細菌致病基因的全局調控物;作為抗病性工程化的靶的細菌自體誘導物失活蛋白的制作方法

專利名稱：細菌致病基因的全局調控物;作為抗病性工程化的靶的細菌自體誘導物失活蛋白的制作方法
相關申請的交叉參考不適用。聯邦資助研究或開發的聲明不適用發明背景1.發明領域本發明涉及細菌致病基因的全局調控物及其賦予疾病抗性的用途。
2.相關現有技術的描述本申請詳細說明之后附有參考文獻目錄，所列參考文獻均引入本文作參考。
細胞之間經小信號分子的通訊不僅對于多細胞活生物體如動物和植物是至關重要的，其在單細胞生物體如細菌的家族成員之間的功能協調方面也起重要作用。近幾年來的飛速進展已清楚表明，已知為自體誘導物(autoinducers，AIs)的N-酰基-高絲氨酸內酯是革蘭氏陰性細菌中廣泛保守的信號分子。AIs首先在海洋細菌菌種弧菌的生物發光性調控中被發現(Eberhard等，1981；Cao and Meighen，1989)。近年來，已在許多革蘭氏陰性細菌中鑒別了AIs。已發現AIs參與一系列生物學功能的調控，包括根癌農桿菌的Ti質粒接合轉移(Zhang等，1993)，胡蘿卜軟腐歐文氏菌、銅綠假單胞菌、斯氏歐文氏菌、嗜線蟲致病桿菌、菊歐文氏菌、青枯假單胞菌和野油菜黃單胞菌的毒力基因的誘導(Jones等，1993；Passador等，1993；Pirhonen等，1993；Pearson等，1994；Beck von Bodman and Farrand，1995；Barber等，1997；Clough等，1997；Costa and Loper，1997；Dunphy等，1997；Nasser等，1998)，致金色假單胞菌和胡蘿卜軟腐歐文氏菌中抗生素產生的調控(Pierson等，1994；Costa and Loper，1997)，液化沙雷氏菌的游動性的調控(Eberl等，1996)，以及熒光假單胞菌和銅綠假單胞菌的生物膜形成(Allison等，1998；Davies等，1998)。已知有更多的細菌菌種產生AIs，但是相關的生物學功能尚不清楚(Bassler等，1997；Dumenyo等，1998；Cha等，1998)。
不同的細菌菌種可產生不同的AIs。所有的AI衍生物均具有相同的高絲氨酸內酯基元，但是可以在其酰基長度和結構上不同。AI介導的基因調控系統中的關鍵組分上LuxI和LuxR型蛋白質。現已證明LuxI型蛋白質是以酰基-ACP和AdoMet(S-腺苷甲硫氨酸)為底物的自體誘導物合酶(More等，1996；Schaefer等，1996)。LuxR型蛋白質推測同時是AIs的受體以及與lux啟動子緊鄰上游的DNA結合的AI依賴性轉錄調控物(Meighen，1994；Sitnikov等，1995)。已鑒別了一20個核苷酸的反向重復序列，其中心位于發光操縱子的轉錄起始位點上游44個核苷酸處，這一序列稱為lux盒，其是LuxR轉錄激活所需的并且可能是LuxR結合位點(Fuqua等，1994)。在至少三個TraR調控的啟動子的上游發現了類似的18bp tra盒，破壞這些元件會破壞TraR的轉錄激活(Fuqua and Winans)。
LuxR型蛋白質似乎由兩個模序組成(Choi and Greenberg，1991；Hanzelka and Greenberg，1995)。它們的羧基末端區含有19個氨基酸的保守短序列，其是推斷的探針型螺旋—轉角—螺旋基序，預測參與與靶啟動子的結合。已推測了激活的一般機制，通過該機制LuxR型蛋白質的N-末端結構域負性作用以防止其C-末端結構域與靶DNA結合位點之間的相互作用。這一抑制可通過自體誘導物配體的作用而解除。一強有力的證據是LuxR的N-末端結構域的缺失導致產生luxR的組成型激活等位基因，而除去了部分預測的DNA結合結構域的更大的缺失破壞了轉錄激活(Choi and Greenberg，1991)。但是，其它的成員可能使用不同的機制。最近的遺傳學研究表明EsaR和ExpR可能是其靶基因的阻遏物而非激活物。由EsaR和ExpR阻遏的基因的表達通過自體誘導物而增加(Beckvon Bodman and Farrand1995；Throup等，1995)。看起來這些蛋白質與它們在啟動子區的靶位點的結合導致阻遏，因此自體誘導物配體可發揮作用降低結合親和性。
目前已有自體誘導物結合位點位于LuxR蛋白的氨基末端結構域證據(Hanzelka and Greenberg，1995)。具有突變的氨基末端區的luxR等位基因比野生型需要更高水平的這一信號，從而表明這一區域是配體相互作用所需的(Slock等，1990；Shadel等，1990)。這一區域(aa 79-127)以及DNA結合結構域內的一區域(aa 180-230)在LuxR及其同系物(ca 50％相同性)中比這些多肽的其它部分具有更高程度的保守性。但是，LuxR和自體誘導物之間的預測的蛋白質—配體相互作用尚未被證明。對含有野生型和突變的LuxR等位基因的部分二倍體大腸桿菌的分析提示LuxR以同源多聚體起作用，并且多聚化所需的區域位于氨基酸殘基116和161之間(Choi andGreenberg，1992)。
發明簡述在一個方面，本發明涉及編碼細菌自體誘導物失活蛋白的分離的核酸分子。
在另一方面，本發明涉及表達載體，其包含編碼細菌自體誘導物失活蛋白的核酸分子，其中所述表達載體在原核或真核細胞中繁殖。
本發明再一方面涉及用本發明的表達載體轉化或轉染的原核或真核細胞。
本發明又一方面涉及具有細菌自體誘導物失活活性的分離的蛋白質，其中所述蛋白質包含SEQ ID NO2的氨基酸序列。
本發明還涉及增加植物或動物的抗病性的方法，該方法包括在這種植物或動物的細胞中導入編碼細菌自體誘導物失活蛋白的核酸序列，使所述細胞表達所述核酸序列。
本發明還涉及防止或降低植物或動物的細菌性損害的方法，所述方法包括將有效量的細菌自體誘導物失活蛋白給予需要這種防止或降低的植物或動物。
本發明還涉及降低植物或動物的細菌性損害的組合物，其包括a)有效量的細菌自體誘導物失活蛋白；和b)合適的載體。
附圖簡述

圖1示出來自芽孢桿菌菌株240BI的細胞提取物對AIs失活的時程。將含有100微克總蛋白的于0.2M磷酸緩沖液(pH7.0)中的細胞提取物加入到含有終濃度為20μM的OHHL的相同緩沖液中。反應以200微升終體積在1.5ml Eppendorf離心管中進行，并于28℃保溫。在磷酸緩沖液中的相同濃度的OHHL用作對照。以10分鐘間隔取樣直至60分鐘，煮沸3分鐘終止反應。在臺式離心機中以最高速離心樣品5分鐘，隨后如所述(Zhang，1993)分析AIs活性。藍色菌落表明存在激活lacZ報道基因的AI，而白色菌落表明不存在AI。從左至右為1，不含蛋白質提取物的OHHL對照；2-7，在10、20、30、40、50、60分鐘酶反應后的樣品。
圖2示出AIs失活酶的分子量的估計。將600微升細胞提取物加入到Centricon 30(Amicon)中并在4℃以5000×g的速度離心30分鐘。通過部分(550微升)和未通過部分(50微升)分別通過加入0.2M磷酸緩沖液(pH7.0)而使終體積為600微升。為進行生物分析，向含有終濃度為20μM的OHHL的管中加入不同量的蛋白質樣品。從列1至6，所加入的蛋白質樣品分別為2、4、6、8、10和0微升，每一反應的終反應體積為20微升。板A通過部分，板B未通過部分。
圖3示出芽孢桿菌菌株240B1 AI失活區的克隆和缺失分析。粘粒克隆E7-R3含有由重疊粘粒克隆的限制分析鑒別的4.3kb EcoRI片段。為進行缺失分析，將同一片段克隆進克隆載體pGEM-7Zf(+)，產生克隆E7-7。通過用限制酶消化和Dnase I處理克隆E7-7產生缺失亞克隆。在粘粒和pGEM-7Zf(+)克隆中的Ptac啟動子的位置和方向用箭頭表示。這些克隆的AI失活活性在第2欄示出+，具有AI失活活性；-，無AI失活活性。限制酶E，EcoRI；H，HindIII；Ev，EcoRV；St，StyI。AiiA ORF的轉錄的位置和方向由空箭頭指示。
圖4A示出aiiA基因的核苷酸序列(SEQ ID NO1)。潛在的核糖體結合序列和-10啟動子元件分別以下劃線和雙下劃線指示。編碼部分在起自堿基1。推斷的因子不依賴性終止位點用重下劃線標出。圖4B示出aiiA基因產物的推斷的氨基酸序列(SEQ ID NO2)。類似于天冬氨酸蛋白酶活性位點共有基序的短肽序列以下劃線標出。
圖5示出aiiA基因產物(AiiA)的氨基酸序列與共有天冬氨酸蛋白酶活性位點基序(Asp)的最佳匹配。符號X代表任意氨基酸。垂直線表示完全匹配。
圖6示出芽孢桿菌菌株240B1，大腸桿菌克隆的AIs失活活性及胡蘿卜軟腐歐文氏菌株的AIs產生活性的生物分析。列1，OHHL對照；列2芽孢桿菌菌株240B1；列3，大腸桿菌DH5α；列4，大腸桿菌DH5α(pE7-R3)；列5，大腸桿菌DH5α(pF41)；列6，胡蘿卜軟腐歐文氏菌SCG1(pE7R3)；列7，胡蘿卜軟腐歐文氏菌SCG1(pLAFR3)；列8，胡蘿卜軟腐歐文氏菌SCG1。在生物分析中，將OHHL以20μM的終濃度加入到1-5道的樣品中。6-8列樣品中沒有加入外源AIs。
圖7示出在胡蘿卜軟腐歐文氏菌中的aiiA基因表達對(A)馬鈴薯；(B)茄子；(C)大白菜；(D)胡蘿卜和(E)芹菜的致病性的影響。上部植物組織用胡蘿卜軟腐歐文氏菌SCG1接種；下部植物組織用胡蘿卜軟腐歐文氏菌SCG1(pE7-R3)接種。以3000×g離心活性生長的細菌1分鐘，用YEB液體培養基重懸至OD600＝1.3(2×109cfu/ml)，其被標為100接種物。分別將100接種物稀釋5和10倍，以制備10-1/2和10-1稀釋液。通過將4微升細菌接種物施加至新切的表面或由移液器尖刺穿的傷口位點而接種植物組織。從左至右板的接種物濃度分別為100，10-1/2和10-1。將接種的植物組織置于塑料皿中并在28℃保溫。在接種后48小時拍照。
發明的詳細描述本發明基于如下發現，SEQ ID NO2蛋白質具有降低或消除細菌自體誘導物(AIs)的活性的作用。因此，該蛋白質和編碼該蛋白質的任何核酸可用于各種需要降低或消除這種細菌的作用的環境。
在一個優選的方面，本發明提供了選自如下一組的核酸分子，所述的組為a)具有SEQ ID NO1的序列的核酸；b)編碼SEQ ID NO2的氨基酸序列的核酸；c)與上述a)或b)雜交的核酸，其中在用1×SSC和0.1％SDS于55℃洗滌1小時后觀察到陽性雜交信號。所述核酸任選地還包括任何序列的信號肽編碼區。
所述核酸序列可用于賦予植物或動物的細菌抗性。編碼細菌自體誘導物失活蛋白的核酸可被導入細胞，從而由植物或動物表達失活蛋白。當致病基因的表達由自體誘導物調控時，所述核酸序列可用于賦予對這種疾病的抗性，如由銅綠假單胞菌、斯氏歐文氏菌、嗜線蟲致病桿菌、菊歐文氏菌、青枯假單胞菌、野油菜黃單胞菌導致的疾病(Passador等，1993；Pirhonen等，1993；Pearson等，1994；Beck von Bodman和Farrand，1995；Barber等，1997；Clough等，1997；Costa和Loper，1997；Dunphy等，1997；Nasser等，1998)。優選地，在農業中，所述序列可用于賦予易感植物如馬鈴薯、茄子、大白菜、胡蘿卜和芹菜的抗軟腐病抗性。
所述序列可通過熟知的方法導入植物或動物中。用外源核酸序列轉化或轉染真核細胞的方法包括轉染、發射轟擊、電穿孔或用根癌農桿菌感染。這些方法是分子生物學和生物工程領域熟練技術人員很熟悉的，本文無需詳細解釋。由于致病細菌細胞限于植物組織的胞間區域，希望將AiiA蛋白導向胞間空間，這可通過將分泌信號肽與AiiA蛋白融合而完成(Sato等，1995；Firek等，1993；Conrad和Fiedler，1998；Borisjuk等，1999)。或者，可將植物膜附著基序摻入AiiA的肽序列以將AiiA酶固定在植物細胞膜的外表面。
本發明提供了工程化抗病性的新策略。具體地，這一策略定向N-酰基高絲氨酸內酯自體誘導物，該誘導物在閾值濃度誘導許多細菌病原體的致病基因的表達。這一策略適用于細菌病原體的致病基因的表達受N-酰基高絲氨酸內酯自體誘導物誘導的所有的植物、動物或哺乳動物疾病。
本發明還涉及細菌自體誘導物失活蛋白直接治療或預防細菌損害的應用。例如，可將蛋白直接施加于需要這種治療或預防的植物。在一個優選的實施方案中，將蛋白質以組合物的形式應用，所述組合物包括有效量的蛋白質和合適的載體。組合物可采用各種形式，包括溶液、粉末、乳液、分散液、糊劑、氣霧劑等。
細菌自體誘導物失活蛋白也可用于治療動物包括人中的細菌感染。在這項應用中，將有效量的活性成分給予需要這種治療的動物。
為了治療，可將活性成分配成藥物組合物，該組合物除包括有效量的活性成分外還可包括藥物可接受的載體、稀釋劑、緩沖劑、防腐劑、表面活性劑等。如果需要或希望，組合物還可包括一或多種其它活性成分。
本領域普通技術人員很清楚本發明的藥物組合物可通過各種方式給予，例如可局部、口服、吸入或腸道外給予。
局部配方可包括軟膏、洗劑、乳液、凝膠、滴劑、栓劑、噴霧劑、液體和粉末。口服配方例如包括粉末、顆粒、在水或非水介質中的懸液或溶液，膠囊或片劑。如果需要可使用增稠劑、香味劑、稀釋劑、乳化劑、分散助劑或粘合劑。
非腸道配方可包括無菌水溶液，其也可含有緩沖劑、稀釋劑和其它合適添加劑。
劑量方案取決于可容易確定的一系列因素，如待處理癥狀的嚴重性和應答性。
以下參照非限制性實施例描述本發明的各方面。實施例1基于其失活N-β-氧基己酰基-L-高絲氨酸內酯(OHHL)、N-β-氧基辛酰基-L-高絲氨酸內酯(OOHL)和N-β-氧基癸酰基-L-高絲氨酸內酯(ODHL)的功能而從土壤懸液中分離細菌分離物240B1(Zhang等，1993)。除非另有說明，用OHHL進大白菜葉中分離。行常規生物分析。胡蘿卜軟腐歐文氏菌菌株SCG1從顯示軟腐癥狀的已經證實菌株SCG1產生AIs并引發馬鈴薯和大白菜中軟腐病。大腸桿菌菌株DH5α用作宿主進行DNA克隆和亞克隆。根癌農桿菌菌株NT1(traR；tra∷lacZ749)在AIs活性生物分析中用作指示劑(Piper等，1993)。大腸桿菌菌株在37℃于Luria-Bertani(LB)培養基中培養，其它菌株在28℃于LB(Miller，1972)或YEB培養基(每升含有酪蛋白水解物10g，酵母膏5g，NaCl 10g，蔗糖5g，MgSO4.7H2O0.5g，瓊脂15g，pH7.2)中培養。OHHL的生物分析使用具有甘露糖醇和(NH4)2SO4作為碳源和氮源的最小鹽培養基(Petit和Tempe，1978)。合適的抗生素以下述濃度加入氨芐青霉素100μg/ml；四環素20μg/ml；卡那霉素50μg/ml。AIs活性的生物分析現有技術已有測定AI活性的定性和定量生物分析方法(Zhang，1993)。為測定野生型和遺傳修飾的歐文氏菌菌株的AIs產生活性，使用相同的生物分析程序，指示在細菌培養物中不加入OHHL。AiiA基因的克隆和測序用EcoRI部分消化240B1的基因組DNA，將DNA片段與粘粒載體pLAFR3(Staskawicz等，1987)的去磷酸化EcoRI位點連接。連接的DNA用Gigapack III XL包裝提取物(Stratagene)包裝并轉染進大腸桿菌DH5α。具有OHHL失活活性的粘粒克隆用如上所述的生物分析方法鑒別。用常規技術(Sambrook等，1989)進行亞克隆進測序載體pGEM-7ZF(+)。用Lin等(1985)所述DNaseI方法進行缺失分析。用ABI PRISMTMdRhodamine終止循環測序反應試劑盒(PE Applied Biosystems)在兩條鏈上均進行測序。用DNASTARTM序列分析軟件包(DNASTAR Inc.)分析核酸序列數據和推導的氨基酸序列，用BLASTA檢索算法(Altschul等，1990)進行數據庫檢索。歐文氏菌菌株SCG1的遺傳修飾通過與輔助菌株RK2013(Ditta等，1980)進行三親本交配將在粘粒載體pLAFR3中攜帶aiiA基因的E7-R3質粒轉染進歐文氏菌菌株SCG1。在含有具四環素的最小培養基的平板上選擇接合子，并用特異于aiiA基因的引物經PCR證實。毒力測試通過接種評價野生型胡蘿卜軟腐歐文氏菌菌株SCG1和aiiA基因轉化子SCG1(E7-R3)的毒力。將4微升早期靜止期細菌懸液(含有約2×109細胞/ml)或稀釋的細菌加至切割表面或植物組織的創傷部位。接種的植物組織在28℃于Petri皿中培養過夜。培養48小時后檢查軟腐的嚴重性。結果篩選失活AIs的細菌篩選來自植物和土壤樣品的細菌分離物的AIs酶失活作用。選擇顯示消除AIs活性的強能力的細菌分離物240B1進行進一步研究。來自分離物240B1的總蛋白提取物在1小時培養期間完全消除AIs活性(圖1)，用蛋白酶K處理1小時或煮沸5分鐘會破壞該蛋白質失活AIs的能力。這些觀察表明細菌分離物240B1的酶失活AI的作用。由于如下特征，該分離物經分類學鑒定為芽孢桿菌菌種革蘭氏陽性，桿狀，過氧化氫酶陽性，兼性厭氧，與其它芽孢桿菌具有16rRNA序列同源性(數據未示出)。
失活AIs的酶的分子量看起來大于30kDa，其活性在將蛋白質提取物通過Centricon 30(Amicon)后喪失，但是在不能通過Centricon30的重懸部分中活性得以恢復(圖2)。AIs失活區的克隆和定位為鑒別編碼AIs失活的基因，用Listera菌株240B1的基因組DNA構建一粘粒文庫。篩選了1200個克隆的AIs失活活性，鑒別了3個顯示AIs失活功能的克隆。限制分析顯示這3個克隆均有一條由EcoRI消化產生的4.3kb條帶。用含有這一4.3kb EcoRI片段的亞克隆E7-7進行的生物分析證實這一片段編碼AIs失活功能(圖3)。為鑒別AIs失活基因(aiiA)的最小大小和位置，通過用DNaseI方法(Lin等，1985)從這一4.3kb片段的兩端缺失而產生一系列缺失克隆。結果表明aiiA基因包含在克隆F41的1.2kb片段中(圖3)。aiiA基因編碼一新蛋白完全測序克隆F41的1.2kb DNA插入序列的兩條鏈，aiiA的核苷酸序列和推導的氨基酸序列示于圖4。該DNA插入物的完整序列含有1222bp，并且具有分別起自第1、42、156和228位核苷酸的4個潛在符合讀框的開放讀框(ORF)(圖4)。缺失分析表明僅最長的ORF編碼AIs失活功能，因為盡管剩余的DNA插入物置于有功能的Ptac啟動子的控制下，但缺失了最長ORF的48bp啟動子區和1-13位核苷酸的克隆R34完全喪失了AI失活功能(圖3)。這一點通過將最長ORF與谷胱甘肽-S-轉移酶在同一ORF中融合并測試純化的融合蛋白的AI失活活性而證實(數據未示出)。這一ORF含有750bp核苷酸并編碼250個氨基酸的蛋白質，該蛋白質預計分子量為28036道爾頓，等電點為4.7，因為有19個強堿性氨基酸殘基和39個強酸性氨基酸殘基。推斷的起始密碼子之前7bp為一潛在的核糖體結合序列(AAGGTGG)，其與大腸桿菌16S rRNA的3’末端互補。與共有-10啟動子元件(TATAAT)的最佳序列匹配(TATTGT)在起始密碼子上游的35bp。代表潛在的因子不依賴性終止位點的TCTT盒和隨后的富T區域在終止密碼子下游發現(Brendel，1986)。aiiA基因的總GC含量為37％，密碼子的第3位的GC含量為27.2％。
數據庫檢索顯示通過FASTA和BLAST分析在核苷酸序列水平或肽序列水平，aiiA基因與主要數據庫(GenBank，歐洲分子生物學實驗室，蛋白質信息來源，和Swiss-Prot)中的已知序列無顯著相似性，提示AiiA是一新蛋白質。用遺傳學計算機公司(Madison，WI)MOTIF程序進行的共有蛋白質基序檢索顯示從AiiA的47-58位的短肽序列“ILVDTGMPESAV”與天冬氨酸蛋白酶活性位點代表模式(Rawlings和Barrett，1995)相似但不相同(圖5)。aiiA基因在胡蘿卜軟腐歐文氏菌中的表達降低了AIs釋放并弱化的毒力通過三親本交配將粘粒克隆E7-R3轉移進胡蘿卜軟腐歐文氏菌菌株SCG1。pLAFR3載體已在胡蘿卜軟腐歐文氏菌中無需選擇壓力而安全保持。生物分析表明由胡蘿卜軟腐歐文氏菌(E7-R3)釋放的AIs顯著降低(圖6，第6道)，而粘粒載體pLAFR3單獨在胡蘿卜軟腐歐文氏菌中的存在不影響AIs產生(圖6，第7道)。數據提示胡蘿卜軟腐歐文氏菌菌株SCG1產生的大多數AIs由aiiA基因產物失活。
表達AiiA蛋白的胡蘿卜軟腐歐文氏菌SCG1(E7-R3)在馬鈴薯、茄子、大白菜、胡蘿卜和芹菜中不導致或僅導致微弱的軟腐病癥狀，而其親本菌株導致嚴重癥狀(圖7A，B，C，D，E)。為防止由遺傳變異導致的實驗誤差，隨機選擇分別來自胡蘿卜軟腐歐文氏菌菌株SCG1及其aiiA基因轉化子的4個菌落，以測試AIs產生和對馬鈴薯的毒力。在兩個實驗中活動類似的結果。僅含有粘粒載體的胡蘿卜軟腐歐文氏菌菌株SCG1(pLAFR3)僅導致與其親本菌株胡蘿卜軟腐歐文氏菌菌株SCG1相同水平的疾病嚴重性(圖7F)。討論鑒別為芽孢桿菌的細菌分離物240B1產生能有效失活所測試的三種AIs，即N-β-氧基己酰基-L-高絲氨酸內酯、N-β-氧基辛酰基-L-高絲氨酸內酯和N-β-氧基癸酰基-L-高絲氨酸內酯的酶。編碼AI失活酶的基因(aiiA)已被克隆和完全測序。aiiA基因在轉化的大腸桿菌和致病細菌胡蘿卜軟腐歐文氏菌中的表達賦予AI失活的能力，并顯著降低胡蘿卜軟腐歐文氏菌釋放的AIs。我們知道，這是第一次鑒別的能酶失活各種細菌菌種中的全局基因調控自體誘導物N-酰基高絲氨酸內酯的蛋白質。
AiiA是一種新蛋白質，其與主要數據庫中的已知蛋白質無明顯同源性。其與天冬氨酸蛋白酶活性位點的共有模式具有相似性(Rawlings and Barret，1995)。天冬氨酸蛋白酶也稱為酸性蛋白酶，其在脊椎動物、真菌、植物、反轉錄病毒和某些植物病毒中廣泛分布。大多數反轉錄病毒和一些植物病毒的天冬氨酸蛋白酶是同源二聚體。AiiA蛋白的分子量大約為28kDa，但其不能通過截留值為30kDa的分子篩，表明AiiA蛋白在天然條件下可能以同源二聚體或同源多聚體形式存在。但是，也有一種可能性，即AiiA單體具有不規則三維結構，使得其不能通過分子篩。天冬氨酸蛋白酶是內切肽酶，其水解蛋白質的酰胺鍵。晶體學研究表明天冬氨酸蛋白酶家族的酶是雙圓形突出狀分子，在圓形突出之間有活性位點裂縫，每一圓形突出貢獻負責催化活性的天冬氨酸殘基對中的一個殘基(Sielecki等，1991)。
胡蘿卜軟腐歐文氏菌是一種植物病原體，其產生和分泌胞外酶以作為導致各種植物包括馬鈴薯、甘藍、番茄、辣椒、胡蘿卜、芹菜、洋蔥和萵苣的軟腐病的毒力決定簇(Kotoujansky，1987)。
不能產生N-3-(氧基己酰基)-L-高絲氨酸內酯的突變體也不能合成果膠酶、纖維素酶和蛋白酶胞外酶。這些突變體不能在馬鈴薯塊莖中誘導軟腐病(Jones等，1993)。已發現與費氏弧菌的luxI基因同源的expI基因編碼胡蘿卜軟腐歐文氏菌中的自體誘導物產生。當expI突變體導入煙草葉中時，其是無毒的，但是通過外部加入自體誘導物毒力得以恢復(Pirhonen等，1993)。很顯然，自體誘導物是植物軟腐病抗性基因工程的潛在靶。作為臨時試驗及概念證實途徑，將含有aiiA基因的粘粒克隆導入胡蘿卜軟腐歐文氏菌菌株SCG1中。AiiA酶在胡蘿卜軟腐歐文氏菌中的表達明顯降低了自體誘導物的釋放，且表達AiiA的遺傳修飾的胡蘿卜軟腐歐文氏菌在所有測試的植物包括馬鈴薯、茄子、大白菜、胡蘿卜和芹菜中不能誘導或僅誘導微弱的軟腐病癥狀。我們的結果進一步支持了自體誘導物在胡蘿卜軟腐歐文氏菌毒力基因表達的調控中的重要作用，以及aiiA基因賦予軟腐病和自體誘導物參與致病基因表達調控的其它疾病的抗性的潛力。
本發明提供了工程化抗病性的新策略，具體地，這一策略靶向以閾值濃度誘導許多細菌病原體的致病基因的表達的N-酰基高絲氨酸內酯自體誘導物。通過使用上述概念證實途徑，本發明證實通過自體誘導物失活酶降低或消除由致病細菌產生的自體誘導物明顯弱化毒性細菌病原體的致病性。由于致病細菌中致病基因的表達需要閾值濃度，因此這一AJ失活策略適用于其中細菌病原體的致病基因的表達由N-酰基高絲氨酸內酯自體誘導物誘導的所有植物、動物或哺乳動物疾病。
aiiA基因也可以是研究AIs在AIs調節的生物學功能尚未確定的細菌中的作用的有用工具。近年來，更多的細菌菌種已示出產生AIs(Bassler等，1997；Dumenyo等，1998；Cha等，1998；Surette等，1999)，它們中的一些是重要的植物病原體如假單胞菌和黃單胞菌菌種。基于序列同源性的基因敲除途徑可能是困難的，來自不同屬的AIs合酶和相關調控蛋白的序列相似性整體水平非常低，LuxI型蛋白之間的相同性經常不超過28-35％，LuxR型蛋白之間的相同性經常不超過18-25％(Fuqua等，1996)。但是將aiiA基因導入這些細菌以探查由AIs調控的生物學功能是可行和簡便的。
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權利要求
1.一種分離的核酸分子，其編碼細菌自體誘導物失活蛋白。
2.權利要求1的分子，其中所述核酸分子選自如下一組a)具有SEQ ID NO1的編碼部分的序列的核酸；b)編碼SEQ ID NO2的氨基酸序列的核酸；和c)與上述a)或b)的核酸雜交的核酸，其中陽性雜交信號在用1×SSC和0.1％SDS在55℃洗滌1小時后觀察到。
3.權利要求1的分子，其進一步包括任何序列的信號肽編碼區。
4.包含權利要求1的核酸分子的表達載體，其中所述表達載體在原核或真核細胞中繁殖。
5.用權利要求4的表達載體轉化或轉染的原核或真核細胞。
6.具有細菌自體誘導失活活性的分離的蛋白質，其中所述蛋白質包含SEQ ID NO2的氨基酸序列。
7.增加植物或動物的抗病性的方法，所述方法包括向這種植物或動物細胞中導入一種核酸序列，所述核酸序列編碼細菌自體誘導物失活蛋白，使所述細胞表達所述核酸序列。
8.權利要求7的方法，其中所述核酸序列選自如下一組a)具有SEQ ID NO1的編碼部分的序列的核酸；b)編碼SEQ ID NO2的氨基酸序列的核酸。
9.權利要求7或8的方法，其中所述核酸序列進一步包含任何序列的信號肽編碼區。
10.權利要求7或8的方法，其中所述核酸序列進一步包含任何來源的膜附著結構域編碼區。
11.權利要求7的方法，其中所述植物易感細菌軟腐病。
12.權利要求11的方法，其中所述植物選自馬鈴薯、茄子、大白菜、胡蘿卜和芹菜。
13.權利要求7的方法，其中所述植物易感其中毒力基因的表達由N-酰基高絲氨酸內酯自體誘導物調控的細菌軟腐病。
14.預防或降低植物或動物的細菌損害的方法，所述方法包括給予需要這種預防或降低的植物或動物有效量的細菌自體誘導物失活蛋白。
15.權利要求14的方法，其中所述蛋白包括SEQ ID NO2。
16.預防或降低植物或動物的細菌損害的組合物，所述組合物包括a)有效量的細菌自體誘導物失活蛋白；和b)合適的載體。
17.權利要求16的組合物，其中所述蛋白包括SEQ ID NO2。
18.篩選細菌分離物的自體誘導物失活活性的方法，包括a)從土壤或植物樣品中分離單菌落細菌培養物；b)篩選培養物的自體誘導物失活活性；c)從所述培養物制備粗蛋白提取物；和d)證實粗蛋白提取物的酶失活自體誘導物活性的作用。
19.分離權利要求1或2的核酸的方法，包括如下步驟a)在一合適宿主生物體中制備來自含有編碼具有自體誘導物失活活性的蛋白質的核酸序列的供體生物體的基因庫；b)篩選基因庫的克隆；和c)分離含有編碼具有自體誘導物失活活性的蛋白質的合適的克隆。
20.權利要求19的方法，其中用大腸桿菌作為宿主生物體。
21.權利要求19的方法，其中制備基因庫、篩選克隆和分離克隆的步驟在不失活自體誘導物的大腸桿菌菌株中進行。
22.一種方法，包括a)將權利要求1或2的核酸序列導入細菌細胞；和b)篩選得自步驟a)的細菌細胞的改變的生物學功能。
23.權利要求22的方法，其中所述改變的生物學功能是由于步驟a)而喪失的功能。
24.權利要求22的方法，其中所述改變的生物學功能是由于步驟a)而被抑制的功能。
25.權利要求22的方法，其中所述改變的生物學功能是由于步驟a)而被增強的功能。
全文摘要
本發明公開了編碼細菌自體誘導物失活蛋白的分離的核酸分子,所編碼的蛋白質及其抗菌用途。
文檔編號C12N5/10GK1361823SQ99816789
公開日2002年7月31日 申請日期1999年11月17日 優先權日1999年7月2日
發明者張煉輝, 董義虎, 徐金玲 申請人:分子農業生物學院