉煙堿，提高煙葉品質的節桿菌AS-2菌株，采用該菌株經過試管種培養、菌種搖床擴大培養、種子罐、發酵罐液體發酵后，制備成一種能降低煙草煙堿含量但并不影響煙葉感官質量的生物制劑。
本發明的生物制劑，由生產菌株經液體發酵生產方法制備。其中1、生產菌株為節桿菌(Arthrobacter sp.)AS-2，該菌株已保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC NO.1282、保藏日為2004年12月28日；該菌株在牛肉膏蛋白胨培養基上形成乳白色菌落，G+，好氧，不形成芽孢，接觸酶陽性，不分解纖維素，認為該菌株屬于節桿菌屬。
節桿菌(Arthrobacter sp.)AS-2系本發明人于2004年發現的一個菌株。該菌株從云南玉溪采集煙田土樣，經過常規的系列稀釋涂布于NA培養基上分離得到，該菌株經常規的體外煙堿測定，發現能夠顯著降低煙堿的含量，使含煙堿的培養基由白色變為藍色。
2、液體發酵生產制備生物制劑的過程為菌劑的制備(1)試管培養采用NA培養基，將該菌種接種在試管斜面培養基上，28℃C培養1-2天。
(2)搖瓶培養采用NA液體培養基，將上述試管中培養菌接種在灌裝液體培養基的錐形瓶中，于搖床30℃振蕩培養1-2天。
液體發酵生產過程包括試管種培養、菌種搖床擴大培養、種子罐、發酵罐液體發酵制備生物制劑；其中a.試管種培養為將Arthrobacter sp.AS-2的菌體接種到試管固體培養基斜面上，培養基配方為1000毫升蒸餾水中添加牛肉膏3g，酵母浸膏1g，蛋白胨5g，葡萄糖10g，控制pH6.8-7.2，在28-30℃下培養1-2天，獲得試管種；b.菌種搖床擴大培養為將斜面種子接種到三角瓶液體培養基中，培養基配方為1000毫升蒸餾水中添加牛肉膏3g，酵母浸膏1g，蛋白胨5g，葡萄糖10g，控制pH6.8-7.2，在28-30℃、轉速200-300rpm的搖床培養16-20小時；c.液體種子罐發酵為將搖床擴大的菌種按0.5-2％的比例接種于不同容量的發酵罐中，培養基配方為搖床擴大培養的培養基配方，培養溫度為28-30℃，培養時間為16-20小時；d.液體發酵罐制備生物制劑為將經種子罐發酵逐級擴大的菌種按1-3％的比例接種于不同容量的發酵罐中，培養基配方為菌種搖床擴大培養的培養基配方，培養溫度為28-30℃，pH7.0-7.2，培養時間為24-48小時，當發酵液中細菌數量達到7.0×108個/ml時，得到生物制劑。
本發明的優點在于1.發酵周期短，節約能源、生產成本低；2.微生物來自煙田土壤，對植物和人畜無害，易生產、耐儲存，易于產業化開發，可操作性強；3.能降堿增香，提高煙草的品質，且降煙堿效果并不影響煙葉感官質量。
具體實施例方式實施例1(用于烤煙煙葉)本發明的生物制劑，由生產菌株(Arthrobacter sp.)AS-2菌株，按液體發酵生產方法制備。具體制備過程及條件與發明內容描述部分相同。
本發明的生物制劑的應用將成熟好的煙葉按部位(中、上部)采收，進入烤房前用本發明的生物制劑按5％的量(生物制劑在稀釋液中的含量)均勻噴淋在煙葉的中、上部，然后編桿入爐，按常規方法烘烤。烘烤后的煙葉經測定表明，本發明的生物制對上部煙葉的煙堿降解率達31.68％，對中部煙葉的煙堿降解率達33.86％。
烤煙煙葉感官質量評吸結果表明，采用本發明的生物制劑處理后，煙葉勁頭明顯下降，香氣量明顯提高，香氣質有所改善，刺激性明顯減弱，雜氣明顯減輕(枯焦氣、粉雜氣)，口感好于對照。
實施例2(用于白肋煙煙葉)本發明的生物制劑，由生產菌株(Arthrobacter sp.)AS-2菌株，按液體發酵生產方法制備。具體制備過程及條件與發明內容描述部分相同。
本發明的生物制劑的應用將砍收好的煙株進入晾房，晾制一周后，用本發明的生物制劑按5％的量(生物制劑在稀釋液中的含量)均勻噴淋在白肋煙上、中、下部位，按常規方法晾制。晾制后的白肋煙經測定表明，本發明的生物制劑對上部白肋煙葉的煙堿降解率達43.56％、對中部白肋煙葉的煙堿降解率達50.22％，對下部白肋煙葉的煙堿降解率達53.02％。
白肋煙煙葉感官質量評吸結果表明，采用本發明的生物制劑處理后，煙葉勁頭明顯下降，香氣量明顯提高，香氣質有所改善，刺激性明顯減弱，感官評吸質量好于CK對照。
權利要求
1.一種以節桿菌AS-2菌株制備的生物制劑，由生產菌株按液體發酵生產方法制備，其特征在于該生物制劑的生產菌株為節桿菌(Arthrobacter sp.)AS-2菌株，該菌株已保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC NO.1282；液體發酵生產制備生物制劑的過程為(1).液體發酵生產過程包括試管種培養、菌種搖床擴大培養、種子罐發酵、發酵罐液體發酵制備生物制劑；其中a.試管種培養為將Arthrobacter sp.AS-2的菌體接種到試管固體培養基斜面上，培養基配方為1000毫升蒸餾水中添加牛肉膏3g，酵母浸膏1g，蛋白胨5g，葡萄糖10g，控制pH6.8-7.2，在28-30℃下培養1-2天，獲得試管種；b.菌種搖床擴大培養為將斜面菌種接種到三角瓶液體培養基中，培養基配方為1000毫升蒸餾水中添加牛肉膏3g，酵母浸膏1g，蛋白胨5g，葡萄糖10g，控制pH6.8-7.2，在28-30℃、轉速200-300rpm的搖床培養16-20小時；c.液體種子罐發酵為將搖床擴大的菌種按0.5-2％的比例接種于不同容量的發酵罐中，培養基配方為搖床擴大培養的培養基配方，培養溫度為28-30℃，培養時間為16-20小時；d.液體發酵罐制備生物制劑為將經種子罐發酵逐級擴大的菌種按1-3％的比例接種于不同容量的發酵罐中，培養基配方為菌種搖床擴大培養的培養基配方，培養溫度為28-30℃，pH7.0-7.2，培養時間為24-48小時，當發酵液中細菌數量達到7.0×108個/ml時，得到生物制劑。
2.權利要求1所述的以節桿菌AS-2菌株制備的生物制劑，用于煙草降堿增香、提高煙草的品質。
全文摘要
本發明涉及一種以節桿菌AS－2菌株制備的生物制劑及其應用，屬微生物技術領域。本生物制劑的生產菌株為節桿菌(Arthrobacter sp.)AS－2菌株，該菌株已保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC NO.1282；該生物制劑由試管種培養、菌種搖床擴大培養、種子罐、發酵罐液體發酵工序制備。菌種接種量為0.5－2％，采用的培養基配方為(W/V)牛肉膏0.3％，酵母浸膏0.1％，蛋白胨0.5％，葡萄糖1.0％，pH6.8－7.2。控制發酵溫度在28－30℃，pH7.0－7.2，種子罐發酵為16－20小時，發酵罐發酵時間為24－48小時，當發酵液中細菌數量達到7.0×10
文檔編號A24B15/00GK1654633SQ20041007965
公開日2005年8月17日 申請日期2004年12月30日 優先權日2004年12月30日
發明者李梅云, 雷麗萍, 崔國民, 高家合, 鄧建華, 楊樹軍, 李云華 申請人:云南省煙草科學研究所