發明人意外發現，使用磷脂酶處理乳卵磷脂得到改善的乳液，即使在含有水解蛋 白質的組合物中也是如此。雖無意于受理論束縛，但據信磷脂酶處理使得乳卵磷脂轉化為 例如游離脂肪酸和/或溶血卵磷脂等的化合物，從而起到穩定乳液的作用。
[0052] 令人意外的是，濃度非常低的已轉化乳卵磷脂和使用的磷脂酶導致了乳液品質和 穩定性得到顯著改善。
[0053] 因此，在一個方面，本發明涉及制備含有水解蛋白質的蛋白質組合物的方法，所述 方法包括以下步驟：
[0054] a)提供配料混合物，所述配料混合物包含至少一種蛋白質和乳卵磷脂；
[0055] b)添加至少一種磷脂酶并且進行乳卵磷脂的轉化；以及
[0056] c)進行所述蛋白質的水解。
[0057] 在另一方面，本發明涉及能夠根據該方法獲得或根據該方法獲得的蛋白質組合 物。
[0058] 蛋白質水解
[0059] 蛋白質水解可在乳卵磷脂轉化之前進行、與乳卵磷脂轉化同時進行或者在乳卵磷 脂轉化之后進行。在一個實施方案中，蛋白質水解可在選自以下階段的至少一個階段進行： 加入至少一種磷脂酶之前、加入至少一種磷脂酶的同時，或者加入至少一種磷脂酶之后。在 一些實施方案中，進行不止一個蛋白質水解步驟。在本發明的方法的一個優選實施方案中， 磷脂酶步驟與蛋白質水解步驟同時進行。
[0060] 優選地，蛋白質水解通過酶法來進行。可施加任何蛋白水解酶或酶混合物，例如來 源于動物、植物或微生物的蛋白酶。在一個特別優選的實施方案中，使用胰蛋白酶、胰蛋白 酶樣內肽酶或含胰蛋白酶的級分來水解蛋白質。胰蛋白酶、胰蛋白酶樣內肽酶或含胰蛋白 酶的制劑可來源于植物、動物胰腺或來自微生物發酵。使用的微生物可（例如）是基因改 造的微生物。胰蛋白酶制劑通常包含不同比例的酶混合物，例如胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、 彈性蛋白、羧肽酶、淀粉酶、脂肪酶和磷脂酶。使用基因改造的微生物的蛋白水解制劑的應 用例子在W02012/042013中有所描述。
[0061] 胰蛋白酶或胰蛋白酶樣內肽酶可與一種或多種其他蛋白酶結合提供。
[0062] 因此，蛋白水解制劑可包含例如由任何微生物制得的胰蛋白酶樣內肽酶和/或胰 凝乳蛋白酶樣內肽酶。
[0063] 在一個實施方案中，胰蛋白酶樣內肽酶來自微生物，所述微生物選自鐮刀菌 (Fusar ium)，優選地尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum)，和/或選自庫茨涅爾氏菌屬 (Kutzneria)，優選地白色庫茨涅爾氏菌（Kutzneria albida);胰凝乳蛋白酶樣內肽酶來 自擬諾卡氏菌（Nocardiopsis)，優選地 Nocardiopsis Sp. EMBL CDS CAI94179,或來自 綠僵菌（Metarhizium)，優選地金龜子綠僵菌（Metarhizium anisopliae)，和/或來自 Brachysporiella，優選地 Brachysporiella gayana。
[0064] 在另外的實施方案中，根據本發明所述的方法中的蛋白質水解使用胰蛋白酶樣內 肽酶和胰凝乳蛋白酶樣內肽酶的混合物來進行，其中所述胰蛋白酶樣內肽酶來自尖孢鐮刀 菌或白色庫茨涅爾氏菌，所述胰凝乳蛋白酶樣內肽酶來自Nocardiopsis Sp.或金龜子綠僵 菌。
[0065] 乳卵磷脂的轉化與蛋白質水解同時進行使流程合理化。
[0066] 制備含有水解蛋白質的蛋白質組合物的方法的其他實施方案包括如下方法：其中 蛋白質水解在添加至少一種磷脂酶之前進行，和/或其中蛋白質水解在添加至少一種磷脂 酶之后進行。
[0067] 蛋白質水解產物在要用于制備（例如）低變應原性的營養產品例如低變應原性的 嬰兒配方產品的蛋白質組合物中是有用的。另外，由于水解蛋白質更易于消化和吸收，因此 期望在設計用于支持具有吸收障礙的個體健康的營養產品中包含蛋白質水解產物，所述吸 收障礙是由于與如胰腺或其他蛋白酶產生腺體之功能不足相關的腸道病癥導致的。又例 如，面臨代謝應激和代謝損傷問題的患者對營養物質和能量增加有顯著需求。
[0068] 然而，本發明還涉及方法、組合物和營養產品，其中所有或大部分蛋白質是完整蛋 白質。據設想，所述磷脂酶處理和乳卵磷脂轉化將支持和/或改善這些最終營養產品的乳 液穩定性。因此，在該實施方案中，所述方法包括提供含乳卵磷脂的配料和提供至少一種磷 脂酶的步驟。這樣形成的組合物可用于制備具有改善的乳液穩定性的營養產品。
[0069] 蛋白質可來自任何來源或來源的組合。例子包括植物蛋白，例如大豆、豌豆、稻中 的一種或多種，和/或動物蛋白，例如來自乳品，如乳清和/或奶。在一個優選的實施方案 中，所述蛋白質為例如選自酪蛋白和乳清蛋白（例如乳球蛋白和α-乳清蛋白）的一 種或多種乳蛋白。在一個特別優選的實施方案中，所述蛋白質以乳清的形式提供，所述乳清 可以是例如乳清蛋白濃縮物（WPC)或乳清蛋白級分（WPF)。WPC可定義為通常使用膜過濾 法制備的乳清蛋白富集產品，而乳清蛋白級分更多地涉及色譜分離富集產品或沉淀富集蛋 白質。乳清還可以液態乳清或干燥形式提供。
[0070] 本發明的一個實施方案涉及一種方法，所述方法包括以下步驟：將乳卵磷脂添加 到含有蛋白質水解產物的營養組合物中或添加到蛋白質水解產物中；添加至少一種磷脂 酶，使得乳卵磷脂被轉化，并且例如脂肪酸和溶血卵磷脂從乳卵磷脂中釋放出來，從而有助 于最終營養產品的乳液穩定性。
[0071] 卵磷脂
[0072] 卵磷脂是一個用于統指磷脂的術語。可存在于卵磷脂中的磷脂的例子包括磷脂酰 肌醇（PI)、磷脂酰-L-絲氨酸（PS)、磷脂酰乙醇胺（PE)、磷脂酰膽堿（PC)和鞘磷脂（SP)。 術語卵磷脂和磷脂在本文中可互換使用。
[0073] 卵磷脂存在于植物和動物中，并且卵磷脂的組成各不相同。在下表1中，對來自大 豆、雞蛋黃和牛乳的卵磷脂進行了比較。很明顯，卵磷脂中存在哪些磷脂，以及這些磷脂的 相對存在量都有區別。
[0074] 與其他卵磷脂相比，乳卵磷脂在組成方面有所不同，因為其包含大量濃度類似的 PE、PC、PS和SP。相比之下，蛋卵磷脂主要包含PC，而來自大豆的卵磷脂缺乏SP并且包含 濃度較高的PI和PA。
[0075] 因此，乳卵磷脂的結構組成與蛋卵磷脂和大豆卵磷脂的結構組成不同。由于這個 原因，來自不同來源的卵磷脂有不同的應用。
[0076] 繼而，磷脂酶作用于乳卵磷脂和作用于來自例如大豆或蛋的卵磷脂而生成的游離 脂肪酸和溶血卵磷脂不同。
[0077] 因此，不同來源的卵磷脂或其級分可提供不同功能。最佳濃度范圍根據卵磷脂類 型和應用的不同而不同。
[0078] 令人意外地，與添加了相對較多量的（如）大豆卵磷脂相比，少量磷脂酶處理的內 源乳卵磷脂實現了更好的乳液穩定性。
[0079] 轟1
[0081] PI =磷脂酰肌醇；PA =磷脂酸；；PS =磷脂酰-L-絲氨酸PE =磷脂酰乙醇胺；PC =磷脂酰膽堿；LPE =溶血磷脂酰乙醇胺；LPC =溶血磷脂酰膽堿；SP =鞘磷脂。其他=神 經酰胺（GluCer、LacCer)
[0082] 表1中的百分比是基于在最終液體配方產品中測得的水平。液體配方產品中應用 的大豆卵磷脂的濃度可最多至0. 5w/w%。這表示每100g配方中含約210mg磷脂。每100g 基于WPC的配方通常僅含有約34mg磷脂。
[0083] 在本發明的一個實施方案中，每100g配料混合物中存在的乳卵磷脂的量可在5mg 至500mg的范圍內，例如每100g中含10至100mg，優選地每100g配料混合物中含20至 IOOmg乳卵磷脂。一般來講，蛋白質水解的程度越高，所需乳卵磷脂的量越高。
[0084] ^ 2
[0086] LPC =溶血磷脂酰膽堿；LPE =溶血磷脂酰乙醇胺。
[0087] 表2描述未添加大豆卵磷脂或添加大豆卵磷脂的情況下，根據本發明所述的營養 產品中獲得的均化程度。令人意外的是，據發現，大豆卵磷脂的添加未能改善乳液品質。
[0088] 因此，本發明的一個實施方案涉及根據本發明的不含大豆卵磷脂的營養產品。在 本發明另外的實施方案中，唯一存在的乳化劑是轉化的乳卵磷脂。
[0089] 在本申請的情況下，術語"轉化的乳卵磷脂"是指磷脂酶作用于乳卵磷脂的產物， 包括游離脂肪酸、溶血磷脂、甘油二酯、磷脂酰化合物、磷酸甘油酯和剩余部分（例如膽 堿）。
[0090] 在該方法的一個優選實施方案中，在根據本發明的方法中提供的乳卵磷脂是內源 乳卵磷脂。術語內源乳卵磷脂意指該乳卵磷脂天然存在于配料混合物的配料中，例如乳清 蛋白濃縮物和/或例如奶、乳清、黃油、奶酪、奶油和酪乳等乳制品或它們的組合中。
[0091] 使用內源乳卵磷脂不再需要添加外源乳卵磷脂或者來自其他來源的真正外源卵 磷脂（例如大豆乳卵磷脂等）。這再一次避免了將潛在過敏原引入蛋白質水解產物和最終 的營養產品中。此外，該實施方案可使用與之前所用相同的基本生產線來實施，僅需少量改 變。
[0092] 乳清蛋白濃縮物是可提供內源乳卵磷脂的一種配料。
[0093] 這種WPC的一個例子是來自丹麥阿拉食品公司（Aria Foods (DK))的 Liacprodail# DI-87。類似產品還可得自例如Armor (法國）、Davisco (美國）、DMV (荷 蘭）、Glanbia(愛爾蘭）、Kerry (愛爾蘭）、Hilmar (美國）、Fonterra(新西蘭）。通常卵磷 脂濃度范圍為每100g約0. 3g至2g，蛋白質濃度范圍為25%至90%。
[0094] 有利地是，乳清蛋白濃縮物中天然存在的乳卵磷脂可保持穩定（valorized)，無須 添加非乳物質。
[0095] 因此，一個實施方案涉及根據本發明的方法，其中乳卵磷脂包含在乳清蛋白濃縮 物中，就是說，提供例如蛋白質等配料（例如提供乳清（如以WPC的形式提供）還提供乳卵 磷脂。
[0096] 磷脂酶
[0097] 本發明的發明人意外發現，向含有乳卵磷脂的組合物中添加磷脂酶將導致乳卵磷 脂的轉化以及游離脂肪酸和/或溶血磷脂等轉化產物的釋放，并且這會改善包含它們的最 終營養產品的乳液品質。
[0098] 至少一種磷脂酶作用于乳卵磷脂會生成游離脂肪酸和/或溶血卵磷脂。根據本 發明所述的磷脂酶可為選自磷脂酶A2(PLA2)、磷脂酶Al (PLAl)、磷脂酶B(PLB)、磷脂酶 C(PLC)和/或磷脂酶D(PLD)的一種或多種。
[0099] 磷脂酶PLAl和PLA2會從磷脂中釋放一個脂肪酸分子，PLAl在甘油的SNl位置處， 而PLA2在SN2位置處。磷脂酶B同時表現出PL