酶促修飾果膠的方法

專利名稱：酶促修飾果膠的方法
技術領域：
本發明涉及一種方法。
本發明具體涉及使用酶的方法。
本發明更具體地涉及酶促修飾果膠的方法。
果膠是結構多糖，在植物細胞壁中通常以原果膠的形式存在。果膠的骨架含有(1→4)連接的-α-D-半乳糖醛酸殘基，其中間插含有少量(1→2)連接的-α-L-鼠李糖單位。
此外，果膠含有高度分支的區域，該區域具有幾乎交替出現的鼠李糖-半乳糖醛酸聚糖鏈。這些高度分支的區域還含有其它糖單位(如D-半乳糖，L-阿拉伯糖和木糖)，這些糖單位通過糖苷鍵與鼠李糖單位的C3或C4原子或半乳糖醛酸單位的C2或C3原子結合。通常，將-(1→4)-α連接的半乳糖醛酸殘基長鏈稱為“光滑”區，而將高度分支的區域稱為“具毛區”。
半乳糖醛酸殘基的一些羧基被酯化(例如羧基被甲基化)。例如，一些半乳糖醛酸殘基被甲醇酯化。典型的羧基酯化發生在半乳糖醛酸殘基聚合之后。然而，所有羧基都被酯化(如甲基化)的情況十分罕見。
通常，酯化的程度為0-90％不等。如果50％或更多的羧基被酯化，所得果膠被稱為“高酯果膠”(簡稱為“HE果膠”)或“高甲氧基果膠”。如果低于50％的羧基被酯化，所得果膠被稱為“低酯果膠”(簡稱為“LE果膠”)或“低甲氧基果膠”。如果50％的羧基被酯化，所得果膠被稱為“中酯果膠”(簡稱為“ME果膠”)或“中甲氧基果膠”。如果果膠不含任何-或僅含極少量酯化基團，通常稱之為果膠酸。
果膠的結構，特別是酯化(如甲基化)程度決定著果膠很多的所得物理和/或化學特性。例如，果膠的膠凝作用取決于果膠的化學結構，尤其是酯化程度。此外，果膠的膠凝作用還取決于可溶性固體的含量，pH和鈣離子濃度。關于后者，已知鈣離子與游離羧基，尤其是LE果膠上的游離羧基形成復合物。
根據果膠酶進攻果膠分子的聚半乳糖醛酸部分所采取的模式對其進行分類。有關一些果膠酶的評論可參見Pilnik和Voragen(食品酶學，編者P.F.Fox；Elsevier；(1991)；pp303-337)。特別是，也被稱為PME的果膠甲脂酶(EC 3.1.1.11)可以使HE果膠脫酯，成為LE果膠或果膠酸。與之相反，例如，果膠解聚酶可以裂解半乳糖醛酸甲酯殘基之間的糖苷鍵。
更詳細地，PME活性可產生游離羧基和游離甲醇。自動滴定可以容易地監測游離羧基的增加。在這一點上，早期研究已證實一些PME能以隨機的方式使果膠脫酯，也就是說它們能使一個或一個以上果膠鏈上的任何酯化(如甲基化)半乳糖醛酸殘基脫酯。能隨機地使果膠脫酯的PME的例子可得自真菌來源，例如棘孢曲霉(參見WO94/25575)和日本曲霉(Ishii等，1980，食品科學雜志，44，p611-14)。Baron等(1980Lebensm.Wiss.μ-Technol，13pp 330-333)顯然已從黑曲霉中分離到真菌的PME。據報道，該真菌PME的分子量為39000D，等電點為3.9，最適pH為4.5，Km值(mg/ml)為3。
與之相反，已知一些PME以分段的方式使果膠脫酯，也就是說，據信它們在非-還原末端或游離羧基的鄰接處進攻果膠，然后通過單鏈機制沿著果膠分子前進，從而產生對鈣敏感的非-酯化半乳糖醛酸單位區段。例如，植物PME能以分段的方式酶促果膠脫酯。有人提出柑橘中存在12種PME同工型(Pilnik W.和Voragen A.G.J(食品酶學，編者P.F.Fox；Elsevier；(1991)；pp303-337))。這些同工型具有不同的特性。
高效離子交換層析可以區分游離羧基的隨機或分段分布(Schols等，食品水膠體，1989，6，pp115-121)。這些試驗經常被用于檢查經巴氏滅菌之后的柑橘汁中殘留的PME活性，因為殘留的PME除了會導致橘汁中甲醇的累積外，還可導致橘汁中所謂的“云狀物損失”。
PME底物，如得自天然植物來源的果膠通常為具有約70％DE的高酯果膠形式。必須在含有這些高酯PME底物的提取物中加入糖，以提供足量的可溶性固體來誘導膠凝。通常最少需要55％可溶性固體。
可能會發生凝縮。例如，當使用HE-果膠時，可溶性固體含量低(＜55％)的橘子醬和果醬中會發生凝縮。然而，上述應用并不經常使用HE-果膠。如果使用果膠，如在SS＜55％的果醬中，一般會使用酰胺化果膠或LE-果膠。
當發生凝縮時，必須使用昂貴的添加劑來誘導膠凝作用。
Versteeg等(食品科學雜志，45(1980)p969-971)顯然已從橙子中分離出PME。據報道，這種植物PME以多種具有不同特性的同工型存在。同工型I的分子量為36000D，等電點為10.0，最適pH為7.6，Km值(mg/ml)為0.083。同工型II的分子量為36200D，等電點為11.0，最適pH為8.8，Km值(mg/ml)為0.0046。同工型III(HMW-PE)的分子量為54000D，等電點為10.2，最適pH為8，Km值(mg/ml)為0.041。然而，迄今為止關于這些PME的序列數據知之甚少。
根據Pilnik和Voragen(文獻同上)的報道，已在多種其它高等植物中發現PME，所述植物如蘋果，杏，鱷梨，香蕉，漿果，酸橙，柚子，中國柑橘，櫻桃，黑醋栗，葡萄，芒果，番木瓜，西番蓮，桃，梨，李子，豆，胡蘿卜，花椰菜，黃瓜，韭菜，洋蔥，豌豆，馬鈴薯，蘿卜和番茄。然而，迄今為止關于這些PME的序列數據同樣知之甚少。
WO-A-97/03574中報道了一種植物PME(該文獻的內容列入本文作為參考)。該PME具有下列特征分子量約為36kD至約64kD；當用0.15M NaCl中的0.5％酸橙果膠測定時，最適pH為pH7-8；最適溫度至少為50℃；溫度穩定性范圍為10℃-至少40℃；Km值為0.07％；在NaCl水平約為0.25M時活性最大；在Na2SO4水平約為0.2M時活性最大；和在NaNO3水平約為0.3M時活性最大。
WO97/31102中報道了另一種PME(該文獻的內容列入本文作為參考)。
PME在工業上具有重要的用途。例如，它們可用于或用作鈣離子的螯合劑。在這一點上，根據Pilnik和Voragen(文獻同上)，可在榨汁后的柑橘皮中添加氫氧化鈣漿液以制備牛飼料。添加之后，高pH和鈣離子能激活柑橘皮中的任何天然PME，導致果膠快速脫酯，發生果酸鈣凝結作用。結合的液相被釋放，并且易于被壓出，使得僅有一小部分原始水含量需要通過昂貴的熱干燥法被除去。壓出的溶液也可用作動物飼料。
如上所述，已從棘孢曲霉(參見WO94/25575)中得到PME。顯然，這種PME可用于改善含果膠物質的硬度，或者使果膠去甲基化，或者增加含果膠物質的粘度。
另外，經常在由含果膠的水果或蔬菜物料制備的食品(如果醬或防腐劑)中使用PME。例如，WO-A-94/25575還報道了使用得自棘孢曲霉的PME制備橘子醬和番茄醬的方法。
JP-A-63/209553中公開了在多價金屬離子的存在下，果膠甲脂酶作用于果膠多糖而獲得的凝膠及其生產方法，其中所述果膠多糖含有高-甲氧基多聚α-1，4-D-galacturonide鏈作為主要成分。
Pilnik和Voragen(文獻同上)列出了內源性PME的用途，包括如果果汁中含有太多得自水果的果膠的話，將所述PME加入果汁中以降低果汁的粘度，將所述PME作為果膠酶溶液加入氣泡中，從而便于從未經觸動的果汁部分除去果皮和其它膜，所述氣泡反映了柑橘已被加熱至20℃至40℃的核心溫度(US-A-4284651)；將所述PME用于保護和改善幾種經加工的水果和蔬菜的結構和硬度，所述水果和蔬菜如蘋果(Wiley & Lee 1970食品技術，24，1168-70)，罐裝番茄(Hsu等，1965，食品科學雜志，30，583-588)和馬鈴薯(Bartolome & Hoff 1972農業食品化學雜志20，p262-266)。
據Glahn和Rolin(1994 Food Ingredients Europe，Conf Proceedings p252-256)報道了工業上的“YM-100型GENU果膠”與酸奶飲料相互作用的假設應用。關于如何制備YM-100型GENU果膠，未提供任何細節。
EP-A-0664300公開了制備鈣敏感型果膠的化學分級分離法。據說這種鈣敏感型果膠對食品工業較為有利。
Plastow G.S(1988，分子微生物學，2(2)247-254)報道了菊歐文氏桿菌B374的果膠甲脂酶基因。據作者稱“歐文氏桿菌基因的分離提供了一種簡單的生產PME的方法，所述PME不含解聚的果膠酶，從而擴展了其潛在的用途”。
Plastow G.S還提到“由大腸桿菌上清液生產的PME已被成功地用于使高-甲氧基果膠脫酯，從而生產出鈣-敏感型凝膠。所得凝膠等同于用提取自橘子皮的酶產生的果膠酸鹽所制備的凝膠(結果未公開)”。
因此，除了PME外，果膠和脫酯果膠都具有重要的工業用途。
然而，如PCT/IB98/00673(1998年4月24日提交)所報道，使用PME制備例如食品的益處在某種程度上取決于所用PME的質，量和類型，和PME底物，尤其是果膠的質，量和類型，所述底物可能存在于制備食品所用的物質中。例如，如果底物源自水果或蔬菜，對不同類型的水果或蔬菜而言，所述底物中天然果膠的量和/或結構將有所不同。這一點也可由WO-A-94/25575，尤其是圖7中所述的數據證實，從中可以清楚地看出其PME系統不甚理想。
根據本發明的第一方面，提供了用果膠甲脂酶(PME)處理果膠的方法；其中PME不是植物PME；但其中PME能表現出至少一種植物PME的特性；其中至少一種植物PME的特性包括至少分段式地使果膠脫酯。
根據本發明的第二方面，提供了經PME處理的果膠，所述果膠是通過本發明的方法制備的。
根據本發明的第三方面，提供了含有經PME處理的果膠的食品，所述果膠是通過本發明的方法制備的。
根據本發明的第四方面，提供了如本文所限定的PME的用途，所述用途是以分段的方式減少果膠中的酯基數目。
根據本發明的第五方面，提供了如本文所限定的PME的用途，所述用途是使至少基本上所有果膠鏈上的兩個或多個鄰接的果膠半乳糖醛酸殘基脫酯。
本發明還涉及下列任何一個或多個主題構建體，其表達或含有如本文所限定的PME或如本文所限定的核苷酸序列。
載體，其表達或含有本發明的構建體或如本文所限定的PME或如本文所限定的核苷酸序列。
構建體組合，其含有至少第一種構建體和第二種構建體，其中所述第一種構建體表達或含有如本文所限定的PME酶或如本文所限定的核苷酸序列，第二種構建體含有所需基因(GOI)和啟動子。
細胞，組織或器官，其表達或含有本發明的載體，或本發明的構建體，或如本文所限定的PME，或如本文所限定的核苷酸序列，或本發明的構建體組合。
轉基因生物體，其表達或含有細胞，組織或器官，其中所述細胞，組織或器官表達或含有本發明的載體，或本發明的構建體，或如本文所限定的PME，或如本文所限定的核苷酸序列，或本發明的構建體組合。
重組PME酶，該酶能與抗本文所限定PME酶的抗體發生免疫學反應。
除了所附序列表中所示的序列(及其片斷，衍生物或同系物)外，本發明還包括與上述序列表中的序列互補的序列(及其片斷，衍生物或同系物)。本發明還包括能與上述序列表中的序列雜交的序列(及其片斷，衍生物或同系物)。本發明還包括與上述序列表中的序列的雜交序列互補的序列(及其片斷，衍生物或同系物)。
本發明還涉及本文所提供的新的氨基酸序列和新的核苷酸序列。
優選所述新的氨基酸序列和新的核苷酸序列是分離的和/或純化的。本文中的術語“分離的”和“純化的”指的是從其天然環境中提取，并從至少一種與其天然相關的其它組分中分離的分子，或者是核酸或者是氨基酸序列。
本發明基于令人十分驚奇的發現，即可以從非植物來源中獲得PME，所述PME能以分段的方式使果膠脫酯，但所述PME具有與植物PME類似的特性。
更具體地，本發明基于令人十分驚奇的發現，即可以從細菌來源中獲得PME，所述PME能以分段的方式使果膠脫酯。
本發明與諸如Plastow G.S(文獻同上)的教導是有區別的，因為作者未公開果膠分段式的脫酯作用。另外，該作者提到未公開的工作包括與“提取自橘皮的酶”之間的比較-但仍未詳細提供比較研究中所用酶的類型，更不用說酶活性了。此外，該論文中“鈣敏感型”凝膠的提及和與果酸鹽產生的凝膠之間的比較表明果膠被脫酯為低酯果膠，這與本發明特別優選的方面形成鮮明的對比。
因此，本發明涉及用PME處理果膠的方法；其中PME不是植物PME；但其中PME能表現出至少一種植物PME的特性；其中至少一種植物PME的特性包括至少分段式地使果膠脫酯。
優選地，PME的分子量約為36,000D，和/或pI約為＞9，和/或對酸橙果膠而言的最適pH(通過上述方法測定)約為7，和/或對酸橙果膠而言的最適溫度(通過上述方法測定)約為48℃。
優選PME含有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列或其變體，衍生物或同系物，包括其組合。
優選PME具有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列或其變體，衍生物或同系物。
優選PME具有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。
優選PME由含有SEQ ID No.1所示核苷酸序列的核苷酸序列，或其變體，衍生物或同系物，或其組合表達。
優選PME由具有SEQ ID No.1所示核苷酸序列的核苷酸序列，或其變體，衍生物或同系物表達。
優選PME由具有SEQ ID No.1所示核苷酸序列的核苷酸序列表達。
優選使用重組DNA技術制備PME。
優選PME可得自微生物，優選得自細菌。
優選在鈉離子的存在下用PME處理果膠。
優選鈉離子源自NaCl，NaNO3或Na2SO4或其組合。
優選本發明的方法還包括將經PME處理的果膠與活性PME分開的步驟。可以用物理學的方法從活性PME中分離出經PME處理的果膠，或者反其道而行之。然而，優選通過簡單地滅活PME，例如通過加熱，從活性PME中分離出經PME處理的果膠。
優選經PME處理的果膠是高酯果膠。
優選經PME處理的果膠含有約70％至約80％酯基。
優選經PME處理的果膠含有約72％至約80％酯基。
優選經PME處理的果膠含有約74％至約80％酯基。
優選經PME處理的果膠含有約76％至約80％酯基。
優選經PME處理的果膠含有約77％至約79％酯基。
優選經PME處理的果膠含有約78％酯基。
優選本發明的方法還包括在適于消耗的介質中加入經PME處理的果膠的步驟。
優選介質是水溶液。
優選介質是酸性環境。
優選酸性環境的pH約為3.5至5.5，優選酸性環境的pH為4至約5.5。
優選酸性環境的pH約為4。
優選水溶液是飲料。
優選飲料是酸奶飲料，可飲用的酸奶酪，含有水果的奶飲料，或富含蛋白質的飲料，所述蛋白質如植物和/或牛奶蛋白質，如乳清蛋白和/或大豆蛋白。實施例章節之后示出了確定經處理的果膠是否適用于飲料的方法。
貨架期長的酸奶飲料十分受歡迎，在遠東地區尤其如此。在某些情況下，必須進行熱處理以使貨架期延長。為了避免加熱過程中和之后蛋白質的沉降，可加入果膠作為穩定劑。在某些應用中，酸奶飲料的品質取決于所用果膠的特性和濃度。
在一個優選的方面，介質含有和/或富含蛋白質。此處優選蛋白質源自或可以源自或包含在乳制品，如牛奶或奶酪中，優選其中蛋白質是酪蛋白或乳清蛋白，和/或源自或可以源自或包含在植物制品中。
如果飲料是酸奶飲料，一般可通過酸化牛奶，然后在低pH下加入果膠來制備該飲料。
如果飲料是大豆蛋白飲料，一般通過在中性pH下溶解大豆蛋白來制備該飲料。通過在中性pH下溶解于大豆蛋白溶液中來加入果膠。然后通過加入例如果汁使溶液酸化。
使用以分段的方式酶促脫酯的果膠(優選使用重組DNA技術制備)是有利的，因為它可以使諸如乳清蛋白和乳蛋白(如酪蛋白)的蛋白質在酸性溶液中穩定。這對于諸如脫脂奶，果汁和乳清蛋白飲料的飲料市場至關重要，在此之前，如果存在大量穩定劑的話，在如此高的酸性條件下(如pH4.2)僅能保留主要蛋白質的味道。
現在，我們發現對某些應用而言，可以使用少量通過本發明的方法制備的脫酯果膠。低水平的本發明脫酯果膠不僅可用作穩定劑，也不會對終產品具有不良作用。
必要時，使用本發明的脫酯果膠可以使食品制造商增加食品(如飲料)的pH。在這一點上，在某些情況下，酸性較低的飲料更符合人們(尤其是嬰兒)的口味。因此，與現有技術的方法相反，現在可以使用以分段的方式酶促脫酯的果膠，尤其是通過例如使用重組DNA技術制備的以分段的方式酶促脫酯的果膠，在高于4.2，如高達pH5.5(如pH5.2)的pH條件下保留蛋白質的味道。
另外，據信甚至在諸如pH4.2或更低的低pH條件下，以分段的方式酶促脫酯的果膠，尤其是優選通過使用重組DNA技術制備的以分段的方式酶促脫酯的果膠，相對于在所述pH條件下使用的現有技術的穩定劑而言，能使蛋白質更加穩定。
另一個優點是本發明的PME能產生基本上均質的，以分段的方式脫酯的果膠。也就是說，基本上所有的果膠鏈都含有至少兩個鄰接的脫酯羧基。然而，對于某些應用而言，不必要制備或使用這種基本上均質的，以分段的方式脫酯的果膠。
不必受理論的束縛，據信以分段的方式酶促脫酯的果膠，尤其是通過使用重組DNA技術制備的上述果膠，通過包圍負電荷層中的蛋白質，由此形成穩定的實體而使蛋白質變得穩定。
當果膠與酶在基本上為水的介質中接觸時，本發明的PME酶對分段式脫酯的果膠是有用的。在某些情況下，脫酯果膠可增加果膠的鈣離子敏感性，這反而也是有利的。
或者，當果膠與酶在基本上不含水的介質，如存在甲醇或存在高濃度硫酸銨的介質中接觸時，本發明的PME酶對酯化果膠是有用的。如果需要降低果膠的鈣敏感性，這將是有利的。
酯化果膠的方法是有利的，因為它不需要與現有技術的方法相關的高溫和甲醇酯化條件。因此，本發明也包括該酯化果膠用于制備食品的用途，以及果膠本身。
根據本發明，本發明的脫酯果膠對于制備食品是有利的。
優選食品是人和/或動物消耗的食品。典型的優選食品包括果醬，橘子醬，果子凍，奶制品(如牛奶或奶酪)，肉制品，家禽制品，魚制品和面包制品。食品甚至可以是飲料。飲料可以是飲用的酸奶酪，果汁或含乳清蛋白的飲料。
除了含有經PME處理的果膠的食品外，食品可含有更多其它成分，如一種或多種適當的食品成分。典型的食品成分包括任何一種或多種酸，如檸檬酸，或糖，如蔗糖，葡萄糖或轉化糖，或水果，或其它酶，防腐劑，著色劑和其它適當的成分。
在一個優選的實施方案中，本發明的食品含有水果。所述水果可賦予凝膠以味道，顏色和結構，以及賦予果膠，酸和少量固體。根據水果中天然味道和顏色的水平，水果含量一般占果醬的25％至60％。一般水果的固體含量為10％Brix，但也可使用一般為65-70％Brix的水果濃縮物。水果的pH差別很大，這取決于所用的水果，但大多數水果的pH為3.0至3.5。
果膠含量也有所不同，這取決于所用的水果。例如，紅葡萄干，黑葡萄干和橘子中的果膠含量高，只需另外加入少量果膠即可從這些水果中獲得令人滿意的凝膠。果膠的選擇取決于所需果醬的類型。例如，在不含水果塊的果醬或僅含有很少水果塊的果醬中，可使用GRINDSTEDTMPectin SS 200。這種果醬中的水果分離不成問題，可使用緩慢-凝結的果膠和較低的盛裝溫度。
例如，在含有大水果塊或整個水果(如櫻桃或草莓)的果醬中，可使用GRINDSTEDTMPectin RS 400。在含有整個水果的果醬中，難以避免水果分離，因此，必須使用快速-凝結的果膠，如GRINDSTEDTMPectinRS 400。
果膠類型的選擇也取決于所用容器的大小。當使用標準罐子時，關于果膠穩定性的盛裝溫度較不嚴格，因為盛裝之后罐子可以相對較快地冷卻下來，果膠不會降解。然而，如果將果醬盛裝在大的容器，如500或1000kg的容器中，冷卻時間將會很長。在這種大容器的中央，果膠尤其會遭受降解，中央的凝膠將會比四周的弱。因此，對大容器而言，通常需使用凝結更加緩慢的果膠，可以在較低的溫度下盛裝，從而避免果膠降解。
鑒于以下多個原因，在果醬中加入糖1.為了提供可溶性固體-HE果膠在膠凝之前至少需要55％的可溶性固體含量。
2.為了提供甜度。
3.為了提供增加的物理，化學和微生物的穩定性。
4.為了提供改善的口感。
5.為了提供改善的顏色和光澤。
通常使用的糖是蔗糖，但也可以使用其它糖，這取決于所需的味道，增甜效果，結晶或結構。所用糖的類型也受價格的影響。
轉化糖具有與蔗糖相同的增甜效果，而葡萄糖漿，葡萄糖和山梨糖醇的增甜效果較低。高果糖玉米漿和果糖的增甜效果比蔗糖更強。
糖組成的變化在某種程度上會影響凝膠的結構和強度以及膠凝溫度。
加入酸的原因有兩個1)一方面是為了降低pH水平至3.0-3.2以用果膠獲得令人滿意的凝膠，和2)一方面是為了增強水果的味道。使用HE果膠膠凝的最適pH取決于所用果膠的類型和固體含量。
如果在具有65-68％Brix的果醬中使用GRINDSTEDTMPectin SS200，最適pH為3.0-3.2。如果固體含量高于此，最適pH為3.1-3.3。反之，如果固體含量較低，最適pH為2.8-3.0。如果使用GRINDSTEDTMPectin RS 400，最適pH約比使用GRINDSTEDTMPectin SS 200時的最適pH高0.2個單位。
最常用的酸是檸檬酸一水合物的50％w/v溶液。
也可使用其它酸(如馬來酸，酒石酸或磷酸)，但必須總是使用溶液形式的酸。
酸的選擇取決于法規，價格和終產品所需甜度。
檸檬酸賦予終產品相對較強的酸味，而馬來酸產生的酸味較溫和但更持久。
酒石酸可導致稍弱的味道，磷酸導致較甜的味道。
經過酶處理的果膠可以防止凝縮，而凝縮常在制備具有低可溶性固體含量的橘子醬和果醬時出現。
在某些情況下，本發明的脫酯果膠也可以有利地用作穩定劑和/或粘度改良劑，用于制備藥物，藥用器具，化妝品和化妝器具。
優選以分段的方式酶促脫酯的果膠是高酯果膠，其含有約80％或更少酯基(即酯化程度(DE)為80％或更低)，優選含有約75％或更少酯基(即DE約為75％或更低)。在這一點上，果膠上游離羧基與酯化羧基的比例為1∶1至1∶4，優選為1∶2至1∶3。
優選以分段的方式酶促脫酯的果膠含有約78％的酯基。
測定PME底物酯化程度的方法見于WO-A-97/03574(其內容列入本文作為參考)的第58頁。為了便于參考，在實施例章節之后會重新提及此方法。
測定鈣敏感性的方法見于WO-A-97/03574(其內容列入本文作為參考)的第57頁。為了便于參考，在實施例章節之后也會重新提及此方法。
優選以分段的方式酶促脫酯的果膠具有高分子量。通常，分子量為約50KD至約150KD。
優選通過用PME處理果膠來制備以分段的方式酶促脫酯的果膠，所述PME能使至少基本上所有果膠鏈上的兩個或多個鄰接的果膠半乳糖醛酸殘基脫酯。
優選PME源自可得自微生物，優選得自細菌的PME。
術語“源自可得自微生物的PME”指的是PME具有類似于可得自微生物的PME的序列，條件是PME可以以分段的方式使果膠脫酯。
術語“源自可得自細菌的PME”指的是PME具有類似于可得自細菌的PME的序列，條件是PME可以以分段的方式使果膠脫酯。
術語“果膠”包括正常意義上的果膠，及其部分和衍生物，以及經修飾的果膠(例如經化學修飾的果膠和經酶修飾的果膠)。
例如，果膠可以是衍生化的果膠，經降解(如部分降解)的果膠或經修飾的果膠。經修飾的果膠的例子是以前曾用諸如PME的酶處理過的果膠，所述PME可以是與本發明的PME相同，或不同的PME或其組合。果膠衍生物的例子是經化學處理，如酰胺化的果膠。
優選果膠不是以前曾用多聚半乳糖醛酸酶處理以基本上降低果膠骨架長度的果膠。
如上所述，在優選的方面，本發明包括本文所示序列的變體，同系物和衍生物。本發明還包括這些序列的片斷。
與本發明的重組酶相關的術語“變體”，“同系物”或“片斷”包括序列中一個(或多個)氨基酸的任何取代，變異，修飾，替代，缺失或添加，條件是所得氨基酸序列具有PME活性，優選重組酶具有至少與含有SEQ ID No.2所示序列的重組酶相同的活性。特別地，術語“同系物”覆蓋了與結構和/或功能相關的同源性，條件是所得重組酶具有PME活性。關于序列同源性(即相似性)，優選與所附序列表中所示的序列具有至少為75％，更優選至少為85％，更優選至少為90％的同源性。更優選與所附序列表中所示的序列具有至少為95％，更優選至少為98％的同源性。
因此，本發明的酶也可以被修飾以含有一個或多個(例如至少2，3，5或10個)取代，缺失或插入，包括保守取代。
例如，可根據下表進行保守取代。第二欄相同格中的氨基酸，優選第三欄相同行中的氨基酸可以互相取代
如上所述，本發明的蛋白質一般可以通過如本文所述的重組方法，和/或使用本領域技術人員眾所周知的技術的合成方法，如固相合成法進行制備。所述序列的變體和衍生物包括融合蛋白，其中融合蛋白至少包括與另一種氨基酸序列(直接或間接)相連的本發明的氨基酸序列。這些其它氨基酸序列(有時也稱之為融合蛋白配對物)一般會賦予有利的功能性，例如有助于提取和純化本發明的氨基酸序列。融合蛋白配對物的例子包括谷胱甘肽-S-轉移酶(GST)，6xHis，GAL4(DNA結合和/或轉錄激活結構域)和β-半乳糖苷酶。較便利的做法是在融合蛋白配對物和本發明的蛋白質序列之間包括蛋白酶裂解位點以除去后者。優選融合蛋白配對物不會阻礙本發明蛋白質的功能。
在一個方面，本發明的氨基酸序列的變體，同系物，衍生物或片斷可包括至少下列結構域，所述結構域如式(I)所示A1-A2-A3-A4-A5-A6-A7-A8-A9-A10-A11-A12-A13-A14-A15-A16-A17-A18-A19-A20-A21-A22(I)其中A1是疏水或極性氨基酸或中性氨基酸A2是疏水氨基酸A3是疏水氨基酸A4是極性氨基酸A5是極性或帶電氨基酸或中性氨基酸A6是極性氨基酸A7是極性或帶電或疏水氨基酸A8是疏水氨基酸A9是疏水或極性氨基酸A10是疏水或極性氨基酸A11是帶電氨基酸A12是帶電或極性或疏水氨基酸A13是疏水或帶電氨基酸或中性氨基酸A14是疏水或極性氨基酸或帶電或中性氨基酸A15是帶電或極性或疏水氨基酸
A16是極性或疏水或帶電氨基酸或中性氨基酸A17是極性或帶電氨基酸或中性氨基酸A18是極性或帶電或疏水氨基酸A19是極性氨基酸或中性氨基酸A20是疏水或極性氨基酸A21是疏水氨基酸A22是極性或疏水氨基酸。
該結構域描述于我們較早期的UK專利申請9910935.7(于1999年5月11日提交)。
在本發明的此方面，優選A1是疏水氨基酸。
優選A5是極性氨基酸。
優選A7是極性氨基酸。
優選A9是疏水氨基酸。
優選A10是疏水氨基酸。
優選A12是帶電氨基酸。
優選A13是疏水氨基酸。
優選A14是疏水氨基酸。
優選A15是帶電氨基酸。
優選A16是極性氨基酸。
優選A17是極性氨基酸。
優選A18是極性氨基酸。
優選A20是疏水氨基酸。
優選A22是極性氨基酸。
對式(I)的氨基酸序列而言，疏水氨基酸的優選例子包括A1a(A)，Val(V)，Phe(F)，Pro(P)，Met(M)，Ile(I)，Leu(L)。
對式(I)的氨基酸序列而言，帶電氨基酸的優選例子包括Asp(D)，Glu(E)，Lys(K)，Arg(R)。
對式(I)的氨基酸序列而言，極性氨基酸的優選例子包括Ser(S)，Thr(T)，Tyr(Y)，His(H)，Cys(C)，Asn(N)，Gln(Q)，Trp(W)。
對式(I)的氨基酸序列而言，中性氨基酸的優選例子是甘氨酸(G)。
優選A1是A，V，G或T。
優選A2是V或L。
優選A3是L，F或I。
優選A4是Q。
優選A5是N，D，K，G或S。
優選A6是C或S。
優選A7是D，Q，K，E，Y或L。
優選A8是I，L或F。
優選A9是H，N，V，M或L。
優選A10是A，C，I，P，L，C或S。
優選A11是R。
優選A12是K，R，L，Q或Y。
優選A13是P，G或R。
優選A14是N，G，M，A，L，R或S。
優選A15是S，K，E，P或D。
優選A16是G，Y，H，N，K或V。
優選A17是Q，G或K。
優選A18是K，Q，F，Y，T或S。
優選A19是N，C或G。
優選A20是M，L，I，T，V，H或N。
優選A21是V或I。
優選A22是T，L或S。
我們也相信氨基酸序列應該保持如式(II)所示序列的氨基酸N-N-N-N-N-N-N-N-N-N-N-N-N-N-N-H-H-N-H-N-N-N-N-N-N-N-N-N-N-N-N-N-H-N-N-N-P-C-P-H-N-H-N-N-N-N-N-N-N-N-N-N-N-N-N-N-N-N-N-N-N-N-N-N-N-H-N-G-N-N-C-N-H-H-G-N-N-N (II)其中H獨立地表示疏水氨基酸C獨立地表示帶電氨基酸P獨立地表示極性氨基酸G表示甘氨酸N獨立地表示甘氨酸或疏水或帶電或極性氨基酸。
對式(II)的氨基酸序列而言，疏水氨基酸的例子包括Ala(A)，Val(V)，Phe(F)，Pro(P)，Met(M)，Ile(I)，Leu(L)；帶電氨基酸的例子包括Asp(D)，Glu(E)，Lys(K)，Arg(R)；極性氨基酸的例子包括Ser(S)，Thr(T)，Tyr(Y)，His(H)，Cys(C)，Asn(N)，Gln(Q)，Trp(W)。
與編碼本發明重組酶的核苷酸序列相關的術語“變體”，“同系物”或“片斷”包括序列中一個(或多個)核酸的任何取代，變異，修飾，替代，缺失或添加，條件是所得核苷酸序列編碼具有PME活性的重組酶，優選重組酶具有至少與含有SEQ ID No.2所示序列的重組酶相同的活性。特別地，術語“同系物”覆蓋了與結構和/或功能相關的同源性，條件是所得核苷酸序列編碼具有PME活性的重組酶。關于序列同源性(即相似性)，優選具有至少為75％，更優選至少為85％，更優選至少為90％的同源性。更優選具有至少為95％，更優選至少為98％的同源性。
在優選的方面，與編碼本發明重組酶的核苷酸序列相關的術語“變體”，“同系物”或“片斷”包括如SEQ ID No.1所示序列中一個(或多個)核酸的任何取代，變異，修飾，替代，缺失或添加，條件是所得核苷酸序列編碼具有PME活性的重組酶，優選重組酶具有至少與含有SEQ ID No.2所示序列的重組酶相同的活性。特別地，術語“同系物”覆蓋了與結構和/或功能相關的同源性，條件是所得核苷酸序列編碼具有PME活性的重組酶。關于序列同源性(即相似性)，優選具有至少為75％，更優選至少為85％，更優選至少為90％的同源性。更優選具有至少為95％，更優選至少為98％的同源性。
上述術語與序列的等位基因變異是同義詞。
如上所述，本發明涉及所附序列表中所示的序列，或其變體，衍生物或同系物。
優選變體，衍生物或同系物與任何一個或多個所示序列具有至少75％的序列同源性(即同一性)。
特別地，本文所用術語“同源性”等同于術語“同一性”。
此處，可簡單地通過“肉眼”比較任何一個或多個序列與另一個序列來測定序列同源性，從而看出其它序列是否與此序列有至少75％的同一性。
也可通過商購的計算機程序測定相對序列同源性(即序列同一性)，所述程序能計算出兩個或多個序列之間的％同源性。這種計算機程序的典型例子是CLUSTAL。
另外，可使用任何適當的同源性算法，使用例如缺省參數來測定序列同源性(或同一性)。使用BLAST算法較為有利，該算法的參數被設置為缺省值。BLAST算法詳細描述于http//www.ncbi.nih.gov/BLAST/blast_help.html(列入本文作為參考)。下文定義了檢索參數，這些參數可有利地被設置為限定的缺省參數。
有利的是，當用BLAST進行評估時，“基本上同源”等同于匹配序列的EXPECT值至少約為7，優選至少約為9和最優選為10或更高。BLAST檢索中的EXPECT缺省閾值通常為10。
BLAST(基本的局部序列對比檢索工具)是程序blastp，blastn，blastx，tblastn和tblastx所用的啟發式檢索算法；這些程序使用經過少許改進的Karlin和Altschul的統計學方法(參見http//www.ncbi.nih.gov/BLAST/blast help.html)將顯著性歸于他們的發現。BLAST程序是專為序列相似性檢索而制作的，例如可用于鑒定查詢序列的同系物。該程序一般不能用于基元-式檢索。有關序列數據庫相似性檢索的基本問題的討論，可參見Altschul等(1994)，自然遺傳學6119-129。
可得自http//www.ncbi.nlm.nih.gov的5個BLAST程序執行下列任務blastp將氨基酸查詢序列與蛋白質序列數據庫進行比較；blastn將核苷酸查詢序列與核苷酸序列數據庫進行比較；blastx將核苷酸查詢序列(兩條鏈)的6-讀框概念翻譯產物與蛋白質序列數據庫進行比較；tblastn將蛋白質查詢序列與被動態翻譯成所有6個閱讀框的核苷酸序列數據庫(兩條鏈)進行比較；tblastx將核苷酸查詢序列的6-讀框翻譯產物與核苷酸序列數據庫的6-讀框翻譯產物進行比較。
BLAST使用下列檢索參數HISTOGRAM顯示每次檢索評分的直方圖；缺省為yes(見BLAST手冊中的參數H)。
DESCRIPTIONS將所記載的匹配序列短描述的數目限定為特定的數目；缺省限是100個描述(見手冊頁的參數V)。也見于EXPECT和CUTOFF。
ALIGNMENTS將數據庫序列限定為所記載的高分片斷配對(HSP)的特定數目；缺省限是50。如果更多的數據庫序列碰巧滿足記載所需的統計學顯著性閾值(見下文的EXPECT和CUTOFF)，僅記載統計學顯著性最高的匹配(見BLAST手冊中的參數B)。
EXPECT記載匹配序列對數據庫序列的統計學顯著性閾值；缺省值為10，以使根據Karlin和Altschul(1990)的隨機模型，有望僅僅碰巧發現10個匹配。如果歸因于匹配的統計學顯著性高于EXPECT閾值，將不會記載匹配。較低的EXPECT閾值更加嚴格，導致記載匹配的機會很少。分數值也是可以接受的(見BLAST手冊中的參數E)。
CUTOFF記載高分片斷配對的閾值分。由EXPECT值(見上文)計算缺省值。僅當歸因于HSP的統計學顯著性至少與歸因于單獨的HSP的統計學顯著性一樣高時，才會記載數據庫序列的HSP，所述單獨HSP具有與CUTOFF值相等的得分。較高的CUTOFF值更加嚴格，導致記載匹配的機會很少(見BLAST手冊中的參數S)。一般，使用EXPECT能更加直觀地處理顯著性閾值。
MATRIX特別說明BLASTP，BLASTX，TBLASTN和TBLASTX的另一種評分矩陣。缺省矩陣是BLOSUM62(Henikoff & Henikoff，1992)。有效的另一種選擇包括PAM40，PAM120，PAM250和IDENTITY。BLASTN中沒有另一種評分矩陣；需特別指出的是，BLASTN中的MATRIX命令需要返回錯誤的反應。
STRAND將TBLASTN檢索局限于數據庫序列的上鏈或下鏈；或將BLASTN，BLASTX或TBLASTX檢索局限于查詢序列上鏈或下鏈的讀碼框。
FILTER遮蓋經Wootton & Federhen(1993)計算機和化學，17149-163的SEG程序測定具有低組成復雜度的查詢序列片斷，或者遮蓋經Claverie & States(1993)，計算機和化學，17191-201的XUN程序測定，或者對BLASTN而言，經Tatusov和Lipman的DUST程序測定，由短-周期性內部重復組成的片斷(見http//www.ncbi.nlm.nih.gov)。過濾可以消除blast輸出數據中具有統計學顯著性但在生物學上沒有什么意義的記載(例如一般的酸性-，堿性-或富含脯氨酸區域的命中)，只留下更具生物學意義的查詢序列區域，與數據庫序列進行特異性的匹配。
在核苷酸序列中使用字母“N”替代過濾程序發現的低復雜度序列(如“NNNNN NNNNNNNN”)，而在蛋白質序列中用字母“X”表示(如“XXXXXXXXX”)。
過濾僅適用于查詢序列(或其翻譯產物)，而不適用于數據庫序列。缺省過濾是DUST(對BLASTN而言)，SEG(對其它程序而言)。
當在SWISS-PROT中用于序列時，SEG，XUN或這兩者經常什么也遮蓋不了，因此，不應希望過濾總能發揮作用。
另外，在某些情況下，序列整個被遮蓋，這表明任何針對未過濾的查詢序列記載的匹配的統計學顯著性都應該是可疑的。
NCBI-gi導致除了登記號和/或基因座名稱外，NCBIgi標識符也在輸出信號中示出。
對于某些應用而言，優選使用http//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST提供的簡單的BLAST檢索算法進行序列比較。
當測定序列同一性時，應該使用空位處罰，優選使用下列參數
其它測定兩個序列之間的同一性和相似性的計算機程序法包括但不限于GCG程序包(Devereux等，1984，核酸研究，12387)和FASTA(Atschul等，1990，分子生物學雜志，403-410)。
本發明還包括與本文所示序列互補的核苷酸序列，或其任何衍生物，片斷或同系物。如果某序列與其片斷互補，則可將該序列用作探針來鑒定其它生物體中的類似編碼序列。
本發明還包括能與本文所示序列雜交的核苷酸序列，或其任何衍生物，片斷或同系物。
本發明還包括能與同本文所示序列互補的序列雜交的核苷酸序列，或其任何衍生物，片斷或同系物。
術語“互補”也包括與編碼序列的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。
術語“變體”也包括與能同本文所示核苷酸序列雜交的序列互補的序列。
優選術語“變體”包括與能在嚴緊條件(如65℃和0.1×SSC[1×SSC＝0.15M NaCl，0.015M檸檬酸鈉，pH7.0])下同本文所示核苷酸序列雜交的序列互補的序列。
本發明還涉及能與本發明的核苷酸序列(包括本文所示核苷酸序列的互補序列)雜交的核苷酸序列。
本發明還涉及與能同本發明的核苷酸序列(包括本文所示核苷酸序列的互補序列)雜交的序列互補的核苷酸序列。
本文所用術語“雜交”應該包括“核酸鏈通過堿基配對與互補鏈連接的方法”(Coombs J(1994)生物技術詞典，Stockton出版社，紐約)以及在按Dieffenbach CW和GS Dveksler(1995，PCR引物，實驗室手冊，冷泉港出版社，Plainview NY)所述的聚合酶鏈反應技術中進行的擴增方法。
本發明的范圍中還包括能在中度至最高嚴緊度的條件下與本文所示核苷酸序列雜交的多核苷酸序列。按照Berger和Kimmel(1987，分子克隆技術指南，酶學方法，Vol152，Academic出版社，San Diego CA)的教導，雜交條件基于核酸結合復合物的解鏈溫度(Tm)，如下文所解釋的那樣，賦予確定的“嚴緊度”。
最高嚴緊度一般發生在約Tm-5℃(比探針的Tm低5℃)；高嚴緊度一般發生在約比Tm低5℃至10℃；中嚴緊度一般發生在約比Tm低10℃至20℃；低嚴緊度一般發生在約比Tm低20℃至25℃。本領域技術人員應理解，可使用最高嚴緊度的雜交鑒定或檢測相同的多核苷酸序列，而用中(或低)嚴緊度的雜交鑒定或檢測相似或相關的多核苷酸序列。
在優選的方面，本發明包括能在嚴緊條件下(如65℃和0.1×SSC)與本發明的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。
與本發明相關的術語“核苷酸”包括基因組DNA，cDNA，合成的DNA和RNA。優選它指的是DNA，更優選指的是本發明編碼序列的cDNA。
術語“構建體”(與諸如“綴合物”，“盒”和“雜合體”的術語同義)包括本發明的核苷酸序列，或對構建體組合而言，包括直接或間接與啟動子連接的GOI。一個間接連接的例子是提供適當的間隔序列，如內含子序列(如Shl-內含子或ADH內含子)，置于啟動子和本發明的核苷酸序列或GOI之間。與本發明相關的術語“融合”也是這樣，包括直接或間接連接。在每種情況下，術語未包括通常與野生型基因啟動子相連的酶基因的天然組合，以及當它們都處于其天然環境時的天然組合。
構建體甚至可含有或表達標記，從而在例如已轉入該標記的絲狀真菌，優選為曲霉屬，如黑曲霉，或植物，如馬鈴薯，甜菜中選擇基因構建體。可以使用現存的多種標記，例如編碼甘露糖-6-磷酸異構酶(尤其適用于植物)的標記，或提供抗生素抗性的標記，所述抗性的例子為G418，潮霉素，博來霉素，卡那霉素和慶大霉素抗性。
術語“載體”包括表達載體和轉化載體。
術語“表達載體”指的是能在體內或體外表達的構建體。
術語“轉化載體”指的是能從一個物種轉移至另一個物種的構建體，例如大腸桿菌質粒轉移至絲狀真菌，優選轉移至曲霉屬中。它甚至可以是能由大腸桿菌質粒轉移至農桿菌再轉移至植物中的構建體。
術語“組織”包括組織本身和器官。
與本發明相關的術語“生物體”包括可含有編碼本發明重組酶的核苷酸序列和/或由其得到的產物的任何生物體，其中當生物體中存在啟動子時，該啟動子可允許本發明的核苷酸序列表達。
優選生物體是絲狀真菌，優選為曲霉屬，更優選為黑曲霉。
與本發明相關的術語“轉基因生物體”包括含有編碼本發明重組酶的核苷酸序列和/或由其得到的產物的任何生物體，其中啟動子可允許本發明的核苷酸序列在生物體內表達。優選核苷酸序列摻入生物體的基因組中。
優選轉基因生物體是絲狀真菌，優選為曲霉屬，更優選為黑曲霉。
因此，本發明的轉基因生物體包括含有以下任何一個或其組合的生物體啟動子，編碼本發明重組酶的核苷酸序列，本發明的構建體(包括其組合)，本發明的載體，本發明的質粒，本發明的細胞，本發明的組織或其產物。
術語“轉基因生物體”未包括受其天然啟動子控制的本發明的天然核苷酸編碼序列，其中所述啟動子和編碼序列都處于其天然環境中。另外，本發明未包括屬于下列幾種情況的本發明的天然酶處于其天然環境；由也處于天然環境的其天然核苷酸編碼序列表達；和核苷酸序列處于其天然啟動子的控制之下，所述啟動子也處于其天然環境中。
經轉化的細胞或生物體可制備可接受量的所需化合物，所述化合物易于從細胞或生物體中重新獲得。
優選本發明的構建體含有本發明的核苷酸序列和啟動子。
術語“啟動子”以本領域的正常含義被使用，例如RNA聚合酶結合位點。
在一個方面，本發明的核苷酸序列處于啟動子的控制之下，所述啟動子可以是細胞或組織特異性啟動子。如果生物體為植物，啟動子可以是在塊莖，莖，芽，根和葉組織的任何一個或多個中影響核苷酸序列表達的啟動子。
例如，如我們于1994年10月21日提交的共同懸而未決的英國專利申請9421292.5中所述，本發明核苷酸序列的啟動子可以是α-Amy 1啟動子(也已知為Amy1啟動子，Amy637啟動子或α-Amy637啟動子)。或者，如我們于1994年10月21日提交的共同懸而未決的英國專利申請9421286.7中所述，本發明核苷酸序列的啟動子可以是α-Amy 3啟動子(也已知為Amy3啟動子，Amy351啟動子或α-Amy351啟動子)。
啟動子可以另外包括確保或增加適當宿主中的表達的特征。例如，所述特征可以是保守區域，如Pribnow Box或TATA盒。啟動子甚至可含有其它能影響(例如維持，增強，降低)本發明核苷酸序列，或者對構建體組合而言為GOI的表達水平的序列。例如，適當的其它序列包括shl-內含子或ADH內含子。其它序列包括可誘導的元件-例如溫度，化學，光或應力可誘導的元件。也可存在能增強轉錄或翻譯的適當元件。后一種元件的例子是TMV5’信號序列(見Sleat Gene 217217-225；和Dawson Plant Mol.Biol.2397)。
此外，本發明也包括啟動子和/或編碼蛋白質或重組酶的核苷酸序列和/或元件的組合。
本發明也包括啟動子表達編碼本發明重組酶的核苷酸序列或GOI的用途，其中啟動子的一部分失活，但啟動子仍能行使啟動子的功能。啟動子的部分失活在某些情況下是有利的。特別是，可以使上文提及的Amy351啟動子失活一部分，使得部分失活的啟動子以更加特異性的方式表達本發明的核苷酸或GOI，如僅在一個特異性的組織類型或器官中表達。
術語“失活”指的是部分失活，意思是說啟動子的表達模式被修飾，但部分失活的啟動子仍能行使啟動子的功能。然而，如上所述，經修飾的啟動子能在至少一個(但不是全部)原始啟動子特異性組織中表達本發明的核苷酸序列或GOI。一個這樣的啟動子是上述的Amy351啟動子。部分失活的例子包括改變啟動子序列的折疊模式，或與核苷酸序列部分結合的方式，使得核苷酸序列的一部分不能被例如RNA聚合酶識別。另一種(也是優選的)部分失活啟動子的方法是截短啟動子以形成啟動子片斷。另一種方法是突變至少部分序列以使RNA聚合酶不能結合該部分或另一部分。另一種修飾是突變調控蛋白的結合位點，例如突變已知能發揮碳分解代謝產物阻抑作用的絲狀真菌CreA蛋白的結合位點，從而消除天然啟動子的分解代謝產物阻抑作用。
與本發明的構建體組合相關的術語“GOI”指的是任何所需基因。GOI可以是任何核苷酸，它對生物體(如絲狀真菌，優選為曲霉屬，或植物)而言可以是外源的或天然的。GOI的典型例子包括編碼蛋白質和酶的基因，所述酶可修飾代謝和分解代謝過程。GOI可編碼導入或增加病原體抗性的因子。GOI甚至可以是反義構建體，該構建體能修飾相關組織中存在的天然轉錄物的表達。GOI甚至可編碼絲狀真菌(優選為曲霉屬)的非-天然蛋白質，或者編碼對動物或人有利的化合物。
GOI的例子包括其它果膠酶，半乳糖醛酸酶，果膠解聚酶，多聚半乳糖醛酸酶，果膠酸鹽裂合酶，果膠裂合酶，鼠李糖-半乳糖醛酸酶，半纖維素酶，內切-β-葡聚糖酶，arabinase，或乙酰基酯酶，或其組合，及其反義序列。
可在加入PME的同時，或者在加入PME之前或之后加入其它類型的酶。
例如，GOI可以是WO-A-97/03574公開的PME，或者是WO-A-94/25575或WO-A-97/31102中公開的PME以及這些專利申請所公開序列的變體，衍生物或同系物。
GOI可以是對食品或作物具有營養價值的蛋白質。典型例子包括能抑制抗-營養因子形成的植物蛋白質，和具有更加合乎需要的氨基酸組成(例如比非轉基因植物的賴氨酸含量高)的植物蛋白質。GOI甚至可編碼能用于食品加工的酶，例如凝乳酶，奇甜蛋白和α-半乳糖苷酶。GOI可以是編碼下列任何一個的基因害蟲毒素，反義轉錄物，如patatin或α-淀粉酶的反義轉錄物，ADP-葡萄糖焦磷酸化酶(例見EP-A-0455316)，蛋白酶反義，葡聚糖酶或基因組PME。
GOI甚至可編碼特定酶的內含子，但其中內含子可以是有義或反義方向。在后一種情況下，特定的酶可以是基因組PME。GOI基因組外顯子或內含子序列的反義表達指的是天然PME表達會降低或消除，但其中重組PME表達不會受影響。這對于反義內含子或有義內含子表達而言是非常正確的。
GOI可以是編碼α-淀粉酶的核苷酸序列，這是我們于1994年7月4日提交的共同懸而未決的英國專利申請9413439.2中的主題。GOI可以是編碼α-淀粉酶的核苷酸序列，這是我們于1994年10月21日提交的共同懸而未決的英國專利申請9421290.9中的主題。GOI可以是編碼ADP-葡萄糖焦磷酸化酶的任何核苷酸序列，這是我們于1994年4月7日提交的共同懸而未決的PCT專利申請PCT/EP94/01082中的主題。GOI可以是編碼α-葡聚糖裂合酶的任何核苷酸序列，所述序列描述于我們于1994年10月15日提交的共同懸而未決的PCT專利申請PCT/EP94/03397中。
宿主生物體可以是原核或真核生物體。適當原核宿主的例子包括大腸桿菌和枯草芽孢桿菌。本技術領域已詳細記載了有關轉化原核宿主的教導，例見Sambrook等(分子克隆實驗室手冊，第2版，1989，冷泉港實驗室出版社)。如果使用的是原核宿主，必須在轉化之前對基因進行適當修飾，例如除去內含子。
如上所述，優選的宿主生物體為曲霉屬，如黑曲霉。
可通過下列教導制備本發明的轉基因曲霉Rambosek，J和Leach，J.1987(絲狀真菌中的重組DNA進展和展望，CRC Crit.Rev.Biotechnol.6357-393)，Davis R.W.1994(曲霉的異源基因表達和蛋白質分泌，Martinelli S.D.，Kinghorn J.R(編)曲霉屬50年來的工業微生物學進展，vol29.Elsevier Amsterdam 1994.p525-560)，Ballance，D.J.1991(絲狀真菌的轉化系統和真菌基因結構總覽，Leong，S.A.，Berka R.M.(編)分子工業真菌學，絲狀真菌系統和應用，Marcel Dekker公司，紐約，1991.p1-29)和Turner G.1994(基因操作載體，Martinelli S.D.，KinghornJ.R(編)曲霉屬50年來的工業微生物學進展，vol29.ElsevierAmsterdam 1994.p641-666)。然而，下列評論提供了產生本發明轉基因曲霉的簡要教導。
近百年來，絲狀真菌已被廣泛用于很多類型的工業中，用于生產有機化合物和酶。例如，傳統的日本酒曲和醬油發酵就使用了曲霉屬的種。在本世紀，黑曲霉被用來生產有機酸，特別是檸檬酸，并且用來生產多種工業用酶。
絲狀真菌在工業中得以廣泛應用的原因主要有兩個首先，絲狀真菌可生產出大量細胞外產物，例如酶和有機化合物，如抗生素或有機酸。第二，絲狀真菌可在低成本的底物(例如谷物，麩糠，甜菜漿等)上生長。相同的原因使得絲狀真菌成為我們感興趣的生物體，它們可用作本發明異源表達的宿主。
為了制備轉基因曲霉，可通過將本發明的核苷酸序列(或者甚至是GOI)插入構建體來制備表達構建體，所述構建體經設計可用于在絲狀真菌中進行表達。
已開發出幾種可用于異源表達的構建體。這些構建體優選含有在真菌中具有活性的啟動子。啟動子的例子包括高水平表達胞外酶的真菌啟動子，例如葡糖淀粉酶啟動子或α-淀粉酶啟動子。本發明的核苷酸序列(或者甚至是GOI)可以與信號序列融合，該信號序列可介導由本發明的核苷酸序列(或者甚至是GOI)編碼的蛋白質的分泌。通常使用真菌來源的信號序列。在真菌中具有活性的終止子可終止表達系統。
已開發出另一種真菌表達系統，其中本發明的核苷酸序列(或者甚至是GOI)可與編碼穩定蛋白質的真菌基因的較小或較大部分融合。這樣就可以穩定由本發明的核苷酸序列(或者甚至是GOI)編碼的蛋白質。在該系統中，可將被特異性蛋白酶識別的裂解位點導入真菌蛋白質與由本發明的核苷酸序列(或者甚至是GOI)編碼的蛋白質之間，因此，所產生的融合蛋白可以在此位置被特異性蛋白酶裂解，從而釋放由本發明的核苷酸序列(或者甚至是GOI)編碼的蛋白質。例如，可導入能被KEX-2樣肽酶識別的位點，所述肽酶至少在一些曲霉中出現。這種融合導致體內裂解，對表達產物而不是較大的融合蛋白產生保護作用。
已報道了幾個編碼細菌，真菌，脊椎動物和植物蛋白質的基因在曲霉中的異源表達。如果本發明的核苷酸序列(或者甚至是GOI)未與信號序列融合，蛋白質將會存放在細胞內。該蛋白質將會累積在胞質中，通常未被糖基化，這對一些細菌蛋白質而言是有利的。如果本發明的核苷酸序列(或者甚至是GOI)配備有信號序列，蛋白質將會在胞外累積。
關于產物的穩定性和宿主菌株修飾，當一些異源蛋白質被分泌至真菌的培養液中時，并不是十分穩定。大多數真菌會產生幾種能降解異源蛋白質的胞外蛋白酶。為了避免這一問題，可將蛋白酶產量較低的特定真菌菌株用作異源生產所用的宿主。
為了轉化絲狀真菌，已開發出幾種適用于很多絲狀真菌的轉化方法(Ballance 1991，文獻同上)。很多方法基于制備原生質體，并使用PEG和鈣離子將DNA導入原生質體。然后再生經轉化的原生質體，并使用多種選擇標記選擇經轉化的真菌。轉化所用的標記是多種營養缺陷型標記，如argB，trpC，niaD和pyrG，抗生素抗性標記，如benomyl抗性，潮霉素抗性和腐草霉素抗性。常用的轉化標記是構巢曲霉的amdS基因，當丙烯酰胺為唯一氮源時，高拷貝數的該基因可以使真菌生長。
在另一個實施方案中，轉基因生物體可以是酵母。在這一點上，酵母已被廣泛用作異源基因表達的載體。釀酒酵母的工業應用歷史久遠，其用途包括表達異源基因。有關在釀酒酵母中表達異源基因的評論可參見Goodey等(1987，酵母生物技術，D R Berry等編，p401-429，Allen和Unwin，倫敦)和King等(1989，酵母分子和細胞生物學，E F Walton和G T Yarronton編，p107-133，Blackie，Glasgow)。
鑒于以下幾個原因，釀酒酵母較適于異源基因表達。首先，它對人而言為非-病原體，不能產生某些內毒素。第二，在幾百年多種用途的商業開發之后，它有較長的安全使用歷史，可以為公眾廣泛接受。第三，對此生物體所作的深入的商業應用和研究使得人們較全面地了解到釀酒酵母的遺傳學，生理學以及大規模的發酵特征。
有關釀酒酵母中異源基因表達的原理和基因產物的分泌，可參見EHinchcliffe E Kenny(1993，“用作異源基因表達載體的酵母”，酵母，Vol5，Anthony H Rose和J Stuart Harrison編，第2版，Academic出版有限公司)。
可以使用的酵母載體有以下幾種類型，包括整合載體和自我復制的質粒載體，其中整合載體需要與宿主基因組重組才能維持。
為了制備轉基因的糖酵母，可通過將本發明的核苷酸序列插入經設計可在酵母中表達的構建體，從而制備表達構建體。已開發出幾種可用于異源表達的構建體。構建體含有在酵母中具有活性的啟動子，所述啟動子與本發明的核苷酸序列融合，通常使用酵母來源的啟動子，如GAL1啟動子。通常使用酵母來源的信號序列，如編碼SUC2信號肽的序列。在酵母中具有活性的終止子終止表達系統。
為了轉化酵母，已開發出幾種轉化方法。例如，可根據Hinnen等(1978，Pro.Nat.Acad.Sci.USA 75，1929)；Beggs，J D(1978，自然，倫敦，275，104)和Ito，H等(1983，細菌學雜志，153，163-168)的教導制備本發明的轉基因糖酵母。
使用多種選擇標記選擇經轉化的酵母。轉化所用的標記是多種營養缺陷型標記，如LEU2，HIS4和TRP1，和顯性抗生素抗性標記，如氨基糖苷抗生素標記，如G418。
另一種宿主生物體是植物。
盡管EP-B-0470145和CA-A-2006454中未公開酶和編碼酶的核苷酸序列，但這兩篇文獻提供了一些有用的背景評論，這些評論提及了可用于制備本發明轉基因植物的技術類型。下述的評論將包括一些這樣的背景教導。
構建經基因修飾之植物的基本原理是將遺傳信息插入植物基因組，以穩定維持所插入的遺傳物質。
有幾種技術可插入遺傳信息，兩個主要的原理是直接導入遺傳信息，和通過使用載體系統導入遺傳信息。一般技術的評論可參見Potrykus(植物生理學和植物分子生物學年評42205-225)和Christou(農業-食品-工業高科技，3月/4月1994 17-27)的論文。
因此，一方面，本發明涉及載體系統，該載體系統攜有本發明的核苷酸序列或構建體，并能將核苷酸序列或構建體導入生物體(如植物)的基因組。
載體系統可含有一個載體，但也可含有兩個載體。當含有兩個載體時，載體系統通常被稱為二元載體系統。二元載體系統詳細描述于Gynheung An等(1980)，二元載體，植物分子生物學手冊A3，1-19。
一個經廣泛應用的，用給定啟動子或核苷酸序列或構建體轉化植物細胞的系統基于使用根瘤農桿菌的Ti質粒或毛根農桿菌的Ri質粒(An等(1986)，植物生理學，81，301-305和Butcher D.N等(1980)，植物病理學家的組織培養法，D.S.Ingrams和J.P.Helgeson編，203-208)。
已構建出幾種不同的Ti和Ri質粒，它們適用于構建上述植物或植物細胞構建體。所述Ti質粒的非限制性例子是pGV3850。
優選將本發明的核苷酸序列或構建體插入Ti-質粒，插入位置為T-DNA末端序列之間或與T-DNA序列鄰接，從而避免破壞緊接T-DNA邊界周圍的序列，因為至少有一個此區域似乎是將經修飾的T-DNA插入植物基因組所必需的。
從上述解釋中可以了解，如果生物體是植物，那么，本發明的載體系統優選含有感染植物所必需的序列(如vir區域)和至少一個T-DNA序列邊界部分，邊界部分與基因構建體位于相同載體上。優選載體系統是根瘤農桿菌Ti-質粒或毛根農桿菌Ri-質粒或其衍生物，因為這些質粒是眾所周知的，并且被廣泛用于構建轉基因植物，現存的很多載體系統都基于這些質粒或其衍生物。
在構建轉基因植物時，首先在微生物中構建本發明的核苷酸序列或構建體，在所述微生物中可以復制載體，并且該微生物在插入植物之前易于操縱。有用的微生物的例子是大腸桿菌，但也可以使用具有上述特性的其它微生物。當已在大腸桿菌中構建出如上文所限定的載體系統的載體時，必要時可將其轉移至適當的農桿菌菌株，如根瘤農桿菌。因此，優選將攜有本發明的核苷酸序列或構建體的Ti-質粒轉移至適當的農桿菌菌株，如根瘤農桿菌，從而獲得攜有本發明的核苷酸序列或構建體的農桿菌細胞，隨后將其DNA轉移至待修飾的植物細胞。
據CA-A-2006454報道，可以使用大量克隆載體，它們含有大腸桿菌復制系統和選擇轉化細胞所用的標記。載體含有例如pBR322，pUC系列，M13mp系列，pACYC 184等。
通過此方法，可將本發明的核苷酸或構建體導入載體中的適當的限制性位置。使用包含的質粒在大腸桿菌中進行轉化。在適當的營養培養基中培養大腸桿菌細胞，然后收集并裂解細胞。回收質粒。通常使用的分析方法有序列分析，限制性分析，電泳和其它生物化學-分子生物學方法。每次操作之后，限制性消化所用DNA序列并與下一個DNA序列相連。每個序列可被克隆至相同或不同的質粒中。
每次導入本發明的所需啟動子或構建體或核苷酸序列之后，其它DNA序列的存在和/或插入也是必需的。例如，如果用Ti-或Ri-質粒轉化植物細胞，至少可連接Ti-和Ri-質粒T-DNA的右邊界，然而經常是右和左邊界，作為導入基因的側翼區。已深入研究了T-DNA用于轉化植物細胞的用途，詳見EP-A-120516；Hoekema，二元植物載體系統offset-drukkerij Kanters B.B.，Alblasserdam，1985，第五章；Fraley等，Crit.Rev.Plant Sci.，41-46和An等，EMBO J.(1985)4277-284。
用農桿菌直接感染植物組織是一項簡單的技術，該項技術已得到廣泛應用，其描述于Butcher D.N等(1980)，植物病理學家的組織培養方法，D.S.Ingrams和J.P.Helgeson編，203-208。關于此論題的其它教導可參見Potrykus(植物生理學和植物分子生物學年評42205-225)和Christou(農業-食品-工業高科技，3月/4月1994 17-27)。用此技術可感染植物的某個部分或組織，即葉，根，莖的一部分或植物的另一部分。
通常，用攜有啟動子和/或GOI的農桿菌直接感染植物組織，會傷害被感染的植物，例如會用剃刀切割植物，或用針刺植物，或用研磨料擦植物。然后在傷口處接種農桿菌，在適當的培養基上培養經接種的植物或植物部分，使其發育成成熟的植物。
當構建植物細胞時，可根據眾所周知的組織培養法培養和維持這些細胞，例如在添加有必需生長因子(如氨基酸，植物激素，維生素等)的適當培養基中培養細胞。使用已知的由細胞或組織培養物再生植物的方法，可將經轉化的細胞再生為經基因修飾的植物，例如，可使用抗生素選擇經轉化的苗，再在含有適當營養物質，植物激素等的培養基上對小苗進行再培養。
有關植物轉化的其它教導可參見EP-A-0449375。
本發明的方法可以在體外進行，或者甚至可以在體內進行-例如在植物中進行。在后一種情況下，植物可以是轉基因植物，如經過基因工程改造能產生不同水平和/或類型的果膠的植物。植物也可以是植物材料，而不是整個植物。此處，植物材料可得自轉基因植物，例如經過基因工程改造能產生不同水平和/或類型的果膠的植物。植物或植物材料可以是或可以衍生自蔬菜，水果，或其它類型的含果膠或產果膠植物。此處，蔬菜材料和/或水果材料可以是糖化膠。
總之，本發明提供了用果膠甲脂酶(PME)處理果膠的方法；其中PME不是植物PME；但其中PME能表現出至少一種植物PME的特性；其中至少一種植物PME的特性包括至少分段式地使果膠脫酯。
PME活性自身十分容易測定。實施例章節之后示出了測定PME活性的方法。
使用Pharmacia PhastSystemTM，用10-15％SDS-梯度凝膠，經SDS-PAGE測定PME組分的純度。按Pharmacia手冊的描述進行蛋白質電泳和銀染。為了測定pI，可使用IEF 3-9 PhastSystemTM凝膠。
可使用免疫凝膠電泳鑒定抗PME抗體(見下文)，如多克隆抗體。然后在SDS-PAGE上分離酶組分，在PhastSystemTM的半干燥轉移裝置上，通過半-干燥印跡技術將酶組分轉移至NC-紙上。將NC-紙與按1∶50稀釋的引發抗體保溫，并用第二抗體染色，所述第二抗體與堿性磷酸酶(Dako A/S Glsotrup，丹麥)偶聯，使用時的稀釋度為1∶1000。
可對PME進行進一步的研究，包括肽作圖。在此方面，可用胰蛋白酶或得自Lysobacter enzymogenes的內切-蛋白酶Lys-C(兩種酶制品應該都是測序級的，可購自Boerhinger Mannheim，德國)消化PME。
通常，用碘乙酰胺使100mg純化的PME羧甲基化以保護還原的SH-基團。然后用胰蛋白酶(4mg/20-100ml)裂解該蛋白質。在40℃水解裂解2×3小時。加入20ml TFA以終止反應。以15,000rpm離心5分鐘之后，在反相HPLC柱(Vydac 10 C18柱)上純化肽。上樣2×500ml樣品。在60分鐘內，用0.1％TFA中的0.05-0.35％漸增的乙腈梯度洗脫和分離肽。手工將肽收集在Eppendorf管中。
為了用內切-蛋白酶Lys-C進行消化，將凍干的PME(0.1mg)溶解于50ml 8M尿素，0.4M NH4HCO3，pH8.4中。覆蓋一層N2并加入5ml 45mMDTT之后，于50℃，在N2中將蛋白質變性和還原15分鐘。冷卻至室溫后，在室溫下，黑暗的氮氣氛圍中，加入5ml 100mM碘乙酰胺，使半胱氨酸衍生化15分鐘。隨后，加入90ml水和5mg內切-蛋白酶Lys-C(溶于50ml 50mM tricine和10mM EDTA，pH8.0中)，37℃，在N2中消化24小時。
然后，按與經胰蛋白酶消化的肽相同的方法分離所得肽。
在Devosil 3 C18RP-HPLC柱0.46×10cm(Novo Nordisk，丹麥)上進一步純化選定的肽。然后，將純化的肽上樣于使用脈沖-液體快速循環的氨基酸測序儀Applied Biosystems 476A。
通過用純化的酶注射兔，并從抗血清中分離免疫球蛋白，即可產生抗本發明酶的抗體。所用方法可參見N Harboe和A Ingild(“免疫，分離免疫球蛋白，估計抗體滴度”，定量免疫電泳手冊，方法和應用，NH Axelsen等(編)，Universitetsforlaget，Oslo，1973)和TG Cooper(“生物化學工具”，John Wiley & Sons，紐約，1977)。
以下將僅通過實施例來描述本發明，實施例將參照下列附圖

圖1-質粒的描述。
圖2-質粒的描述。
圖3-質粒的描述。
圖4-質粒的描述。
圖5-質粒的描述。
實施例克隆菊歐文氏桿菌PME基因材料菊歐文氏桿菌(PD97)(“E.chr.”)購自植物保護機構的培養物保藏中心(PD)Wageningen，荷蘭。
歐文氏桿菌菌株的培養于30℃，在LB-培養基中培養菌株。
DNA使用Qiagen RNA/DNA試劑盒(Qiagen)從菌株中分離基因組DNA。
PCR將基因組DNA用作模板。
根據菊歐文氏桿菌B374 PME基因已公開的核苷酸序列(登錄在EMBL/GenBank數據庫，登記號為Y00549)，設計克隆菊歐文氏桿菌的PME基因所需的引物。
菊歐文氏桿菌PCR引物PME 5’末端引物5’-AGTCGACGTGTATGTTAAAAACGATCTCTGG-3’PME 3’末端引物5’-AGCGGCCGCAATTCGTCAGGGTAATGTCGG-3’5’末端引物含有SalI酶限制性位點(以斜體表示)，3’末端引物含有NotI酶限制性位點(以下劃線表示)，便于將擴增的基因克隆至表達載體。
根據廠商說明，使用Expand High Fidelity PCR系統(BoehringerMannheim)，以下列溫度循環進行PCR95℃3分鐘1個循環94℃15秒，50℃30秒，68℃3分鐘10個循環94℃15秒，57℃30秒，68℃3分鐘，每隔一個循環再加20秒，20個循環克隆PCR片斷按廠商所述，將PCR片斷克隆至PCR2.1-TOPO克隆載體(Invitrogen)。
DNA測序基本上根據Sanger等(1979)的雙脫氧法，使用Thermo Sequenase熒光標記的引物循環測序試劑盒對雙鏈DNA進行測序，所述試劑盒中含有7-脫氮-dGTP(Amersham Pharmacia Biotech)，5’Cy5-標記的引物和Pharmacia LKB A.L.F.DNA測序儀(參見Sanger，F.，Nicklen，S和Coulson A.R.(1979)用鏈終止劑進行DNA測序，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 745463-5467)。以下列出了測序所用的引物(以5’至3’方向表示)UNI(M13-20引物)-17聚體Cy5-GTAAACGACGGCCAGTREV-19聚體
Cy5-GGAAACAGCTATGACCATG菊歐文氏桿菌PME-01 17聚體Cy5-GATTATCCATGCTGGTG菊歐文氏桿菌PME-02 18聚體Cy5-CGGCGTCTATAATGAACG菊歐文氏桿菌PME-03 16聚體Cy5-GCGACAGCGACAGCAG菊歐文氏桿菌PME-04 19聚體Cy5-CCGTGGCAGCCGCAATGACPME基因測序的核苷酸序列示于所附序列表中。
在大腸桿菌中表達菊歐文氏桿菌PME基因產生表達載體pATP1為了使用克隆基因自身的翻譯起始位點，并除去組氨酸標記，可修飾得自Qiagen的pQE60表達載體，產生pATP1。pQE60表達載體示于圖1。
從pQE60表達載體上切下64bp EcoRI-HindIII片斷，替代以pSPORT1載體(Gibco/BRL)上50bp的EcoRI-BamHI片斷，以導入更多的酶限制性位點。
50bp pSPORT1 EcoRI-HindIII片斷5’AAGCTTGGATCCTCTAGAGCGGCCGCCGACTAGTGAGCTCGTCGACCCGGGAATTC3’下劃線的是EcoRI酶限制性位點，黑斜體字母表示HindIII酶限制性位點。
得自pSPORT1載體的50bp片斷內的10bp EcoRI-SaII片斷被含有核糖體結合位點(RBS)的28bp EcoRI-SalI片斷所替代，從而產生表達載體pATP1(見圖2)。
通過退火兩個寡核苷酸產生28bp EcoRI-SalI片斷RBS引物15’CACACAGAATTCATTAAAGAGGAGAAATTAACCCGTCGACCCGGGAG3’RBS引物2
5’CTCCCGGGTCGACGGGTTAATTTCTCCTCTTTAATGAATTCTGTGTG3’下劃線的是EcoRI酶限制性位點。
斜體字母表示的是SalI酶限制性位點。
黑體字母表示的是核糖體結合位點(RBS)。
從PCR2.1 TOPO載體的SalI和NotI位點切下從菊歐文氏桿菌中克隆的PME基因，所述位點位于PCR克隆該基因所用的引物中。將SalI-NotI基因片斷再次克隆至pATP1表達載體pATP1E.chr.PME(圖3)。
將pATP1E.chr.PME載體轉化至M15/pREP4感受態細胞。
按廠商(Qiagen)所述，將pATP1E.chr.PME載體轉化至感受態M15/pREP4細胞。
選擇含有pATP1E.chr.PME載體的菌落，用于誘導菊歐文氏桿菌PME基因的表達。
大腸桿菌的培養于37℃，在LB－培養基＋100μg/ml氨芐青霉素和25μg/ml卡那霉素中，將被pATP1E.chr.PME載體轉化的大腸桿菌培養過夜，將20ml預培養物加入800ml LB－培養基＋100μg/ml氨芐青霉素和25μg/ml卡那霉素中，于37℃保溫。總共制備3×800ml。將細胞培養至600nm光吸收值為0.7。加入800μl 1M IPTG，37℃保溫4小時之后收集細胞。
制備無細胞提取物以10000rpm離心10分鐘以收集細胞，并將細胞重新懸浮于50ml提取緩沖液(50mM MES pH6.8)。以70％的負載周期超聲處理4×3分鐘以破碎細胞。在超聲處理的間隙和過程中，將樣品置于冰上。10000rpm離心10分鐘之后，得到PME組分(上清液)。
層析根據下列方法純化PME。所有操作都在4℃進行。通過陽離子交換層析分離按上文所述得到的上清液。將50ml樣品上樣于CM-SepharoseTMCL-6B(50ml柱材料)，用緩沖液A50mM MES pH6.8洗滌。大多數蛋白質不與柱結合，但PME吸附在柱上，用緩沖液A洗下未結合的蛋白質之后，用總共450ml漸增的NaCl梯度(0-1MNaCl)洗脫結合的蛋白質。流速為0.5ml/分鐘，收集2.5ml級分。測定280nm處的蛋白質光吸收分布圖。
分析所有級分的PME活性和蛋白質。用BioRad法分光光度測定蛋白質含量。
集中含有PME活性的級分，用作酶提取物，對果膠進行酶促PME處理。SDS-PAGE揭示出這種部分純化的菊歐文氏桿菌PME級分僅含有3-4種蛋白質。
為了將PME純化至均質，使用Centricon過濾系統，通過透析濃縮1ml集中的級分。在相同系統中進行緩沖液交換至50mM Tris，0.1MNaCl pH7。
然后將200μl濃縮的樣品上樣于SephacrylTMS-200(2.6×70cm)凝膠過濾柱。用50mM Tris，0.1M NaCl pH7平衡該柱。流速為0.5ml/分鐘，收集0.5ml級分。
集中含有PME活性的級分，如上述使用Centricon進行濃縮。然后將濃縮樣品上樣于用50mM Tris，0.1M NaCl pH7平衡過的SuperdexTMG-75。流速為0.5ml/分鐘，收集2ml級分。集中含有PME活性的級分并濃縮。
酶活性PME催化甲酯基從果膠上裂解下來。在純化過程中，通過使用甲基紅指示劑試驗的快速法檢測PME。由于甲基從果膠鏈中的半乳糖醛酸殘基上裂解下來，因此該試驗中形成了羧基，pH值降低。pH指示劑甲基紅隨著pH的降低，顏色由黃(pH6.2)變為粉紅(pH4.2)。試驗中含有1ml溶解于0.15M NaCl pH7的0.5％酸橙果膠(DE70％)和25μl樣品。然后通過滴定法(Versteeg等(1978)Lebensmittel-Wiss.u.Technol.，11267-274)進一步測定在30℃保溫10分鐘之后顯示出陽性甲基紅試驗的樣品。
在滴定法中，試驗含有10ml溶解于0.15M NaCl pH6.8的0.5％酸橙果膠和10-100μl樣品。用0.02M NaOH進行滴定，并在室溫下測定反應。使用自動滴定儀(Versteeg等(1978)Lebensmittel-Wiss.u.Technol.，11267-274)。
SDS-PAGE/Western印跡如上文所述，通過SDS-PAGE測定PME級分的純度。
抗體的產生通過用純化的酶注射兔，并從抗血清中分離免疫球蛋白，即可產生抗本發明酶的抗體。所用方法可參見N Harboe和A Ingild(“免疫，分離免疫球蛋白，估計抗體滴度”，定量免疫電泳手冊，方法和應用，NH Axelsen等(編)，Universitetsforlaget，Oslo，1973)和TG Cooper(“生物化學工具”，John Wiley & Sons，紐約，1977)。
研究實驗1在純化PME的過程中，將無細胞提取物上樣于陽離子交換柱(CM-Sepharose CL-6B)。PME與pH6.8的陽離子交換柱材料緊密結合，而大多數蛋白質不與柱結合，因此被洗脫至洗滌體積中。用漸增的NaCl梯度將PME洗脫成一個峰(級分56-64)。
濃縮之后，使用凝膠過濾層析(Sephacryl S-200柱)，接著使用Superdex G-75凝膠過濾進一步純化PME級分。集中含有最高PME活性的級分。酶活性為65U/ml。
通過用1％果膠(pH4.8)進行粘度測定，來檢測級分的果膠降解活性。結果表明在24小時之后，粘度沒有變化。
SDS-PAGE表明純化的PME級分中只有一條蛋白質帶，其分子量為36,000D，PME的等電聚焦顯示出pI＞9。
鑒定和動力學數據按“材料和方法”所述，用滴定法進行PME的鑒定和最適值的測定。
用0.15MNaCl中的0.5％酸橙果膠測定PME活性的最適pH。最適值約為pH7。酶的最適pH為中性pH，但pH5時仍能檢測到最大活性的70％。
最適溫度為48℃。
通過在不同溫度下將酶樣品置于Eppendorf管中保溫15分鐘，來測定PME的溫度穩定性。保溫之后，通過傳統的滴定法測定酶活性。酶活性的穩定性為20℃-50℃。于60℃保溫15分鐘導致酶失活。
通過將不同果膠濃度對活性進行Hanes作圖，測定酸橙果膠的親和性。由曲線計算出Km為0.44mg/ml。Km是用DE70％的果膠測定的，結果表明Km值與用橘子PME測出的Km范圍相同，但比用曲霉屬真菌PME測出的Km低10倍。這意味著植物和細菌酶的催化活性比真菌酶的高10倍。
菊歐文氏桿菌PME也可以使甜菜果膠脫酯。按“材料和方法”所述測定PME活性，不同的是試驗中使用的是溶解于0.15M NaCl中的1％甜菜果膠。
我們還發現酶活性不必需要NaCl。然而，加入達0.1-0.15M的NaCl會增加活性。較高濃度的NaCl會降低活性。
研究實驗2用菊歐文氏桿菌PME處理的果膠與用植物PME處理的果膠特性相似鈣敏感型果膠用菊歐文氏桿菌PME處理URS果膠，鑒定所得經修飾果膠的％DE和鈣敏感性(CS)。
在試驗中，兩種果膠(Pectin 2084-125-2和Pectin 2084-125-1)因很高的Ca-敏感性而與添加的鈣發生膠凝作用，因此不可能得到CS值。僅用分段式脫-甲基化的果膠才能得到很高的Ca-敏感性。
通過使用果膠裂合酶或聚半乳糖醛酸酶對菊歐文氏桿菌的經修飾果膠進行酶促指紋分析，結果表明菊歐文氏桿菌PME以分段的方式使果膠脫-甲基化，產生非聚半乳糖醛酸樣片斷(隨機片斷)。
經菊歐文氏桿菌PME處理的果膠對蛋白質飲料的粘度和穩定性的影響
SP＝果膠使酸奶飲料穩定所需的最低濃度。
URS果膠由81％脫酯為78-79％改變了Ca-敏感性。
在酸奶飲料中檢測劑量濃度為0.1％，0.15％，0.175％，0.2％和0.25％的酶修飾果膠。通過諸如乳清分離，沉降％和粘度的參數研究所產生的各個酸奶飲料的品質。
結果表明經酶修飾的果膠能在0.15％的低果膠濃度下穩定蛋白質。各個樣品具有低粘度。相對于標準的商用穩定劑而言，經菊歐文氏桿菌PME修飾的果膠在果膠濃度為0.15％時的粘度較低。
通過用菊歐文氏桿菌PME處理親代URS果膠，原本不適于用作酸奶飲料中的穩定劑的果膠轉變為適當的果膠，這種經處理的果膠與很好的商用穩定劑的效果一樣好。
方法用菊歐文氏桿菌PME酶促處理果膠按下述制備一批酶解果膠在有效攪拌的熱水中溶解45g果膠，加入15g NaCl，用水將體積調節為1.81。攪拌該溶液直至鹽溶解。將果膠溶液冷卻至40℃，使用1N NaOH有效攪拌使pH升高為pH6.5。加入適當的菊歐文氏桿菌PME樣品，繼續進行酶促反應直至獲得所需程度的酯化。通過保溫期間自動劑量的1NNaOH將pH維持在pH6.5不變，酶反應之后，消耗NaOH。
當果膠樣品已達到所需的酯化程度時，終止加入NaOH，通過加入2％HCl將溶液的pH降低為約3.0。然后將果膠溶液加熱至70℃達5分鐘以完全滅活酶。用1倍體積的異丙醇沉淀經處理的果膠，用60％異丙醇洗滌，壓至約半成干。然后于40℃風干這批經處理的果膠，最后研磨成干粉。
測定果膠樣品鈣敏感性的指數(CS)通過上述方法測定鈣敏感性。
測定果膠樣品的酯化程度(％DE)通過上述方法測定酯化程度。
酸奶飲料試驗用68℃的足量去離子水混合奶粉20分鐘，冷卻至30℃，制備出標準化的脫脂奶(17％MSNF)，于30℃，用3.3％glucone-δ-內酯(GDL)將脫脂奶酸化至約pH4。將果膠樣品作為糖溶液添加進去，攪拌30分鐘。室溫下，以200巴使酸奶飲料成為勻漿，然后裝入無菌的250ml塑料瓶。在75℃的水浴中加熱10分鐘，其間振蕩5分鐘。最后，將飲料冷卻至室溫，然后置于5℃儲存過夜。
酸奶飲料的粘度測定使用Brookfield粘度計11T，以rpm30測定牛奶飲料樣品的粘度。攪拌30秒之后測定粘度。
通過離心試驗測定蛋白質穩定性室溫下，以2300×g離心40g樣品(如酸奶飲料)20分鐘。棄上清，將離心玻璃管頭朝下放置30分鐘。稱重玻璃管，按下述計算沉降％％沉降＝[(離心后玻璃管的重量-玻璃管重量)/樣品重量]×100構建芽孢桿菌表達質粒pCS修飾芽孢桿菌-大腸桿菌穿梭載體pDP66K(得自荷蘭Groningen大學的L.Dijkhuizen，Rijks博士)，使其適于克隆和表達不同基因。pDP66K載體詳細描述于Penninga D等(1996)。(需說明的是，本實驗中也可以使用任何其它適當穿梭載體-如商用穿梭載體)。通過修飾啟動子，環化糊精糖基轉移酶(cgt)信號序列，缺失其余環化糊精糖基轉移酶基因和取代轉錄終止序列，產生pCS質粒。通過PCR修飾p32啟動子和環化糊精糖基轉移酶信號序列，以使信號序列3’末端ATG密碼子處含有NcoI位點。轉錄終止序列被得自pUB110質粒，經PCR擴增的轉錄終止序列所取代(McKenzie，T.，Hoshino，T.，Tanaka，T和Sueoka，N(1986)，pUB110的核苷酸序列一些與復制及其調節相關的顯著特征，質粒15(2)，93-103和McKenzie，T.，Hoshino，T.，Tanaka，T和Sueoka，N(1987)校正，pUB110核苷酸序列和功能圖譜的修正，質粒17(1)，83-85)。為了便于克隆，將5’BamHI和3’HindIII酶限制性位點導入經PCR擴增的轉錄終止序列。所得pCS質粒示于圖5。
產生PME基因片斷以克隆至芽孢桿菌pCS質粒擴增兩個PME基因PCR產物，含有全長編碼區的一個產物的第二個氨基酸由亮氨酸轉變為纈氨酸，從而在基因5’ATG起始密碼子處導入NcoI位點以便于克隆。為了便于克隆，在3’末端導入BamHI位點。在氨基酸水平上，由第25位丙氨酸氨基酸密碼子起始擴增第二個PME基因PCR產物，該產物不含基因信號序列。設計PCR產物，使其在起始丙氨酸氨基酸之前含有甲硫氨酸以導入克隆所必需的NcoI。在PCR產物的3’末端導入BamHI位點。通過DNA測序證實兩個PME序列的PCR擴增。使用NcoI和BamHI限制性酶將兩個擴增的PME序列克隆至pHM質粒，使用相同的酶將不含信號序列的PME序列克隆至pCS質粒。
在芽孢桿菌中表達PME基因將4個不同的構建體轉化至枯草芽孢桿菌，并在含有50mg/ml卡那霉素的2×YT培養基中培養。
在黑曲霉中表達菊歐文氏桿菌PME基因構建表達載體pPR42-FS-PMEA為了在黑曲霉中進行表達，使菊歐文氏桿菌PME基因裝備有得自黑曲霉PME基因的真菌信號序列(Khanh，N.Q等(1991)，基因1,71-77)，所述信號序列含有下列序列黑曲霉PME信號序列ATGGTTAAGTCAATTCTTGCATCCGTTCTCTTTGCGGCGACTGCGCTGGCCMetValLysSerIleLeuAlaSerValLeuPheAlaAlaThrAlaLeuAla使用3個重疊的寡核苷酸5’末端引物P1，P2和P3以及3’末端引物P4，通過PCR融合真菌信號序列與菊歐文氏桿菌PME基因編碼序列的5’端。
P15’-GCGGCGACTGCGCTGGCCATGTTAAAAACGATCTCTGGAACCCP25’-AAGTCAATTCTTGCATCCGTTCTCTTTGCGGCGACTGCGCP35’-TGAATTCTCATGGTTAAGTCAATTCTTGCATCCGP45’-TACTAGTGTCAGGGTAATGTCGGC5’末端引物P1含有菊歐文氏桿菌PME編碼序列的5’端(下劃線部分)。為了便于克隆，5’末端引物P3含有EcoRI限制性酶位點(下劃線部分)，3’末端引物P4含有SpeI限制性酶位點(下劃線部分)。
根據廠商說明，用Expand High Fidelity PCR system (BoehringerMannheim)進行PCR。
根據廠商說明，將擴增的DNA片斷克隆至PCR2.1-TOPO克隆載體(Invitrogen)，所述片斷含有與菊歐文氏桿菌PME基因融合的真菌信號序列。根據廠商的推薦，使用熱測序酶熒光循環測序試劑盒(Amersham)和ALF DNA測序儀(Pharmacia)對克隆的DNA片斷進行測序。
從PCR2.1-TOPO克隆載體上切下EcoRI DNA片斷，該片斷含有真菌信號序列和菊歐文氏桿菌PME基因，將此片斷導入含有XlnB啟動子和TrpC終止子的真菌表達載體pPR42(見WO 9838321 A)，產生載體pPR42-FS-PMEA(圖4)。
轉化黑曲霉使用修改自Van Someren等(1991)Curr.Genet.20，293-299的方法，利用與黑曲霉乳清苷-5’-磷酸-脫羧酶基因共轉化并選擇尿苷營養缺陷型突變的互補體(Goosen等(1987)Curr.Genet.11，499-503)，將pPR42-FS-PMEA載體轉化至黑曲霉的尿苷營養缺陷型突變體。
于30℃，將含有5mM尿苷的PDA(馬鈴薯葡萄糖瓊脂-Difco Lab.Detroit)平板保溫3-4天，為了純化黑曲霉的原生質體，將平板上長出的孢子洗至10ml ST(8g/l NaCl，0.5g/l吐溫20)中。按106個孢子/ml的密度將孢子接種于500ml搖瓶內的200ml生長培養基中。
生長培養基含有6g/l NaNO3，1.5g/l KH2PO4，0.5g/l MgSO4.7H2O，0.5g/l KCl，10mM(NH4)2SO4，0.2％酪蛋白酶促水解物(Sigma C-0626)，2％葡萄糖，0.5％酵母提取物(Difco 0127-17-9)，10mM 尿苷，10mg/lEDTA，4.4mg/l ZnSO4.7H2O，1mg/l MnCl2.4H2O，0.32mg/l CoCl2.6H2O，0.32mg/l CuSO4.5H2O，0.22mg/l (NH4)6MO7O24.4H2O，1.47mg/lCaCl2，2H2O，1.0mg/l FeSO4.7H2O，pH6.0。
于30℃，以230-250rpm的轉速將燒瓶振蕩16-18小時。使用Miracloth收集菌絲體，用SMC(1.33M山梨糖醇，50mM CaCl2，20mMMES，pH5.8)將菌絲體洗滌2-3次。在無菌瓶內，將1g濕菌絲體重新懸浮于20ml含有150mg裂解酶(Sigma L-2265)的SMC中，于37℃保溫，以80-100rpm的轉速振蕩1-3小時直至原生質體釋放出來。通過使懸浮液穿過5ml無菌玻璃棉，接著以3000rpm離心10分鐘以收集原生質體。用5-10ml STC(1.33 M山梨糖醇，50mM CaCl2，10mM Tris/HCl，pH7.5)將原生質體洗滌2次，最后以1×108個原生質體/ml的密度重新懸浮于STC中。
為了進行轉化，小心地將0.2ml原生質體與5-10mg DNA(pPr42-FS-PMEA)，0.5mg選擇DNA(pGW635-含有乳清苷-5′-磷酸脫羧酶基因(Goosen等(1987)Curr.Genet.11，499-503))和50ml PEG溶液(0.25g/ml PEG 6000，50mM CaCl2，10mM Tris/HCl，pH7.5)混合。于室溫下保溫混合物20分鐘，然后小心加入2ml PEG溶液并混合。再于室溫下保溫5分鐘，加入6ml STC，小心振蕩混合物。以300rpm離心混合物10分鐘，除去大多數上清液。
將原生質體重新懸浮于其余的1-2ml上清液中，與TR軟瓊脂(6g/lNaNO3，1.5g/l KH2PO4，0.5g/l MgSO4.7H2O，0.5g/l KCl，1.22M山梨糖醇，10mg/l EDTA，4.4mg/l ZnSO4.7H2O，1mg/l MnCl2.4H2O，0.32mg/lCoCl2.6H2O，0.32mg/l CuSO4.5H2O，0.22mg/l(NH4)6MO7O24.4H2O，1.47mg/l CaCl2，2H2O，1.0mg/l FeSO4.7H2O，0.8％瓊脂(Difco 0140-01)，pH6.0)混合，鋪于TR平板(與TR軟瓊脂組分相同，但含有1.2％瓊脂)。挑選轉化的菌落，影印在新鮮的TR平板上。
培養黑曲霉轉化子以表達菊歐文氏桿菌PME基因為了在黑曲霉轉化子中表達菊歐文氏桿菌PME基因，將孢子(約500,000個/ml)接種于誘導培養基(6g/l NaNO3，1.5g/l KH2PO4，0.5g/lMgSO4.7H2O，0.5g/l KCl，10mM(NH4)2SO4，10mg/l EDTA，4.4mg/lZnSO4.7H2O，1mg/l MnCl2.4H2O，0.32mg/l CoCl2.6H2O，0.32mg/lCuSO4.5H2O，0.22mg/l(NH4)6MO7O24.4H2O，1.47mg/l CaCl2.2H2O，1.0mg/l FeSO4.7H2O，29.4g/l檸檬酸鈉.2H2O，0.2％酪蛋白酶促水解物(Sigma C-0626)和2％木糖)中，于30℃振蕩保溫。2-3天之后，每天取出上清液樣品，分析PME活性。
研究實驗3通過上述方法檢測黑曲霉中表達的PME的活性。比活為600U/mg蛋白質。
通過SDS-PAGE鑒定蛋白質，結果證實蛋白質的分子量為36kDa。成熟蛋白質的正確分子量表明該蛋白質未糖基化。對重組PME蛋白進行MALDI TOF MS分析，結果也表明酶未糖基化。在氨基酸序列中檢測到兩個潛在的N-糖基化位點。
測定蛋白質N-末端的序列，N-末端序列是ATTYNAVV。該結果表明真菌信號肽和歐文氏桿菌的信號肽都被正確加工，產生了不含任何N-末端信號肽的成熟蛋白質。
黑曲霉中表達的菊歐文氏桿菌PME的最適pH為pH5.5至7。在大腸桿菌中表達的菊歐文氏桿菌PME也具有相同的pH分布圖。
使用YM 10膜(Amicon)超濾濃縮曲霉表達的菊歐文氏桿菌PME，然后再對果膠進行酶促修飾。
用曲霉表達的菊歐文氏桿菌PME修飾果膠方法在有效攪拌的熱水中溶解40g GRINDSTEDTMPectin URS 1400，加入7.8g NaCl，用水將體積調節為1.331。攪拌果膠溶液直至所有物質都已溶解，然后冷卻至37℃。使用1N NaOH有效攪拌使pH升高為pH5.5。加入26U PME，在約2小時內，通過自動劑量的1N NaOH將pH和溫度維持在pH5.5和37℃不變，直至消耗8ml 1N NaOH。通過加入2N HCl將溶液的pH降低為3.0以終止酶反應。然后將果膠溶液加熱至70℃達5分鐘以完全滅活酶。用1倍體積的異丙醇沉淀經處理的果膠，用60vol.％異丙醇洗滌，壓至約半成干。然后于50℃風干經處理的果膠，最后研磨成干粉。分離38.7g經酶處理的果膠。
結果分析經曲霉表達的菊歐文氏桿菌PME處理的果膠的％DE和鈣敏感性(CS)。結果表明經酶處理的果膠相對于親代果膠而言具有增加的鈣敏感性。酶處理導致產生HE-果膠，其具有顯著較高的鈣敏感性。這些結果與用大腸桿菌中表達的菊歐文氏桿菌PME得到的結果相同。
討論已分離和鑒定出細菌PME(菊歐文氏桿菌)。DE為81％的URS果膠已被此PME脫酯成具有不同DE％的經修飾果膠。果膠的鑒定揭示出果膠為具有中度鈣敏感性的果膠或是在高DE％時鈣敏感性很高的果膠。我們相信這是首次證明細菌PME能以分段的方式使果膠去甲基化。
在本發明的特定實施方案中，已在酸奶飲料系統中檢測了DE為78％的經修飾果膠。結果表明濃度為0.15％果膠的經修飾果膠能穩定酸奶飲料中的蛋白質。只有很高果膠濃度(＞0.5)的URS果膠才能穩定酸奶飲料中的蛋白質。
類似地，我們相信這是首次證明細菌PME能以分段的方式使果膠去甲基化，而且能產生鈣-敏感型果膠，其中經修飾的果膠能穩定化酸奶飲料。
方案方案I鈣敏感性指數(CS)鈣敏感性被測定為溶解于含57.6mg鈣/g果膠的溶液中的果膠粘度除以未加鈣的溶液中完全等量的果膠的粘度。對鈣不敏感的果膠的CS值為1。
將4.2g果膠樣品溶解于550ml有效攪拌的熱水中。使溶液冷卻至約20℃，用1N HCl將pH調節至1.5。用水將果膠溶液調節至700ml并攪拌。分別在4個粘度玻璃管中測定145g該溶液。在兩個玻璃管中攪拌加入10ml水(雙份測定)，在其它兩個玻璃管中攪拌加入10ml250mM CaCl2溶液。
在有效磁力攪拌的同時，在所有4個粘度玻璃管中加入50ml醋酸鹽緩沖液(0.5M，pH約為4.6)，從而使果膠溶液的pH達到pH4.0。除去磁力，將玻璃管置于20℃過夜。第二天用Brookfield粘度計測定粘度。按下式計算鈣敏感性指數CS＝含57.6mg Ca2+/g果膠的溶液的粘度/含0.0mg Ca2+/g果膠的溶液的粘度方案II酯化程度(％DE)在50ml 60％異丙醇和5％HCl溶液中加入2.5g果膠樣品，攪拌10分鐘。使果膠溶液濾過玻璃濾器，用15ml 60％異丙醇/5％HCl溶液沖洗6次，接著再用60％異丙醇沖洗直至過濾物不含氯化物。于80℃使過濾物干燥過夜。
在錐瓶中混合20.0ml 0.5N NaOH和20.0ml 0.5N HCl，加入2滴酚酞。用0.1N NaOH滴定直至得到持久的顏色改變。0.5N HCl應該比0.5NNaOH稍強。加入的0.1N NaOH的體積以V0表示。
在錐瓶中測定0.5g干燥的果膠樣品(過濾物)，將樣品用96％乙醇弄濕。加入100ml剛剛煮沸并冷卻的蒸餾水，攪拌所得溶液直至果膠完全溶解。然后加入5滴酚酞，用0.1N NaOH滴定溶液(直至顏色改變且pH為8.5)。此處，所用0.1N NaOH的體積以V1表示。加入20.0ml 0.5NNaOH，用力振蕩燒瓶，然后靜置15分鐘。加入20.0ml 0.5N HCl，振蕩燒瓶直至粉色消失。然后加入3滴酚酞，用0.1N NaOH滴定所得溶液，所用0.1N NaOH的體積以V2表示。
按下式計算酯化程度(％DE占總羧基的百分數)％DE＝(V2－V0)/[V1＋(V2－V0)]方案III飲料試驗1.導言以下將描述僅使用約1.7g果膠至盡可能少的果膠的方案。評價系統性能所用的方法是粘度測定法，離心沉降法和顆粒大小測定。
2.材料和方法2.1材料含有約36％蛋白質的脫脂奶粉得自Mejeriernes FaellesIndkob(Kolding，丹麥)。通過用本發明的經修飾PME處理果膠，得到試驗所用的果膠。這些果膠可以具有不同的特性，例如酯化程度和分子量，這取決于所用經修飾PME的類型。
2.1制備牛奶飲料通過混合酸奶溶液和果膠溶液，接著進行進一步加工以制備牛奶飲料。
用68℃的蒸餾水溶解17％(w/w)脫脂奶粉，并攪拌30分鐘，制備出牛奶溶液。于30℃，通過加入3.3％(w/w)glucono-d-內酯(GDL)將牛奶溶液酸化至pH4.1。
分幾步制備果膠溶液。首先，以3∶2的重量比干混果膠和葡萄糖，然后用蒸餾水制備混合物的1.11％(w/w)溶液。制備果膠溶液的最后一步是加入蔗糖至終濃度為17.8％(w/w)。
然后通過將1份牛奶溶液與1.13份(w/w)果膠溶液相混合，接著進行熱處理(見3.2節)，并于20℃，使用Mini Jet勻漿器以20-22MPa進行勻漿(Burgaud等，1990)，制備出牛奶飲料。通過這些操作程序，牛奶飲料中果膠的終濃度為0.3％(w/w)。所有樣品都產生雙份，儲存于5℃，第二天，檢測其粘度，顆粒大小和沉降。
2.3粘度測定使用Bohlin VOR Rheometer系統(Bohlin Instruments，Metric GroupLtd.，Gloucestershire，英國)測定粘度。通過Bohlin lower-plate溫控裝置獲得恒溫。以91.9s-1的剪切速率測定粘度。測量溫度為20℃，在測量前將樣品置于20℃約1小時。所用測量系統是C14(同軸圓柱體系統)。所用轉矩元件為0.25gcm。整聯時間為5s，測量間隔為30s，未使用自動調零。在PC上用Bohlin Rheometer軟件4.05版本進行儀器控制和原始數據處理。
2.4顆粒大小測定用Malvern Mastersizer Micro Plus(Malvern Instruments Limited，Worcestershire，UK)測定顆粒的平均直徑D[4.3]。儀器設置為顯示碼5NBD，分析模型多分散。在PC上用Mastersizer Microplus的Windows2.15版本進行儀器控制和原始數據處理。
將得自用4號果膠制備的一批酸奶飲料的超濾滲透物用于稀釋。使用裝配有GR61PP膜的DDS UF Lab 20-0.36組件進行超濾，所述膜的截留分子量為20,000Da。
2.5沉降通過使用IEC Centra-8R離心機(International Equipment，NeedhamHts，MA，美國)離心樣品來進行沉降測定。于20℃，以2400g將2.5g酸奶飲料離心25分鐘。除去上清液，將試管倒置15分鐘，測定沉降重量，將其表示為百分比(占所用牛奶飲料量的百分比)。對每份樣品進行雙份實驗。
3.結果和討論3.1試驗系統的大小相對于以前的實驗系統而言，這個新系統較小，但它仍保留了與基于550g酸奶飲料的現存試驗系統相同的特性。制備在酸奶飲料中檢測果膠所用模型系統的最簡單方法是簡單地混合攪拌酸奶飲料與果膠溶液，并對此混合物進行測量。這樣做的優點是實際上可以在任何規模上進行檢測。然而，Glahn和Rolin證實勻漿化會減少穩定所需的果膠量，勻漿化和熱處理對穩定性具有相當大的影響。由于現存的550g規模的系統中包括勻漿化和熱處理(如同在工業過程中一樣)，因此，小規模的系統中也需要存在這兩種處理。
在工業中，使用上游(加熱之前)和下游(加熱之后)勻漿化。在此模型系統中，我們選擇在熱處理之后再進行勻漿化，因為這樣可以得到更加均一的樣品，從而使重現粘度的測量結果變得更加容易。
為了用Mini Jet勻漿器獲得可再現的勻漿化，為了補償樣品轉移過程中的多種損失，需要在勻漿階段用40ml樣品進行操作。由于試驗僅需要8-9ml樣品(粘度測定需要2.5ml，沉降需要5ml，顆粒大小測定需要0.5-1ml)，需要最大量樣品的步驟是勻漿化，因此，結果是現存的試驗系統的規模是550g-40g牛奶飲料。
3.2熱處理為了制備盡可能酷似現存試驗系統的小規模系統，需要對熱處理步驟進行改動。現存的550g系統加熱發生在600ml藍-帽瓶中，75℃水浴30分鐘，每5分鐘攪拌一下。
在新的40g系統中，熱處理在50ml塑料離心管中進行，該離心管被置于裝滿水的600ml藍-帽瓶中。此處75℃的水浴太熱，可能是因為水的導熱性大于凝固的牛奶的緣故。因此，試驗了70-75℃之間的不同溫度，發現72℃30分鐘(不攪拌)給出的溫度分布圖非常近似于大系統的溫度分布圖。
3.3檢測小規模系統如果用果膠(該果膠已用本發明的經修飾PME處理過)穩定的牛奶飲料顯示出很少的沉降和小顆粒，這就表明使用了很好的果膠，另外，還說明本發明的經修飾PME適用于此用途。
4.結論在酸奶飲料中檢測穩定果膠粉末的系統的規模已成功地被降至550g至40g牛奶飲料，這意味著所需的果膠量由ca.1.7g降至ca.0.15g。如此少的量足以篩選用本發明的經修飾果膠處理過的實驗果膠樣品。闡明了兩種方法之間顆粒大小，粘度和沉降結果的高度相關性。規模降低的方法相對較簡單，但它仍含有加熱和勻漿化步驟，這對工業相關性來說非常重要。
方案IVPME活性PME催化甲酯基從果膠上裂解下來。在純化過程中，通過使用甲基紅指示劑試驗的快速法檢測PME。由于甲基從果膠鏈中的半乳糖醛酸殘基上裂解下來，因此該試驗中形成了羧基，pH值降低。pH指示劑甲基紅隨著pH的降低，顏色由黃(pH6.2)變為粉紅(pH4.2)。通常，試驗中含有1ml溶解于0.15M NaCl pH7的0.5％ GrindstedTMPectin 1450(DE70％)(由Danisco Ingredients，Danisco A/S提供)和25μl樣品。然后通過滴定法(Versteeg等(1978) Lebensmittel-Wiss.u.Technol.，11267-274)進一步測定在30℃保溫10分鐘之后顯示出陽性甲基紅試驗的樣品。
在滴定法中，試驗一般含有10ml溶解于0.15M NaCl pH6.8的0.5％酸橙果膠(GrindstedTMPectin 1450-由Danisco Ingredients，Danisco A/S提供)和10-100μl樣品。用0.02M NaOH進行滴定，并在室溫下測定反應。使用自動滴定儀(Versteeg等(1978)Lebensmittel-Wiss.u.Technol.，11267-274)。
為了方便起見，下表示出了氨基酸密碼。
上述說明書中提及的所有出版物都列入本文作為參考。本發明所述方法和系統的多種修飾和變化對本領域技術人員而言是顯而易見的，并不背離本發明的范圍和精神。盡管聯系特定的優選實施方案描述了本發明，但應該理解所要求的發明應該不僅僅局限于這些特定的實施方案。實際上，對分子生物學或相關領域技術人員而言顯而易見的，對實施本發明的所述模式所作的多種修飾也包括在下列權利要求書的范圍內。
參考文獻Glahn.P.E.Rolin，C.Food Ingredients Europe，Conf. Proc.252-256(1994)Burgaud，I.，Dickinson，E.，Nelson，E國際食品科學和技術雜志25，39-46(1990)Finer JJ，Vain P，Jones MW & McMullen MD(1992)將DNA傳遞至植物細胞所用的顆粒注入槍的發展植物細胞報道11323-328Klein TM，Wolf ED，Wu R & Sanford JC(1987)將核酸傳遞至活細胞所用的高速微射彈自然32770-73Sanford JC，Klein TM，Wolf ED & Allen N(1987)使用顆粒轟擊法將物質傳遞至細胞和組織微粒科學和技術527-37Vain P，Keen N，Murillo J，Rathus C，Nemes C & Finer JJ(1993)顆粒注入槍的發展植物細胞，組織和器官培養33237-246Penninga D，van der Veen BA，Knegtel RMA，van Hijum SAFT，Rozeboom HJ，Kalk KH，Dijkstra BW，Dijkhuizen L.(1996)環狀芽孢桿菌菌株251的環糊精糖基轉移酶的粗淀粉結合結構域，生物化學雜志，2712777-32784序列SEQ.I.D.NO.1菊歐文氏桿菌果膠甲脂酶cDNAATGTTAAAAA CGATCTCTGG AACCCTCGCG CTGTCGCTGA TTATCGCTGC CAGCGTACATCAGGCACAGG CAGCGACCAC CTACAACGCT GTGGTATCAA AATCCTCCAG CGACGGCAAAACAATCAAAA CTATTGCCGA CGCAATTGCC AGCGCCCCAG CAGGCAGCAC GCCGTTCGTCATTTTGATCA AGAACGGCGT CTATAATGAA CGCCTGACGA TTACCCGCAA TAACCTGCATCTGAAAGGCG AAAGTCGTAA CGGTGCGGTC ATTGCGGCTG CCACGGCGGC GGGCACCCTGAAATCGGACG GCAGCAAGTG GGGAACGGCA GGCAGCAGCA CCATCACCAT CAGCGCCAAGGATTTCAGCG CCCAGTCGCT GACCATTCGC AACGACTTTG ATTTCCCGGC CAATCAGGCCAAAAGCGACA GCGACAGCAG TAAAATCAAG GACACGCAGG CAGTTGCGCT CTATGTCACCAAAAGCGGCG ACCGCGCCTA CTTCAAAGAC GTCAGTCTGG TCGGCTATCA GGACACGCTGTATGTTTCCG GCGGCCGCAG TTTCTTCTCC GACTGCCGTA TCAGCGGCAC GGTTGACTTTATCTTTGGCG ACGGCACCGC GCTGTTCAAC AACTGCGATC TGGTTTCCCG CTATCGCGCTGATGTGAAAA GCGGCAATGT TTCCGGCTAC CTGACCGCGC CCAGCACCAA CATCAATCAGAAGTATGGCC TGGTGATCAC CAACAGTCGC GTGATACGGG AAAGTGACTC TGTACCGGCGAAAAGCTACG GGCTGGGTCG CCCCTGGCAT CCAACAACAA CCTTCTCTGA TGGCCGTTACGCGAATCCGA ACGCTATTGG TCAGACCGTT TTCCTGAACA CCAGCATGGA TAATCATATTTATGGTTGGG ACAAGATGTC CGGCAAGGAC AAAAACGGCA ACACCATCTG GTTCAACCCGGAAGATTCCC GTTTCTTCGA GTACAAATCC TATGGCGCGG GAGCGGCGGT GAGCAAAGACCGCCGACAGT TGACTGACGC ACAGGCGGCA GAGTACACGC AGAGCAAAGT CCTGGGCGACTGGACGCCGA CATTACCCTG A菊歐文氏桿菌果膠甲脂酶MLKTISGTLA LSLIIAASVH QAQAATTYNA VVSKSSSDGK TIKTIADAIA SAPAGSTPFVILIKNGVYNE RLTITRNNLH LKGESRNGAV IAAATAAGTL KSDGSKWGTA GSSTITISAKDFSAQSLTIR NDFDFPANQA KSDSDSSKIK DTQAVALTVT KSGDRAYFKD VSLVGYQDTLYVSGGRSFFS DCRISGTVDF IFGDGTALFN NCDLVSRYRA DVKSGNVSGY LTAPSTNINQKYGLVITNSR VIRESDSVPA KSYGLGRPWH PTTTFSDGRY ANPNAIGQTV FLNTSMDNKIYGWDKMSGKD KNGNIIWFNP EDSRFFEYKS YGAGAAVSKD RRQLTDAQAA EYTQSKVLGDWTPTLP
權利要求
1.用果膠甲脂酶(PME)處理果膠的方法；其中PME不是植物PME；但其中PME能表現出至少一種植物PME的特性；其中至少一種植物PME的特性包括至少分段式地使果膠脫酯。
2.根據權利要求1的方法，其中PME的分子量約為36,000D，和/或pI約為＞9，和/或對酸橙果膠而言的最適pH(通過上述方法測定)約為7，和/或對酸橙果膠而言的最適溫度(通過上述方法測定)約為48℃。
3.根據權利要求1或2的方法，其中PME含有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列或其變體，衍生物或同系物，包括其組合。
4.根據上述任一權利要求的方法，其中PME具有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列或其變體，衍生物或同系物。
5.根據上述任一權利要求的方法，其中PME具有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。
6.根據上述任一權利要求的方法，其中PME由含有SEQ ID No.1所示核苷酸序列的核苷酸序列，或其變體，衍生物或同系物，或其組合表達。
7.根據上述任一權利要求的方法，其中PME由具有SEQ ID No.1所示核苷酸序列的核苷酸序列，或其變體，衍生物或同系物表達。
8.根據上述任一權利要求的方法，其中PME由具有SEQ ID No.1所示核苷酸序列的核苷酸序列表達。
9.根據上述任一權利要求的方法，其中使用DNA技術制備PME。
10.根據上述任一權利要求的方法，其中PME可得自微生物，優選得自細菌。
11.根據上述任一權利要求的方法，其中在鈉離子的存在下用PME處理果膠。
12.根據權利要求11的方法，其中鈉離子源自NaCl，NaNO3或Na2SO4或其組合。
13.根據上述任一權利要求的方法，其中方法還包括將經PME處理的果膠與活性PME分開的步驟。
14.根據權利要求13的方法，其中經PME處理的果膠是高酯果膠。
15.根據權利要求13或14的方法，其中經PME處理的果膠含有約70％至約80％酯基。
16.根據權利要求13至15中任一項的方法，其中經PME處理的果膠含有約72％至約80％酯基。
17.根據權利要求13至16中任一項的方法，其中經PME處理的果膠含有約74％至約80％酯基。
18.根據權利要求13至17中任一項的方法，其中經PME處理的果膠含有約76％至約80％酯基。
19.根據權利要求13至18中任一項的方法，其中經PME處理的果膠含有約77％至約80％酯基。
20.根據上述任一權利要求的方法，其中方法還包括在適于消耗的介質中加入經PME處理的果膠的步驟。
21.根據權利要求20的方法，其中介質是水溶液。
22.根據權利要求20或21的方法，其中水溶液是飲料。
23.根據權利要求20至22中任一項的方法，其中介質為酸性環境。
24.根據權利要求23的方法，其中酸性環境的pH約為3.5至5.5，優選酸性環境的pH為4至約5.5。
25.根據權利要求24的方法，其中酸性環境的pH約為4。
26.根據權利要求20至25中任一項的方法，其中飲料是酸奶飲料。
27.根據權利要求20至26中任一項的方法，其中介質含有和/或富含蛋白質。
28.根據權利要求27的方法，其中蛋白質源自或可以源自或包含在乳制品中。
29.根據權利要求27的方法，其中蛋白質源自或可以源自或包含在植物制品中。
30.通過上述權利要求中任一項的方法制備的，經PME處理的果膠。
31.一種食品，其中含有通過上述權利要求中任一項的方法制備的，經PME處理的果膠。
32.如權利要求3至10中任一項所限定的PME用于以分段的方式降低果膠中的酯基數目的用途。
33.如權利要求3至10中任一項所限定的PME用于使至少基本上所有果膠鏈上的兩個或多個鄰接果膠半乳糖醛酸殘基脫酯的用途。
全文摘要
本發明描述了用果膠甲脂酶(PME)處理果膠的方法,所述PME不是植物PME;但PME能表現出至少一種植物PME的特性;其中至少一種植物PME的特性包括至少分段式地使果膠脫酯。
文檔編號A23L1/0524GK1326513SQ99813293
公開日2001年12月12日 申請日期1999年9月15日 優先權日1998年9月16日
發明者T·M·I·E·克里斯滕森, A·A·佩德森, J·布倫斯特德特, J·D·米克爾森 申請人:丹尼斯科有限公司