利用葉柄外植體進行的土壤桿菌介導的高效棉花轉化的制作方法

專利名稱：利用葉柄外植體進行的土壤桿菌介導的高效棉花轉化的制作方法
技術領域：
本發明涉及植物基因工程一般領域，尤其是通過土壤桿菌轉化棉花葉柄外植體接著進行體細胞胚胎再生而將外源遺傳物質導入棉花。
背景棉花是國際上最有價值并廣泛種植的經濟作物之一。世界棉花年產量超過一億包，價值450億美元。亞洲是最大的棉花產地，世界上五大棉花制造商中有四個位于亞洲。棉花不僅是紡織業的主要支柱，也為生產除草劑、控制病蟲害的化學品的生產商提供了巨大的有利市場。有多種從分子水平改良棉花的機會，包括提高產量和纖維質量及創造新的抗除草劑、昆蟲、線蟲和病變的品種。(Steward，1991)。
棉花的組織培養在1935年，Skovsted首次報道了棉花的胚胎培養。Beasley(1971)報道了棉花中愈傷組織的形成是受精的胚珠在Murashige & Skoog(MS)基質上從珠孔端長出旁枝。從G.klotzschianum(Price & Smith，1979)懸浮培養物中獲得體細胞胚胎發生。在1983年，Davidonis & Hamilton首次成功的從培養了兩年的愈傷組織獲得有效的可重復的棉花(陸地棉)植株的再生。從此棉植株從各種外植體(Zhang & Feng，1992；Zhang，1994)再生，外植體包括子葉(Davidonis等，1987；Davidonis & Hamilton，1983；Finer，1988；Firoozabady等，1987)、下胚軸(Cousins等，1991；Rangan & Zavala，1984；Rangan & Rajasekaran，1996；Trolinder & Goodin，1988；Umbeck等，1987，1989)、莖(Altman等，1990；Bajaj等，1989；Chen等，1987；Finer & Smith，1984)、苗端(Bajaj等，1985；Gould等，1991；Turaev & Shamina，1986)、未成熟胚胎(Bealsey，1971；Stewart & Hsu，1977，1978)、葉柄(Finer & Smith，1984；Gawel等，1986；Gawel &Robacker，1990)、葉(Fener & Smith，1984；Gawel &Robacker，1986)、根(Chen & Xia，1991；Kuo等，1989)、愈傷組織(Finer & McMullen，1990；Trolinder等，1991)和原生質體(Chen等，1989)。
棉花的轉化十年前首次報道使用下胚軸和子葉做外植體的土壤桿菌介導的棉花轉化(Firoozababy等，1987；Umbeck等，1987)。通過土壤桿菌介導的轉化，已將幾種有用的基因導入棉花中，包括害蟲和除草劑抗性基因(Perlak等，1990；Trolinder等，1991；Chen等，1994)。已經使用外植體(例如下胚軸、子葉、下胚軸和子葉產生的愈傷組織，及未成熟胚胎)進行土壤桿菌介導的轉化和粒子轟擊(de Framond等，1983；Finer & McMullen，1990；Firoozabady等，1987；Perlak等，1990；Rangan &Rajasekaran，1996；Rajasekaran等，1996；Trolinder等，1991；Umbeck等，1987，1989，1992)。另外，離體胚軸的分生組織也已通過粒子轟擊被用于棉花轉化(Chlan等，1995；John，1996；John & Keller，1996；McCabe & Martinell，1993)。Zhou等(1983)在自體授粉一天后將DNA注射到中軸胎座中而轉化棉花。
然而，轉化率通常較低，用下胚軸作外植體時，在20％到30％之間(Firoozabady等，1987；Cousins等，1991；Rajasekaran等，1996)。有報道使用子葉作外植體并用編碼章魚堿合成酶的ocs基因作報道基因時的顯著性高轉化效率，高達80％(Firoozababy等，1987)。然而，因為在確定的沒有被根癌土壤桿菌感染轉化的幾種植物中已經發現了章魚堿，所以使用章魚堿作為轉化標記的有效性仍不可靠(Wendt-Gallitelli和Dobrigkeit，1973)。一份最近的報道說明子葉的轉化效率大約在20到30％(Cousins等，1991)。當使用粒子轟擊法時，該轉化效率甚至更低(Keller等，1997)。用于轉化的外植體類型的差異可能對轉化和再生的效率有顯著性影響。已有報道，例如，為了減少假陽性轉化體，子葉是一種優于下胚軸的外植體(Firoozabady等，1987)。
棉花轉化也高度依賴于基因型(Trolinder，1985a，1986；Trolinder & Goodin，1987，1988a，1988b；Trolinder &Chen，1989)。除了少數可再生的并可轉化的品種，如陸地棉cv.Coker 312和陸地棉Jin7，大部分其它重要的優良商用品種，如陸地棉cv.D&P 5415和陸地棉cv.Zhongmian 12，用這些方法不能轉化和再生。缺少高效植物再生方法已被視為應用土壤桿菌介導的棉花轉化的主要障礙(Gawel等，1986；Firoozabady等，1987)。
發明的詳細描述本發明公開了一種有效的用葉柄作為外植體的基因轉化棉植株，包括優良品系的方法。通過使用葉柄作為外植體，和一系列改良培養基，與以前報道的方法相比，轉化效率顯著增強并且縮短了從轉化到再生所需的時間。
通過使用本發明的方法，從土壤桿菌轉化到轉基因小植株再生的整個過程需要6-7個月。所報道的下胚軸和子葉方法通常需要7-9個月或更長的時間完成相同的過程(Cousins等，1991；Chen等，未報道的觀察結果)。將小植株培養到合適移植入土壤中的大小還需要兩個月。
將外源基因導入土壤桿菌使得外源基因穩定地轉移到暴露于土壤桿菌的植物或植物組織中的技術是本領域公知的，其不屬于本發明的一部分。優選使用所謂“緩和(disarmed)”土壤桿菌菌株或Ti質粒，即，已除去或滅活由野生型土壤桿菌導致的冠癭病的腫瘤性質的基因的菌株或質粒。在文獻中可見大量緩和土壤桿菌菌株的實例(例如，pAL4404，pEHA101和pEH105(Walkerpeach &Veltern，1994))。更優選使用所謂二元載體系統，例如在Schilperoort等1990，1995中所描述的。二元載體系統允許在大腸桿菌中操作攜帶要導入植株中的外源基因的質粒，這使得載體構建的方法更易于進行。
類似地，使用本領域公知的技術構建載體，包括構建含有要導入植株的外源基因的嵌合基因，這不屬于本發明的一部分。嵌合基因應包括在要表達的宿主中有活性的啟動子。例如，為了轉化細胞的選擇，在轉化過程的不同階段具有一系列選擇標記是優選的。與在大腸桿菌中具有活性的啟動子相連的選擇標記(例如提供對抗生素如卡那霉素、頭孢噻肟或鏈霉素抗性的基因)可以用于選擇含該標記的細菌(即，轉化體)。另一種與植物活性啟動子如CaMV 35S啟動子或T-DNA啟動子如NPT II NOS啟動子相連的選擇標記可以用于選擇轉化植物細胞。要導入植物細胞的目的外源基因應含有與編碼序列功能相關的植物活性啟動子，這樣啟動子在轉化細胞中驅動基因表達。同樣，植物活性啟動子，如CaMV 35S，NPT II NOS啟動子或任何組織特異性的啟動子均為本領域公知的而且選擇適當的啟動子正是本領域的常規技術。
本方法可以用于產生表達任何數目外源基因的轉基因植物，而不被這種基因的選擇限制。目的外源基因的選擇根據研究者的目的而定，能夠用于本發明的目的基因的大量實例是本領域公知的(例如，蘇云金桿菌毒素基因、除草劑抗性基因如提供抗草甘膦抗性的莽草酸合成酶基因、美國專利5,188,642，或提供抗2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)抗性的2，4-D單加氧酶基因，Bayley等，理論及應用遺傳學，82卷，PP.645-49，雄性不育基因如美國專利5,741,684的反義基因(Fabijanski，等)，甚或美國專利5,723,765(Oliver等)描述的精細作物保護系統)。
本領域認為棉花再生有很強的品種依賴性。已證明Coker系列棉花品種相對易于轉化。然而，DP 5412，Zhongmian 12和許多其它品種仍然難于再生。海島棉和其它二倍體種情況是相同的。然而棉花的體細胞胚胎發生和再生成整個植株是高度基因型依賴的過程，用本發明方法已成功轉化并再生兩種不同的棉花品種，即美國Coker 312和中國Si-Mian 3。因此認為本發明可廣泛應用于不同棉花種系的轉化。
用標準Southern雜交技術已證實本發明的方法產生的棉花的基因組中的轉基因整合，同樣可以鑒定各轉基因品系中的插入轉基因的拷貝數(參見實施例6，見下)。可以檢測轉基因棉F1代中轉基因的存在，并可以分析F1代的轉基因遺傳模式以證實其穩定性和遺傳性。
與其它報道的方法相比，本發明的棉花轉化系統具有更高的轉化效率和生存率。這有幾方面的原因。本發明中，使用葉柄作為外植體進行轉化。不同類型的棉花外植體對植株的轉化和再生效率有顯著性影響。(Firoozabady等，1987)。曾有報道用葉柄進行體細胞胚胎發生的誘導。但再生并不成功或再生率極低(Finer和Smith，1984；Gawel等，1986)。而本發明中，通過使用下文所述的改良培養基顯著提高了再生效率。在優選的實施方案中，在含低濃度2，4-D和激動素的MMST培養基(見下文所述)中培養幼嫩的在初生維管束組織中富含薄壁組織細胞的葉柄時，獲得高質量的愈傷組織。
使用本發明，在懸浮培養基中誘導胚胎的時間可以縮短到10-14天，而不是以前報道的3周(Cousins等，1991)。發現縮短懸浮培養基處理的時間對高頻率誘導胚胎發生是很重要的。因為當棉花愈傷組織在懸浮培養基中長時間保存時，產生高百分比的很難再生的玻璃體胚胎，所以減少異常胚胎的產生也是重要的(Chen等，未發表的觀察結果)。
為了除幼小植株生長期以外的不同階段的最大細胞生長，使用葡萄糖作為單一碳源。培養基中葡萄糖的量可以為約10至約50g/l，優選為約30g/l。在幼小植株生長期，優選葡萄糖和蔗糖各為約10g/l作為碳源以促進幼小植株的健康生長。
對于愈傷組織的生長、胚胎發生和愈傷組織增殖，pH 5.8-7.5，優選pH6.2-7.0，最優選pH6.5。為了小植株根部健康生長，優選pH7.0的培養基。
為了有效的愈傷組織引發和胚胎潛能誘導，在愈傷組織誘導和選擇培養基中低濃度的2，4-D和激動素是重要的。2，4-D的量可以為0至約0.5mg/l，優選為約0.05mg/l。激動素的量為0.0mg/l至約1.0mg/l，優選為約0.1mg/l。在愈傷組織分化階段和胚胎萌發階段，當培養基中不添加植物激素時獲得最佳的結果。
氨基酸天冬酰胺和谷氨酰胺是特別有利于胚胎萌發和根部發生的優于無機氨氮的氮源。在胚胎萌發的培養基中，天冬酰胺的量為約200至約1000mg/l，優選為約500mg/l。谷氨酰胺的量為約500至約2000mg/l，優選為約1000mg/l。使用這些優選的氮源，當胚胎萌發、生長和根部發生被優先促進時，非胚胎發生的愈傷組織生長被抑制。
在除與土壤桿菌共培養之外的棉花轉化的不同階段，植物組織和愈傷組織優選保持在28℃，但可以在25-35℃變化。為了有效的轉化，共培養階段的溫度不應高于28℃。棉花轉化和再生的所有階段的優選光照條件均為每天光照16小時(60-90，μEm-2S-1)，8小時避光。
與以前報道的轉化和再生方法(Umbeck等，1987；Firoozabady等，1987，Cousins等)不同，本發明使用的培養基在幾個方面得到優化(a)除用于在植入溫室前培養幼小植株的培養基之外，所有的培養基都使用葡萄糖作為單一碳源；(b)培養基調至高pH值(6.5-7.0)；(c)僅在愈傷組織引發階段使用低濃度的2，4-D(0.05mg/l)和激動素(0.1mg/l)，在其它階段不使用激素；(d)用于胚胎萌發的培養基中使用天冬酰胺和谷氨酰胺替代無機氨氮。這些改良適合棉花胚胎發生和小植株生長的生理需要。已發現健康的胚胎發生和小植株生長，特別是根系發生，極大地得利于這些優化的培養基。例如，已發現天冬酰胺和谷氨酰胺是優于無機氨氮的氮源，利于胚胎萌發和根部發生。在含有天冬酰胺和谷氨酰胺作為氮源的優選的MMS3培養基(如下文所述)中，當胚胎萌發、生長和根部發生被有利地促進時，非胚胎生成的愈傷組織的生長受到抑制。由于健康的根部發生，由本發明方法獲得的移植轉基因棉存活率幾乎是100％。報道的下胚軸和子葉方法(Umbeck等，1987；Firoozabady等，1987)，不好的根部發生被認為是移植轉基因棉植株的低存活率的主要原因。
以下是實施例中優選使用的組織培養基(1)幼苗生長培養基(每升)1/2 MS基本鹽混合物(Sigma M5524)0.9g MgCl2·6H2O2.0g 吉蘭糖膠(PhytagelTM，Sigma)pH7.0(2)葉柄預培養培養基(每升)MS基本鹽混合物0.9g MgCl2·6H2O2.0g 吉蘭糖膠(PhytagelTM，Sigma)pH7.0(3)共培養培養基(每升)MS基本鹽混合物100mg鹽酸硫胺素1mg鹽酸吡多醇1mg煙酸100mg 肌醇0.05mg 2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)0.1mg 激動素30g葡萄糖0.9g MgCl2·6H2O2.0g 吉蘭糖膠(PhytagelTM，Sigma)pH 6.5(4)MMS1-愈傷組織誘導和選擇培養基(每升)共培養培養基50mg 卡那霉素500mg 頭孢噻肟(5)MMS2-分化培養基(每升)MS基本鹽混合物10mg 鹽酸硫胺素1mg鹽酸吡多醇1mg煙酸100mg 肌醇0.9g KNO330g葡萄糖0.9g MgCl2·6H2O2.0g 吉蘭糖膠(PhytagelTM，Sigma)pH6.5(6)MMS3-胚胎萌發培養基(每升)3.8gKNO3440mg CaCl2·H2O375mg MgSO4·7H2O170mg KH2PO41g 谷氨酰胺500mg 天冬酰胺43mgEDTA三價鐵-鈉鹽MS微量營養物(Murashige和Skoog，1962)10mg 鹽酸硫胺素1mg鹽酸吡多醇1mg煙酸100mg 肌醇30g葡萄糖0.9g MgCl2·6H2O2.0g 吉蘭糖膠(PhytagelTM，Sigma)pH6.5(7)幼小植株培養基S&H培養基大量和微量元素(Strewart和Hsu，1977)10mg 鹽酸硫胺素1mg鹽酸吡多醇1mg煙酸100mg 肌醇10g葡萄糖10g蔗糖0.9g MgCl2·6H2O2.0g 吉蘭糖膠(PhytagelTM，Sigma)pH7.0下述實施例的目的在于說明本發明，而非在任何意義上限制本發明的范圍，本發明的范圍僅在權利要求中限定。實施例1土壤桿菌菌株和質粒A.使用土壤桿菌菌株LBA 4404(pBI121GFP)轉化棉花葉柄和幼小的莖。

圖1顯示pBI121GFP物理圖譜，其含有GFP作為報道基因和NPTII基因(編碼新霉素磷酸轉移酶)作為選擇標記。GFP和NPTII基因分別受CaMV 35S啟動子和nos啟動子的控制。為了構建pBI121GFP，將來自質粒pGFP2的720bp的GFP基因XbaI-SstI片段克隆到質粒載體pBI121(Clonetech)上相同的位點以替代GUS基因。通過電穿孔將pBI121GFP質粒導入根癌土壤桿菌LBλ4404中。
收集低光照條件下在溫室中生長8-12周植株的幼嫩葉柄。用70％乙醇表面滅菌葉柄幾秒鐘，然后用20％漂白溶液(Clorox Co.USA，含1％氯)表面滅菌20分鐘。在無菌水中清洗五次后，葉柄在MS培養基中預培養3天。
將葉柄和幼嫩的莖切成約2cm長的片段。將片段浸入稀釋的細菌懸浮液中5分鐘，然后轉移到含有浸在50mml共培養培養基中的濾紙的塑料平皿(100×25mm)上。平皿置于24℃培養箱中連續光照48小時。將共培養外植體轉移到MMSI培養基中并在28℃培養，每天光照(60-90，μEm-2s-1)16小時，避光8小時。2-4周后在葉柄片段的切割端產生愈傷組織。4-6周后已出現卡那霉素抗性的愈傷組織，計算愈傷組織的數目并檢測GFP基因的表達。
在熒光顯微鏡下，未轉化的對照愈傷組織顯紅色，而表達GFP基因的轉化愈傷組織顯示鮮明的綠色熒光。總共檢測113個推測轉化的愈傷組織的GFP活性，GFP基因的轉化頻率是39.8％(表1)。當使用棉花品種Si-Mian 3的葉柄轉化時，發現26個檢測的愈傷組織中有11個為GFP陽性，轉化效率是42.3％。表1棉花Coker 312和Si-Mian 3葉柄的轉化頻率

實施例4誘導體細胞胚胎發生和植株再生選擇急劇生長和強表達GFP的愈傷組織并將其轉移到液體MMS2培養基中懸浮培養2周。選擇易成粉狀的乳白色顆粒狀愈傷組織并將其轉移到半固體分化培養基MMS2中。約2個月后，產生大量胚狀體。1-2個月內，培養基上逐漸發生胞質緊密的胚胎發生結構，并產生大胚胎。短時間的懸浮培養處理，不僅對高頻率誘導胚胎發生很重要，而且對產生高質量的胚狀體很重要。再次檢查GFP基因的表達均是GFP陽性的。
將具有強GFP活性的胚狀體和胚胎發生愈傷組織轉移到MMS3培養基中。1-2個月后，將約1-2cm高的具有1-2片真葉和根部發生良好的小植株轉移到幼小植物生長培養基培養約一個月。約一個月后，將具有6-8片葉子和高約10-15cm的小植株移植于土壤中并移入溫室。所有30株移植的轉基因植株均存活并發現表達GFP蛋白。獲得所使用的轉基因小植株所需要的總時間少于7個月，移植于溫室后看到小植株另需2個月(參見表2)。表2從轉化葉柄片段到植株再生的時間范圍(Coker 312)

實施例5檢測GFP蛋白活性使用Leica MZ FLIII熒光立體顯微鏡，其具有480/40nM激發濾片和510nM阻擋濾片，檢測GFP蛋白活性的表達。
在熒光立體顯微鏡下，轉化愈傷組織、胚狀體，和幼嫩小植株中GFP基因的綠色熒光易于分辨，而未轉化的對照呈紅色。可能是因為某些生色的化學物質積累于根部，未轉化的根部是例外，其在熒光顯微鏡下顯示弱綠色。但由于GFP蛋白產生的綠色熒光更亮更均一，所以仍然可鑒定出有GFP活性的根。在熒光立體顯微鏡產生的藍光下，諸如葉和莖這樣富含葉綠素的綠色植物組織的紅色熒光清晰可見。在GFP陽性綠色植物組織中，由于紅色和綠色熒光的重疊，黃色熒光也可檢測到。然而，與植物其它部分相比，GFP基因在花瓣和花藥中的表達更低。實施例6轉基因植物的分析根據Paterson等(1993)純化推測轉化品系和未轉化對照植株的基因組。用EcoRI消化后，EcoRI切割位于嵌合GFP基因T-DNA左邊緣和Nos-3′終止子之間的inj(圖1)，根據生產商說明書用0.8％的TAE瓊脂糖凝膠分離DNA并轉移到Hybond-N膜上。通過紫外交聯將DNA固定于膜上，再用DIG標記的GFP基因編碼區雜交。根據生產商說明書(BOEHRINGER MANNHEIM)用抗-DIG-AP綴合物檢測雜交探針。
用GFP基因編碼區作為雜交探針，Southern雜交分析來自11個隨機選擇的轉基因品系和1個未轉化的對照植株的基因組DNA樣品。數據表明11個品系中7個有單拷貝，3個品系有2拷貝，1個品系有6拷貝的T-DNA插入。具有單一拷貝T-DNA插入的轉基因品系的高百分比說明這種轉化方法導致基因沉默和不希望的插入突變體的危險較低。
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權利要求
1.生產轉基因棉植株的方法，所述方法包括下列步驟(a)獲得棉葉柄外植體，(b)將葉柄外植體暴露于攜帶包含外源基因和選擇標記的載體的根癌土壤桿菌培養物，該土壤桿菌能夠實現外源基因和選擇標記抗性基因穩定轉移到葉柄外植體細胞的基因組中，(c)培養葉柄外植體以誘導愈傷組織形成，(d)選擇表達外源基因的轉化愈傷組織，(e)在懸浮培養液中培養所選擇的愈傷組織以誘導胚狀體形成，(f)使胚狀體再生成整株轉基因棉植株。
2.如權利要求1所述的方法，其中的葉柄外植體在暴露于根癌土壤桿菌培養物之前預培養一段時間。
3.如權利要求1所述的方法，其中步驟(b)-(e)中使用的培養基含有葡萄糖作為單一碳源。
4.如權利要求3所述的方法，其中葡萄糖的量為約10g/l至約50g/l。
5.如權利要求4所述的方法，其中葡萄糖的量為約30g/l。
6.如權利要求1所述的方法，其中步驟(b)和(d)-(e)中使用的培養基不含激素。
7.如權利要求1所述的方法，其中胚狀體萌發在含有選自天冬酰胺、谷氨酰胺，或天冬酰胺和谷氨酰胺二者的氮源的培養基中進行。
8.如權利要求7所述的方法，其中氮源的量為約700mg/l至約5g/l。
9.如權利要求8所述的方法，其中氮源的量為約3.8g/l。
10.如權利要求7所述的方法，其中氮源是天冬酰胺和谷氨酰胺二者，且天冬酰胺的量為約200mg/l至約1g/l，谷氨酰胺的量為約500mg/l至約2g/l。
11.如權利要求10所述的方法，其中天冬酰胺的量為約500mg/l，谷氨酰胺的量為約1g/l。
12.如權利要求1所述的方法，其中步驟(e)的懸浮培養基的保存時間少于約20天。
13.如權利要求12所述的方法，其中步驟(e)的懸浮培養基的保存時間為約10至約20天。
14.如權利要求13所述的方法，其中步驟(e)的懸浮培養基的保存時間為約14天。
15.如權利要求1所述的方法，其中步驟(c)在低濃度的一種或多種激素的存在下進行。
16.如權利要求15所述的方法，其中任何一種激素的濃度為0至約1mg/l。
17.如權利要求15所述的方法，其中步驟(c)在濃度為0至約0.5mg/l的2，4-二氯苯氧乙酸和濃度為0至約1mg/l的激動素的存在下進行。
18.如權利要求17所述的方法，其中2，4-二氯苯氧乙酸的濃度為約0.05mg/l，激動素的濃度為約0.1mg/l。
全文摘要
本發明公開了土壤桿菌介導轉化葉柄組織從而產生轉基因棉的方法。本發明包括步驟(a)獲得棉花葉柄的外植體,(b)將葉柄外植體暴露于攜帶包含外源基因和選擇標記的載體的根癌土壤桿菌培養物,該土壤桿菌能夠實現外源基因和選擇標記抗性基因穩定轉移到葉柄外植體細胞的基因組中,(c)培養葉柄外植體以誘導愈傷組織形成,(d)選擇表達外源基因的轉化愈傷組織,(e)在懸浮培養基中培養所選擇的愈傷組織以誘導胚狀體形成,(f)使胚狀體再生形成整株轉基因棉植株。
文檔編號C12N5/10GK1352692SQ9981672
公開日2002年6月5日 申請日期1999年6月11日 優先權日1999年6月11日
發明者陳志賢, 張煉輝 申請人:分子農業生物學院