專利名稱：控制細菌即發根土壤桿菌中的基因表達,來改進根瘤發育、固氮和植物生物量產生的方法
描述本發明涉及使用發根土壤桿菌(Agrobacterium rhizogenens)A4菌株的rolA基因的啟動內含子(promintron)DNA序列，或其衍生的啟動內含子DNA序列，或其它發根土壤桿菌菌株同源基因的啟動內含子DNA序列，在重組細菌中轉錄水平上啟動基因表達，并在細菌和/或類菌體內實現例如植物激素的合成。
本發明證明，當丁香假單胞菌(Pseudomonas syringae)的iaaM基因和根癌土壤桿菌(Agrobacterium tumefaciens)的tms2基因在啟動內含子序列控制下，在根瘤菌中作為雙順反子單元表達時，能改進根瘤形成過程和固氮。啟動內含子特別適用于在根瘤發育的所有階段中，在類菌體中驅動基因表達，以在根瘤發育期中獲得感興趣基因的組成型表達。因此，組成型在此意味著通過根瘤發育各階段的不同表達模式，在植物細胞攜帶根瘤菌的根瘤所有部分中實現了基因表達。
本發明來源于以下未公開的證明，即土壤桿菌A4菌株rolA基因的85bp內含子序列能啟動原核細胞內的基因表達。因此，該85bp DNA序列稱為“啟動內含子(promintron)”，表明它在真核細胞中作為內含子(Magrelli，A.等(1994)科學，266，1986-1988)和原核細胞中作為啟動子的功能。術語“啟動子”指轉錄起始，即RNA多聚酶結合所必需的核苷酸序列，還包括例如-35和-10盒，或其它調控區。
rolA啟動內含子在根瘤菌中的啟動子活性能在根瘤中以新穎特殊模式導致基因表達，導致組成型表達。
本發明特別用于ⅰ)通過產根瘤的植物和/或固氮細菌改變根瘤發育并提高固氮；ⅱ)用遺傳學改變的根瘤菌(在此根瘤菌用作包括根瘤菌、中華根瘤菌、固氮根瘤菌和慢生根瘤菌的總稱)接種豆科植物，來改進植物生長和加速植物生物量產生。
本發明還涉及DNA構建物，其中所述啟動內含子控制DNA序列表達，通過表達導致上述作用。另外，本發明涉及基因工程改造的細菌，它們能改進固氮并因而改進植物生物量產生。另外，可在對根瘤形成過程有不利影響的硝酸鹽濃度存在下實現植物中固氮的提高。
在今后的25年中，世界人口將很可能增加兩億，大部分在亞洲和非洲。來自豆科植物的蛋白質實際占了人類總飲食的33％。豆科植物能通過與根瘤菌屬(即根瘤菌、中華根瘤菌、固氮根瘤菌、中間根瘤菌(Mesorhizobium)和慢生根瘤菌)的固氮菌共生，來自身供氮。還存在不屬于豆科植物的其它植物，也能通過讓細菌寄生在固氮根瘤中。不屬于豆科，能與固氮根瘤菌相互作用的植物是Parasponia(榆)。另外，弗蘭克菌(Frankia)屬的放線菌能與八個不同科的植物物種相互作用，并導致根瘤的產生(Pawlowski，K.等，(1998)于21世紀的生物固氮，C.Elmerich，A.Kondorosi和W.E.Newton編，Kluwer Academic Publisher，pp.199-201)。共生固氮在氮循環中起主要作用。然而，農業利用導致從土壤中大量吸收有機氮，須通過向作物供肥料來補償。然而施用氮肥引起嚴重的環境問題，因為它的過量引起水污染。施用氮肥代表了農業成本最重要的部分之一。在過去55年中，全世界氮肥的消費從3TG增加到100TG(1TG＝1012g)。為了生產氮肥，全世界每年要燒掉2％-5％的不可更新能源(例如石油和其它形式的燃料)。與使用合成氮肥有關的環境問題是過量硝酸鹽滲入地下水。釋放的硝酸鹽10％以上會變成一氧化氮(一種溫室氣體，其能量反射量是二氧化碳的180倍)(Hardy，R.M.F.和Eaglesham，A.R.J.(1995)，于固氮原理和應用，I.A.Tikhonovich等(編)，pp.619-620)。工業化國家中的許多大城市正面臨著飲用水的硝酸鹽污染問題，人用水的價格將迅速上升。
因此，本發明代表的根本問題是，需要改進豆科植物和其它根瘤植物的種植，目的是使環境中硝酸鹽的釋放急劇下降。這些問題的一個解決方法是增加能固定大氣中氮的作物種植，或提高其固氮能力。
自生生活(free-living)、結合、和共生固氮微生物的生物固氮作用(BNF)每年將約120,000,000噸大氣中的氮轉化成氨，提供了氮總需求的40％(Vance，C.P.，第三屆歐洲固氮會議，Lunteren，The Netherlands，1998，p.17)；共生固氮是還原氮的主要天然機制(Franssen，H.J.等(1992)，植物分子生物學，19，89-107)。根瘤菌家族的成員(包括固氮根瘤菌)能和主要豆科作物共生，導致形成根瘤。在根瘤細胞中，細菌分化成類菌體。成熟的類菌體固定大氣中的氮并通過固氮酶作用將其轉化成氨。如此產生的銨鹽從根瘤中輸出，摻入植物氨基酸，酰脲和含氮堿基中。因此，在根瘤存在下，植物生長不依賴其它氮源。
根瘤發育是受幾種因素控制的共生作用的結果。該作用早期需要在兩個參與者植物根和細菌之間交換化學信號。植物根產生化學信號，如類黃酮，它吸引根瘤菌，最重要的是誘導細菌基因(nod基因，和所謂的Nod因子產生有關)的表達。Nod因子是脂寡聚糖，它在根瘤發育早期起關鍵作用(Denariè，J.，Debellè，F.，和Promè，J-C.(1996)生物化學年鑒，65，503-535)。
雖然已明確了Nod因子在引發根瘤發育中的作用，但還不清楚根瘤發育中植物激素的作用，植物激素是能改變植物生長和發育的植物生長因子。因為植物激素幾乎和植物的任何發育和/或生理過程有關，植物激素在根瘤發育中的作用是最合理的。然而，盡管努力對根瘤形成中植物激素作用的總體問題作了闡述，1994年Hirsch和Fang用下面的話總結了該領域中的狀況“重要的問題仍未解答哪些激素參與根瘤形成，和它們是如何起作用的？”(A.M.Hirsch和Y.Fang，(1994)植物分子生物學，26，5-9)。
在1936年，Thimann(Thimann，K(1936)P.N.A.S.USA，22，511-514)已提出植物生長素在根瘤發育中起作用，而且根瘤含有植物生長素。另外，根據生物試驗，Thimann顯示根瘤內以植物生長素活性所估計的植物生長素含量比未受感染的根中高。
現在，已明確自生生活的根瘤菌確實含有植物生長素，如吲哚-3-乙酸(IAA)、吲哚-3-乙醇、吲哚-3-醛和吲哚-3-甲醇(Ernstsen，A.等(1987)Planta 171，422-428)。另外，吸引根瘤菌和刺激Nod因子合成的類黃酮(即植物根產生的化學信號)刺激液體培養中生長的根瘤菌的IAA合成(Prinsen，E.等(1991)FEBS Letters，282，53-55)。
雖然這些資料和植物生長素在根瘤發育中的可能作用一致，但Hirsch 1992年報道了“根瘤菌能合成植物激素，但它們的產生植物生長素基因中的突變不阻止根瘤形成，Nod-突變株也能產生激素”(Hirsch，A.M.(1992)新植物學家，122，211-237)。
其它研究著重于對根瘤形成過程的“植物貢獻”，如Hirsch，A.M.等(P.N.A.S.USA(1989)86，1244-1248)、Allen，E.K.，O.N.和Newman，A.S.(美國植物學雜志(1953)40，429-435)和Torrey，J.G.(于“植物和插條中的新根形成”，1986編，Jackson MB，Martinus Nijhoff Publishers，Dordrecht，31-66)，已發現極性植物生長素運輸的抑制劑誘導了擬南芥根上的假根瘤。Mathesius等(植物雜志(1998)14，23-34)近來顯示植物生長素運輸抑制先于根瘤形成。Kijne，J.W.等(第三屆歐洲固氮會議，Lunteren，The Netherlands，1998，p24)已顯示ⅰ)IAA的局部增加先于在內皮中細胞分化的誘導和ⅱ)硝酸鹽抑制對IAA的反應，而不是其積聚。
其它在根瘤發育中，植物組織產生的植物生長素性植物激素的作用指標來自苜蓿(Medicago varia)的變體，其已明確為植物生長素敏感性，并常含有較高含量的植物生長素，比起不敏感的變體能形成更多的根瘤(Kondorosi，E.等(1993)于Nester，E.W.和Verma，D.P.S.編.，植物微生物相互作用的分子遺傳學進展，pp.143-150)。另外，轉入rolB基因的植物更快的形成根瘤，并具有更多的根瘤(Kondorosi等，ibidem)。已知RolB能增加植物生長素敏感性。一些作者認為rolB的作用不影響植物生長素含量，并且是植物生長素IAA的膜受體，而其它人(PCT申請號WO98/28430)認為RolB蛋白是一種β-葡糖苷酶，能使吲哚乙醇-葡糖苷釋放植物生長素吲哚乙醇。吲哚乙醇本身被視為植物生長素，它被轉化成IAA，植物中的主要植物生長素形式(Sembdner，G.等(1980)于植物生理學百科全書，第9卷發育的激素調節.I.植物激素的分子方面，pp.281-444；MacMillan，J.編，Springer，Berlin，Herdelberg，New York；Sandberg，G.，Crozier，A.，Ernstsen，A.(1987)于植物激素分析的原理和實踐，卷2，pp.169-301，Riveier，L.，Crozier，A.編，Academic Press，London)。
本發明著重于與上述問題有關的三個方面ⅰ)是否可能通過在根瘤菌內表達植物生長素合成基因改變根瘤發育？；ⅱ)根瘤菌基因修飾株形成的根瘤植物將大氣中的氮還原成氨的能力是否提高？ⅲ)基因修飾的根瘤菌產生的根瘤植物是否有生長改變，和該改變是否促進植物生物量的產生？可從植物基因組或細菌基因組中取得編碼能改變植物生長素代謝的酶的基因(Spena，A.，Estruch，J.J.和Schell，J.(1992)生物技術目前觀點3，159-163)。無論基因和/或編碼區的起源如何，必須在正確的啟動子(DNA)序列控制下通過對編碼區進行定位賦予所述編碼區在細菌內，和最重要的，在類菌體內正確的表達特異性。
本發明通過提供一種技術，改進重組細菌，優選根瘤菌屬和最優選根瘤菌中的基因表達，來解決該優先領域的這些問題。不難利用該方法來正確控制能提高植物生長素含量的基因表達，結果促進根瘤化和固氮過程。本發明的啟動內含子序列能以臨時確定的表達方式在類菌體所位于的所有根瘤區帶中促進原核表達。另外，該啟動內含子驅動生長對數期的基因表達且在自生生活細菌的靜止期中被誘導。當要在生長的對數期和靜止期和在根瘤類菌體中，促進固氮土壤細菌的基因表達時，所有這些特征都是非常有利的。
特別在本發明的基因構建物中含有rolA基因的啟動內含子序列，如SEQ IDNO1，和丁香假單胞菌薩氏亞種iaaM及根癌土壤桿菌的tms2基因的編碼區。這兩個編碼區已被構建成在rolA啟動內含子控制下的雙順反子，該啟動內含子的啟動子活性在根瘤中以未公開的新穎表達模式發揮作用。該啟動內含子和雙順反子單元聯合及將其導入根瘤菌中，使本發明的作者得以顯示植物生長素影響根瘤的發育和功能。這兩個編碼區的用途是在根瘤植物細胞中提高IAA的合成和含量，并因而也提高IAA偶聯物(總稱，指所有和氨基酸或和葡萄糖或其它化學基團共價偶聯的IAA形式)的合成和含量。可使用其它土壤桿菌或假單胞菌菌株的iaaM和tms2基因，或使用其它能提高IAA含量的基因來實現相同效果。
由于根瘤菌通常不含有吲哚乙酰胺，也不能將色氨酸轉化成吲哚乙酰胺(IAM)，更不能將IAM轉化成IAA(Ernstsen等，1987，ibidem)，作者已工程改造了一種生物化學途徑，它同時需要兩種基因來從色氨酸有效合成IAA。然而，在不含bam基因-一種tms2基因的內源同源物(Sekine，M.，Watanabe，K.和Syono，K.(1989)細菌學雜志171，1718-1724)的那些根瘤菌(如慢生根瘤菌)中，在該啟動內含子DNA序列的控制下僅表達iaaM基因這可能已經足夠了。tms2的功能同源物還存在于一些高等植物中，如PCT申請WO98/28430所示。
在本發明的另一個實施例中，該啟動內含子驅動的DNA序列表達是一種編碼吲哚丙酮酸脫羧酶啟動內含子。吲哚丙酮酸脫羧酶是IAA合成的吲哚丙酮酸途徑中的關鍵酶，其中IAA是從色氨酸合成的。吲哚丙酮酸轉化成IAA是該途徑的限速步驟。例如，已從陰溝腸桿菌(Enterobacter cloacae)克隆了一種編碼合適的吲哚丙酮酸脫羧酶的DNA序列，(見例如Koga等，普通分子遺傳學(1991)，226，10-16)。
術語“植物生長素”在本文中指天然存在和合成的有機物質，起植物激素的作用，即它們優選以低濃度，最優選低于10-6M的濃度促進芽的伸長并抑制根的伸長。優選的，植物生長素對植物發育顯示至少一種以下作用刺激細胞分裂、細胞伸長、和/或細胞膨脹、頂端優勢，刺激木質部分化，刺激形成層細胞的細胞伸長和細胞分化作用，刺激側根和不定根形成，刺激根瘤化、發芽、葉子的偏上性、子房細胞生長、單性結實、雌花形成和葉子長大。更具體的，術語“植物生長素”指吲哚3-乙酸(IAA)，它最有可能在植物細胞中通過吲哚-3-丙酮酸和吲哚-3-乙醛從色氨酸合成，并通過酶催化性氧化而降解。然而，該術語也指其它天然存在的起植物生長素作用的化合物，衍生自吲哚或其它化合物，例如，非吲哚植物生長素或4-(吲哚-3-基)丁酸的天然存在的苯乙酸。另外，該術語指來自植物以外的生物體的化合物，或化學合成的化合物，它們對植物發育具有至少一種如上列出的作用。這些化合物的一個例子是(2，4-二氯苯氧基)-乙酸(2，4-D)。
在一個優選例中，和該啟動內含子連接的DNA序列編碼與至少一種植物生長素的生物合成天然有關的多肽。該DNA序列在根瘤菌細胞中的表達導致該多肽生物(如酶)活性的提高，并因而在根瘤植物細胞中首先提高了至少一種植物生長素在類菌體中的含量，以及隨后從類菌體中輸出植物生長素。因此從原理上說，通過該實施例可見，由于刺激/加速導致植物生長素合成的生物合成途徑而提高了至少一種植物生長素的生物合成，可增加植物生長素含量和/或活性。在另一個優選例中，和該啟動內含子連接的DNA序列編碼一種天然根瘤菌中不表達的蛋白質，它在類菌體中表達后導致從細菌細胞和/或類菌體代謝物合成至少一種植物生長素，或植物生長素前體。為本發明的該目的優選使用的一種基因的例子是薩氏假單胞菌(Pseudomonas syringae subsp.Savastanoi)的iaaM基因，橄欖和夾竹桃樹中植物腫瘤的病原因子(ethiologicalagent)(Spena，A.，Estruch，J.J.，Schell，J.，生物技術目前觀點(1992)，3，159-163)。腫瘤發育是由該細菌合成的植物激素引起的，然后它被分泌入周圍組織，并刺激植物細胞的局部化生長。在和該類腫瘤的致病機理有關的基因中，iaaM基因編碼吲哚乙酰胺一氧化酶，而且它負責通過氧化將氨基酸色氨酸轉化成吲哚乙酰胺。吲哚乙酰胺沒有特別的植物生長素活性，但它通過薩氏假單胞菌的iaaH基因(和根癌土壤桿菌的tms2基因同源)編碼的水解酶轉化成IAA。在植物組織中，吲哚乙酰胺也可經化學或非特異性水解酶轉化成IAA。
已知薩氏假單胞菌的iaaM基因，而且已公布了它的序列(Yamada等(1985)P.N.A.S.USA，82，6522-6526)。已知道根癌土壤桿菌的tms2基因，并公布了其序列(Klee，H等(1984)P.N.A.S.USA81，1728-1732)。根據本發明，可為了本發明的目的可使用與丁香假單胞菌的iaaM基因和根癌土壤桿菌的tms2基因功能同源的基因。本領域技術人員可使用已知方法，如采用基于丁香假單胞菌iaaM基因和/或根癌土壤桿菌的tms2基因設計的探針篩選cDNA或基因組文庫，來優選分離核苷酸序列也同源的這些基因。已從例如土壤桿菌的某些菌株(即根癌土壤桿菌和根瘤土壤桿菌；見例如Klee等(1987)基因發育1，186-196；White等(1985)細菌學雜志，164，33-44；Cardarelli等(1987)，普通分子遺傳學，208，457-463)克隆了與丁香假單胞菌的iaaM基因產物活性相似的這些基因。
Ri質粒A4的rolA基因的85bpDNA啟動內含子序列(SEQID NO1)能在原核系統(如大腸桿菌、根瘤菌和土壤桿菌)中，在生長的對數期、對數期后和靜止期啟動在它控制下(即和它的3’末端連接)的DNA序列的基因表達。另外，該啟動內含子能促進根瘤內類菌體中的基因表達。本領域技術人員可不難的，而且不經創造性努力即可從其它根瘤土壤桿菌的菌株中分離啟動內含子序列和/或分離功能性同源的啟動子，即能在根瘤內的類菌體中和/或自生生活的細菌中以相同方式驅動基因表達的啟動子。
因此本發明的一個具體目的是使用SEQ ID NO1中的根瘤土壤桿菌rolA基因的啟動內含子序列，或使用含有所述啟動內含子序列的DNA序列，或其功能性同源物或其部分，在重組細菌的生長對數期、對數后期和靜止期中以及在根瘤內的類菌體中，誘導DNA編碼序列的表達，所述編碼DNA序列是在所述啟動內含子序列的控制下，或在功能同源性啟動子的控制下。優選重組細菌屬于陰溝腸桿菌或根瘤菌家族，更優選是大腸桿菌、根瘤菌或土壤桿菌。
在一個優選例中，重組細菌是根瘤菌屬的，在共生根瘤內或自生生活狀態。當細菌在共生根瘤中時，它們是I、II、III、IV、V階段的類菌體，或質外(apoplastic)空間的根瘤菌，或衰老區的根瘤菌、或存在于固氮區的根瘤菌，或存在于侵襲區的根瘤茵。
本發明的另一個目的是一種重組DNA分子，它含有本發明的啟動內含子序列，或其功能同源物或部分，和與該啟動內含子序列3’末端共價連接的DNA編碼序列，其中該重組DNA分子是由游離基因元件所攜帶或整合在細菌基因組中。優選的DNA編碼序列是單順反子或多順反子轉錄單元，更優選編碼和植物激素合成和/或代謝有關的蛋白質，最優選編碼和植物激素植物生長素合成和/或代謝有關的蛋白質，最優選編碼和植物生長素IAA和或植物生長素吲哚乙醇的合成和/或代謝有關的蛋白質，甚至更優選編碼來自薩氏假單胞菌的iaaM蛋白或其同源物(即具有相似的酶活性)和/或編碼根癌土壤桿菌的tms2蛋白或其同源物。在一優選方面中，本發明的重組DNA同時包含iaaM和tms2編碼區。
另外，本發明的重組DNA分子含有一DNA編碼序列，它編碼陰溝腸桿菌的吲哚丙酮酸脫羧酶或其同源物。
本發明的另一個目的是基因工程改造含有所述重組DNA分子的細菌。細菌優選包含在下表中如上面具體化的根瘤菌、土壤桿菌、固氮螺菌、魚腥藍細菌、腸桿菌。
使用重組DNA分子來增加根瘤的大小和/或活性，和/或提高植物生物量生產在本發明的范圍內。
使用重組DNA分子提高根瘤的固氮能力在本發明的范圍內。
本發明將在一些例子中參考下圖進行描述
圖1嵌合性報道基因的示意圖。86AGUS構建物含有ⅰ)86bp長的DNA片段，含有如SEQ ID NO1所示85bp的長啟動內含子序列，在其3’末端加一個A殘基；ⅱ)對應rolA蛋白的前40個氨基酸的DNA序列，融合于ⅲ)uidA編碼區。85-17GUS構建物從5’到3’末端含有Eco RI限制性位點(GAATTC)，SEQ IDNO1的啟動內含子序列，17bp接頭序列(SEQ ID NO2)，KpnI限制性位點(GGTACC)，先于uidA編碼區的ATG。ΔGUS指僅含uidA編碼區的構建物，即不含任何啟動內含子序列。啟動內含子指含有rolA啟動內含子的85bp(從-1到-86，rolA基因ATG起始密碼子的A是+1)的86bp序列。rolA編碼區指編碼rolA蛋白NH2端40個氨基酸的序列。GUS指uidA編碼區。作為EcoRI片段在載體pG(pMB393(Gage，D.J.，Bobo，T.和Long，S.R.(1996)細菌學雜志，178，7159-7166，見材料和方法))中雙向克隆了該構建物。
圖2在含有86AGUS構建物的豌豆根瘤菌(Rhizobium leguminosarum)中β-葡糖醛酸酶活性的生長期依賴性表達。使細胞在豐富培養基(富含色氨酸-酵母抽提物的培養基)中生長，直到靜止期(在時間軸線負側的第一樣品)，然后用TYR培養液稀釋100倍。顯示了600nm處的光密度(空心方塊)和特異性β-葡糖醛酸酶活性(實心方塊)。數值是至少4個獨立實驗的平均值。SE指標準誤差。構建物ΔGUS(只含有uidA(GUS)編碼區)顯示沒有可檢測水平的特異性β-葡糖醛酸酶活性，而因此在圖中未表示。
圖3用含有86AGUS構建物的豌豆根瘤菌蠶豆變種(R.I.viciae)感染小巢菜(Vicia hirsuta)植株的根瘤，在不同齡對根瘤染色檢測β-葡糖醛酸酶活性。欄A-D顯示了一周齡的根瘤。A欄顯示只有幾層細胞被感染，因此就在分生組織(在E欄中用星號標出)背后著染(藍)色。欄B顯示在該發育階段感染區正在擴大并將隨后(欄C)占據整個根瘤。欄D顯示同一根上三個不同感染階段的三個根瘤。欄E顯示一個兩周齡的根瘤；注意所有內部組織受到表達GUS活性的類菌體侵襲的柱形根瘤區。欄F顯示三周齡的固氮根瘤(其中II和III區著染(藍)色，而衰老的IV區幾乎不著色)。欄G顯示四周齡的根瘤，和根最接近的衰老晚期區帶染色深。欄H顯示對GUS活性和淀粉沉積的雙染色(見材料和方法)；注意箭頭指出的間斷帶II-III。在間斷帶II-III上方可見尺寸變小，仍著染(藍)色的侵襲區II；雙箭頭顯示最接近根的GUS活性(藍)斑點。
圖4。欄A-E1被含有86AGUS構建物(欄C、D和欄A和G右側)或啟動內含子-iaaM-tms2構建物(欄B、E、E1、F和欄A和G左側)的野生型豌豆根瘤菌蠶豆變種感染的根。欄F和G是顯微鏡明視野影像。注意欄A左側的根被含有啟動內含子-iaam-tms2構建物的細菌感染，具有較大的根瘤，群聚在種子附近，后隨一長段沒有根瘤的根。根的最遠端部分又有根瘤。欄A右側的根已被含有86AGUS構建物的豌豆根瘤菌蠶豆變種感染顯示沿著根有規律的出現根瘤(在欄D中放大)。欄B和C比較了用野生型(欄C)和含有啟動子-iaaM-tms2構建物基因修飾(欄B)的根瘤菌引生的根瘤大小。欄E和E1顯示了攜帶啟動內含子-iaaM-tms2構建物的細菌引發的兩類根瘤形態欄E中為二葉形，或欄E1中為高度成簇。在欄F中顯示暗視野顯微鏡對用含有啟動內含子-iaaM-tms2構建物的豌豆根瘤菌蠶豆變種接種而產生二葉根瘤(見材料和方法)的清晰圖像。在欄G中，將欄F中所示的同一對根瘤與攜帶86AGUS構建物的豌豆根瘤菌蠶豆變種衍生的同齡根瘤的比較，并染色顯示β-葡糖醛酸酶活性。
圖5在種子生長袋(Mega International，Minneapolis)中培育小巢菜，每袋5粒種子。在欄A和B左側，和欄C中，顯示了35日齡的，被攜帶啟動內含子-iaaM-tms2構建物的豌豆根瘤菌蠶豆變種感染的植株；在欄A和B的右側部分和欄D中顯示了被含有86AGUS構建物的豌豆根瘤菌蠶豆變種感染的植株。注意在欄A和B中，被啟動內含子-iaaM-tms2構建物感染的植株比被攜帶86AGUS構建物的根瘤菌感染的植株尺寸大。用含有86AGUS構建物的豌豆根瘤菌蠶豆變種根瘤化的植物每株具有(欄D)較小的葉子，較少的枝和更多老化葉子。由攜帶啟動內含子-iaaM-tms2構建物的根瘤菌根瘤化的植株顯示具有更深暗綠色的葉子(欄C)，另外植株具有更健康的外觀(比較欄C和欄D)。
圖6乙炔還原試驗(ARA)。數據比較用攜帶86AGUS構建物的豌豆根瘤菌蠶豆變種(對照)或用攜帶啟動內含子-iaaM-tms2構建物的根瘤菌根瘤化的18、27和31日齡植株的ARA。在每種情況下，將對照視為100％，而數據表示為用含有啟動內含子-iaaM-tms2構建物的根瘤菌根瘤化的根所獲得的ARA增長百分數。各直方柱代表從50株植物獲得的中位值。ARA表示成任意單位。
圖7植株干重。緊靠種子上方切下根瘤化植株莖，在85℃爐中干燥過夜。欄A顯示了用攜帶86AGUS構建物(對照)的豌豆根瘤菌蠶豆變種根瘤化的，和用含有啟動內含子-iaaM-tms2構建物的根瘤菌感染的18、27和31日齡植株的干重。在每種情況下，將對照視為100％，在橫坐標軸上標為0；數據表示為用啟動內含子-iaaM-tms2構建物根瘤化的植株莖獲得的干重相對應于對照的變化百分數。各直方柱代表50株植物的值。
圖8根瘤土壤桿菌Ri質粒A4的rolA啟動內含子核苷酸序列。序列顯示和Sigma 70-依賴性啟動子的-10和-35區，ⅱ)sigma 38依賴性啟動子的-10區，以及ⅲ)黑體印出的所謂的GEAR-BOX序列具有同源性。箭頭標出了主要的轉錄起始點。
圖9野生型豌豆根瘤菌蠶豆變種RPR1105(欄1-4)或啟動內含子-iaaMtms2構建物(欄5-8)在小巢菜幼苗上產生的29(欄1和5)、36(欄2和6)、43(欄3和7)和50(欄4和8)日齡的根瘤。注意5、6、7和8與欄1、2、3和4中的對照根瘤比較，根瘤大小增加和形狀不同。
圖10小巢菜植株的根瘤，由豌豆根瘤菌蠶豆變種RPR1105的野生株或由其含有啟動內含子-iaaM-tms2構建物的衍生物所根瘤化，在感染后14、21、28、35、42和49日從根上切下。欄B顯示了每株植株平均重量圖(Mnod(mg)/pp)；標出了標準誤差。各點代表每株植物的平均根瘤重量，該結果來自至少200個經篩選的根瘤。欄A顯示了獲得的線的垂線。
圖11野生型豌豆根瘤菌蠶豆變種RPR1105(欄1和2)、啟動內含子-iaaMtms2構建物(欄3和4)或86AGUS構建物(欄5)產生的5周齡根瘤的薄切片(甲苯胺藍染色)。欄2和4分別是欄1和3所示兩個根瘤的根瘤分生組織放大圖。分生組織在欄5中無活性，在欄1和2的根瘤頂端有活性，在欄3和4的雙側極端活躍并擴大，其中在具有大區帶的新近感染細菌的根瘤帽上有小分裂細胞(亮染色)。
下文描述了所用的材料和方法重組質粒的構建使用標準技術構建了重組DNA質粒。將86AGUS、85-17GUS和ΔGUS構建物雙向作為EcoRI片段亞克隆入質粒載體pG(pMB393的衍生物)中(Gage，D.J.，Bobo，T.和Long，S.R.(1996)，ibidem)，該質粒載體pG是通過除去一條750bp長的EcoRI片段而獲得，然后通過電穿孔引入豌豆根瘤菌蠶豆生物變種(Rhizobium leguminosarum biovar viciae)，菌株LPR1105，一種RCR1001的利福平抗性衍生型(Hooykas P.J.J.等(1977)普通微生物學雜志，98,477-484)中。實施例3中描述了含有驅動iaaM和tms2基因的rolA啟動內含子的構建物pG-啟動內含子-iaaMtms2。
生長條件和GUS試驗30℃在TYR培養液中培養攜帶不同構建物的豌豆根瘤菌蠶豆生物變種細胞。測量OD600確定生長曲線。
離心收集細菌，以50mM磷酸鈉緩沖液(pH7.0)、10mM β-巰基乙醇、10mMNa2EDTA、0.1％十二烷基肌氨酸鈉、0.1％Triton X-100重量、5分鐘超聲處理兩次，4℃16.000xg離心10分鐘。用上清液測試GUS活性。如Jefferson所述進行熒光GUS試驗(Jefferson，R.(1987)植物分子生物學報告，5,387-405)。用Bradford試劑(BIORAD)按照廠商說明書確定細菌抽提物中的蛋白質濃度。
將攜帶不同構建物的根瘤菌接種在補充了100微克/毫升奇霉素的TYR豐富培養基上，并篩選，影印到含有100微克/毫升利福平的平板上。培養要接種到植物上的菌株，直到靜止期，12,000g離心5分鐘，用pH7.4的PBS洗滌，重懸于相同緩沖液。測定600nm的光密度，將105個細胞施用于各株秧苗，培育1小時。以5％的過氧化氫表面滅菌小巢菜種子30分鐘，然后用無菌雙蒸水充分洗滌。種子4℃膨脹過夜，然后在1.5％瓊脂平板上避光發芽三天。感染后，發芽的幼苗在含有10毫升Jensen培養液(Vincent，J.M.(1970)I.B.P.手冊第15冊，Oxford，Blackwell Scientific publications)的種子發芽袋(MEGAInternational Minneapolis，USA)中生長。植物在70％濕度、16/8光/暗周期17℃或22℃中生長。
原位GUS染色切下根瘤化植株的根，37℃在X-Gluc試劑混合物(1mM X-葡糖醛酸化物、0.1mM NaPO4、10mM EDTA pH7.0、0.5mM亞鐵氰化鉀pH7.0、0.5mM亞鐵氰化鉀pH7.0、0.1％Triton X-100)中培養過夜，然后以含4％多聚甲醛的PBS緩沖液固定(GUS方案，Gallagher S.G.，1992，Academic Press，Inc)。然后將根在遞增濃度的無水乙醇中脫水，浸入2∶1苯甲酸苯酯-苯甲醇的混合液(Sigma)中澄清。對于淀粉染色，將整個根瘤在0.1M碘化鉀水溶液中浸20秒。用Nikon顯微鏡在亮視野和反射偏振光光路中拍攝整個根瘤。
切下根瘤化的根(每15毫升試管4個根)并在室溫下注射1毫升乙炔至少1小時，進行乙炔還原試驗(ARA)。從各試管取出1毫升注射入配備了PerkinElmer 561記錄儀和Porapack Q柱的Perkin Elmer Sigma 3B氣相色譜儀中，獲得了乙炔和乙烯峰。
實施例1根瘤土壤桿菌的rolA基因的剪接體內含子是在根瘤菌中具有活性的啟動子。
跨越rolA內含子(85bp長，從位置-1到位置-86，rolA基因ATG起始密碼子的A是+1)的DNA序列(下文稱為啟動內含子)，能驅動根瘤菌中的原核表達。通過將uidA基因(Jefferson，1987，ibidem)的編碼區和一片段融合，(該片段含有編碼該啟動內含子(即rolA啟動內含子(SEQ ID NO1)的85個bp加上后隨rolA編碼區的ATG起始密碼子的A)之后RolA蛋白的NH2-末端40個氨基酸的DNA序列)構建了一報道基因構建物(86AGUS；圖1)。用熒光試驗檢測攜帶構建物86AGUS的豌豆根瘤菌蠶豆生物變種抽提物中的GUS活性(圖2)。用85-17GUS構建物(含有SEQ ID NO.1的啟動內含子和一個17bp接頭(SEQ ID NO2)和uidA編碼區(圖1))獲得了相似的表達模式(數據未顯示)。構建物ΔGUS本身含uidA編碼區(圖1)，在攜帶該構建物的根瘤菌中不顯示任何GUS活性(數據未顯示)。在色氨酸-酵母抽提物(豐富培養基)中培養攜帶三種構建物任一種的豌豆根瘤菌蠶豆變種LPR1105至靜止期，600nm光密度達1.8，然后在相同培養液中稀釋100倍。在生長對數期的早、中和晚期取樣，然后在靜止期的早期和晚期取樣。僅在攜帶86AGUS(圖2)或85-17GUS(數據未顯示)構建物的豌豆根瘤菌蠶豆變種的蛋白質抽提物中檢測到GUS活性，而ΔGUS和未轉化的根瘤菌一樣，顯示沒有可檢測水平的β-葡糖醛酸酶活性。獲得的數據顯示，在攜帶86AGUS(或85-17GUS構建物)的根瘤菌中，β-葡糖醛酸酶活性在生長對數期間下降，并在靜止期早期升高，在生長靜止期晚期達到最高值(圖2)。重復同一實驗，但用含有一定濃度的甘露醇作為碳源的最小極限培養液稀釋在豐富培養液中生長的靜止期培養物100倍。稀釋后，觀察到長期遲后期的延長，隨后是生長對數期和光密度達到0.6的生長靜止期。該0.D.的減少是使用了碳限制條件所導致的。受靜止期sigma因子sigma S調控的腸細菌啟動子在這些條件下特別活躍。啟動內含子序列攜帶有類似sigma S的共有序列(圖8)。在生長靜止期中，攜帶86AGUS構建物的根瘤菌GUS活性增強，達到的值比在豐富培養基中達到的生長靜止期所測的值高2倍，這是碳饑餓的結果。因此，由該啟動內含子序列驅動的基因表達和生長速率呈逆相關，并在生長靜止期的開始被誘導。已發現一種利用85-17GUS構建物的相同表達模式，其中用17個堿基對的如SEQ ID NO.2所示的多接頭將啟動內含子序列和uidA基因分開。因此，85bp長的該啟動內含子在根瘤菌中具有啟動子功能。空心方塊代表600nm處的光密度；實心方塊代表GUS活性。
實施例2啟動內含子以新穎和出乎意料的表達模式驅動根瘤內的基因表達。
用攜帶86AGUS構建物或85-17GUS或ΔGUS的豌豆根瘤菌蠶豆生物變種菌株LPR1105感染小巢菜植株。幼苗在溫室條件下生長至種植后60天，在不同時間切下根，用聚甲醛緩沖液固定，并染色檢測原位GUS活性(Jefferson，1987，ibidem)，在合適的緩沖液中過夜培育后，將根浸在遞增的乙醇溶液中脫水，然后用甲苯澄清，在亮視野光學顯微鏡下觀察。含有SEQ IDNO.1所示的啟動內含子DNA序列的DNA片段在根瘤中促進共生根瘤菌的表達，具有特征性和新穎的表達模式，導致感興趣的基因組成型表達。組成型表達是指，雖然在具體模式中是定時的，但總體上它在植物細胞含有類菌體的根瘤的所有區域發生。該表達模式與sigma54或sigma70類調控的啟動子的表達模式具有明顯差異，對于比較見Sharma.S.B.和E.R.Signer(1990)普通發育學，4,344-356。
當進入宿主植物時，根瘤菌即稱為類菌體。已知類菌體經歷5種分化形式，從階段1-5逐漸老化。Vasse，J.，等(1990)細菌學雜志，172，pp.4295-4306描述了這些不同階段。在不確定的根瘤如小巢菜中，最年幼的類菌體位于早期感染區II中，靠近從根伸出的分生組織尖(代表I區)，其中剛從先跨越根毛然后皮質層的感染線釋放的細菌，最終達到生長的根瘤。老得多的類菌體位于晚感染區II，然后是在固氮區III，最后在衰老區IV中僅存在類菌體的痕量(ghost)膜。在任何年齡的根瘤II、III和IV區中，包括在最鄰近根的非常老的衰老區中均觀察到該啟動內含子驅動的表達(見圖3)。因此，在任何階段的攜帶類菌體的所有植物細胞確實在其類菌體內具有β-葡糖醛酸酶活性。拍攝了被含有86AGUS構建物的根瘤菌感染的根瘤的照片。采用僅能得到稍弱的信號的85-17GUS構建體獲得了相同的表達模式。用攜帶構建物ΔGUS的根瘤菌未觀察到染色。在圖3，I欄中存在GUS(藍)活性和淀粉(深棕色)的雙染色。在更老的根瘤中，淀粉沉積發生在III和IV區，但它是最常用的，因為其染色說明了間區II-III(見圖3欄I中的箭頭)。GUS染色同時在間區II-III上或下。
實施例3質粒DG-啟動內含子-iaaM-tms2的構建在用EcoRI-KpnI切開的pG質粒中連接含有SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2的EcoRI-KpnI片段，跨越rolA啟動內含子序列，獲得重組質粒pG-啟動內含子-iaaM-tms2。然后用KpnI-HindIII切開質粒pG-啟動內含子，分別引入作為KpnI-SphI和SphI-HindIII片段的iaaM和tms2編碼序列。1775bp(2＋53＋1671＋49)的KpnI-SphI片段跨越薩氏假單胞菌的iaaM基因的編碼區。Yamada等(1985，indem)已確定了iaaM序列的特征，所用的序列含有1773bp(53＋1671＋49)，從位于ATG起始密碼子前53個bp的DraI位點到TAA終止密碼子后46bp的SphI位點。跨越根癌土壤桿菌pTi A6(Klee，H.等(1984)P.N.A.S.USA 81，pp.1728-1732)的tms2編碼區的1452(22＋13＋1403＋14)bp的SphI-HindIII片段含有編碼區的1403個bp，前有14個bp，后有5個bp，屬于tms2基因的非翻譯區。
因此，獲得的質粒pG-啟動內含子-iaaM-tms2具有以下結構特征-一個啟動內含子片段，它含有rolA啟動內含子的85個bp(SEQ ID NO.1)，加接頭序列的17個bp(SEQ ID NO.2)，并在其5’末端具有EcoRI銜接頭(序列為GAATTC)；-作為KpnI位點的6個bp(序列GGTACC)加另兩個額外堿基作為接頭；-薩氏假單胞菌iaaM基因5’非翻譯序列的53個bp；-薩氏假單胞菌iaaM基因編碼區的1671個bp；-以SphI位點為末端的薩氏假單胞菌iaaM基因3’非翻譯尾隨序列的49個bp(終止密碼子的46＋3bp)；-由多接頭序列構成的22個bp(CTGCAGGTCGACTCTAGAGGAT，SEQ ID NO.3)；-tms2基因非翻譯前導區的13個bp(CCAACTCAGAGAG，SEQ ID NO.4)；-跨越根癌土壤桿菌pTiA6的tms2基因編碼區的1403個bp；-3’末端處的14個bp，包括HindIII位點(序列TAAACATCAAGCTT，SEQ IDNO.5)，其中TAA是終止密碼子，該終止密碼子后的tms2編碼區3’處的AC序列，和剩下的HindIII接頭序列(HindIII位點是AAGCTTT)。
實施例4啟動內含子-iaaM-tms2構建物改變根瘤數，位置和大小。
用86AGUS構建物或啟動內含子-iaaM-tms2構建物感染后，在第18日收集小巢菜幼苗。使用攜帶86AGUS構建物的根瘤菌感染植物，每株植物觀察到平均22個根瘤，而用攜帶啟動內含子-iaaM-tms2構建物的根瘤菌感染植物，該數量減少到每株植物7.5個根瘤。將對照的86AGUS構建物感染的植物看成100％，根瘤菌中存在的雙順反子操縱子使根瘤數減少了65％。和該特征相反，用攜帶啟動內含子-iaaM-tms2構建物的根瘤菌感染的植物根瘤尺寸大大增加。在圖4欄B和C中，可比較根瘤大小。不僅含有啟動內含子-iaaM-tms2構建物的根瘤菌誘導尺寸更大的根瘤，而且有時候根瘤還是二葉的(欄E)。另外，攜帶啟動內含子-iaaM-tms2構建物的根瘤菌引起的根瘤大多數位于主根上(圖4，欄A左)很少象攜帶86AGUS構建物或不攜帶任何構建物的根瘤菌接種的植物那樣，位于次生根上(圖4，欄A，右)。最后，圖4(欄A，左)顯示攜帶啟動內含子-iaaM-tms2構建物的根瘤菌引起的根瘤聚集在靠近種子的根區，然后是一大段不發生根瘤的根。這不是野生型根瘤菌引起的根瘤化模式(其均由沿根均勻分布的小根瘤組成)(圖4，欄A右和欄D)。
實施例5攜帶啟動內含子-iaaM-tms2構建物的根瘤菌誘導的根瘤顯示乙炔還原活性(ARA)的提高。
用野生型豌豆根瘤菌蠶豆生物變種菌株LPR1105或攜帶86AGUS或啟動內含子-iaaM-tms2構建物的相同菌株感染的根瘤化根，感染后跟蹤1個月，并分析將乙炔還原成乙烯的活性。這是最常用的間接酶分析，來評估固氮酶復合物將大氣中的氮還原成氨的能力。在兩種不同溫度(17℃和22℃)下，每點使用50株植物，進行了8個獨立實驗。結果顯示啟動內含子-iaaM-tms2構建物誘導了根瘤的形成(在22℃)，這些根瘤與野生型根瘤菌或攜帶86AGUS或85-17GUS的根瘤菌產生的對照根瘤相比能更有效的將乙炔還原成乙烯。因此，啟動內含子-iaaM-tms2構建物的存在提高了根瘤固氮的能力。用細菌接種發芽的種子后18、27和31天采集樣品。以氣相色譜(見材料和方法)中跟蹤乙炔還原活性(ARA)，并表示成任意單位。在圖6中取對照(每種情況至少50株植物)的中位值作為100％。每根直方柱表示和對照比較，用啟動內含子-iaaM-tms2構建物根瘤化的根的ARA增加百分數。在時間函數中，ARA百分數與對照相比從18天時增加30％，到31天時增加240％。
實施例6植物生長和生物量如圖5所示，用含有啟動內含子-iaaM-tms2構建物的根瘤菌根瘤化的35日齡小巢菜較大(增加20％以上)。另外，這些植物不僅更大，而且其表型也改變，與用野生型豌豆根瘤菌蠶豆變種接種的姐妹植株比較，具有暗綠色的葉子和更好的活力。在圖7中列出了18、27和31日齡植物的干重。將任一日齡的對照植物干重視為100％，標為0。可觀察到在18日，當種子儲藏蛋白對植物生長影響仍重要時，用含有啟動內含子-iaaM-tms2構建物的根瘤菌根瘤化的植物平均干重有顯著下降(即24％)。相反，27和31日齡植物，當種子中所含的氮幾乎耗盡時，用攜帶啟動內含子-iaaM-tms2構建物的根瘤菌根瘤化的植物干重，與用野生型根瘤菌株或含有86AGUS或85-17GUS構建物根瘤化的植物干重相比，分別增加了35％和44％。
實施例7乙炔還原測量進行乙炔還原試驗，比較在小巢菜上用豌豆根瘤菌蠶豆生物變種野生型菌株RPR1105或其含有啟動內含子-iaaM-tms2構建物的衍生株產生的根瘤。感染后直到23日，這兩種菌株以相似速率還原相同量的乙炔。感染5周后，對照根瘤中分生組織活性停止，而用含有啟動內含子-iaaM-tms2構建物的細菌接種的根瘤中，直到8周后仍在產生新感染的細胞。感染39日后，當比較啟動內含子-iaaM-tms2構建物和野生型菌株時，乙炔還原達到了100％增加。
實施例8莖干重的增加進行了小巢菜莖干重的分析，來比較用豌豆根瘤菌蠶豆生物變種野生型菌株RPR1105和其含有啟動內含子-iaaM-tms2構建物的衍生株根瘤化的小巢菜植物。直到感染后23天，植物生物量基本未受影響。然而感染51天后，當啟動內含子-iaaM-tms2構建物和野生型菌株比較時，觀察到15％的增加。
實施例9總氮含量分析進行小巢菜莖干重的分析后，接著進行了礦物質化總氮含量分析。按照Dumas的方法(Simonne等，食品農業科學雜志，73，39-45)，使用氮分析儀Macro-N(Foss Heraeus Analysensysteme，Hanau Germany)測量了作為元素N的總氮含量。在用豌豆根瘤菌蠶豆生物變種野生型菌株RPR1105，和用其含有啟動內含子-iaaM-tms2構建物的衍生株根瘤化的小巢菜植物上，直到感染后51日總氮濃度都未受影響。
實施例10根瘤重量分析進行了根瘤重量分析，來比較用豌豆根瘤菌蠶豆生物變種野生型菌株RPR1105和其含有啟動內含子-iaaM-tms2構建物的衍生株根瘤化的植物。圖9顯示在小巢菜幼苗上由野生型豌豆根瘤菌蠶豆變種1004株(欄1-4)或啟動內含子-iaaM-tms2構建物(欄5-8)所產生的29、36、43和50日齡的根瘤。用兩種菌株感染后直到4周根瘤總質量都未受影響。在感染42天后，當比較啟動內含子-iaaM-tms2構建物和野生型菌株時，達到2倍增加。圖10B顯示兩種菌株直到感染49天后的根瘤重量比較數據圖表。圖10A欄顯示了對于豌豆根瘤菌蠶豆生物變種野生型菌株RPR1105，內推線的斜率是0.26，而當使用啟動內含子-iaaM-tms2構建物時，斜率值是0.46。
實施例11分生組織活性分析分析了用0.02％甲苯胺藍染色的5周齡根瘤的薄切片，以比較用豌豆根瘤菌蠶豆生物變種野生型菌株RPR1105和其含有啟動內含子-iaaM-tms2構建物的衍生株根瘤化的植物。圖11顯示在含有86AGUS的細菌產生的根瘤中沒有分生組織活性和新感染的細胞。然而當使用野生型菌株RPR1105時，它們存在并限于根尖；同時，當使用啟動內含子-iaaM-tms2構建物時分生組織活性仍然非常活躍，在根瘤頂部有許多分裂(小)細胞，和許多新感染(亮染色)的細胞。因此很明顯，相同日齡在三個樣品中產生的根瘤的大小和形狀是具有統計學差異的。
實施例12法國菜豆中乙炔還原的測量進行了乙炔還原試驗，來比較用(Rhizobuim etli)的野生型菌株E3或其含有啟動內含子-iaaM-tms2構建物的衍生株根瘤化的法國菜豆植株。和根瘤的小巢菜不定型相反，法國菜豆產生定型根瘤，即缺乏持久分生組織的根瘤，這和在黃豆根上產生的類似。感染后23日，乙炔還原速率相同，與用于感染根的菌株無關。感染后43日，用含有啟動內含子-iaaM-tms2構建物的細菌接種的法國菜豆植株與野生型(R.etli)CE3比較時，增加了100％。
實施例13法國菜豆中莖干重的增加進行了法國菜豆莖干重分析，來比較用(Rhizobuim etli)野生型菌株CE3或其含有啟動內含子-iaaM-tms2構建物的衍生株根瘤化的植株。干重在感染后直到23日時還是相同的，與所用的菌株無關，而在48日后用含有啟動內含子-iaaM-tms2構建物的CE3菌株根瘤化的植物莖干重與用(Rhizobuim etli)CE3野生型菌株感染的48日齡法國菜豆植株比較時，增加了15％。
實施例14法國菜豆中根瘤重量分析進行了法國菜豆根瘤重量分析，比較用(Rhizobuim etli)野生型菌株CE3或其含有啟動內含子-iaaM-tms2構建物的衍生株根瘤化的植物。直到感染后23日，根瘤重量是相同的，與所用的菌株無關。而在48日時，用含有啟動內含子-iaaM-tms2構建物的CE3菌株根瘤化的植株根瘤重量與48日齡的用(Rhizobuim etli)野生型CE3菌株感染的法國菜豆植株比較，增加了50％。
序列表<110>G.IN.E.ST.R.A.s.c.ar.l.
ConSiglio Nazionale delle RicercheSpena，AngeloDefez，Roberto<120>控制細菌即發根土壤桿菌中的基因表達，來改進根瘤發育、固氮和植物生物量產生的方法<130>PCT<140><141><160>5<170>PatentIn Ver 2.1<210>1<211>85<212>DNA<213>發根土壤桿菌<400>1gtgagtgtgg ttgtaggttc aattattact atttttgaag ctgtgtattt ccctttttct 60aatatgcacc tatttcatgt ttcag<210>2<211>17<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述接頭序列<400>2gggtaggtca gtccctt17<210>3<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述接頭序列<400>3ctgcaggtcg actctagagg at 22<210>4<211>13<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述接頭序列<400>4ccaactcaga gag13<210>4<211>13<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述接頭序列<400>4ccaactcaga gag13<210>5<211>14<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述接頭序列<400>5taaacatcaa gctt 1權利要求
1.如SEQ ID NO.1的發根土壤桿菌rolA基因的啟動內含子序列，或含有所述啟動內含子序列的DNA序列，或其功能性同源物或其部分的用途，其特征在于，在生長對數期、對數期后和靜止期的重組細菌中，和在根瘤內的類菌體中誘導DNA編碼序列的表達，所述編碼DNA序列在所述啟動內含子序列的控制下。
2.如權利要求1所述的啟動內含子序列的用途，其特征在于，所述重組細菌屬于腸桿菌或根瘤菌科。
3.如權利要求2所述的啟動內含子序列的用途，其特征在于，屬于腸桿菌或根瘤菌科的所述重組細菌是大腸桿菌、根瘤菌或土壤桿菌。
4.如權利要求3所述的啟動內含子序列的用途，其特征在于，所述重組細菌屬于根瘤菌屬，在共生根瘤內或自生生活狀態下。
5.如權利要求1所述的啟動內含子序列的用途，其特征在于，所述共生根瘤內的根瘤菌屬重組細菌是I、II、III、IV、V階段的類菌體，或質外空間中的根瘤菌，或衰老區中的根瘤菌，或固氮區中的根瘤菌，或侵襲區中的根瘤菌。
6.一種重組DNA分子，其特征在于，該DNA分子含有如權利要求1所述的啟動內含子序列，或其功能性同源物或其部分，和共價連接于所述啟動內含子序列3′末端的DNA編碼序列，所述重組DNA分子由游離基因元件攜帶或整合在細菌基因組中。
7.如權利要求6所述的重組DNA分子，其特征在于，所述DNA編碼序列是一種單順反子或多順反子轉錄單元。
8.如權利要求6或7所述的重組DNA分子，其特征在于，所述DNA編碼序列編碼與植物激素合成和/或代謝有關的蛋白質。
9.如權利要求8所述的重組DNA分子，其特征在于，所述DNA編碼序列編碼和植物激素植物生長素合成和/或代謝有關的蛋白質。
10.如權利要求8所述的重組DNA分子，其特征在于，所述DNA編碼序列編碼與植物生長素吲哚-3-乙酸或植物生長素吲哚乙醇合成和/或代謝有關的蛋白質。
11.如權利要求8所述的重組DNA分子，其特征在于，所述DNA編碼序列編碼薩氏假單胞菌的iaaM蛋白質或其同源物。
12.如權利要求8所述的重組DNA分子，其特征在于，所述DNA編碼序列編碼根癌土壤桿菌的tms2蛋白質或其同源物。
13.如權利要求8所述的重組DNA分子，其特征在于，所述DNA編碼序列同時編碼權利要求11和12中分別所述的iaaM和tms2編碼區。
14.如權利要求8所述的重組DNA分子，其特征在于，所述DNA編碼序列編碼陰溝腸桿菌的吲哚丙酮酸脫羧酶或其同源物。
15.含有權利要求6-14的重組DNA分子的基因工程改造的細菌。
16.如權利要求6-14所述的重組DNA分子的用途是使植物根瘤顯著增大。
17.如權利要求16所述的重組DNA分子的用途，其特征在于，根瘤大小的所述統計學顯著增加是至少20％。
18.如權利要求6-14所述的重組DNA分子的用途是使根瘤化植物固氮能力顯著提高。
19.如權利要求18所述的重組DNA分子的用途，其特征在于，固氮能力的所述統計學顯著的增加是至少20％。
20.如權利要求6-14所述的重組DNA分子的用途是使植物生物量產生顯著增加。
21.如權利要求20所述的重組DNA分子的用途，其特征在于，植物生物量生產的所述統計學顯著增加是至少10％。
22.豆科植物，其特征在于，該豆科植物被攜帶如權利要求6-14所述的重組DNA分子的細菌感染，并在根瘤尺寸，和/或根瘤固氮能力，和/或植物生物量，和/或固氮能力上有顯著提高。
全文摘要
本發明描述了一種衍生自發根土壤桿菌A4菌株rolA基因的插入序列的啟動內含子序列。該序列能在根瘤發育的所有階段驅動類菌體內的基因表達,以在根瘤發育期內獲得感興趣基因的組成型表達。還描述了所述序列、衍生的載體和重組細菌的用途。
文檔編號C12N15/70GK1330716SQ99814359
公開日2002年1月9日 申請日期1999年11月8日 優先權日1998年11月9日
發明者R·德費, A·斯彭納 申請人:G.In.E.St.R.A.有限合伙公司, 國家研究院