專利名稱：：改進的用于產生多肽的α因子信號肽的制作方法改進的用于產生多肽的a因子信號肽對序列表的涉及本發明包含計算機可讀形式的序列表。該計算機可讀形式通過引用并入。發明領域本發明涉及產生和分泌多肽的方法，還涉及包含編碼信號肽和所述多肽的第一和第二核苷酸序列的核酸構建體，以及包含所述核酸構建體的表達載體和宿主細胞。
背景技術：
：在真菌宿主細胞中，尤其是絲狀真菌細胞如曲霉屬(A^e/^〃^)或酵母細胞如酵母屬(Sacc/2aramyce力中重組產生異源蛋白可以為產生商業相關量的所述蛋白提供更理想的手段。異源蛋白的重組產生通常通過構建表達盒來實現，在所述表達盒中將編碼所述蛋白的DNA置于啟動子的表達調控下，所述啟動子自受調節的基因切下，適合于所述宿主細胞。將所述表達盒引入宿主細胞。然后通過在所述表達盒上包含的啟動子正確發揮功能所必需的誘導條件下培養經轉化的宿主細胞來實現所述異源蛋白的產生。改進蛋白質的重組產生通常需要可用的新調節序列，該調節序列適合于調控宿主細胞中所述蛋白質的表達。一種這樣的調節序列包括編碼酵母a因子信號肽的序列，其最先記載于Kurjan和Herskowitz(Cell,vol.30:933-943，1982)中。隨后證明了這種信號肽可以作為常規分泌信號應用，用于異源多肽在酵母中的產生(EPO116201Bl)。Allison和Young(MolecularandCellularBiology,1989,vol:9(11)p.4977-4985)描述了a因子信號序列中突變的作用。描述的所有突變均導致了cx因子降低至1/2-1/12。本發明的目的是提供改進的用于在真菌宿主細胞中產生多肽的方法，所述方法使用酵母a因子信號肽的衍生物。
發明內容本發明提供用于提高分泌性多肽的產生的方法，包括(a)在有益于所述多肽產生的培養基中培養真菌宿主細胞，其中所述宿主細胞包含核酸構建體，該核酸構建體包含編碼信號肽的第一核苷酸序列，其與編碼所述多肽的第二核香酸序列可操作地連接，其中所述第一核苷酸序列對于所述第二核苷酸序列是外源的，所述第一核苷酸序列的3'端在第二核苷酸序列的上游，并且所述第一核苦酸序列是選自編碼a因子信號肽的核苷酸序列，其中所述a因子信號肽具有至少一個在位置9對丙氨酸進^f亍的取代；和(b)從所述培養基分離所述分泌性多肽。在第二個方面，本發明涉及所述a因子信號肽的分離的變體，其中所述位置9的氨基酸，或通過與野生型序列比對確定的相應位置的氨基酸，經過修飾而包括一個選自下組的取代A9T、A9S、A9H、A9I、A9F和A9G。另外，本發明提供核酸構建體，其包含編碼信號肽的第一核苷酸序列，所述第一核苷酸序列與編碼多肽的第二核苷酸序列可操作地連接，其中所述第一核普酸序列對于所述第二核苷酸序列是外源的，并且所述第一核苷酸序列的3'端在第二核苷酸序列的上游，并且所述第一核苷酸序列選自編碼本發明的信號肽的核苷酸序列。本發明還提供包含所述核酸構建體的表達載體和宿主細胞。在最后的方面，本發明涉及改進的信號肽用于產生多肽的用途，其中所迷信號肽由第一核苦酸序列編碼，并且所述多肽由第二核苷酸序列編碼，所述第二核苷酸序列對于所述第一核苷酸序列是外源的，并且所述第一核苷酸序列的3'端在第二核苷酸序列的上游，并且其中所述第一核苷酸序列選自編碼a因子信號肽的核苦酸序列，其中所述a因子信號肽具有至少一個在位置9對丙氨酸進行的取代。發明詳述定義術語"變體"在本發明的上下文中當涉及另一種多肽或核苷酸序列使用時應該被理解為與另一種多肽相比包含一個或幾個氨基酸或核苷酸的取代、缺失和/或插入的多肽或核苷酸序列(即，它是與它進行比較的多肽/核苷酸序列的變體)。具體而言，所述改變可以是性質上較不重要的(ofminornature),如不顯著影響多肽活性的保守氨基酸取代，或就核苷酸序列而言導致保守氨基酸取代的取代；或小缺失，通常為1至約20個氨基酸，其依賴于進行改變的多肽的大小。在目前的情況下，所述信號肽僅19個氨基酸。因此小缺失的范圍是l-3個氨基酸。保守取代的實例是在以下組之內堿性氨基酸組(精氨酸、賴氨酸和組氨酸)、酸性氨基酸組(谷氨酸和天冬氨酸)、極性氨基酸組(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸組(亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸)、芳族氨基酸組(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)和小氨基酸組(甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸和曱硫氨酸)。通常不改變比活性(specificactivity)的氨基酸取代是本領域已知的，并且由例如H.Neurath和R.L.Hill,1979，In,TheProteins,AcademicPress,NewYork描述。最普遍發生的交換是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、A旨ro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu和Asp/Gly，以及這些的相反情況。所述第一核芬酸序列編碼本發明的信號肽。術語"信號肽"或"信號肽序列"在本文定義為通常存在于新合成的分泌性或膜多肽N末端的肽序列，該序列指導所述多肽跨過或進入細胞的細胞膜(原核生物的質膜和真核生物的內質網膜)。隨后通常將其去除。具體而言，所述信號肽可能能夠指導所述多肽進入細胞的分泌途徑。根據本發明的a因子信號肽是源于酵母的信號肽，并且在Kurjan和Herskowitz(Cell,vol.30:933-943)中有描述。野生型a因子氨基酸序列示于SEQIDNO:1。術語"可操作地連接"在本文定義為這樣一種構型，其中將調控序列例如信號肽序列適當地置于與編碼序列相關的位置，由此使所述調控序列指導由所述編碼序列編碼的多肽的產生。術語"編碼序列"在本文定義為當置于適當調控序列的控制下時翻譯成多肽的核苷酸序列。編碼序列的邊界通常由位于開讀框開始處(5，端)的起始密碼子和位于開讀框3'端的終止密碼子確定。編碼序列可以包括，但不限于，基因組DNA、cDNA、RNA、半合成、合成和重組核苷酸序列。兩個氨基酸序列之間的相關度由參數"同一性"描述。就本發明而言，兩個氨基酸序列的比對通過使用來自EMBOSS軟件包(http://emboss.org)2.8.0版的Needle程序來確定。Needle程序執行總體比對算法，所述算法描述于NeedlemanS,B.和WunschC.D.(1970)，J.Mol.Biol.48,443-453中。所使用的取代矩陣是BLOSUM62,缺口產生罰分(gapopeningpenalty)是10,并且在夾口延伸罰分(gapextensionpenalty)是0.5。本發明的氨基酸序列("本發明序列"，例如，SEQIDNO:2的氨基酸1至19)和不同的氨基酸序列("外源序列")之間的同一性程度，是以兩種序列的比對中精確匹配的數目除以"本發明序列"的長度或"外源序列，，的長度中最短的一個而計算的。結果以百分比同一性表示。當"本發明序列"和"外源序列"在重疊的相同位置中具有相同的氨基酸殘基時，出現精確匹配(在下文的比對實例中以T表示)。序列的長度是序列中氨基酸殘基的數目(例如，SEQIDNO:2的長度是19)。在下文純假設性的比對實例中，重疊是序列1的氨基酸序列"HTWGER-NL";或序列2的氨基酸序列"HGWGEDANL"。在該實例中，缺口用"表示。假設性比對實例序歹'j1:ACMSHTWGER-NLSEQ工DNO:15iIIIII序歹1！2:HGWGEDANLAMNPSSEQIDNO:16就本發明而言，兩個核苷酸序列之間的同一性程度通過Wilbur-Lipman方法(Wilbur和Lipman,1983,PraceW"gso/7V"加'o憩/^cacfe附;/o/;5W朋ce80:726-730)使用LASERGENEMEGALIGNtm軟件(DNASTAR,Inc.,Madison,WI)來確定，其中使用同一性表和以下多重比對參數缺口罰分為10,并且缺口長度罰分為10。配對比對參數是K元組(Ktuple)-l，缺口罰分=3,和窗口(windows)=20。在具體的實施方案中，多肽的氨基酸序列與或對于SEQIDNO:2的氨基酸1-19的同一性百分比通過如下確定，通過i)使用Needle程序比對所述兩個氨基酸序列，其中使用BLOSUM62取代矩陣，缺口產生罰分為10，并且缺口延伸罰分為0.5;ii)計數比對中的精確匹配數目；iii)用精確匹配的數目除以兩個氨基酸序列中較短者的長度，和iv)將iii)中除法的結果轉化成百分數。與或對于本發明其它序列(例如SEQIDNO:3的氨基酸l-19)的同一性百分比以類似方式計算。本發明的方法
技術領域：
：本發明涉及用于增加分泌性多肽產生的方法，包括(a)在有益于產生所述多肽的培養基中培養真菌宿主細胞，其中所述宿主細胞包含核酸構建體，該核酸構建體包含編碼信號肽的第一核苷酸序列，該序列與編碼所述多肽的第二核普酸序列可搡作地連接，其中所述第一核普酸序列對于第二核苷酸序列是外源的，所述第一核苷酸序列的3'端在第二核苷酸序列的上游，并且所述第一核苷Si序列選自編碼a因子信號肽的核苷酸序列，其中所述a因子信號肽具有至少一個在位置9對丙氨酸進行的取代；和(b)從培養基中分離所述分泌性多肽。在本發明的方法中，使用本領域已知的方法將真菌宿主細胞培養在有益于所述多肽產生的培養基中，即培養在適合于所述多肽產生的營養培養基中。例如，可以通過在合適培養基中和允許表達和/或分離所述多肽的條件下進行的搖瓶培養，或實驗室或工業發酵罐中的小規模或大規模發酵(包括連續、分批、補料分批或固態發酵)來培養細胞。使用本領域已知的方法，在包含碳源和氮源和無機鹽的合適營養培養基中進行培養。合適的培養基能夠從商業供應商獲得或可以根據公布的組成制備(例如，在美國典型培養物保藏中心的目錄中)。可以使用本領域已知的對于所述多肽是特異性的方法來檢測多肽。這些檢測方法可包括特異性抗體的使用、酶產物的形成或酶底物的消失。在本發明的方法中，當在相同的產生條件下培養時，相對于含有與編碼所述多肽的核苦酸序列可搡作地連接的天然信號肽序列的真菌細胞，所述真菌宿主細胞具體而言可以產生多至少約25%的多肽，更特別是多至少約50%，更特別是多至少約75%，更特別是多至少約100%,甚至更特別是多至少約200%,最特別是多至少約300%，甚至更特別是多至少約400%，甚至更特別是多至少約500%，并且甚至最特別是多至少約700%的多肽。所得分泌性多肽可以通過本領域已知的方法直接從培養基回收。例如，可以通過常規方法，包括但不限于，離心、過濾、提取、噴霧干燥、蒸發或沉淀從營養培養基回收多肽。所述多肽可以通過多種本領域已知的多種方法純化，所述方法包括但不限于層析(例如，離子交換、親和、疏水、層析聚焦和大小排阻)、電泳方法(例10如，制備型(preparative)等電聚焦)、差示溶解度(例如，硫酸銨沉淀)、SDS-PAGE或拔—耳又(參見，例如，ProteinPurification,J,C.JansonandLarsRyden，editors,VCHPublishers,NewYork,1989)。信號肽多肽編碼序列的5'端可以包含編碼信號肽的天然核苷酸序列，該序列與編碼多肽成熟形式(或前肽形式(pro-form))的核苷酸序列區段天然相連。本發明的信號肽可以取代所述天然信號肽。在本發明的方法中，所述信號肽序列對于編碼感興趣的多肽的核苷酸序列是外源的，但是所述信號肽序列或核苷酸序列對于真菌宿主細胞可以是天然的。在本上下文中，術語"外源的"應該理解為非所述多肽固有的信號肽，即，所述信號肽源自所述多肽之外的另一個基因。在一個實施方案中，所述第一核苷酸序列可以編碼改進的信號肽，所述改進的信號肽具有SEQIDNO:1的變體的氨基酸序列，并且能夠指導多肽進入或跨過細胞膜(下文的"同源信號肽")，例如進入細胞分泌途徑。SEQIDNO:1顯示了與來自酵母酉良酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的a因子連4妾(associated)的正常信號肽，如Kurjan和Herskowitz(Celvol.30:933-943,1982)中所述。在具體的方面，根據本發明的信號肽變體可以具有與SEQIDNO:1有一個氨基酸不同的氨基酸序列。具體而言，所述第一核苷酸序列可以編碼包含SEQIDNO:l的氨基酸序列的信號肽，或編碼該信號肽的能夠指導多肽進入或跨過細胞膜(例如進入細胞的分泌途徑)的片段，并且其中已經將位置9的丙氨酸(A9A)用另一種氨基酸取代。在更具體的方面，位置9的這種取代包括選自下組的取代A9T、A9S、A9H、A9I、A9F、A9E、A9G。這些具體的取代將導致表達至少2倍的改進(按照分泌產物測量)，在一些情況下觀察到高達8倍的改進。改進的水平將在某種程度上^^賴于由第二核苷酸序列編碼的感興趣的多肽，還依賴于宿主細胞。因此在具體的實施方案中，本發明涉及分離的信號肽，其選自下組(a)包含與SEQIDNO:2具有至少84%同一性，更優選至少89%同一性，更優選至少94%同一性的氨基酸序列的多肽，并且其中在對應于SEQIDNO:2位置9的位置中的T是保守的；和(b)變體，該變體保留指導多肽進入或跨過細胞膜的能力，所述變體包含對SEQIDNO:2的氨基酸在不同于位置9的位置的一個或幾個氨基酸的保守取代、缺失和/或插入。在另一個具體實施方案中，本發明涉及分離的信號肽，其選自下組(a)包含與SEQIDNO:3具有至少84%，更優選至少89%，更優選至少94%同一性的氨基酸序列的多肽，并且其中在對應于SEQIDNO:3位置9的位置中的S是保守的；和(b)變體，該變體保留指導多肽進入或跨過細胞膜的能力，所述變體包含對SEQIDNO:3的氨基酸在不同于位置9的位置的一個或幾個氨基酸的保守取代、缺失和/或插入。在另一個具體實施方案中，本發明涉及分離的信號肽，其選自下組(a)包含與SEQIDNO:4具有至少84%，更優選至少89。/。，更優選至少94%同一性的氨基酸序列的多肽，并且其中在對應于SEQIDNO:4位置9的位置中的H是保守的；和(b)變體，該變體保留指導多肽進入或跨過細胞膜的能力，所述變體包含對SEQIDNO:4的氨基酸在不同于位置9的位置的一個或幾個氨基酸的保守取代、缺失和/或插入。在另一個具體實施方案中，本發明涉及分離的信號肽，其選自下組(a)包含與SEQIDNO:5具有至少84%,更優選至少89%,更優選至少94%同一性的氨基酸序列的多肽，并且其中在對應于SEQIDNO:5位置9的位置中的I是保守的；和(b)變體，該變體保留指導多肽進入或跨過細胞膜的能力，所述變體包含對SEQIDNO:5的氨基酸在不同于位置9的位置的一個或幾個氨基酸的保守取代、缺失和/或插入。在另一個具體實施方案中，本發明涉及分離的信號肽，其選自下組(a)包含與SEQIDNO:6具有至少84%，更優選至少89。/。，更優選至少94%同一性的氨基酸序列的多肽，并且其中在對應于SEQIDNO:6位置9的位置中的F是保守的；和(b)變體，該變體保留指導多肽進入或跨過細胞膜的能力，所述變體包含對SEQIDNO:6的氨基酸在不同于位置9的位置的一個或幾個氨基酸的保守取代、缺失和/或插入。在另一個具體實施方案中，本發明涉及分離的信號肽，其選自下組(a)包含與SEQIDNO:7具有至少84%,更優選至少89%,更優選至少94%同一性的氨基酸序列的多肽，并且其中在對應于SEQIDNO:7位置9的位置中的E是保守的；和(b)變體，該變體保留指導多肽進入或跨過細胞膜的能力，所述變體包含對SEQIDNO:7的氨基酸在不同于位置9的位置的一個或幾個氨基酸的保守取代、缺失和/或插入。在另一個具體實施方案中，本發明涉及分離的信號肽，其選自下組(a)包含與SEQIDNO:8具有至少84%,更優選至少89%，更優選至少94%同一性的氨基酸序列的多肽，并且其中在對應于SEQIDNO:8位置9的位置中的G是保守的；和(b)變體，該變體保留指導多肽進入或跨過細胞膜的能力，所述變體包含對SEQIDNO:8的氨基酸在不同于位置9的位置的一個或幾個氨基酸的保守取代、缺失和/或插入。在具體的方面，本發明涉及如上所述與SEQIDNO:2、3、4、5、6、7或8有關的本發明的分離的信號肽，其具有這樣的氨基酸序列，該序列與SEQIDNO:2、3、4、5、6、7或8的氨基酸1-19具有至少84%,優選至少85%,更優選至少86%,更優選至少87°/。，更優選至少88%,更優選至少89%,甚至更優選至少90%,最偶選至少94%,最優選至少95%，最優選至少96%,最優選至少97%,并且甚至最優選至少98%的同一性程度，并且所述信號肽保留指導多肽進入或跨過細胞膜的能力。SEQIDNO:1的變體也包含片段，片段在本上下文中意指從這種氨基酸序列的氨基和/或羧基末端缺失了一個或多個氨基酸的多肽。具體而言片段包含至少10個氨基酸殘基，例如至少12個氨基酸殘基或至少13個氨基酸殘基或至少14個氨基酸殘基或至少15個氨基酸殘基或至少16個氨基酸殘基或至少17個氨基酸殘基，或至少18個氨基酸殘基。根據本發明的變體也可以是一個或多個氨基酸的取代或插入。在經修飾的a因子信號肽包含額外的取代、插入或缺失的情況下，這些額外的修飾不影響所述經修飾的a因子信號肽指導多肽進入或跨過細胞膜(例如進入細胞的分泌途徑)的能力。然而在SEQIDNO:1中位置9或對應于位置9的位置的特定修飾始終應該存在。當然，在經修飾信號肽中的實際位置將依賴于所述經修飾的信號肽相較于野生型的長度，并且可以通過比對所述經修飾的信號與野生型信號得到。多肽本發明的第二核苷酸序列編碼感興趣的多肽。所述多肽對于產生它的真菌宿主細胞可以是天然的或異源的。術語"多肽"在本文不意指特定長度的編碼產物，并且因此包含肽、寡肽和蛋白質。蛋白質可以是成熟形式或前肽(pro-peptide)的形式。術語"異源多肽'，在本文定義為非所述真菌細胞固有的多肽，進行過修飾而改變了天然序列的天然多肽，或通過重組DNA技術操作編碼所述多肽的基因后改變了表達量的天然多肽。所述真菌細胞可以含有一個或多個拷貝的編碼所述多肽的核芬酸序列。具體而言，所述多肽可以是激素或激素變體、酶、受體或其片段、抗體或其片段、變應原或報道分子。在具體的方面，所述多肽可以是源自塵螨屬物種(Dermato//zagoz'tfessp.)的變應原。具體而言，所述塵螨屬物種選自下組屋塵螨(Dem^to;/zagozWesjDferow;yM/ii/s)、4分塵蟲萵(Dermatop/iagor.ciesy^n'wae)、絲泊塵蟲葛(Z)er"7a嘩/7ago/(5feyJ7'6owe力、De環a鄉/zagoz'deyw/croceaw、熱帶無爪蟲葛(別o,w'afra-cato)和埋內宇塵螨(五wrag/^p/zw或來自隨后經修飾的所述生物體之一的變應原。更具體而言，所述變應原可以是來自屋塵螨的Derp1(SEQIDNO:9)或Derp2(SEQIDNO:10)。具體而言，所述多肽可以是SEQIDNO:9的氨基酸19-320的序列。在更具體實施方案中，所述多肽可以是SEQIDNO:9的氨基酸19-320的多肽序列的變體。更具體而言，所述變體可以是S54X或N52X,其中"X，，表示任何氨基酸，如所述破壞Derp1的N-糖基化位點，具體而言所述變體可以是S54N或N52Q。在另一個具體實施方案中，所述多肽可以是酶，例如氧化還原酶、轉移酶、水解酶、裂合酶、異構酶或連接酶。在更具體的方面，所述多肽可以是氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、過氧化氫酶、纖維素酶、纖維二糖水解酶、幾丁質酶、角質酶(cutinase)、環糊精糖基轉移酶、脫氧核糖核酸酶、內切葡聚糖酶、酯酶、a-半乳糖苷酶、(3-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、a-葡糖苷酶、卩-葡糖苷酶、轉化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、mutanase(變構酶)、氧化酶、果膠分解酶(pectinolytic.enzyme)、過氧化物酶、磷脂酶、肌醇六磷酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、轉谷氨酰胺酶、木聚糖酶或(3-木糖苷酶。相關纖維素酶的實例包括但不限于來自巻枝毛霉(Mwcwch'"e//W^)例如巻枝毛霉IF04554的纖維素酶。相關蛋白水解酶的實例包括但不限于半月光氛酉^蛋白酉爭(cysteinprotease),例如來自白車軸草(7>7/0//17reperaL.)的半胱氨酸蛋白酵5。相關肌醇六磷酸酶的實例包括但不限于來自隔孢伏革菌(尸em'，/wra/，z',')例如i3/yd/CBS686.96的月JL醇六石舞酸酶。編碼本發明的多肽的第二核苷酸序列可以獲得自任何原核、真核或其它來源。就本發明而言，用于本文與給定的來源相關的術語"獲得自"，意思用于分離或克隆編碼感興趣的多肽的核苷酸序列的技術是本領域已知的，并且包括從基因組DNA分離，從cDNA制備，或它們的組合。例如，從這種基因組DNA克隆所述第二核苦酸序列可以通過使用公知的聚合酶鏈式反應(PCR)來實現。參見，例如，Innis等,1990,PCRProtocols:AGuidetoMethodsandApplication,AcademicPress,NewYork。所述克隆方法可以包括切下并分離期望的包含編碼所述多肽的核苷酸序列的核芬酸片段，將所述片段插入載體分子中，和將所述重組載體并入突變真菌細胞，在該細胞中所述核苷酸序列的多個拷貝或克隆將被復制。所述第二核苷酸序列可以是基因組的、cDNA、RNA、半合成、合成來源的，或它們的任意組合。在本發明的方法中，所述多肽也可以是融合或雜合多肽，其中將另一種多肽融合在所述多肽或其片段的N末端或C末端。融合多肽通過將編碼一種多肽的核普酸序列(或其片段)與編碼本發明的多肽的第二核香酸序列(或其片段)融合而產生。用于產生融合多肽的技術是本領域已知的，并且包括，肽的表達在相同的啟動子和終止子的調控之下。雜合多肽可以包含從至少兩個不同多肽獲得的部分或完整多肽序列的組合，其中的一個或多個多肽對于所述突變真菌細胞可以是異源的。核酸構建體本發明還涉及核酸構建體，其包含編碼本發明的信號肽的第一核苷酸序列，該序列與編碼本發明的多肽的第二核苷酸序列可操作地連接。更具體地，本發明涉及核酸構建體，其包含編碼信號肽的第一核普酸序列，該序列與編碼多肽的第二核苦酸序列可操作地連接，其中所述第一核苷酸序列對于第二核苷酸序列是外源的，并且所述第一核苷酸序列的3'端在第二核苷酸序列的上游，并且所述第一核苷酸序列選自編碼根據本發明的信號肽的核苷酸序列。"核酸構建體"在本文定義為單鏈或雙鏈的核苷酸分子，所述分子分離(juxtapose)的核酸區段。當核酸構建體含有編碼序列和表達該編碼序列所需的所有調控序列時，術語核酸構建體與術語表達盒同義。編碼多肽的第二核苷酸序列可以按多種方式進一步操作以提供所述多肽的表達。將核苷酸序列插入載體之前對核苷酸序列進行操作可能是理想的或必要的，這取決于所述表達載體。使用重組DNA方法修飾核苷酸序列的在本發明的方法中，所述核酸構建體可以包含一個或多個天然調控序列，或所述天然調控序列中的一個或多個可以用對于所述核酸構建體的第一和/或第二核苦酸序列是外源的一個或多個調控序列代替，用于改進編碼多肽的第二核苷酸序列在宿主細胞中的表達。術語"調控序列，，在本文定義為包括對于由第二核苷酸序列編碼的多肽的表達是必需的或有利的所有成分。每個調控序列對于編碼多肽的第二核苷酸序列可以是天然的或外源的。這些調控序列包括，但不限于，前導序列、聚腺苦酸化序列、前肽序列、本發明的信號肽序列和轉錄終止子。最少的情況下，調控序列包括本發明的信號肽序列，以及轉錄和翻譯的停止信號。調控序列可以與接頭一起提供，所述接頭的目的是引入特異性限制位點，促進調控序列與編碼多肽的第二核苷酸序列的連接。調控序列還可以是合適的啟動子序列，其由宿主細胞識別用于核苷酸序列表達。啟動子序列含有介導多肽表達的轉錄調控序列。啟動子可以是在所選宿主細胞中顯示轉錄活性的任何序列，包括突變的、截斷的和雜合的啟動用于指導本發明的核酸構建體在絲狀真菌宿主細胞中轉錄的合適啟動TAKA淀粉酶、曼赫根毛霉(i^zz'zomMcor7w'e/犯0天冬氨酸蛋白酶、黑曲(Aj^^〃Mm&r)中性a-淀粉酶、黑曲霉酸穩定性a-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉0^/e;^7/^awawon')葡糖淀粉酶(glaA)、曼赫根毛霉脂肪酶、米曲霉堿性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸異構酶、構巢曲霉(A;erg/〃wm'^/am)乙酰胺酶、胰蛋白酶樣蛋白酶(WO96/00787)、里氏木霉(7Wc/2^/er奶aree5ez')纖維二糖水解酶I、里氏木霉纖維二糖水解酶II、里氏木霉內切葡聚糖酶I、里氏木霉內切葡聚糖酶II、里氏木霉內切葡聚糖酶III、里氏木霉內切葡聚糖酶IV、里氏木霉內切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉p—木糖普酶；以及NA2-tpi啟動子(來自黑曲霉中性a-淀粉酶基因和米曲霉丙糖磷酸異構酶基因的啟動子的雜合體)；和它們的突變的、截短的和雜合的啟動子。在酵母宿主中，有用的啟動子包括但不限于獲得自以下各項的基因的那些S良酒酵母烯醇化酶(ENO-l)、釀酒酵母半乳糖激酶(GAL1)、釀酒酵母醇脫氫酶/甘油醛-3-磷酸脫氫酶(ADHl,ADH2/GAP)、釀酒酵母丙糖磷酸異構酶(TPI)、S良酒酵母金屬硫蛋白(CUP1)和釀酒酵母3-磷酸甘油酸激酶。其它對于酵母宿主細胞有用的啟動子由Romanos等，1992,Yeast8:423-488描述。調控序列可以是合適的轉錄終止子序列，其由宿主細胞識別以終止轉錄。終止子序列與編碼多肽的核苷酸序列的3'末端可操作連接。在所選宿主細胞中有功能的任何終止子均可以在本發明中使用。用于絲狀真菌宿主細胞的合適終止子的實例包括但不限于獲得自以下各項的基因的那些米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、構巢曲霉鄰氨基苯曱酸合酶、黑曲霉a-葡糖苷酶和尖鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶。的基因的那些釀酒酵母烯醇化酶、釀酒酵母細胞色素C(CYC1)和釀酒酵母甘油醛-3-磷酸脫氬酶。其它對于酵母宿主細胞有用的終止子由Romanos等，1992，見上文描述。調控序列也可以是聚腺苷酸化序列，其是與編碼多肽的核苷酸序列的3'端可操作地連接的序列，并且在轉錄時，宿主細胞將其識別為向轉錄的mRNA添加聚腺苷殘基的信號。可以將在所選宿主細胞中有功能的任何聚腺對于絲狀真菌宿主細胞合適的聚腺苷酸化序列的實例包括但不限于從巢曲霉鄰氨基苯甲酸合酶、尖鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶和黑曲霉a-葡糖苦酶。對于酵母宿主細胞有用的聚腺苦酸化序列包括但不限于由Guo和Sherman，1995,MolecularCellularBiology15:5983-5990描述的那些。調控序列還可以是前肽編碼區，其編碼位于多肽氨基末端的氨基酸序列。所得多肽稱為酶原(proenzyme)或前多肽(propolypeptide)(或在某些情況下稱為酶原(zymogen))。前多肽通常是無活性的并且能夠通過前肽的催化或自催化切割從前多肽轉化為成熟活性多肽。前肽編碼區的實例包括但不限于從以下各項的基因獲得的那些屋塵螨Derp1,或其它從塵螨屬獲得的基因，尖鐮孢胰蛋白酶，釀酒酵母a因子，曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶和嗜熱毀絲霉(MvcWop/^waf/zem7op/77a)漆酶(WO95/33836)。當信號肽和前肽區二者均出現在多肽的氨基末端時，將前肽區置于緊接著(ncxtto)多肽氨基末端，并且將信號肽區置于緊接著前肽區的氨基末端。米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、構如果存在前肽，在一個實施方案中，可切割位點可以存在于所述前肽和成熟多肽之間。術語"可切割位點，，應理解為由能夠在該位點切割多肽的蛋白水解酶識別的氨基酸序列。這種位點的實例包括kex位點，尤其是kex-II位點。同樣理想的是添加調節序列，其允許相對于宿主細胞的生長來調節多肽的表達。調節系統的實例是引起基因表達響應化學或物理刺激物，包括調節化合物的存在而開啟或關閉的那些系統。在酵母中，可以使用ADH2系統或GAL1系統。在絲狀真菌中，可以使用TAKAot-淀粉酶啟動子、黑曲霉葡糖淀粉酶啟動子和米曲霉葡糖淀粉酶啟動子作為調節序列。調節序列的其它實例是那些允許基因擴增的序列。在真核系統中，這些序列包括在氨甲蝶呤(methotrexate)存在下擴增的二氫葉酸還原酶基因，和以重金屬(withheavymetal)擴增的金屬硫蛋白基因。在這些情況下，編碼多肽的核苦酸序列將與調節序列可操作地連接。本發明還涉及包含本發明的核酸構建體的重組表達載體。除了包含本發明分別編碼信號肽和多肽的第一和第二核苷酸序列，所述表達載體可以特別包含轉錄和翻譯停止信號。上文描述的多種核苷酸和調控序列可以結合在一起產生重組表達載體，該重組表達載體可以包括一個或多個方^更的限制位點以允許在這些位點插入或取代啟動子和/或編碼多肽的核苦酸序列。可供選擇的是，可以將核酸構建體插入載體中，所述載體對于由第二核苷酸序列編碼的多肽的表達是適合的。在制備表達載體的過程中，將編碼多肽的第二核香酸序列置于載體中，從而將所述序列與本發明的信號肽序列和一個或多個適當的用于表達的調控序列可操作地連接。重組表達載體可以是任何載體(例如，質粒或病毒)，其能夠方便地進行重組DNA步驟，并且能夠產生核苷酸序列的表達。載體的選擇將通常依賴于載體與將引入該載體的宿主細胞的相容性。載體可以是線狀或閉合環狀質粒。本發明的載體可以特別含有一個或多個選擇性標記，其允許簡單選擇經轉化的細胞。選擇性標記是基因，其產物提供殺生物劑或病毒抗性、對重金屬的抗性、對營養缺陷型的原養性(prototrophytoauxotrophs)等。對于酵母宿主細胞合適的標記包括但不限于ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1和URA3。用于絲狀真菌宿主細胞的選擇性標記包括但不限于amdS(乙酰胺酶)、argB(鳥氨酸氨曱酰基轉移酶)、bar(草銨膦(phosphinothricin)乙酰轉移酶)、hygB(潮霉素磷酸轉移酶)、niaD(硝酸還原酶)(nitratereductase)、pyrG(乳清酸核苦-5'-磷酸脫羧酶)(orotidine-5'-phosphatedecarboxylase)、sC(石克酸腺苷酰轉移酶)、trpC(鄰氨基苯曱酸合酶(anthranilatesynthase)),以及它們的等價物。特別用于曲霉屬G4^er^7/w)細胞中的是構巢曲霉或米曲霉的amdS和pyrG基因和吸7m連霉菌(^S^e/7tomyce51/^gmsco^ctw)的bar基因。載體可以是自主復制載體，即，作為染色體外實體(entity)存在的載體，其復制獨立于染色體復制，例如，質粒、染色體外元件、微型染色體(minichromosome)或人工染色體。載體可以含有任何用于確保自復制的手段(means)。或者，載體可以是一種當被引入宿主細胞中時，整合到基因組中并且與整合了該載體的染色體一起復制的載體。此外，可以使用單獨的載體或質粒或兩個或更多個載體或質粒，其共同含有待引入宿主細胞基因組的完整DNA(totalDNA),或可以使用轉座子(transposon)。本發明的載體可以特別含有元件，其允許載體穩定整合入宿主細胞基因組或允許載體在所述細胞中獨立于基因組自主復制。為了整合入宿主細胞基因組，載體可依賴編碼多肽的第二核苦酸序列或用于通過同源或非同源重組將載體穩定整合入基因組的任何其它載體元件。或者，載體可以含有額外的核苷酸序列，用于指導通過同源重組整合入宿主細胞基因組。所述額外的核苷酸序列可以使載體能夠整合入宿主細胞基因組內染色體中的精確位置。為了增加在精確位置整合的可能性，整合元件應特別含有足夠數量的核苷酸，如100至1,500堿基對，優選400至1,500堿基對，并且最優選800至1,500石咸基對，其與相應的目標序列高度同源以增強同源重組的概率。整合元件可以是任何序列，其與宿主細胞基因組中的目標序列同源。此外，整合元件可以是非編碼或編碼的核苦酸序列。另一方面，可以將載體通過非同源重組整合到宿主細胞的基因組中。為了自主復制，載體可以還包含復制起點，其使載體能夠在所述宿主細胞中自主地復制。復制的起點可以是任何在細胞中有功能的介導自主復制的質粒復制子(plasmidreplicator)。術語"復制起點"或"質粒復制子"在本文定義為使質粒或載體能夠在體內復制的核苦酸序列。用于酵母宿主細胞的復制起點的實例是2微米復制起點，ARS1，ARS4，ARS1和CEN3的組合，以及ARS4和CEN6的組合。復制的起點可以是一種具有突變的復制起點，所述突變使該復制起點能夠在宿主細胞中發揮溫度牽l感寸生的功能(參見，例戈口，Ehrlich,1978,ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA75:1433)。可用于絲狀真菌宿主細胞的復制起點的實例是AMA1和ANSI(Gems等，1991，Gene98:61-67;Cullen等，1987，NucleicAcidsResearch15:9163-9175;WO00/24883)。AMA1基因的分離和包含該基因的質粒或載體的構建可以根據WO00/24883中公開的方法完成。可以將多于一個拷貝的編碼多肽的核苷酸序列插入宿主細胞以增加該基因產物的產生。核苦酸序列拷貝數的增加可如下獲得通過將至少一個額外拷貝的序列整合入宿主細胞基因組，或者通過包括可與所述核苷酸序列一起擴增的選擇性標記基因，其中可通過在合適的選擇劑(selectableagent)存在下培養細胞來選擇含有所述選擇性標記基因的擴增拷貝、并由此含有所述核苷酸序列的額外拷貝的細胞。用于連接上述元件以構建本發明的重組表達載體的方法是本領域技術人員公知的(參見，例如，Sambrook等，1989,見上文)。宿主細胞本發明涉及在真菌宿主細胞中產生多肽的方法，和包含本發明的核酸構建體的重組宿主細胞。將包含與編碼多肽的第二核苷酸序列可操作地連接的、編碼本發明的信號肽的第一核苷酸序列的載體導入真菌宿主細胞，從而使所述載體作為染色體整合體或作為如先前所述的自復制染色體外載體保留。術語"宿主細胞"包括親本細胞的任何子代，其由于復制過程中發生的突變而與所述親本細胞本文包括子嚢菌門(Ac簡yc。to)、擔子菌門(S肌'(iz'。m少coto)、壺菌門(C73^n'(i/o7Mycoto)禾口4妾合菌門(2ygomycoto)(長口Hawksworth等，In,AinsworthandBisby'sDictionaryofTheFungi,第8版，1995,CABInternational,UniversityPress,Cambridge,UK所定義),以及卵菌門((9簡ycoto)(如Hawksworth等，1995，見上文，第171頁中所引用)和所有有絲分裂孢子真菌(mitosporicfungi)(Hawksworth等,1995，見上文)。20在具體的方面，所述真菌宿主細胞是酵母細胞。"酵母"用于本文包括產子嚢酵母(oscos;orage"ousyeast)(內孢霉目C&cfomyceto/e力)、產擔子酵母(^wWosporagewoMSyeast)和屬于半知菌類(FungiImperfecti)(芽孑包纟岡(說Mtomj;cefe力)的酵母。鑒于酵母的分類在將來可能變化，就本發明而言，酵母應該限定為長口BiologyandActivitiesofYeast(Skinner,RA.,Passmore,S.M.，andDavenport,R.R.,eds,Soc.App.Bacteriol.SymposiumSeriesNo.9,1980)中所述。在更具體的方面，所述酵母宿主細胞是念珠菌屬(Ca"&^)、漢遜酵母屬(//arae"w/a)、克魯維酵母屬(《/i(yvera/w少ce力、畢赤酵母屬(尸/c/z/a)、酵母屬(iS(3cc/zaram;;ca)、裂殖酵母屬(iSc/7/zosacc/zaramyces)、或西洋蓍霉屬(Kjrravt^)在最具體的方面，所述酵母宿主細胞是卡爾酵母OSacc/zaramyc^cfl廠/We,sea^)、釀酒酵母(例如釀酒酵母YNG318)、糖化酵母(&cc/^ramyc^(Sflcc/zwowcas1A:—ve",)、諾地酵母(iSbcc/zara，c&s1wor6e腦》、卵形酵母(Sac6'/zfl/'omj/'cas1ovz/or7柳'力、乳酸克魯維酵母(A7^yve/w"ycas1/"cto)、巴斯德畢赤酉孝母(尸/c/zz'"/^wtor^)或解脂西洋蓍霉(forravWa/^0/》'"ca)細月包。在另一個具體的方面，所述真菌宿主細胞是絲狀真菌細胞。"絲狀真菌，，包括真菌(五,^ycoto)和卵菌(Oomycoto)亞門的所有絲狀形式(如Hawksworth等，l995，見上文所定義)。絲狀真菌的特征在于由殼多糖(chitin)、纖維素、聚糖、殼聚糖、甘露聚糖(mannan)和其它復雜多糖所組成的菌絲體壁。營養生長通過菌絲延長進行，并且碳分解代謝是專性需氧的。與此相反，酵母如釀酒酵母的營養生長則通過單細胞菌體(unicellularthallus)的芽殖(budding)進行，碳分解代謝可以是發酵的。在更具體的方面，所述絲狀真菌宿主細胞是(但不限于)以下物種的細胞才支頂孑包霉屬(^cnmom'w7w)、曲霉屬、鐮孑包屬(FusaWwm)、腐質霉屬(7/ww/co/a)、毛霉屬、毀絲霉屬(71今^//，/^7^^)、脈孢菌屬、青霉屬、梭孢殼屬(77^/aWa)、彎頸霉屬(r。(y7X)c/aWw"7)或木霉屬(r,7.c/7ode，(3)。在甚至更具體的方面，所述絲狀真菌宿主細胞是泡盛曲霉、臭曲霉(/^J9erg7'〃w5ybe"aks1)、日本曲霉(y^perg7'〃M"/a/。m'cw力、構巢曲霉、黑曲霉或米曲霉細胞。在另一個甚至更具體的方面，所述絲狀真菌宿主細胞是桿孢狀鐮孢細月包。廠ehcM/a^ww)、4分纟工嫌孑包(i^ksan'w附ros^w附)、^妾骨木錄孑包(Fwsan'w附sa附6wc/wwm)、月夫色鐮孑包OFkyon'm附rarcoc/zraw附)、4以分^支孑包鐮孑包(尸wsor/ww5poro/n'c/n-oWas)、石克色鐮孑包(尸usan'wm犯/^/2m/^m附)、圓鐮孑包(尸wsan'wmtorw/oswm)、擬、絲孑包鐮孑包CPw犯n:wmm'c/2oAedo^es)、或鑲片鐮孢細胞。在另一個甚至更具體的方面，所述絲狀真菌宿主細胞是特異腐質霉(/^/w'co/"/"w/e"力、疏棉狀腐質霉Z/z纏—7a)、粗糙脈孢菌(iVeMmsporaeras—、產紫青霉菌(尸era'c/〃/wm在最具體的方面，所述鑲片鐮孢細胞是鑲片鐮孢A3/5,其最初作為禾本科鐮孢ATCC20334保藏，并在最近由Yoder和Christianson,1998,FungalGeneticsandBiology23:62-80以及O'Donnell等，1998，FungalGeneticsandBiology23:57-67重新分類為鑲片鐮孢；以及鑲片鐮孢的分類學等價物，而不考慮它們目前已知的物種名。在另一個具體方面，所述鑲片鐮孢細胞是鑲片鐮孢A3/5或鑲片鐮孢ATCC20334的形態學突變體，如WO97/26330中所公開的。在另一個最具體的方面，木霉屬細胞是里氏木霉ATCC56765、里氏木霉ATCC13631、里氏木霉CBS526.94、里氏木霉CBS529.94、長枝木霉CBS528.94、長枝木霉ATCC2106、長枝木霉CBS592.94、綠色木霉NRRL3652、綠色木霉CBS517.94、或綠色木霉NIBHFERM/BP447。真菌細胞可以通過包括原生質體形成、原生質體轉化和以本身已知的方式再生細胞壁的方法來轉化。用于轉化曲霉屬宿主細胞的合適方法在EP238023和Ye!ton等，1984,ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA81:1470-1474中描述。用于轉化里氏木霉宿主細胞的合適方法是Penttila等，1987，Gene61:155-164和Gmber等，1990,CurrGenet.18(1):71-6中所述。用于轉化鐮孢屬菌種的合適方法由Malardier等，1989,Gene78:147-156和WO96/00787描述。酵母可以使用由Becker和Guarente,InAbelson,J.N.和Simon.M丄,編,GuidetoYeastGeneticsandMolecularBiology,MethodsinEnzymology,Volume194,pp182-187,AcademicPress,Inc.,NewYork;Ito等，1983,JournalofBacteriology153:163;禾口Hinnen等，1978,ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA75:1920描述的方法來轉化。才才沖+禾口方法菌抹和質粒菌抹使用大腸桿菌DH12S(可從GibcoBRL獲得)用于酵母質粒挽救(plasmidrescue)。釀酒酵母YNG318:MATaDpep4[cir+]um3-52,Ieu2-D2,his4-539在J.Biol.Chem.272(15),9720-9727,1997中描述。質粒全部酵母表達載體均為在TPI啟動子調控下的釀酒酵母和大腸桿菌穿梭載體，其構建自WO00/10038中描述的pJC039。基因來自屋塵螨的Derp1:NCBI登錄號P08176，氨基S餅列示于SEQIDNO:9來自屋塵螨的Derp2:NCBI登錄號:P49278,氨基酸序列示于SEQIDNO:10培養基和底物RS-25:40gZL大豆粉、40g/L葡萄糖、10g/LKH2P04、0.25g/LMgS04、0.01g/LFeS04、2.5g/LNH4N03;pH6YPD:20g/L葡萄糖、20g/L蛋白胨和10g/L酵母提取物10X基礎溶液(basalsolution)^66.8g/1不含氨基酸的酵母含氮堿基(Yeastnitrogenbasew/oaminoacids)(DIFCO)、100g/1琥珀酸鹽和60g/1NaOH。SC-葡萄糖(或SC-培養基)100ml/120%葡萄糖(即，終濃度為2%=2g/100ml)、4ml/15o/。蘇氨酸、10ml/lP/。色氨酸、25ml/120%酪蛋白氨基酸和100ml/110X基礎溶液。將此溶液使用孔徑為0.20微米(Microm)的濾器滅菌。將瓊脂和H20(約761mi)—起高壓滅菌，再將單獨滅菌的SC-葡萄糖溶液加至瓊脂溶液。23PEG/LiAc溶液50ml40%PEG4000(通過高壓滅菌來除菌)和lml5M醋酸鋰(通過高壓滅菌來除菌)。方法酵母轉化本方法在實施例1和2中使用。為了轉化酵母利用了體內重組機制，通過這種機制，如果載體序列和PCR片段二者具有相同的側翼區，那么酵母有可能在體內重組所述載體序列和PCR片段以產生表達載體。DNA混合物通過混合0.5微升載體(經EcoRI-NotI消化的)和1微升PCR片段來制備。將釀酒酵母YNG318感受態細胞在冰上解凍。在12ml聚丙烯試管(Falcon2059)中將100微升的所述細胞與所述DNA混合物和l(H斂升載體DNA(Clontech)混合。向其中添加0.6mlPEG/LiAc溶液并輕輕混合，然后在30。C和200rpm溫育30分鐘。之后將其在42。C溫育30分鐘(熱休克(heatshock))，然后將其轉移至Eppendorf管并離心5秒。去除上清，并再溶解于3mlYPD中。然后將細胞懸液在30。C以200rpm溫育45分鐘，然后將其傾倒至SC-葡萄糖平板上。PCR反應除非另有說明，否則在以下條件下進行PCR反應所述PCR反應含有38.9微升H20、5微升10x反應緩沖液、1微升KlenTaqLA(Clontech)、4微升10mMdNTPs、0.3微升x2100pmol/微升引物和0.5微升模板DNA,并且在以下條件下進行30個循環的98。C10秒和68。C90秒，以及最終的68°C10分鐘。夾心ELISA將免疫平板(NuncMaxisorb;Nunc-Nalgene)分別用合適劑量的Derp1或Derp2測定用多克隆兔抗Derp1或Derp2免疫球蛋白在4°C過夜包被。然后將所述平板用含0.05%Tween20的0.15M磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)(PBST)徹底清洗，并且用含有2%脫脂乳粉的PBS封閉剩余的結合位點，在室溫進行1小時。以合適劑量或劑量范圍添加樣品，所述樣品可以是純化的、半純化的重組螨多肽變應原或含有感興趣的蛋白質的粗制培養液。然后用0.15MPBST徹底清洗平板，再通過分別與生物素酰化的抗Derp1或Derp2抗體一起在室溫溫育1小時來檢測變應原。然后再次在0.15MPBST中清洗平板，之后與鏈霉抗生物素:辣根過氧化物酶(Kierkegaard&Perry)的復合物在室溫綴合(conjugate)1小時。重復清洗步驟，再通過添加3,3，，5,5，-四曱基聯苯胺過氧化氫(TMBPlus,Kem-En-Tec)來使平板顯影(develop)，其后通過添加0.2MEbS04停止反應。450nm的光密度(OD)反映了與免疫球蛋白結合的變應原，那么通過與針對以已知濃度劑量范圍包括在ELISA中的天然Derp1或Derp2(可從InDoorbiotechnologies獲得)獲得的數據進行比較，可以檢測、也可以確定結合的變應原的量。挽救酵母質粒的大腸桿菌轉化通過電穿孔(BIO-RADGenePulser(基因脈沖儀))進行。用QiagenPlasmidKit(質粒試劑盒)制備了DNA質粒。通過Qiagen凝膠提取試劑盒從瓊脂糖凝膠回收了DNA片段。PCR通過PTC-200DNAEngine進行。使用ABIPRISMTM310GeneticAnalyzer(基因分析儀)用于全部DNA序列的測定。酵母總DNA通過Robzyk和Kassir的方法提取，該方法在NucleicAcidsResearchvol.20,No.14(1992)3790中描述。實施例實施例1Derp1在釀酒酵母中的表達使用本發明的經改進a因子信號的感興趣多肽的表達水平能夠通過例如Derpl的表達水平來闡明。任何適用于在酵母中表達多肽的表達載體均可使用。在以下內容中，描述了合適的表達構建體的實例，該構建體基于酵母pYES2載體。使用PWO聚合酶通過標準PCR反應從釀酒酵母基因組DNA擴增了TPI啟動子。引物正向引物5，(SEQIDNO:11)反向引物5'TAAGTAAAGCTTTCTTTTAATCGTTTATATTGTGTATG3，(SEQIDNO:12)將擴增的產物經QiaquickSpinColumn(旋轉柱)純化。將純化的產物和載體pYes2用HinDIII/Agel在Nebuffer2(NewEnglandBiolabs)中消化。此消化過程將Gall啟動子從所述載體中去除。將所述載體和插入片段使用QIAquick方法(Qiagen)由1.5%制備型瓊脂糖凝膠純化。將載體和插入片段通過T4-DNA連接酶連接，轉化入通過CaCl2制成感受態的DH10B細胞，并且涂布在含有氨千青霉素(100jig/ml)的LB平板上。通過DNA測序驗證了克隆，并命名為pYES-TPI。設計了用于引入氨基酸序列為MRFPSIFTAVLFAASSALA的a信號和用于擴增Derp1的寡聚物(oligo):正向DNA寡聚物從5，端序列起具有與質粒中HinDIII位點上游的pYES-TPI序列的重疊(l-42)，及編碼a信號的序列(43-99),以及與編碼前肽N-末端的Derp1基因重疊的序列(100-132):反向寡聚物從5'端序列起具有與質粒中HinDIII位點下游的pYES-TPI重疊的序列(l-40),和與Derp1基因的編碼C末端重疊的序列(41-68):TAACAACGTACGGGTATTCTTCG3，(SEQIDNO:14)將pYES-TPI表達載體用HinDIII(NewEnglandBiolabs)消化，將線性化的載體純化并用于與a-信號-proDerp1擴增基因一起轉化釀酒酵母(Sambrook等,MolecularCloning:ALaboratoryManual,2ndEd"ColdSpringHarbor,1989)。所述載體片段和擴增基因通過缺口修復在酵母細胞中重組(Orr-WeaverandSzostak,PNAS，1983,vol.80,p.4417-4421)。轉化之后，將轉化體涂布在含2%葡萄糖的SC瓊脂上。在30°C溫育3-4天之后，將菌落培養在含2%葡萄糖的SC培養基中進行質粒挽救，并且對a-信號-proDerp1基因進4亍DNA測序。以相同的方式構建了a信號變體，除了將正向引物中的第67-69位(編碼從Met起第9位的Ala)變為編碼Thr的密碼子選l奪或任何其它相關iF又代。a-信號-proDerp1基因，并進行了DNA純化其它表達構建體也可以應用。在一組數據中，使用了pSteD212載體，其源自酵母表達載體pYES2.0(Invitrogen，UK和Kofod等1994J.Biol.Chem.269:29182-29189)。這種質粒可在大腸桿菌中和釀酒酵母中復制，并且在釀酒酵母中，從這種質粒表達了Derp1。pSteD212是附加型(episomal)表達載體，其含有尿嗜啶合成途徑的基因URA3，該基因編碼允許在基本培養基上進行選才奪的乳清酸核苷5，-脫羧酶。所述載體還含有2my起點，其是在酵母和大腸桿菌二者中保證該質粒的多拷貝的DNA復制起點。TPI(丙糖磷酸異構酶)啟動子保證感興趣的基因的組成型表達，可以將所述基因克隆至位于該啟動子下游的多克隆位點(mcs)中。酵母轉錄終止子存在于所述mcs的下游。同樣由pSteD212攜帶的氨千青霉素抗性基因用于在大腸桿菌中進行選擇。因此pSteD212載體在功能和結構上非常類似于pYES2。對上述用于基因表達載體的元件更詳細的描述可以參見Romanos等，1992,Yeast，8,423-488和Sambrool(等(MolecularCloning:ALaboratoryManual,2ndEd.,ColdSpringHarbor,1989)。重組Derp1與Derp1前肽一起表達，并且具有突變S54N，該突變破壞了成熟序列中僅有的N-糖基化基序。為了篩選表達Derp1的酵母轉化體，將轉化溶液涂布在SC瓊脂平板上在30。C進行3天的菌落形成。將菌落接種在50ml無菌塑料管中，每個管含有10mLSC培養基。在含有100mlSC培養基的500ml帶擋板的錐形瓶(baffledErlenmeyerflask)中使試管培養物在30°C,250rpm發酵4天。將來自這些發酵的培養液用于夾心ELISA實驗以確定表達的蛋白質的濃度。如上文方法部分中所述通過夾心ELISA確定了通過野生型c^言號或通過A9Ta信號表達的Derp1S54N的表達水平。使用A9Ta信號的Derp1S54N表達與使用野生型a信號的相同蛋白的表達相比增加到約5倍。實施例2Derp2在釀酒酵母中的表達作為根據本發明的另一個說明性實施例，對使用本發明信號肽的不同變體的Derp2表達進4亍描述。在以下內容中，描述的是基于酵母pYES2載體的合適的表達構建體的實例。將來自屋塵螨的Derp2(SEQIDNO:10中所示的氨基酸序歹'j)編碼基因置于載體pYES-TPI中，所述載體如實施例1中所述源自酵母表達載體pYES2(Invitrogen)。這種質粒可在大腸桿菌和釀酒酵母二者中復制。在釀酒酵母中，可以從這種質粒表達Derp2。使用pSteD212作為表達載體獲得了一組實驗數據。為了在酵母中分泌，通過將不同ot信號肽變體引入編碼Derp2基因的上游而測試了它們的表達效率。一個a信號是氨基酸序列為MRFPSIFTAVLFAASSALA的野生型信號，其它信號除了位置A9的氨基酸不同之外是同樣的氨基酸序列。將位置9中的丙氨酸取代為S、H、I、F、E、G或T，其中通過如實施例1中所述的標準寡聚物和PCR技術，但是使用與Derp2序列具有重疊的引物。通過克隆同樣在上文所述的DNA片段制備了具有不同信號肽的表達構建體。將構建體轉化入釀酒酵母。為了篩選表達Derp2的酵母轉化體，將轉化溶液涂布在SC瓊脂平板上用于在30°C進行3天的菌落形成。將菌落接種在50ml無菌塑料管中，每個管含有10mLSC培養基。在含有100mlSC培養基的500ml帶擋板的錐形瓶中使試管培養物在30°C，250rpm發酵4天。如上所述將來自這些發酵的培養液用于夾心ELISA實驗以確定表達的蛋白質的濃度。通過夾心ELISA確定了藉由不同a信號突變體的Derp2表達水平，并且與使用野生型a信號(A9A)的Derp2表達進行了比較。在下表中給出了與野生型a信號(A9A)相比成倍改進的表達前導序列取代Derp2的表達倍數MRFPSIFTAVLFAASSALA(A9A)(SEQIDNO:1)1XMRFPSIFTTVLFAASSALA(A9T)(SEQIDNO:2)7XMRFPSIFTSVLFAASSALA(A9S)(SEQIDNO:3)7XMRFPSIFTHVLFAASSALA(A9H)(SEQIDNO:4)7XMRFPS1FTIVLFAASSALA(A9I)(SEQIDNO:5)8XMRFPSIFTFVLFAASSALA(A9F)(SEQIDNO:6)5XMRFPSIFTEVLFAASSALA(A9E)(SEQIDNO:7)2XMRFPSIFTGVLFAASSALA(A9G)(SEQIDNO:8)3X權利要求1.一種用于增加分泌性多肽產生的方法，包括(a)在有益于所述多肽產生的培養基中培養真菌宿主細胞，其中所述宿主細胞包含核酸構建體，該構建體包含編碼信號肽的第一核苷酸序列，其與編碼所述多肽的第二核苷酸序列可操作地連接，其中所述第一核苷酸序列對于第二核苷酸序列是外源的，第一核苷酸序列的3’端在第二核苷酸序列的上游，并且所述第一核苷酸序列選自下組編碼α因子信號肽的核苷酸序列，其中所述α因子信號肽具有至少一個在位置9對丙氨酸進行的取代；和(b)從培養基分離所述分泌性多肽。2.權利要求1的方法，其中在由第一核苷酸序列編碼的氨基酸序列中的至少一個修飾A9Xaa選自下組A9T、A9S、A9H、A9I、A9F、A9E和A9G。3.權利要求1或2中任一項的方法，其中所述經修飾的a因子信號肽包含額外的取代或缺失，所述取代或缺失不影響經修飾的a因子信號肽指導多肽進入或跨過細胞膜的能力，例如指導多肽進入細胞的分泌途徑的能力。4.根據前述權利要求中任一項的方法，其中所述第二核苷酸序列編碼對于所述真菌宿主細胞是天然的多肽。5.根據權利要求1-3中任一項的方法，其中所述第二核苷酸序列編碼對于所述真菌宿主細胞是異源的多肽。6.根據前述權利要求中任一項的方法，其中所述真菌宿主細胞含有多于一個拷貝的第一和第二核苷酸序列。7.根據前述權利要求中任一項的方法，其中所述第二核苷酸序列編碼激素或激素變體、酶、受體或其片段、抗體或其片段、變應原或報道分子。8.根據權利要求7的方法，其中所述酶是氧化還原酶、轉移酶、水解酶、裂合酶、異構酶或連接酶。9.根據權利要求8的方法，其中所述酶是氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、過氧化氫酶、纖維素酶、纖維二糖水解酶、幾丁質酶、角質酶、環糊精糖基轉移酶、脫氧核糖核酸酶、內切葡聚糖酶、酯酶、a-半乳糖苷酶、(3-半乳糖普酶、葡糖淀粉酶、a-葡糖苷酶、(3-葡糖苷酶、轉化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、變構酶、氧化酶、果膠分解酶、過氧化物酶、磷脂酶、肌醇六磷酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、轉谷氨酰胺酶、木聚糖酶或p-木糖苷酶。10.根據權利要求7的方法，其中所述第二核苷酸序列編碼來自塵螨屬物種的變應原。11.根據權利要求IO的方法，其中所述塵螨屬物種選自下組屋塵螨、4分塵蟲禹、絲泊塵蟲蕩、Z)erwatop/zago/tfesm/craceaus。12.根據權利要求ll的方法，其中所述變應原選自下組來自屋塵螨的Derpl或Derp2,或它們的變體。13.根據前述權利要求中任一項的方法，其中所述真菌宿主細胞是絲狀真菌宿主細月包。14.根據權利要求13的方法，其中所述絲狀真菌宿主細胞選自下組枝頂孢霉屬、曲霉屬、鐮孢屬、腐質霉屬、毛霉屬、毀絲霉屬、脈孢菌屬、青霉屬、梭孢殼屬、彎頸霉屬或木霉屬。15.根據權利要求14的方法，其中所述曲霉屬宿主細胞選自下組泡盛曲霉、臭曲霉、曰本曲霉、構巢曲霉、黑曲霉或米曲霉。16.根據權利要求1-12中任一項的方法，其中所述真菌宿主細胞是酵母細胞。17.根據權利要求16的方法，其中所述酵母細胞是酵母屬細胞或畢赤酵母屬細胞。18.根據權利要求17的方法，其中所述酵母細胞是釀酒酵母細胞或巴斯德畢赤酵母細胞。19.一種分離的信號肽，其選自下組(a)包含與SEQIDNO:2具有至少84%同一性，更優選至少89%同一性，更優選至少94%同一性的氨基酸序列的多肽，并且其中在對應于SEQIDNO:2位置9的位置中的T是保守的；和(b)變體，該變體保留指導多肽進入或跨過細胞膜的能力，所述變體包含對SEQIDNO:2的氨基酸在不同于位置9的位置的一個或幾個氨基酸的保守取代、缺失和/或插入。20.—種分離的信號肽，其選自下組(a)包含與SEQIDNO:3具有至少84%同一性，更優選至少89%同一性，更優選至少94%同一性的氨基酸序列的多肽，并且其中在對應于SEQIDNO:3位置9的位置中的S是保守的；和(b)變體，該變體保留指導多肽進入或跨過細胞膜的能力，所述變體包含對SEQIDNO:3的氨基酸在不同于位置9的位置的一個或幾個氨基酸的保守取代、缺失和/或插入。21.—種分離的信號肽，其選自下組(a)包含與SEQIDNO:4具有至少84%同一性，更優選至少89%同一性，更優選至少94%同一性的氨基酸序列的多肽，并且其中在對應于SEQIDNO:4位置9的位置中的H是保守的；和(b)變體，該變體保留指導多肽進入或跨過細胞膜的能力，所述變體包含對SEQIDNO:4的氨基酸在不同于位置9的位置的一個或幾個氨基酸的保守取代、缺失和/或插入。22.—種分離的信號肽，其選自下組(a)包含與SEQIDNO:5具有至少84%同一性，更優選至少89°/。同一性，更優選至少94%同一性的氨基酸序列的多肽，并且其中在對應于SEQIDNO:5位置9的位置中的I是保守的；和(b)變體，該變體保留指導多肽進入或跨過細胞膜的能力，所述變體包含對SEQIDNO:5的氨基酸在不同于位置9的位置的一個或幾個氨基酸的保守取代、缺失和/或插入。23.—種分離的信號肽，其選自下組(a)包含與SEQIDNO:6具有至少84%同一性，更優選至少89%同一性，更優選至少94%同一性的氨基酸序列的多肽，并且其中在對應于SEQIDNO:6位置9的位置中的F是保守的；和(b)變體，該變體保留指導多肽進入或跨過細胞膜的能力，所述變體包含對SEQIDNO:6的氨基酸在不同于位置9的位置的一個或幾個氨基酸的保守取代、缺失和/或插入。24.—種分離的信號肽，其選自下組(a)包含與SEQIDNO:8具有至少84%同一性，更優選至少89%同一性，更優選至少94%同一性的氨基酸序列的多肽，并且其中在對應于SEQIDNO:8位置9的位置中的G是保守的；和(b)變體，該變體保留指導多肽進入或跨過細胞膜的能力，所述變體包含對SEQIDNO:8的氨基酸在不同于位置9的位置的一個或幾個氨基酸的保守取代、缺失和/或插入。25.—種核酸構建體，其包含編碼信號肽的第一核苷酸序列，該序列與編碼多肽的第二核苷酸序列可操作地連接，其中所述第一核苷酸序列對于第二核苷酸序列是外源的，并且第一核苷酸序列的3'端在第二核苷酸序列的上游，并且所述第一核苷酸序列選自下組編碼沖艮據權利要求19-24中任一項的信號肽的核苷酸序列。26.—種重組表達載體，其包含權利要求25的核酸構建體。27.—種重組宿主細胞，其包含權利要求25的核酸構建體或權利要求26的表達載體。28.改進的信號肽用于產生多肽的用途，其中所述信號肽由第一核苷酸序列編碼，并且所述多肽由第二核苷酸編碼，第二核苷S吏序列對于第一核苷酸序列是外源的，并且第一核苷酸序列的3'端在第二核苷酸序列的上游，并且其中所述第一核苷酸序列選自下組編碼a因子信號肽的核苷酸序列，其中所述a因子信號肽具有至少一個在位置9對丙氨酸進行的取代。全文摘要本發明涉及用于產生多肽的方法，包括使用變體α因子信號肽，其在位置9中具有取代，導致將A取代為T、S、H、I、F、E或。本發明還涉及核酸構建體，其包含編碼所述變體信號肽的第一核苷酸序列和編碼多肽的第二核苷酸序列，所述第二核苷酸序列對于第一核苷酸序列是外源的。此外，本發明還涉及包含所述核酸構建體的表達載體和宿主細胞。文檔編號C12N15/80GK101528931SQ200780039084公開日2009年9月9日申請日期2007年10月23日優先權日2006年10月24日發明者亨里特·德拉博格申請人:諾維信公司