蘆薈干細胞凍干粉及其制備方法和應用

蘆薈干細胞凍干粉及其制備方法和應用
【專利摘要】本發明涉及一種蘆薈干細胞凍干粉的制備方法，包括以下步驟：從蘆薈中獲取含有形成層的組織；將所述含有形成層的組織置于固體培養基中培養后，分離出蘆薈干細胞；再將所述蘆薈干細胞置于植物干細胞培養基中進行體外培養，獲得擴增后的蘆薈干細胞；所述擴增后的蘆薈干細胞經冷凍破碎后濃縮，收獲蘆薈干細胞提取物；將所述蘆薈干細胞提取物與甘露醇混合后，除菌、凍干后，收獲蘆薈干細胞凍干粉。通過從蘆薈莖尖中提取蘆薈干細胞，對蘆薈干細胞進行放大培養后，提取蘆薈干細胞提取物，之后進行凍干處理獲得蘆薈干細胞，通過該方法制備蘆薈干細胞凍干粉周期較短，產率較高，凍干方法簡單易行，提取效率較高，具有較高的使用價值。
【專利說明】
蘆薈干細胞凍干粉及其制備方法和應用
技術領域
[0001] 本發明涉及生物技術領域，特別涉及一種蘆薈干細胞凍干粉及其制備方法和應 用。
【背景技術】
[0002] 植物干細胞(plant stem cell)是未分化的細胞，具有很強的自我更新和持續分 裂能力。植物干細胞培養技術，是在傳統組培技術的基礎上，以植物干細胞為目標，誘導、分 離和培養外植體，建立相應的干細胞培養體系植物干細胞培養技術，不僅豐富了植物培養 技術，而且為天然產物的商業化生產，乃至植物生物技術的發展，提供了新的研究方向和契 機。
[0003] 蘆薈是一種多年生的肉質草本植物，屬百合科蘆薈屬，傳統上作為瀉藥使用，近年 來，也在化妝品和食品行業中得到了廣泛的應用。隨著研究的深入，蘆薈的抗氧化能力、抑 菌、消炎、抗腫瘤、免疫調節和輔助治療糖尿病的作用也相繼被報道出來。蘆薈中的蘆薈素 A、創傷激素和聚糖肽甘露等具有抗病毒感染、促進傷口愈合復原的作用，又可以消炎殺菌、 吸熱消腫、軟化皮膚、保持細胞活力，凝膠多糖與愈傷酸聯合還具有愈合創傷活性的功效。 因此，提供一種能夠快速制備活性成分含量較高且適合醫用的蘆薈干細胞制品十分必要。

【發明內容】

[0004] 有鑒于此，本發明要解決的技術問題在于提供一種蘆薈干細胞凍干粉及其制備方 法。
[0005] 本發明解決其技術問題所采用的技術方案是：一種蘆薈干細胞凍干粉的制備方 法，包括以下步驟：
[0006] 從蘆薈中獲取含有形成層的組織；
[0007] 將所述含有形成層的組織置于固體培養基中培養后，分離出蘆薈干細胞；
[0008] 再將所述蘆薈干細胞置于植物干細胞培養基中進行體外培養，獲得擴增后的蘆薈 干細胞；
[0009] 所述擴增后的蘆薈干細胞經冷凍破碎后濃縮，收獲蘆薈干細胞提取物；
[0010] 將所述蘆薈干細胞提取物與甘露醇混合后，除菌、凍干后，收獲蘆薈干細胞凍干 粉。
[0011] 在本發明提供的蘆薈干細胞凍干粉的制備方法中，所述凍干步驟之前，
[0012] 還需調整所述蘆薈干細胞提取物中的蛋白質濃度至30~70μg/ml。
[0013] 在本發明提供的蘆薈干細胞凍干粉的制備方法中，所述凍干條件為:溫度_20°C ~-35°C，真空度50~200Pa，凍干時間為36~48小時。
[0014] 在本發明提供的蘆薈干細胞凍干粉的制備方法中，所述冷凍破碎過程為:將所述 擴增后的蘆薈干細胞放入-50~_100°C低溫環境下冷凍2~3小時，然后取出解凍，重復3~5 次。
[0015] 在本發明提供的蘆薈干細胞凍干粉的制備方法中，所述植物干細胞培養基包括無 機鹽、維生素、氨基酸、生長素、糖類和瓊脂。
[0016] 在本發明提供的蘆薈干細胞凍干粉的制備方法中，所述固體培養基包括無機鹽、 維生素、氨基酸、生長素、糖類和活性炭。
[0017] 在本發明提供的蘆薈干細胞凍干粉的制備方法中，所述體外培養過程是在恒溫培 養搖床中培養7~14天后，再轉移至生物反應器中進行大規模培養。
[0018] 在本發明提供的蘆薈干細胞凍干粉的制備方法中，所述體外培養的條件為溫度為 30°C~37°C，每小時光照5~lOmin。
[0019] 本發明進一步保護上述蘆薈干細胞凍干粉的制備方法所獲得的蘆薈干細胞凍干 粉。
[0020] 本發明進一步保護上述蘆薈干細胞凍干粉在制備食品、藥品、保健品或化妝品中 的應用。
[0021] 實施本發明提供的蘆薈干細胞提取物及其的制備方法，可以達到以下有益效果： 通過從蘆薈莖尖中提取蘆薈干細胞，對蘆薈干細胞進行放大培養后，提取蘆薈干細胞提取 物，之后進行凍干處理獲得蘆薈干細胞，通過該方法制備蘆薈干細胞凍干粉周期較短，產率 較高，凍干方法簡單易行，提取效率較高，且凍干粉中所含有的蘆薈活性成分較高，特別是 蘆薈苷，具有較高的醫學使用價值。
【具體實施方式】
[0022] 本發明提供的蘆薈干細胞凍干粉的制備方法，包括以下步驟：
[0023] S1、從蘆薈中獲取含有形成層的組織；
[0024] S2、將步驟S1中獲得的含有形成層的組織置于固體培養基中進行培養后，分離出 蘆薈干細胞；
[0025] S3、將步驟S2中獲得的蘆薈干細胞置于植物干細胞培養基中進行體外培養，獲得 擴增后的蘆薈干細胞；
[0026] 其中，所述植物干細胞培養基包括無機鹽、維生素、氨基酸、生長素、糖類和瓊脂。 其中，無機鹽包括<&(：1 2、1(11屮〇4、謂03、]\%3〇4、順4勵3、(：113〇4*511 20等;糖類為蔗糖或乳糖等； 優選地，植物干細胞培養基中，生長素的濃度為0.5~1.5mg/L、蔗糖或乳糖的質量分數為2 ~5 %，瓊脂的濃度為5.5~7.5g/L;植物干細胞培養基為MS培養基。
[0027] S4、步驟S3獲得的擴增后蘆薈干細胞經冷凍破碎后濃縮，收獲蘆薈干細胞提取物；
[0028] S5、將步驟S4中獲得的蘆薈干細胞提取物與甘露醇混合后，除菌，凍干，即獲得蘆 薈干細胞凍干粉。
[0029] 步驟S1中，由于蘆薈莖尖中含有大量的具有自我更新能力又能產生具有持續分裂 能力的干細胞，因此，本發明中優先采用從蘆薈莖尖中獲取蘆薈干細胞。含有形成層的組織 的獲取過程，包括以下步驟：
[0030] 取蘆薈莖尖，沖洗15~20分鐘，酒精消毒，再用升汞液消毒10~20分鐘后，無菌水 沖洗數次，剝離獲取形成層的組織。
[0031] 步驟S2中，固體培養基包括無機鹽、維生素、氨基酸、生長素、糖類和活性炭;其中， 無機鹽包括:〇&(：12、10^〇4、謂0 3、]\%3〇4、順4勵3、〇13〇4.51120等;糖類為蔗糖或乳糖等。優選 地，固體培養基為MS培養基;且生長素的濃度為0.5~1.5mg/L、蔗糖或乳糖的質量分數為2 ~5 % ;更為優選地，固體培養基中還包括萘乙酸和芐氨基腺嘌呤，萘乙酸的濃度為0.5~ 1.5mg/L，芐氨基腺嘌呤的濃度為0.5~1.5mg/L。
[0032] 進一步地，該步驟中，將含有形成層的組織置于固體培養基中進行培養的條件為： 培養溫度為23~29 °C，光照10~12小時，光照強度1500~20001x，PH值為5.6~5.9,培養7~ 14天。
[0033] 進一步地，含有形成層的組織經固體培養基培養培養后獲得生長良好的形成層干 細胞團，還需要采用酶解法分離出蘆薈干細胞。本發明優先采用質量分數為0.2-0.3%纖維 素酶溶液和質量分數為0.2-0.3%果膠酶溶液對形成層干細胞團進行酶解8~12小時。
[0034] 步驟S3中，體外培養蘆薈干細胞的過程是在恒溫培養搖床中進行的，搖床轉速為 100轉/分鐘~120轉/分鐘，溫度為30°C~37°C，每小時光照5~lOmin，培養時間為7天~14 天后，得到單細胞懸液。然后將單細胞懸液轉移至生物反應器進行大規模培養，在生物反應 器中培養第4~7天時，加入新鮮的植物干細胞培養基，繼續培養后收獲擴增后的蘆薈干細 胞。
[0035] 步驟S4中，將步驟S3中獲得的擴增后的蘆薈干細胞放入-50~-100°C低溫環境下 冷凍2~3小時，然后取出解凍，重復3~5次，最后一次解凍后用超聲波破碎儀破碎細胞，收 集濾液，真空蒸發濃度，即獲得蘆薈干細胞提取物。
[0036] 步驟S5中，在對蘆薈干細胞提取物進行凍干之前，還需要調整蘆薈干細胞提取物 中的蛋白質濃度，使得蛋白質濃度為30~70μg/ml，降低蛋白質濃度。
[0037] 進一步地，甘露醇在蘆薈干細胞提取物中的質量分數為4~6 %，蘆薈干細胞提取 物的凍干條件為:溫度_20°C~_35°C，真空度50~200Pa，凍干時間為36~48小時。
[0038] 本發明進一步保護上述方法所獲得的蘆薈干細胞凍干粉在制備食品、藥品、保健 品或化妝品中的應用。
[0039]為了使本發明的目的、技術方案及優點更加清楚明白，以下結合實施例，對本發明 進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅用以解釋本發明，并不用于限 定本發明。
[0040] 實施例1
[0041 ]本實施例中，蘆薈干細胞凍干粉的制備方法，包括以下步驟：
[0042] S1、從蘆薈中獲取含有形成層的組織；
[0043]選擇無化肥農藥污染、綠色有機種植的蘆薈，并選取生長狀況較佳的蘆薈莖尖，用 無菌水沖洗蘆薈莖尖表面附著物15~20分鐘，再用75%的酒精進行表面消毒30秒，然后，用 〇. 1 %的升汞液消毒10~20分鐘，最后用無菌水反復沖洗5次，洗去植物表面的升汞殘液;將 滅菌后的蘆薈莖尖切成5_X 5_大小，用接種刀剝離出含有形成層的組織。
[0044] S2、將含有形成層的組織置于固體培養基中進行培養，分離出蘆薈干細胞；
[0045] 將步驟S1中剝離出的含有形成層的組織接種至固體培養基中，以每lg組織接種 5cm2固體培養基的密度進行接種，培養后，形成層組織為均一生長的平板狀組織，而其他組 織則為不規則的聚集生長物；將再生的形成層組織與其他組織分離開，以每lg組織接種 5cm 2固體培養基的密度，將再生的形成層組織接種至新鮮的固體培養基中進行培養。其中， 固體培養基中還含有濃度為1 .Omg/L的萘乙酸和濃度為1 .Omg/L的芐氨基腺嘌呤，且固體培 養基為MS培養基，含有濃度為232mg/L的CaCl2、140mg/L的KH2P〇4、1642mg/L的KN0 3、 130.54mg/L的MgS〇4、1560mg/L的NH4N03、0.021mg/L的CuS〇4 ? 5H20、60mg/L的維生素C、、2mg/ L的甘氨酸、1. Omg/L的生長素、質量分數為3 %的蔗糖和活性炭;培養條件為:溫度26 °C，光 照11小時，光照強度為18001x，PH值為5.6~5.9，培養14天；即可收獲形成層組織來源的蘆 薈干細胞團；用質量分數為〇. 25%的果膠酶溶液和質量分數為0.25%的纖維素酶對蘆薈干 細胞團進行酶解12小時，分離出蘆薈干細胞。
[0046] S3、將蘆薈干細胞置于植物干細胞培養基中進行體外培養；
[0047] 將步驟S2中酶解后的蘆薈干細胞轉移至植物干細胞培養液中，并置于恒溫培養搖 床上培養。
[0048]其中，植物干細胞培養液為MS培養基，其中含有濃度為372mg/L的CaCl2、181mg/L 的KH2PO4、1790mg/L的KN〇3、173.54mg/L的MgSCk、1840mg/L的NH4N〇3、0.022mg/L的CuS〇4 ? 5H2〇、60mg/L的維生素C、1 ? 58mg/L的甘氨酸、1 ? 5mg/L的生長素、質量分數為3%的鹿糖和濃 度為6. Og/L的瓊脂等添加物;搖床的轉速為110轉/分鐘，培養溫度為34°C，每小時光照8分 鐘，培養第7天，加入新鮮的植物干細胞培養液至細胞密度為IX 107個/ml，然后繼續培養， 培養后用100目的不銹鋼篩網過濾，除去細胞團、殘渣等，得到蘆薈干細胞懸液；
[0049]然后，將蘆薈干細胞懸液轉移至20L生物反應器中進行大規模培養，生物反應器中 添加有5L的植物干細胞培養基，培養第7天時，加入10L的新鮮培養基，繼續培養后收獲細 胞。對照組培養在生物反應器中持續培養20天，中間不添加培養基。培養后收獲細胞，稱重。
[0052]步驟S4、蘆薈干細胞提取物的制備；
[0053] 收集步驟S3中獲得蘆薈干細胞懸液，用lum過濾器過濾，去掉培養基，收獲截留的 細胞;并將細胞放入-80 °C的超低溫冷凍2小時，然后取出解凍30分鐘，重復上述操作5次，最 后一次室溫解凍后，用超聲波破碎儀破碎細胞，過濾器過濾后，搜集濾液，于旋轉式真空蒸 發器內濃縮，即可獲得蘆薈干細胞提取物。
[0054] S5、蘆薈干細胞凍干粉的制備；
[0055] 采用BCA法對步驟S4中獲得的蘆薈干細胞提取物進行蛋白質濃度測定，根據該蛋 白質濃度，加入無菌蒸餾水調節至蛋白終濃度為50.0 ± 0.5iig/ml;再加入甘露醇，使得甘露 醇在蘆薈干細胞提取物中的質量分數為5%，然后，進行滅菌和凍干處理，凍干的溫度為-30 °C，真空度為150Pa，凍干時間為48小時，即可得到蘆薈干細胞凍干粉。
[0056] S6、蘆薈干細胞凍干粉質量鑒定；
[0057] 采用HPLC法測定蘆薈干細胞凍干粉中蘆薈苷的含量
[0058] 色譜條件色譜柱：1^(：111'〇8口61^18(25〇1]1111\4.61]1111，5_)流動相：乙腈-水（25:75); 流速：1 ? OmL ? min-1;柱溫:25 °C ;檢測波長:355nm;進樣量：10LL。
[0059] 將蘆薈凍干粉，以75%乙醇提取3次，合并提取液經旋轉蒸發、冷凍干燥后，以蒸餾 水溶解后，采用HPLC法測定多酚含量：
[0060] 蘆薈干細胞凍干粉中，蘆薈苷的含量為150.80mg/g;而直接從蘆薈萃取液中，蘆薈 苷的含量僅為32.35mg/g;由此可知，通過本發明提供的方法所獲得的蘆薈干細胞凍干粉 中，蘆薈苷的含量顯著增加。
[0061] 以上對本發明的實施例進行了描述，但是本發明并不局限于上述的具體實施方 式，上述的【具體實施方式】僅僅是示意性的，而不是限制性的，本領域的普通技術人員在本發 明的啟示下，在不脫離本發明宗旨和權利要求所保護的范圍情況下，還可做出很多形式，這 些均屬于本發明的保護之內。
【主權項】
1. 一種蘆薈干細胞凍干粉的制備方法，其特征在于，包括以下步驟： 從蘆薈中獲取含有形成層的組織； 將所述含有形成層的組織置于固體培養基中培養后，分離出蘆薈干細胞； 再將所述蘆薈干細胞置于植物干細胞培養基中進行體外培養，獲得擴增后的蘆薈干細 胞； 所述擴增后的蘆薈干細胞經冷凍破碎后濃縮，收獲蘆薈干細胞提取物； 將所述蘆薈干細胞提取物與甘露醇混合后，除菌、凍干后，收獲蘆薈干細胞凍干粉。2. 根據權利要求1所述的蘆薈干細胞凍干粉的制備方法，其特征在于，所述凍干步驟之 前，還需調整所述蘆薈干細胞提取物中的蛋白質濃度至30~70μg/ml。3. 根據權利要求2所述的蘆薈干細胞凍干粉的制備方法，其特征在于，所述凍干條件 為:溫度_20°C~_35°C，真空度50~200Pa，凍干時間為36~48小時。4. 根據權利要求3所述的蘆薈干細胞凍干粉的制備方法，其特征在于，所述冷凍破碎過 程為:將所述擴增后的蘆薈干細胞放入-50~_100°C低溫環境下冷凍2~3小時，然后取出解 凍，重復3~5次。5. 根據權利要求1所述的蘆薈干細胞凍干粉的制備方法，其特征在于，所述植物干細胞 培養基包括無機鹽、維生素、氨基酸、生長素、糖類和瓊脂。6. 根據權利要求1所述的蘆薈干細胞凍干粉的制備方法，其特征在于，所述固體培養基 包括無機鹽、維生素、氨基酸、生長素、糖類和活性炭。7. 根據權利要求1所述的蘆薈干細胞凍干粉的制備方法，其特征在于，所述體外培養過 程是在恒溫培養搖床中培養7~14天后，再轉移至生物反應器中進行大規模培養。8. 根據權利要求7所述的蘆薈干細胞凍干粉的制備方法，其特征在于，所述體外培養的 條件為溫度為30°C~37°C，每小時光照5~lOmin。9. 一種根據權利要求1~8任一項所述的蘆薈干細胞凍干粉的制備方法所獲得的蘆薈 干細胞凍干粉。10. 根據權利要求9所述的蘆薈干細胞凍干粉在制備食品、藥品、保健品或化妝品中的 應用。
【文檔編號】A61K36/886GK105852125SQ201610268493
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年4月27日
【發明人】曾憲卓, 張哲
【申請人】深圳愛生再生醫學科技有限公司