專利名稱：Tpl－2/cot激酶和使用方法
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本發明背景核因子κB(NFκB)是以參與κ輕鏈轉錄的核因子于1986年首次在B細胞中發現(Sen和Baltimore,(1986)Cell 46:705-716)，而且自那以后證實它是真正存在于所有真核細胞類型的遍在轉錄因子(綜述于Ghosh等，(1998)Ann.Rev.Immunol.16:225-260)。在細胞中，NFκB以與抑制蛋白IκB復合的失活形式存在于細胞質中。當用合適的誘導物刺激時，IκB與NFκB解離并暴露其核定位信號，使其轉運到核中，在核中發揮其作為轉錄因子的生物活性。因此，NFκB是基因表達的快速調節劑，因為其誘導與從頭蛋白合成無關。
活性NFκB是Rel家族的蛋白二聚體，它含有稱為Rel同源域的300個氨基酸N-末端保守域。該區與DNA結合、與其它Rel蛋白二聚合、核定位和與IκB結合有關。每種Rel蛋白含有所需要的DNA結合位點的一半，因此容許適當的Rel結合，表現為共有NFκB結合位點5’-GGGGYNNCCY-3’的微小變異。
如上所述，Rel蛋白在胞質中與IκB分子結合。IκB是含有錨蛋白重復序列的分子，其中許多成分已經表征，包括IκB-α、β、γ、ε、Bc1-3和Cactus。Bcl-3是高等脊椎動物多肽，而Cactus是果蠅基因。錨蛋白重復序列和NFκB/Rel的相互作用似乎是調節NFκB蛋白進化上的保守機制。
Rel蛋白家族包括Relish、Dif、Dorsal、RelB、c-Rel、v-Rel(雞癌基因)、p65、p100/p52和p105/p50。列于前面的3個是果蠅蛋白。后兩種多肽不常見，因為較大的前體分子(p100或p105)編碼Rel蛋白和IκB,IκB與其相關的Rel蛋白結合阻斷其核定位。p50和p52的單體或同型二聚體沒有轉錄激活域。因此，為了激活基因轉錄，它們與另一種反式激活Rel蛋白以雜二聚體形式締合。p50/p52同型二聚體可能在某些細胞類型中抑制基因轉錄。
IκB磷酸化觸發激活NFκB/Rel。緊接著蛋白酶體降解IκB，但是IκB磷酸化的主要機制迄今仍然很不清楚。如果是p100/p105，需要蛋白酶剪切Rel區的含錨蛋白重復序列的C末端區，以暴露核定位信號p52/p50。
NFκB在體內調節參與免疫應答、急性期反應和炎癥反應的基因中起重要作用。雖然NFκB的作用是高度多效的，但是用失效小鼠(p105-/-)研究了p105的作用。這些動物缺失p105的C末端區，使得所述小鼠能夠表達p50，但是表達的不是與p105的IκB樣抑制性錨蛋白重復序列復合的形式的p50。換句話說，產生組成活性的p50(Ishikawa等，(1998)J.Exp.Med.187:985-996)。這些小鼠呈現炎癥表型，包括肺部和肝臟的淋巴細胞侵潤、對感染的易感性增加、多個淋巴結增大、脾大和淋巴樣細胞增生。巨噬細胞產生細胞因子的能力受損，而B細胞的增生增強。
不適當或不正確的NFκB合成與哺乳動物的多種疾病和機能障礙有關。如Schreck等(1991)EMBO J.10:2247-2258所述，NFκB遷移至核與在HIV感染細胞中的HIV基因組轉錄和產生HIV病毒體以及HIV基因表達有關(Swingler等，(1992)AIDS Res Hum Retroviruses 8:487-493)。NFκB還參與其它逆轉錄病毒如EBV的復制(Powell等，(1993)Clin Exp Immunol 91:473-481)。
而且，已知NFκB保護細胞免于發生凋亡(參見例如Sikora等，(1993)BBRC 197:709-715)，介導TNF的生物效應(Renier等，(1994)JLipid Res 35:271-278；WO97/37016)、介導應激反應(Tacchini等，(1995)Biochem J 309:453-459)以及保護細胞免于發生例如局部缺血(Mattson,(1997)Neurosci.Biobehav.rev.21:193-206)，而且NFκB與各種癌癥有關(Chang等，(1994)Oncogene 9:923-933；Enwonwu和Meeks,(1995)CritRev Oral Biol Med 6:5-17；Denhardt,(1996)Crit Rev Oncog 7:261-291)。
但是，一般來說，NFκB參與調節表達各種各樣的細胞因子和淋巴因子。說明NFκB活性在治療伴隨或涉及應激、感染或炎癥，或者利用在體內受NFκB控制的反應例如炎癥反應的各種病癥中起調節劑作用。
最早鑒定C末端缺失型的TPL-2，它是與莫洛尼鼠類白血病病毒誘發的大鼠T細胞淋巴瘤有關的癌基因產物(Patriotis等，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:2251-2255)。TPL-2是一種絲氨酸蛋白激酶，其催化域與MAP激酶激酶激酶(3K)同源(Salmeron,A.等，(1996)EMBOJ.15:817-826)，而且與人COT的原癌基因產物的同一性在90％以上(Aoki,M.等，(1993)J.Biol.Chem.268:22723-22732)。TPL-2還與激酶NIK高度同源，已經證實NIK調節誘導性降解IκB-α(Malinin等，(1997)Nature 385:540-544；WO97/37016；May和Ghosh,(1998)Immunol.Today 19:80-88)。然而，TPL-2/COT的生物學功能迄今仍然不清楚。
下文證實TPL-2與p105降解有關而且導致釋放Rel亞單位。所以，本發明提供的TPL-2為p105降解的特異性調節劑，因此成為p50Rel參與的炎癥反應的調節劑。
因而，本發明的第一方面提供應用TPL-2調節NFκB活性，從而發揮NFκB的調節作用。在一個優選的實施方案中，通過p105發揮調節作用。
本發明的第二個方面提供鑒定能夠直接或間接調節p105的蛋白酶解而因此調節其抑制活性的一種或多種化合物的方法，該方法包括以下步驟(a)溫育TPL-2分子與需要評價的一種或多種化合物；和(b)鑒定影響TPL-2分子活性的化合物。
如在下文中證實的一樣，發現TPL-2與p105的直接或間接磷酸化有關，所述磷酸化直接導致p105降解并以同型二聚體或與其它Rel單體的雜二聚體轉移到核的相關Rel亞單位。因此，以下這樣的化合物能夠通過p105調節NFκB的激活，所述化合物能夠調節TPL-2和p105之間的直接或間接作用，其調節作用是通過結合TPL-2調節TPL-2的活性，或者影響TPL-2與p105或其它參與p105磷酸化作用的多肽的相互作用實現。
而且本發明提供產生能夠調節TPL-2活性的多肽的方法，包括表達編碼它們的核酸序列、調節體內細胞中的NFκB活性的方法和治療與NFκB有關的病癥或需要減輕或抑制炎癥的病癥的方法。
本發明的再一方面提供應用TPL-2調節腫瘤壞死因子在細胞中的活性或對細胞的活性。如下所述，應用TPL-2拮抗劑TPL-2(A270)可阻斷TNF激活的基因轉錄。
已知TNF-α能夠刺激p105的降解以及NFκB誘導激活的基因轉錄。因此本發明涉及調節TNF激活p105的途徑的方法。在一個優選的實施方案中，本發明提供鑒定藥用前導化合物的方法，包括除了存在受試化合物之外，在TNF和TPL-2相互作用產生可測量的化學或生物效應的條件下將待測的一種或多種化合物與TPL-2分子和腫瘤壞死因子(TNF)溫育；檢測在受試化合物存在下TNF與TPL-2直接或間接作用產生可測量的化學或生物效應的能力；和選擇調節TNF和TPL-2相互作用的化合物。
在一個優選的實施方案中，本發明包括鑒定藥用前導化合物的方法，包括以下步驟提供純化的TPL-2分子；溫育TPL-2分子和被TPL-2磷酸化的已知底物和受試的一種或多種化合物；和鑒定能夠調節所述底物磷酸化作用的受試化合物。
然后，任選的是使所鑒定的受試化合物進行體內測試，確定其對TNF/p105產生的信號通道的作用。
另一方面，本發明提供鑒定調節TPL-2介導的炎癥反應的化合物的方法，包括使包括TPL-2多肽或其片段的反應混合物與受試化合物接觸，以及測定所述受試化合物對NFκB活性指標的效應，由此鑒定調節TPL-2介導的NFκB活性的化合物。
在一個相關方面，本發明提供鑒定調節TPL-2介導的NFκB活性的化合物的方法。
另一方面，本發明提供鑒定調節TPL-2信號轉導的化合物的方法，包括使含有TPL-2多肽或其片段的反應混合物與受試化合物接觸，以及測定所述受試化合物對所述反應混合物中的TPL-2多肽的信號轉導指標的效應，以便鑒定調節TPL-2信號轉導的化合物。
甚至再一方面，本發明提供鑒定調節TPL-2多肽與TPL-2調節作用的靶組分相互作用的化合物的方法，包括使含有TPL-2多肽或其片段的反應混合物與TPL-2調節作用的靶組分和受試化合物在以下條件下接觸，所述接觸條件是除了存在所述受試化合物之外，所述TPL-2多肽或其片段與參考水平的靶組分特異性作用。因此，所述方法可測定在所述受試化合物存在下TPL-2多肽或其片段與TPL-2調節作用的靶組分相互作用的水平變化，其中變化水平差值說明所述受試化合物對TPL-2多肽或其片段與TPL-2調節作用的靶組分之間的相互作用的調節作用。在一個優選的實施方案中，所述靶組分是p105、IκB-α、IκB-β、MEK-1、SEK-1或NFκB，優選純化的多肽。
在前述方面的一個優選實施方案中，所述方法包括使用TPL-2多肽，優選使用重組多肽，所述多肽包括與SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4所示氨基酸序列具有至少75％的同一性的氨基酸序列。
在前述方面的另一優選實施方案中，所述方法包括TPL-2多肽、優選重組多肽，其由在高嚴格條件下與具有SEQ ID NO:1或SEQ IDNO:3所示序列的核酸分子雜交的核酸分子編碼。
在前述方面的另一優選實施方案中，所述方法包括使用無細胞混合物或基于細胞的混合物，而且這種混合物可以衍生自重組細胞、優選具有編碼TPL-2多肽的異源核酸的重組細胞。在一個優選的實施方案中，所述無細胞混合物可使用純化的TPL-2多肽。在另一個實施方案中，所述方法包括測定信號活動，該信號活動包括TNF表達。在一個相關實施方案中，所述重組細胞含有與轉錄調節序列有效連接的報道基因構建物，所述轉錄調節序列對TPL-2或NFκB轉導的細胞內信號敏感。在一個優選的實施方案中，所述轉錄調節序列是TNF轉錄調節序列。
在前述方面的另一優選實施方案中，所述方法包括測定TPL-2活性，例如激酶活性、結合活性和/或信號活動。
在前述方面的再一優選實施方案中，所述方法包括的測定有檢測細胞凋亡、細胞增殖或免疫應答。
在前述方面的又一優選實施方案中，所述方法包括使用基于蛋白質、碳水化合物、脂質、核酸、天然有機物、合成有機物或抗體的受試化合物。
在另一優選實施方案中，本發明提供按照前述方面的方法鑒定的化合物，這種化合物優選為適合治療疾病的化合物，所述疾病例如是多發性硬化癥(MS)、炎癥性腸病(IBD)、胰島素依賴性糖尿病(IDDM)、膿毒病、牛皮癬、移植排斥反應、調節異常的TNF表達或優選是類風濕性關節炎。
另一方面，本發明提供在其需要患者治療免疫系統疾病的方法，該方法通過給予能夠調節TPL-2的藥用組合物調節TPL-2活性進行治療，所給予的所述藥用組合物量足以調節所述患者免疫系統應答。
在一個相關方面，本發明提供治療患者TPL-2介導的病癥的方法，該方法通過給予能夠調節TPL-2的組合物進行治療，所給予的所述組合物的有效治療量足以在所述接受者調節TPL-2介導的病癥。
在另一相關方面，本發明提供在其需要對象調節TPL-2介導的NFκB調節作用的方法，該方法是對所述人類對象給予有效治療量的藥用組合物，以產生所需要的調節作用。
在又一相關方面，本發明提供在一種細胞中調節TPL-2介導的NFκB調節作用的方法，包括給予細胞能夠調節TPL-2的組合物，所給予的量足以達到改變TPL-2介導的NFκB調節作用。
在前述方面的一個優選實施方案中，所治療的病癥是多發性硬化癥(MS)、炎癥性腸病(IBD)、胰島素依賴性糖尿病(IDDM)、膿毒病、牛皮癬、移植排斥反應、調節異常的TNF表達或優選是類風濕性關節炎。
在前述方面的另一優選實施方案中，所給予的組合物含有選自以下的化合物N1-[4-(4-氨基-7-環戊基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)-2-氯苯基]-1-苯磺酰胺、5-氧代-4-[4-(苯硫基)苯胺基]-5,6,7,8-四氫-3-喹啉羧酸乙酯、3-(4-吡啶基)-4,5-二氫-2H-苯并[g]-吲唑甲磺酸鹽和2-氯苯并[1][1,9]菲咯啉-7-羧酸鈉。
另一方面，本發明提供治療TNF調節異常的方法，該方法給予TNF調節異常風險個體有效治療量的TPL-2調節劑，以進行治療。
在一個相關方面，本發明提供治療類風濕性關節炎的方法，該方法給予類風濕性關節炎風險個體有效治療量的TPL-2調節劑，以進行治療。
在以上兩個方面的一個優選實施方案中，所述TPL-2調節劑是N1-[4-(4-氨基-7-環戊基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)-2-氯苯基]-1-苯磺酰胺、5-氧代-4-[4-(苯硫基)苯胺基]-5,6,7,8-四氫-3-喹啉羧酸乙酯、3-(4-吡啶基)-4,5-二氫-2H-苯并[g]-吲唑甲磺酸鹽或2-氯苯并[l][1,9]菲咯啉-7-羧酸鈉。
在再一實施方案中，當所治療的病癥是關節炎例如類風濕性關節炎時，使用的TPL-2調節劑不是3-(4-吡啶基)-4,5-二氫-2H-苯并[g]-吲哚甲磺酸鹽。
A)TPL-2缺失突變體標示myc和TSP3表位的位置(Salmeron,A.等，(1996)EMBO J.15,817-826)。M30相當于TPL-2的選擇性起始位點(Aoki,M.等，(1993)J.Biol.Chem.268,22723-22732)。B)TPL-2ΔC不能與p105形成穩定復合物。合成p105(Blank等，(1991)EMBO J.10,41594167)，并用[35S]-Met通過獨立或與TPL-2或TPL-2ΔC一起的體外無細胞翻譯進行標記(Salmeron等，1996)。然后用抗-TPL-2抗體-/+競爭肽免疫沉淀合適的翻譯混合物。用10％SDS-PAGE分開分離的蛋白，并用熒光自顯影顯現(右側組)。左側組標記的‘溶胞產物’顯示在整個兔網織紅細胞溶胞產物翻譯混合物中的TPL-2和p105表達。體外翻譯的p105產生只在過度曝光的膠片(數據未提供)才可見到的低水平p50(泳道3)。C)TPL-2N末端不需要與p105結合。與B一樣，所指示的TPL-2蛋白(均在其N末端標記的myc表位)與p105在體外翻譯，然后用抗-myc MAb免疫沉淀。10％SDS-PAGE后熒光自顯影顯示[35S]-Met-標記蛋白。下面一組顯示溶胞產物中的p105表達。圖2TPL-2與NF-κBl p105的C末端在體外的相互作用。
A)p105缺失突變體(Fan等，(1991)Nature 354,395-398)。標示Rel同源結構域(RHD)(Ghosh等，(1998)Annu.Rev.Immunol.16,225-260)、富含甘氨酸區(GRR)(Lin等，(1996)Mol.Cell Biol.16,2248-2254)和抗體表位myc和NF-κBl(N)的位置。空心箭頭指示p50 C末端的位置。實心箭頭指示不同TPL-2互作的NF-κBl雙雜交克隆的N末端起始位置，它們均與所述蛋白的C末端連接。B)和C)TPL-2與p105的C末端相互作用。TPL-2與指示的p105突變體一起在體外翻譯。通過對抗-TPL-2免疫沉淀物(右側組)進行8％SDS-PAGE以及熒光自顯影分析復合物的形成。左側組顯示溶胞產物中的TPL-2和p105突變體的表達。B)中的箭頭指示p48的位置。圖3TPL-2與NF-κBl p105在體內締合而且瞬時表達后激活NF-κB-依賴性報道基因。
A)TPL-2與p105在體內締合。用指示的抗體-/+競爭肽免疫沉淀HeLa細胞溶胞產物。通過10％SDS-PAGE分開分離的蛋白，然后依次對所示蛋白進行蛋白質印跡。B)大部分TPL-2與p105在體內復合。用抗-NF-κBl抗體對HeLa細胞溶胞產物連續免疫沉淀3次。細胞溶胞產物的蛋白質印跡證實消除了p105/p50，但是沒有消除α-微管蛋白。用抗-TPL-2抗血清探測溶胞產物和溶胞產物的抗-TPL-2免疫沉淀物的蛋白質印跡，測定耗竭NF-κBl的溶胞產物的TPL-2含量。C)TPL-2表達激活NF-κB-依賴性熒光素酶報道基因。用0.5μg指定表達載體和2μg報道構建物(用空pcDNA3載體將總DNA調節為4μg)轉染JurkateT細胞。復份進行熒光素酶測定，并表示為相當于空載體對照的平均刺激指數(+/-SE)。按蛋白質印跡測定，根據其表達水平，相對于指定為任意值1的TPL-2，對TPL-2ΔC數據歸一化。TPL-2ΔC(A270)是TPL-2的激酶失活點突變。D)C末端p105片段的共表達阻斷TPL-2激活NF-κB。用0.5μg指定表達載體和或者2μg空載體或者3’NN構建物和2μg NF-κB熒光素酶報道構建物轉染JurkatT細胞。復份熒光素酶測定表示為相對于空載體對照的平均刺激指數(+/-SE)。蛋白質印跡證實3’NN的表達不會影響共轉染的TPL-2的表達(數據未提供)。圖4TPL-2與myc-p105共表達誘導活性myc-p50的核轉運。
A)TPL-2誘發共表達的NF-κBl的核轉運。用0.5μg各指定表達載體瞬時轉染3T3細胞，并用定位myc-p105/myc-p50的抗-myc MAb(綠色；表現為亮點)和抗-TPL-2抗血清(紅色，表現為黑點)對其進行間接免疫熒光染色。所示圖象是透過典型轉染細胞的一個共焦區的圖片。還顯示了相差圖。
B)TPL-2誘導myc-p50轉運入細胞核中。從用指定載體轉染的細胞制備胞質和細胞核提取物。用抗-NF-κBl(N)抗血清探測抗-myc免疫沉淀物的蛋白質印跡，顯示myc-p105/myc-p50。與總細胞溶胞產物比較提示，不能從細胞核部分有效提取myc-p50，所以它不能充分說明問題。
C)TPL-2誘導的核NF-κBl具有生物活性。用EMSA(Alkalay,I等，(1995)Mol.Cell. Biol.15,1294-1301)分析從用指定表達載體(各0.5μg；Watanabe等，(1997)EMBO J.16,3609-3620)轉染的3T3細胞制備的核提取物的NF-κB DNA結合活性。實心箭頭指示檢測到的兩種NF-κB復合物的位置。空心箭頭指示抗體-超漂移(supershifted)的NF-κB復合物的位置(泳道6和7)。在泳道8中，與100倍未標記的κB寡核苷酸的競爭證實檢測到的NF-κB復合物的特異性。圖5TPL-2促進與p105加工無關的p50的核轉運。
用編碼HA-p50(0.4μg)、或者TPL-2(A270)或者TPL-2(0.2μg)和myc-p105AGRR的載體或空載體(0.4μg)瞬時轉染3T3細胞。培養24小時后，用定位HA-p50的抗-HA MAb(綠色表現為亮點)和抗-TPL-2抗血清(紅色表現為黑點)對細胞進行間接免疫熒光染色。所示圖象是透過典型轉染細胞的一個共焦區圖片。還提供了相差圖。圖6TPL-2刺激共表達的myc-p105的蛋白酶解。
A)TPL-2共表達對p105蛋白酶解的影響。用編碼myc-p105和TPL-2(TPL-2)的表達載體或用編碼myc-p105的表達載體和空載體(對照)瞬時轉染3T3細胞。培養24小時后，用[35S]-Met/[35S]-Cys對細胞進行代謝性脈沖標記30分鐘，然后追蹤指定時間。用抗-myc MAb從細胞溶胞產物免疫沉淀標記蛋白，通過8％SDS-PAGE分開，并用熒光自顯影顯示。實心箭頭證實共免疫沉淀的TPL-2的位置。空心箭頭指示TPL-2共表達引起的myc-p105的電泳遷移率變化。B)和C)用激光光密度測定法定量A組的免疫沉淀的myc-p105和myc-p50，而且圖示數據表明myc-p105的轉換(B)和myc-p50/myc-p105比(C)。D)用編碼myc-p105AGRR和TPL-2(TPL-2)的載體或編碼myc-p105AGRR的載體以及沒有插入片段的載體(對照)瞬時轉染3T3細胞。如同B一樣測定myc-p105的轉換。E)用編碼myc-p105的載體和編碼TPL-2(A270)的載體或空載體(對照)一起轉染3T3細胞。如同B一樣測定myc-p105的轉換。F)蛋白酶體的抑制劑阻斷TPL-2誘導的p105蛋白酶解。如同A一樣轉染3T3細胞。在脈沖標記前加入MG132蛋白酶體抑制劑(2011M)或DMSO溶媒(對照)并保持于整個追蹤期。如同A一樣通過免疫沉淀分離標記的myc-p105，并用激光光密度測定法進行定量。圖示數據表示所述藥物對TPL-2誘導的myc-p105蛋白酶解的影響。在追蹤期，MG132處理完全阻斷了TPL-2共轉染細胞產生myc-p50(數據未提供)。G)如同A一樣，用指定載體復份轉染3T3細胞。24小時后用抗-myc抗血清探測細胞溶胞產物的蛋白質印跡，測定穩態水平的myc-p50/myc-p105。與對照相比，TPL-2共轉染提高myc-p50的絕對水平。因此，在TPL-2共表達細胞中myc-p50可能更穩定，可能由于其核轉運所致，因為不增加由myc-p105產生myc-p50的總速率(圖6A)。圖7TNF-α誘導的降解p105需要TPL-2活性。
A)激酶失活TPL-2阻斷TNF-α誘導的p105降解。按蛋白質印跡測定，轉染的JurkatT細胞穩定表達激酶失活TPL-2(A270)。用[35S]-Met/[35S]-Cys對用空載體穩定轉染的載體對照細胞和兩種獨立衍生的表達TPL-2(A270)的克隆進行代謝性脈沖標記30分鐘，然后在TNF-a(20ng/ml)或對照介質(如圖所示)存在下追蹤指定時間。用抗-NF-κBl(N)抗血清從細胞溶胞產物免疫沉淀標記的p105，通過SDS-PAGE分開并用熒光自顯影顯示。通過激光光密度測定法定量免疫沉淀的p105，而且數據以圖形式提供。
B)TPL-2誘導共表達的myc-p105的磷酸化。用編碼myc-p105和指定蛋白或沒有插入片段的對照(O)的載體瞬時轉染3T3細胞。用抗-myc MAb經免疫沉淀分離myc-p105，然后用對照緩沖液(1)、磷酸酶(2)或磷酸酶和磷酸酶抑制劑(3)處理。通過8％SDS-PAGE分開分離的蛋白，并用抗-NF-κBl(N)抗血清進行蛋白質印跡。箭頭指示TPL-2共表達引起的myc-p105的電泳遷移率的變化。圖8顯性失活TPL-2調節TNF-誘導的報道基因的轉錄用在TNF誘導型NFκB反應啟動子系統控制下表達熒光素酶報道基因的載體，按照圖7A的方法轉化Jurkat T細胞。TPL-2 KD(激酶失活)或TPL-2 Cter(C末端截短)的共表達導致TNF-介導的激活降低。圖9圖示化合物N-(6-苯氧基-4-喹啉基)-N-[4-(苯硫基)苯基]胺的化學結構，它能夠在50μM水平時抑制TPL-2激酶活性50％。
圖10圖示化合物5-氧代-4-[4-(苯硫基)苯胺基]-5,6,7,8-四氫-3-喹啉羧酸乙酯的化學結構，它能夠在10μM水平時抑制TPL-2激酶活性50％。圖11圖示化合物3-(4-吡啶基)-4,5-二氫-2H-苯并[g]吲唑-2-鎓甲磺酸鹽的化學結構，它能夠在100μM水平時抑制TPL-2激酶活性50％。圖12圖示化合物2-氯苯并[l][1,9]菲咯啉-7-羧酸鈉的化學結構，它能夠在100μM水平時抑制TPL-2激酶活性50％。圖13為放射性自顯影圖片，它證實幾種不同化合物在降低TPL-2自身磷酸化(FLAG-COT(30-397))和靶多肽即GST-IκB-α的磷酸化水平中的抑制活性(泳道1,3-(4-吡啶基)-4,5-二氫-2H-苯并[g]吲唑；泳道2,5-氧代-4-[4-(苯硫基)苯胺基]-5,6,7,8-四氫-3-喹啉羧酸乙酯；泳道3,N-(6-苯氧基-4-喹啉基)-N-[4-(苯硫基)苯基]胺；泳道4，星形孢菌素；泳道5,SB203580；泳道6,PD098059；泳道7，只有FLAG-COT(30-397)和溶媒(DMSO)；以及泳道8，只有FLAG-COT(30-397)、GST-IκB-α和溶媒(DMSO)；進一步的細節參見文本)。圖14圖示喹啉基衍生物的核心結構。
發明詳述TPL-2(腫瘤發展基因座2(tumour progression locus 2))是首次分離的與莫洛尼鼠類白血病病毒有關的MAP激酶激酶激酶。基因(tpl-2)編碼的多肽與各個系統的腫瘤發展以及腫瘤發生有關，而且似乎它是在腫瘤中通過C末端截短作用激活(Makris等，(1993)J Virol 67:1286-1291；Patrotis等，(1993)PNAS(USA)90:2251-2255；Makris等，(1993)J Virol 67:4283-4289；Patrotis等，(1994)PNAS(USA)91:97559759；Salmeron等，(1996)EMBO J 15:817-826；Ceci等，(1997)Genes Dev 11:688-700)。大鼠TPL-2的完整核酸和氨基酸序列可以登錄號M94454在GenBank獲得。Oska甲狀腺癌(cancer Osaka throid)的TPL-2人同源物(稱為COT)的核酸和氨基酸序列可以登錄號NM 005204和729884在GenBank獲得(另外參見例如Miyoshi等，Mol.Cell.Biol.11(8),4088-4096(1991))。1．TPL-2是NFκB調節劑第一方面，本發明涉及利用TPL-2分子調節NFκB活性。1a．TPL-2分子的應用本發明包括例如應用TPL-2分子調節在體外和/或體內測定中的NFκB活性、尤其是在這類測定系統中磷酸化p105；應用TPL-2分子調節體內細胞中的NFκB活性，例如以便誘導或防止免疫反應或炎癥反應。在一個優選的實施方案中，本發明涉及應用TPL-2分子治療與去調節的NFκB表達有關的疾病。
在一個優選的實施方案中，或者在體內或在體外(例如在體外進行的測定方法中或細胞中例如細胞培養物中)，按照本發明的TPL-2分子可用于調節處于NFκB控制元件控制下的基因轉錄。
用于以上定義的測定或方法的TPL-2分子可用來誘導或防止p105磷酸化和蛋白酶解。因此，例如具有野生型TPL-2生物活性和能夠結合并磷酸化p105的TPL-2分子可用來誘導p105降解和/或炎癥反應。而且可使用組成型活性的TPL-2突變體，由此使其活性從其它細胞控制途徑分離。
本發明的再一方面，可應用TPL-2的“激酶失活(kinase dead)”顯性失活突變體，通過與內源野生型TPL-2競爭p105但不調節所述靶的磷酸化，向下調節p105磷酸化作用。最好通過使TPL-2在激酶域中的例如位置270發生突變，制備激酶失活突變體。可進行隨機突變，并通過評價磷酸化人工底物的能力選擇突變，或者可以通過模擬活性位點和定點誘變設計突變，以阻止或降低激酶活性。優選的激酶失活突變體是TPL-2(A270)和TPL-2(R167)。根據TPL-2結構的序列同源性推測這兩種已知的突變體。1b．TPL-2分子本文使用的“TPL-2分子”是指具有至少一種TPL-2生物活性的多肽。因此該術語包括保留至少一個TPL-2結構決定簇的TPL-2片段。
優選的TPL-2分子具有GenBank(登錄號M94454)所給出的結構。此大鼠TPL-2多肽也由登錄號M94454給出的核酸序列編碼。本領域技術人員可以按照遺傳密碼簡并性設計編碼M94454多肽的替代序列。而且，本發明包括由與M94454給出的核酸序列基本同源的序列編碼的TPL-2多肽。當同源性是指序列同一性時，“基本同源”意味著按照直接的序列排列和對比判斷，序列同一性高于40％，優選序列同一性高于45％，優選序列同一性高于55％，優選序列同一性高于65％，最優選序列同一性為75％或更高。
例如術語“TPL-2分子”是指COT，即TPL-2的人同源物(登錄號NM005204)。COT與TPL-290％相同。
此外，可使用例如默認參數用任何合適同源性算法確定序列同源性(或同一性)。最好使用BLAST算法，參數設定為默認值。BLAST算法詳細描述于http://www.nchi.nih.gov/BLAST/blast_help.html，將其通過引用結合到本文中。檢索參數定義如下，而且最好設定為定義的默認參數。
當用BLAST評價時，最好將“基本同源”看作EXPECT值至少約7、優選至少約9和最優選10或更高的序列。BLAST檢索的EXPECT的默認閾值通常為10。
BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)是程序blastp、blastn、blastx、tblastn和tblastx使用的探試檢索算法；這些程序利用少許增強的Karlin和Altschul的統計學方法(參見http://www.ncbi.nih.gov/BLAST/blast_help.html)對其發現進行顯著性檢驗。使BLAST程序適于進行序列相似性檢索，以便例如鑒定查詢序列的同源物。該程序一般不適用于主題型檢索。關于序列數據庫的相似性檢索的基本問題討論，見Altschul等，(1994)Nature Genetics 6:119-129。
在http://www.ncbi.nlm.nih.gov可獲得5個BLAST程序進行以下工作blastp比較氨基酸查詢序列與蛋白序列數據庫；blasm比較核苷酸查詢序列與核苷酸序列數據庫；blastx比較核苷酸查詢序列(雙鏈)的6個讀框概念翻譯產物與蛋白序列數據庫；tblastn比較蛋白查詢序列與所有6個讀框(雙鏈)動態翻譯的核苷酸序列數據庫；tblastx比較核苷酸查詢序列的6個讀框翻譯與核苷酸序列數據庫的6個讀框翻譯。
BLAST采用以下檢索參數HISTOGRAM顯示每次檢索評分(score)的直方圖；默認值為是(yes)。(參見BLAST手冊的參數H)。
DESCRIPTIONS限定匹配序列的簡短描述的數目，以具體數字報告；默認限定值是100條描述。(參見手冊頁的參數V)。另外參見EXPECT和CUTOFF。
ALIGNMENTS將數據庫序列限定于報告為高評分區段對(HSP)的具體數字；默認限值為50。如果更多的數據庫序列符合報告的統計學顯著性閾值(見下文的EXPECT和CUTOFF)，則只報告統計學顯著性最大的匹配。(參見BLAST手冊中的參數B)。
EXPECT是相對于數據庫序列的報告序列匹配的統計學顯著性閾值；默認值是10，因此，按照Karlin和Altschul的統計學模型(1990)認為10個匹配只是偶然發現。如果匹配統計學顯著性大于EXPECT閾值，則不能報告匹配。較低的EXPECT閾值更嚴格，使報告的匹配的機會性更小。分數值是可接受的(參見BLAST手冊中的參數E)。
CUTOFF是報告高評分區段對的臨界評分。根據EXPECT值計算默認值(見上文)。只有當其統計學顯著性至少高至等于CUTOFF臨界值的評分的單一HSP時，報告HSP為數據庫序列。CUTOFF臨界值越高，則報告序列匹配的機會性就越小。(參見BLAST手冊的參數S)。通常用EXPECT能夠更直觀地處理顯著性閾值。
MATRIX指定BLASTP、BLASTX、TBLASTN和TBLASTX的變更評分矩陣。默認矩陣是BLOSUM62(Henikoff&Henikoff,1992)。有效的變更選擇包括PAM40、PAM120、PAM250和IDENTITY。BLASTN沒有可用的變更評分矩陣；指定BLASTN請求的MATRIX命令返回錯誤應答。
STRAND將TBLASTN檢索剛好限定在數據庫序列的上鏈或下鏈；或者將BLASTN、BLASTX或TBLASTX檢索剛好限定于查詢序列的上鏈或下鏈的讀框。
如果按Wootton&Federhen(1993)Computers and Chemistry 17:149-163的SEG程序測定，FILTER屏蔽組成復雜性小的查詢序列的區段；如果按Claverie&States(1993)Computers and Chemistry 17:191-201的XNU程序測定或者對于BLASTN按Tatusov和Lipman(見http://www.nchi.nlm.nih.gov)的DUST程序測定，FILTER屏蔽短周期性的內重復序列組成的區段。篩選可從blast輸出篩除具有統計學顯著性但是沒有生物學意義的報告(例如找到常見的富含酸性氨基酸、堿性氨基酸或脯氨酸的區)，保留相對于數據庫序列特異性匹配的查詢序列的更具有生物學意義的區。
用核苷酸序列中的字母“N”(例如“NNNNNNNNNNNNN”)和蛋白序列中的字母“X”(例如“XXXXXXXXX”)代替篩選程序發現的復雜性低的序列。
篩選只適用于查詢序列(或其翻譯產物)，而不適用于數據庫序列。BLASTN的默認篩選是DUST，其它程序的默認篩選是SEG。
當應用于SWISS-PROT序列時，SEG、XNU或二者常常什么也不能屏蔽，所以不能期望篩選總能產生作用。而且在某些情況下，整個序列全被屏蔽，說明應該懷疑對未篩選的查詢序列報告的任何匹配的統計學顯著性。
除了訪問名稱和/或位置名稱之外，輸出時顯示NCBI-gi CausesNCBI gi用戶標識符。
最優選采用http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST提供的簡單BLAST檢索算法比較序列。
而且，本發明包括在低、中等或高嚴格條件中的任何一種條件下能夠與GenBank M94454所示的核酸序列雜交的核酸序列編碼的多肽。
雜交的嚴格性是指一些條件，在所述條件下多核酸雜種分子是穩定的。這樣的條件對本領域一般技術人員而言是顯而易見的。本領域技術人員已知，雜種分子的解鏈溫度(Tm)反映雜種分子的穩定性，序列同源性每降低1％，解鏈溫度約降低1-1.5℃。一般來說，雜種分子的穩定性是鈉離子濃度和溫度的函數。通常在高嚴格條件下進行雜交反應，然后以變化的嚴格性進行洗滌。
本文所用的高嚴格性是指只允許在1M Na+、65-68℃下形成穩定雜種分子的核酸序列進行雜交的條件。例如在含有6×SSC、5×Denhardt試劑、1％SDS(十二烷基硫酸鈉)、0.1焦磷酸鈉和作為非特異性競爭物的0.1mg/ml變性鮭精DNA的水溶液中進行雜交可以獲得高嚴格條件。雜交后，可以幾個步驟進行高嚴格洗滌，最后一次洗滌(約30分鐘)在0.2-0.1×SSC、0.1％SDS中于雜交溫度下進行。
中等嚴格性是指等同于在上述溶液中但是于約60-62℃進行雜交的條件。在此情況下，最后一次洗滌在1×SSC、0.1％SDS中于雜交溫度下進行。
低嚴格性是指等同于在上述溶液中于約50-52℃下雜交的條件。在此情況下，最后一次洗滌在2×SSC、0.1％SDS中于雜交溫度下進行。
當然可用各種緩沖液例如基于甲酰胺的緩沖液以及不同溫度應用上述條件，并重復一次。Denhardt溶液和SSC同其它合適的雜交緩沖液一樣是本領域眾所周知的(參見例如Sambrook等編輯(1989)Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor LaboratoryPress,New York或Ausubel等編輯(1990)Current Protocols in MolecularBiology,John Wiley&Sons,Inc.)。必須經驗性確定最佳雜交條件，因為探針的長度和GC含量也對其有影響。
而且，本發明有利提供在嚴格條件下能夠與GenBank M94454或NM005204所示的核酸序列(分別參見SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:3)的片段雜交的核酸序列。所述片段優選是15-50個堿基長度。最好它為約25個堿基長度。
如果按照本文提供的指導，本發明的核酸可按照本領域周知的方法獲得。例如可利用聚合酶鏈反應(PCR)通過化學合成或者通過篩選從認為含有TPL-2并以可檢測水平表達TPL-2的來源制備的基因組文庫或合適的cDNA文庫獲得本發明的DNA。
合成目的核酸的化學法是本領域已知的，包括三酯法、亞磷酸酯法、亞磷酰胺和H-磷酸酯法、PCR和其它自動引物法以及在固體支持物上的寡核苷酸合成。如果所述核酸的全部核酸序列是已知的或者可獲得與所述編碼鏈互補的核酸序列，則可使用這些方法。另一方面，如果已知目的氨基酸序列，人們可用每個氨基酸的已知和優選編碼殘基推測潛在的核酸序列。
分離編碼TPL-2的基因的替代方法可使用按例如Sambrook等，1989中的14小節中所述的PCR技術。該方法需要使用將與TPL-2核酸雜交的寡核苷酸探針。選擇寡核苷酸的策略如下所述。
用設計來鑒定目的基因或由其編碼的蛋白的探針或分析手段篩選文庫。對于cDNA表達文庫，合適的材料包括識別并特異性結合TPL-2的單克隆抗體或多克隆抗體；編碼已知的或可疑的來自相同或不同物種的TPL-2 cDNA的約20-80個堿基長度的寡核苷酸；和/或編碼相同基因或雜交基因的互補或同源cDNA或其片段。篩選基因組DNA文庫的合適探針包括但不限于編碼相同或雜交DNA的寡核苷酸、cDNA或其片段；和/或同源基因組DNA或其片段。
通過用探針篩選在合適雜交條件下的合適cDNA或基因組文庫，可分離編碼TPL-2的核酸，所述探針即本文公開的核酸，包括可衍生自GenBank登錄號M94454或NM005204所示序列(分別參見SEQ IDNO:1和SEQ ID NO:3)的寡核苷酸。合適的文庫可從市場上獲得，或者可以由例如細胞系、組織標本等制得。
本文所用的探針是例如單鏈DNA或RNA，它們具有含10-50個連續堿基、優選15-30個連續堿基、最優選至少約20個連續堿基的核苷酸序列，所述連續堿基其數量等于或大于M94454所示連續堿基數，或與M94454所示連續堿基互補。選作探針的20個核酸序列的長度應該足夠長而且遍在性足夠小，使得假陽性結果最小。所述核苷酸序列一般基于TPL-2的保守的或高度同源的核苷酸序列或區。用作探針的核酸可以在一個或多個位置是簡并性的。當從不知道其優選密碼子使用的物種中篩選文庫時，使用簡并寡核苷酸可能特別重要。
由其構建探針的優選區包括5’和/或3’編碼序列、預期編碼配體結合位點的序列等。例如本文公開的全長cDNA克隆或其片段可用作探針。最好用雜交時檢測簡便的合適標記措施標記本發明的核酸探針。例如合適的標記措施是放射性標記。標記DNA片段的優選方法是在隨機引發的反應中混合DNA聚合酶的Klenow片段和α-32P dATP，這是本領域眾所周知的。通常用α-32P-標記的ATP和多核苷酸激酶對寡核苷酸進行末端標記。但是，其它方法(例如非放射性標記法)也可用來標記所述片段或寡核苷酸，包括例如酶標記、采用合適熒光團的熒光標記和生物素化標記。
例如用含有基本完整的TPL-2編碼序列的DNA的一部分或基于所述DNA的一部分的合適寡核苷酸篩選所述文庫后，通過檢測雜交信號鑒定陽性克隆；所鑒定克隆的特征在于限制酶圖譜和/或DNA序列分析，然后通過與本文給出序列比較進行檢測，以確定它們是否含有編碼完整TPL-2的DNA(即它們是否含有翻譯起始密碼子和終止密碼子)。如果選定的克隆是不完整的，則可用它們再篩選相同或不同文庫，以獲得重疊克隆。如果所述文庫是基因組文庫，那么所述重疊克隆可能包括外顯子和內含子。如果所述文庫是cDNA文庫，那么所述重疊克隆將含有可讀框。在這兩種情況下，通過與本文提供的DNA和推定的氨基酸序列比較可以鑒定完整克隆。
“結構決定簇”意味著所述衍生物保有至少一種TPL-2結構特征。結構特征包括具有能夠重現天然產生的TPL-2多肽的至少一種生物活性的結構基元。因此，本發明提供的TPL-2包括由初級轉錄物可變剪接產生的mRNA編碼的剪接變體、氨基酸突變體、糖基化變異體和保有至少一種TPL-2的生理特性和/或物理特性的TPL-2的其它共價衍生物。典型的衍生物包括其中通過取代、化學方法、酶學方法或利用非天然產生氨基酸的部分的其它合適途徑共價修飾本發明的蛋白的分子。所述非天然產生氨基酸的部分是可檢測到的部分例如酶或放射性同位素。所述TPL-2衍生物還包括見于特定物種、尤其是哺乳動物的天然產生的TPL-2變異體。這種變異體可由同一基因家族的相關基因或特定基因的等位變異體編碼，或者這種變異體是TPL-2基因的可變剪接變體。
觀測到TPL-2的C末端對于與p105的相互作用是必需的。因此，按照本發明的TPL-2分子優選保有天然產生的TPL-2的C末端部分。按照本發明的TPL-2分子優選至少保有天然產生的TPL-2例如M94454代表的TPL-2的氨基酸398-468。
按照本發明的TPL-2分子最好包括TPL-2的氨基酸350-468；優選為TPL-2的氨基酸300-468；優選為TPL-2的氨基酸250-468；優選為TPL-2的氨基酸200-468；最優選為TPL-2的氨基酸131-468。
另一方面，按照本發明的TPL-2分子包含M94454所示的7個TPL-2外顯子中的至少一個。所以，所述TPL-2分子最好包含氨基酸425-468(外顯子7)；最好它包含氨基酸343-424(外顯子6)；優選它包含氨基酸256-342(外顯子5)；優選它包含氨基酸169-255(外顯子4)；優選它包含氨基酸113-168(外顯子3)；優選它包含氨基酸1-112(外顯子2)；或者以上的任何一種組合。
而且，本發明外延至以上定義的這類片段的同源物。
如上所述，保有共同結構決定簇的衍生物可以是TPL-2的片段。TPL-2片段包括其各個結構域以及衍生自所述結構域的較小多肽。最好是，衍生自按照本發明的TPL-2的較小的多肽確定了一個為TPL-2特征的功能域。在理論上片段幾乎可以是任何大小，前提是它們保有一種TPL-2特征。片段最好是4-300個氨基酸長度。更長的片段被認為是對全長TPL-2的截短所致，而且它通常包括在術語“TPL-2”定義內。
TPL-2衍生物還包括其可含有氨基酸缺失、添加或取代的突變體，前提是它保有至少一種TPL-2特征。因此，可以進行保守的氨基酸取代而基本上不改變TPL-2的性質，從N末端截短就可以做到這一點。而且可以對本發明包括的TPL-2片段進行缺失和取代。可以使編碼TPL-2的DNA在體外進行誘變，導致例如一個或多個氨基酸的添加、交換和/或缺失，從而由所述DNA產生TPL-2突變體。例如通過重組的方法可制備TPL-2的取代、缺失或插入突變體，并篩選與天然形式的TPL-2的交叉免疫反應性。
TPL-2的片段、突變體和其它衍生物優選保有與TPL-2的顯著同源性。本文使用的“同源性”是指兩種實體共有的足夠特征，以便技術人員確定它們在來源和功能上的相似性。同源性優選用來指序列同一性，而且按以上定義確定序列同一性。
在一個實施方案中，不同形式的TPL-2蛋白包括例如稱為COT的人TPL-2同源物的不同氨基酸區，特別包括例如氨基酸殘基30-397的人TPL-2多肽(即COT(30-397))、氨基酸殘基30-467的人TPL-2多肽(即COT(30-467))、氨基酸殘基1-397的人TPL-2多肽(即COT(1-397))和氨基酸殘基1-467的人TPL-2多肽(即COT(1-467))。這些不同形式的TPL-2多肽可以與本領域已知的各種免疫標記物或親和標記物融合，以有助于純化特定多肽。標記物包括但不限于FLAG標記物、GST(谷胱甘肽S轉移酶)和聚組氨酸殘基例如His6。此外，本發明還包括工程后具有例如需要的蛋白酶剪切位點的多肽，所述蛋白酶剪切位點可插入上述標記物的鄰近部位，有助于在純化蛋白后將其去除。
因此，可表達本發明的TPL-2多肽，通過免疫沉淀從本文所述的例如轉染的人293A細胞或從例如桿狀病毒感染的昆蟲細胞純化TPL-2多肽。通常桿狀病毒感染的昆蟲細胞允許大量純化適合大量篩選化學文庫的重組表達蛋白。制備TPL-2分子的其它方法在下文描述。1c．制備TPL-2分子本發明包括產生用于調節如上所述的p105活性的TPL-2分子。TPL-2分子最好通過重組DNA技術產生，利用重組DNA技術可將編碼TPL-2分子的核酸摻入載體中，以進行進一步操作。本文使用的載體(或質粒)是獨立元件，它用來將外源DNA導入細胞，以使其表達或復制。所述載體的選擇和使用均是本領域技術人員熟知的。可使用許多載體，而合適載體的選擇取決于載體的預定用途(即它用于擴增DNA還是表達DNA)、需要插入所述載體中的DNA的大小和將用所述載體轉化的宿主細胞。根據每種載體的功能(擴增DNA還是表達DNA)以及與其匹配的宿主細胞，每種載體含有不同的組分。所述載體組分一般包括但不限于以下組分中的一種或多種組分復制起點、一個或多個標記基因、增強子元件、啟動子、轉錄終止序列和信號序列。
表達載體和克隆載體一般均含有能夠使所述載體在一種或多種選定的宿主細胞中復制的核酸序列。通常在克隆載體中，該序列是使所述載體能夠獨立于所述宿主染色體DNA復制的序列，包括復制起點或自主復制序列。對于各種細菌、酵母和病毒而言，這種序列是眾所周知的。質粒pBR322的復制起點適用于大多數革蘭氏陰性細菌，2p質粒復制起點適用于酵母，而各種病毒復制起點(例如SV 40、多瘤病毒、腺病毒)適用于哺乳動物細胞的克隆載體。一般而言，哺乳動物表達載體不需要復制起點組分，除非在能夠高水平復制DNA的哺乳動物細胞(例如COS細胞)中使用復制起點。
大多數表達載體是穿梭載體，即它們能夠在至少一類生物體中復制，但是可轉染入另一類生物體表達。例如，在大腸桿菌中克隆一種載體，然后將該載體轉染入酵母細胞或哺乳動物細胞，但是它不能獨立于宿主細胞染色體進行復制。DNA也可以通過插入宿主基因組而進行復制。但是，編碼TPL-2的基因組DNA的回收比外源性復制載體的回收更復雜，因為需要限制酶消化切除TPL-2 DNA。DNA能夠通過PCR擴增并直接轉染入宿主細胞，而不需要任何復制組分。
最好是表達及克隆載體含有也稱為選擇標記的選擇基因。該基因編碼在選擇培養基中培養的轉化宿主細胞生存或生長所必需的蛋白。沒有被含有所述選擇基因的載體轉化的宿主細胞不能在所述培養基中存活。通常選擇基因編碼的蛋白質賦予抗生素以及其它毒素例如氨芐青霉素、新霉素、氨甲喋呤或四環素抗性；賦予互補的營養缺陷；或者提供不能從復合培養基獲得的關鍵營養素。
關于適用于酵母的選擇基因標記，可使用因為所述標記基因的表型表達而有助于選擇轉化體的任何標記基因。合適的酵母標記例如是賦予抗生素G418、潮霉素或博萊霉素抗性的標記，或者為營養缺陷酵母突變體供給原養的標記，例如URA3、LEU2、LYS2、TRP1或HIS3基因。
因為載體的復制通常在大腸桿菌中進行，所以最好包括大腸桿菌遺傳標記和大腸桿菌復制起點。它們可從大腸桿菌質粒獲得，大腸桿菌質粒例如有pBR322、Bluescript載體或pUC質粒，例如pUC18或pUC19質粒，它們同時含有大腸桿菌復制起點和賦予抗生素如氨芐青霉素抗性的大腸桿菌遺傳標記。
適用于哺乳動物細胞的選擇標記是能鑒定可吸收TPL-2核酸的細胞的選擇標記，例如二氫葉酸還原酶(DHFR，氨甲喋呤抗性)、胸腺嘧啶激酶或賦予G418或潮霉素抗性的基因。將所述哺乳動物細胞轉化體置于選擇壓力下，在該選擇壓力下只有吸收并表達所述標記的轉化體才能存活。如果是DHFR或谷氨酰胺合酶(GS)標記，選擇壓力施加是通過在所述選擇壓力進行性增強的條件下培養所述轉化體，由此導致所述選擇基因和編碼TPL-2的連鎖DNA擴增(在其染色體整合位點)。擴增過程是在所述重組細胞的染色體上串聯性重復對于產生生長關鍵性蛋白大量需要的基因和與其緊密連接的編碼目的蛋白的基因。一般通過由此擴增的DNA合成增加量的目的蛋白。
表達以及克隆載體一般含有所述宿主生物體識別并與TPL-2核酸有效連接的啟動子。這種啟動子可以是誘導型或組成型啟動子。通過用限制酶消化來源DNA取出所述啟動子，然后將分離的啟動子序列插入所述載體，從而將啟動子與編碼TPL-2的DNA有效連接。天然TPL-2啟動子序列和許多異源啟動子啟動子均可用來控制TPL-2 DNA的擴增和/或表達。術語“有效連接”是指其中所述組分處于允許它們以其預期方式起作用的關系狀態的并列。與編碼序列“有效連接”的控制序列的連接方式使得可在適合所述控制序列的條件下實現表達所述編碼序列。
適用于原核生物宿主的啟動子包括例如β-內酰胺酶和乳糖啟動子系統、堿性磷酸酶、色氨酸(trp)啟動子系統和雜種啟動子例如tac啟動子。它們的核苷酸序列均已公布，所以技術人員能夠采用提供任何需要的限制位點的接頭將其與編碼TPL-2的DNA有效連接。用于細菌系統的啟動子也一般含有與編碼TPL-2的DNA有效連接的Shine-Delgamo序列。
優選的表達載體是含有能夠在細菌中起作用的嗜菌體(例如phagex或T7)啟動子的細菌表達載體。在一個最廣泛使用的表達系統中，編碼所述融合蛋白的核酸通過T7 RNA聚合酶從所述載體轉錄(Studier等，Methods in Enzymol.185；60-89,1990)。在大腸桿菌BL21(DE3)宿主菌株與pET載體結合使用時，T7 RNA聚合酶從宿主細菌的\-溶原體DE3產生，而且其表達處于IPTG誘導型lac UV5啟動子控制之下。已成功將該系統用于過量產生許多蛋白。或者通過用int-嗜菌體例如市售獲得的CE6嗜菌體(Novagen,Madison,USA)感染可將所述聚合酶基因導入λ嗜菌體。其它載體包括含有λPL啟動子的載體例如PLEX(Invitrogen,NL)、含有trc啟動子的載體例如p TrcHisXpressTm(Invitrogen)或pTrc99(Pharmacia Biotech,SE)或含有tac啟動子的載體例如pKK223-3(Pharmacia Biotech)或PMAL(new England Biolabs,MA,USA)。
此外，按照本發明的TPL-2基因優選包含分泌序列，以便促進所述多肽從細菌宿主分泌，因而它以可溶性天然肽而不是以包涵體產生。可根據情況從所述細菌的周質間隙或培養基回收所述肽。
適用于酵母宿主的啟動子序列是調節型或組成型啟動子序列，并優選衍生自高表達的酵母基因尤其是釀酒酵母基因。因此可以使用TRPl基因、ADIH或ADHII基因、酸性磷酸酶(PH05)基因的啟動子；接合編碼a或a因子的信息素基因的酵母啟動子；或衍生自編碼糖酵解酶的基因的啟動子，例如以下糖酵解酶的啟動子烯醇化酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAP)、3-磷酸甘油酸激酶(PGK)、己糖激酶、丙酮酸脫羧酶、磷酸果糖激酶、葡糖-6-磷酸異構酶、3-磷酸甘油酸變位酶、丙酮酸激酶、丙糖磷酸異構酶、磷酸葡糖異構酶或葡糖激酶基因；釀酒酵母GAL 4基因啟動子；S.pombe nmt l基因啟動子或TATA結合蛋白(TBP)基因的啟動子。此外，可以使用含有一種酵母基因的上游激活序列(UAS)和另一種酵母基因的下游啟動子元件(包括有功能的TATA盒)的雜種啟動子，例如包含酵母PH05基因的UAS和下游啟動子元件(包括酵母GAP基因的有功能的TATA盒)的雜種啟動子(PH05-GAP雜種啟動子)。合適的組成型PH05啟動子有例如去除上游調節元件(UAS)的縮短的酸性磷酸酶PH05啟動子，如起始于PH05基因的核苷酸-173而終止于核苷酸-9的PH05(-173)啟動子元件。
在哺乳動物宿主中從載體轉錄的TPL-2基因可受控于衍生自病毒基因組的啟動子或異源哺乳動物啟動子以及通常與TPL-2序列連接的啟動子，前提是這類啟動子與所述宿主細胞系統匹配，所述病毒例如多瘤病毒、腺病毒、禽痘病毒、牛乳頭瘤病毒、禽類肉瘤病毒、巨細胞病毒(CMV)、逆轉錄病毒和猿猴病毒40(SV40)，所述異源哺乳動物啟動子諸如肌動蛋白啟動子或非常強的啟動子如核糖體蛋白啟動子。
通過在所述載體中插入增強子序列可增強高等真核生物轉錄編碼TPL-2的DNA。增強子的取向和位置相對獨立。已知哺乳動物基因(例如彈性蛋白酶和球蛋白)的許多增強子序列。但是人們一般使用真核細胞病毒的增強子。實例包括復制起點后側的SV40增強子(bp100-270)和CMV早期啟動子增強子。可在TPL-2 DNA的5’或3’位置將所述增強子剪接入所述載體中，但是優選增強子位于所述啟動子的5’位置。
編碼TPL-2的真核生物表達載體最好含有基因座控制區(LCR)。LCR能夠控制高水平整合部位獨立表達整合入宿主細胞染色質的轉基因，當TPL-2基因將在所述載體整合入染色體的永久性轉染的真核細胞系中表達時，LCR特別重要，其中所述載體設計用于基因治療用途和轉基因動物。
真核表達載體也含有轉錄終止和穩定mRNA必需的序列。這類序列常常可得自于真核生物或病毒DNA或cDNA的5’和3’非翻譯區。這些區含有轉錄為編碼TPL-2的mRNA的非翻譯部分的聚腺苷酸片段的核苷酸區段。
表達載體包括能夠表達TPL-2核酸的任何載體，所述TPL-2核酸與能夠表達所述DNA的調節序列如啟動子區有效連接。因此，表達載體是指當導入合適宿主細胞時導致所述克隆DNA表達的重組DNA或RNA構建物，例如質粒、嗜菌體、重組病毒或其它載體。合適的表達載體是本領域眾所周知的，包括可在真核生物和/或原核生物細胞中復制的載體以及保持游離的載體或整合入宿主細胞基因組的載體。例如編碼TPL-2的DNA可插入適合在哺乳動物細胞中表達cDNA的載體中，所述載體例如是基于CMV增強子的載體如pEVRF(Matthias等，(1989)NAR 17,6418)。
使得編碼TPL-2的DNA在哺乳動物細胞中瞬時表達的表達載體對于實施本發明特別有用。瞬時表達通常涉及使用能夠在宿主細胞中有效復制的表達載體，使得所述宿主細胞累積許多拷貝的表達載體，然后合成高水平的TPL-2。為了本發明的目的，瞬時表達系統用于例如鑒定TPL-2突變體，以鑒定潛在的磷酸化位點或表征所述蛋白的功能域。
應用常規連接技術構建按照本發明的載體。將分離的質粒或DNA片段切割、加尾并以產生所需要質粒的需要方式重新連接。如果需要，用已知方法進行分析以確證在所構建的質粒中的正確序列。構建表達載體、制備體外轉錄物、將DNA導入宿主細胞中并分析評價TPL-2的表達和功能的合適方法是本領域技術人員已知的。例如直接用適當標記的基于本文提供的序列的探針通過常規DNA印跡法、定量mRNA轉錄的RNA印跡法、點印跡法(DNA或RNA分析)或原位雜交，可測定基因在樣品中的存在、擴增和/或表達。如果需要的話，本領域技術人員將容易地設計如何改進這些方法。
因此本發明包括用編碼異源TPL-2分子的載體轉化的宿主細胞。本文使用的外源TPL-2分子可以是突變型內源TPL-2、或者突變型或野生型外源TPL-2。
TPL-2最好可在昆蟲細胞系統中表達。適用于本發明方法的昆蟲細胞一般包括能夠用表達載體轉化并因此表達由其編碼的異源蛋白的任何鱗翅目昆蟲細胞。特別優選應用Sf細胞系，例如草地夜蛾細胞系IPBL-SF-21 AE(Vaughn等，(1997)In vitro,13,213-217)。特別優選衍生的細胞系Sf9。但是可以使用其它細胞系，例如Tricoplusia ni 368(Kurstack和Marmorosch,(1976)Invertebrate Tissue Culture Applicationsin Medicine,Biology and Agriculture,Academic Press,New York,USA)。這些細胞系以及適用于本發明的其它昆蟲細胞系可市售獲得(例如從Stratagene,La Jolla,CA,USA獲得)。
除了在培養的昆蟲細胞中表達之外，本發明還包括在完整的昆蟲生物體中表達TPL-2蛋白。應用病毒載體例如桿狀病毒可感染整個昆蟲，昆蟲生長在一定程度上比培養細胞容易，因為它不怎么要求特殊的生長條件。大昆蟲例如蠶蛾提供高產率的外源蛋白。可按照常規提取技術從昆蟲提取所述蛋白。
適用于本發明的表達載體包括能夠在昆蟲細胞系中表達上述蛋白的所有載體。一般而言，用于哺乳動物和其它真核細胞的載體也適用于昆蟲細胞培養物。特別優選特異性用于昆蟲細胞培養物的桿狀病毒載體，而且它可廣泛市售獲得(例如從Invitrogen和Clotech獲得)。能夠感染昆蟲細胞的其它病毒載體是已知的，例如新培斯病毒(Hahn等，(1992)PNAS(USA)89,2679-2683)。精選的桿狀病毒載體(綜述于Miller(1988)Ann.Rev.Microbiol.42,177-199)是苜蓿銀紋夜蛾多核型多角體病毒AcMNPV。
一般所述異源基因至少部分取代AcMNPV的多角體基因，因為產生病毒不需要多角體。為了插入所述異源基因，最好使用轉移載體。在大腸桿菌宿主中制備轉移載體，然后將所述DNA插入片段通過同源重組轉移到AcMNPV中。2．TPL-2是藥物開發的靶按照本發明，TPL-2分子用作鑒定化合物例如藥物前導化合物的靶，所述化合物能夠通過p105蛋白酶解和Rel亞單位釋放調節NFκB活性。因此本發明涉及一種測定并提供鑒定能夠直接或間接調節p105活性的一種或多種化合物的方法，該方法包括以下步驟
(a)將TPL-2分子與需要評價的一種或多種化合物溫育；和(b)鑒定影響TPL-2分子活性的化合物。2a．TPL-2結合化合物按照這方面發明的第一個實施方案，應用所述測定檢測直接與TPL-2分子結合的多肽。
因此本發明提供鑒定NFκB活性調節劑的方法，該方法包括以下步驟(a)將TPL-2分子與需要評價的一種或多種化合物溫育；和(b)鑒定與TPL-2分子結合的化合物。
最好所述方法還包括以下步驟(c)評價與TPL-2結合的化合物在基于細胞的測定中調節NFκB活化的能力。
可用本領域技術人員已知的任何技術評價與TPL-2的結合。
合適測定的實例包括檢測體內相互作用的雙雜交測定系統、親和層析測定(例如包括結合至固定在柱上的多肽)、其中所述化合物和TPL-2的結合與結合對中的一個或兩個配偶體熒光變化有關的熒光測定等。優選在細胞內進行測定，例如雙雜交測定。
在該實施方案的一個優選方面，本發明提供鑒定用于治療涉及或利用炎癥反應的疾病的藥物的前導化合物的方法，包括在除了存在待測化合物之外TPL-2與具有參比親合性的p105締合的條件下使待測化合物與TPL-2分子和p105溫育；測定在待測化合物存在下TPL-2對p105的結合親和力；和選擇相對于參比結合親和力調節TPL-2對p105的結合親和力的化合物。
所以，在不存在待測化合物或存在參比化合物的情況下校正按照本發明的測定，所述參比化合物與TPL-2的結合活性是已知的或者其活性用作參比值是理想的。例如在雙雜交系統中，參比值可在沒有任何化合物的情況下獲得。加入增強TPL-2與p105的結合親和力的化合物使所述測定的讀數高于所述參比水平，而加入降低該親和力的化合物導致測定讀數低于所述參比水平。2b．調節有功能的p105/TPL-2相互作用的化合物在第二個實施方案中，本發明具體檢測化合物和TPL-2的有功能的相互作用。在調節水平的TPL-2時發生這種相互作用，使得這種激酶本身在對待測化合物的反應中活化或失活，或者在調節TPL-2對p105的生物效應的水平時發生所述相互作用。本文使用的“活化”和“失活”包括化合物對酶活性或其它活性的調節作用以及其對生產速率的調節作用，例如激活或抑制多肽在細胞中的表達。該術語包括對基因轉錄的控制作用，以調節表達基因產物。
檢測對TPL-2和p105的有功能的相互作用的調節作用的測定優選為基于細胞的測定。例如它們可基于對p105磷酸化程度的評價，TPL-2-p105相互作用導致p105磷酸化，其磷酸化程度指示NFκB活化程度。
在優選的實施方案中，編碼TPL-2分子的核酸連接入載體并導入合適宿主細胞中，產生表達TPL-2分子的轉化細胞系。然后生產所獲得的細胞系，以可重復性定性和/或定量分析潛在化合物影響TPL-2功能的作用。因此可用表達TPL-2的細胞鑒定調節TPL-2功能的化合物、特別是低分子量化合物。因此表達TPL-2的宿主細胞可用于藥物篩選，本發明的另一目的是提供鑒定調節TPL-2活性的化合物的方法，所述方法包括使含有編碼TPL-2的異源DNA的細胞暴露于試圖檢測其調節所述TPL-2活性的能力的至少一種化合物或化合物的混合物或信號，其中所述細胞產生有功能的TPL-2，然后監測所述細胞由所述調節作用引起的變化。這種測定使得能夠鑒定TPL-2的調節劑，例如激動劑、拮抗劑和變構調節劑。本文使用的調節TPL-2活性的化合物或信號是指改變TPL-2活性的化合物，其改變方式使得在所述化合物或信號存在下TPL-2激活p105的活性不同(與缺乏所述化合物或信號時比較)。
可通過構建細胞系設計基于細胞的篩選測定，其中報告蛋白(即容易檢測的蛋白，例如β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰轉移酶(CAT)或熒光素酶)的表達依賴于34 TPL-2激活p105。例如編碼一種上述多肽的報告基因可以處于特異性激活p50的NFκB反應元件控制之下。當p50雜二聚體激活所述元件時，必須保證以預期水平表達可變的Re1單體。這種測定使得可檢測直接調節TPL-2功能的化合物，例如拮抗TPL-2引起的p105磷酸化的化合物或者抑制或增強TPL-2活性需要的其它細胞功能的化合物。
替代形式的測定包括直接評價生物系統的炎癥反應的測定。已知不受調節的組成型表達p50使動物產生炎癥表型。基于細胞的系統例如依賴于細胞因子釋放或細胞增殖的測定可用來評價p50的活性。
在本發明該實施方案的一個優選方面，提供鑒定用于治療涉及或利用炎癥反應的疾病的藥物前導化合物的方法，包括在其中除了存在待測化合物之外，TPL-2以參比磷酸化效率直接或間接磷酸化p105的條件下，使待測化合物與TPL-2分子和p105溫育；測定在待測化合物存在下TPL-2直接或間接引起p105磷酸化的能力；以及選擇相對于參比磷酸化效率具有調節TPL-2磷酸化p105的能力的化合物。
當TPL-2間接磷酸化靶多肽例如p105時，可能涉及其它激酶，所以按照本發明該實施方案的測定最好具體檢測TPL-2對靶多肽或p105的間接磷酸化作用。
在又一優選方面，本發明涉及鑒定藥物前導化合物的方法，包括以下步驟提供純化的TPL-2分子；將所述TPL-2分子與被TPL-2磷酸化的已知底物以及受試化合物溫育；以及鑒定能夠調節所述底物的磷酸化的受試化合物。
TPL-2磷酸化的底物是MEK(EMBOJ.15:817-826,1996)。所以優選MEK用作底物，以監測能夠調節TPL-2激酶活性的化合物。在另一實施方案中，所述受試底物可以是任何合適的TPL-2靶多肽例如MEK-1、SEK-1、IκB-α、IκB-β、NF-κBl p105、NFκB和TPL-2/COT本身。本發明特別提供重組融合蛋白構建物，以使這類底物例如成為常規的典型融合蛋白。在一個優選的實施方案中，典型融合蛋白包括例如GST-IκB-α(1-50)即IκB-α的氨基酸殘基1-50與GST融合以及GST-p105Ndel.498(包含p105的殘基498-969)。TPL-2/COT的其它肽底物可衍生自這些蛋白底物，而且包括例如IκB-α衍生的肽NH2-DDRHDSGLDSMKDKKK-COOH(其中粗體絲氨酸殘基相當于IκB-α的絲氨酸殘基32)和MEK衍生的肽NH2-QLIDSMANSFVGTKKK-COOH(其中粗體絲氨酸殘基相當于MEK-1的絲氨酸殘基217)。本文所述的這些靶多肽和其它TPL-2靶多肽使得本領域技術人員可以直接篩選激酶調節劑。激酶調節劑優選為激酶(TPL-2)抑制劑。
然后可任選地使所鑒定的受試化合物進行體內測試，以確定其對TNF/p105產生的原信號通路(例如以上實施方案中給出的信號通路)的作用。2c．調節TPL-2活性的化合物本文使用的“TPL-2活性”可以是指任何TPL-2活性，包括其結合活性，但是特別指TPL-2的磷酸化活性。因此，本發明可具體為檢測TPL-2對靶化合物的磷酸化作用以及潛在治療藥物對該活性的調節作用。
調節TPL-2的磷酸化活性的化合物實例包括TPL-2本身的顯性失活突變體。這類化合物能夠與TPL-2的靶競爭，因此降低TPL-2在生物或人工系統中的活性。所以，本發明另外還涉及能夠調節TPL-2磷酸化活性的化合物。3．化合物在再一方面中，本發明涉及可通過本發明前述方面定義的測定方法鑒定的一種或多種化合物。因此提供應用可通過本文所述測定鑒定的化合物調節NFκB活性。
影響TPL-2/NFκB相互作用的化合物幾乎可以是任何常規類型，包括低分子量化合物，包括可以是線性、環形、多環或其組合的有機化合物，肽，多肽(包括抗體)或蛋白。一般來說，本文使用的“肽”、“多肽”和“蛋白”可以認為是相同的。3a．抗體本文使用的抗體是指能夠結合選定靶的完整抗體或抗體片段，包括Fv、ScFv、Fab’和F(ab’)2、單克隆抗體和多克隆抗體、工程抗體(包括嵌合型抗體、CDR-移植性抗體和人源化抗體)以及用嗜菌體展示或替代技術產生的人工選定抗體。因為小片段例如Fv和ScFv較小并因而具有良好的組織分布，所以所述小片段在診斷和治療應用中具有有利的特性。
特別說明按照本發明的抗體用于診斷和治療用途。因此它們可以是經改變的抗體，包括效應蛋白例如毒素或標記物。特別優選為允許對所述抗體的體內分布成象的標記物。這類標記物可以是放射性標記物或不透射線的標記物例如金屬顆粒，它們容易在患者體內顯現。此外，它們可以是熒光標記物或在從患者取出的組織標本中顯現的其它標記物。
可用重組DNA技術改進本發明的抗體。因此可構建嵌合型抗體，以便降低其在診斷或治療應用中的免疫原性。而且通過CDR移植[參見歐洲專利申請0239400(Winter)]以及任選改進構架[參見國際專利申請WO90/07861(Protein Design Labs)]人源化所述抗體，可使得免疫原性最小化。
按照本發明的抗體可得自動物血清，或者如果是單克隆抗體或其片段時，以細胞培養物產生本發明抗體。可用重組DNA技術按照所建立的方法在細菌或優選哺乳動物細胞培養物中產生所述抗體。所選定的細胞培養系統優選分泌所述抗體產物。
因而本發明包括產生按照本發明的抗體的方法，包括培養宿主細胞例如大腸桿菌或哺乳動物細胞以及分離所述蛋白，其中所述宿主細胞是用包括表達盒的雜合載體轉化的宿主細胞，所述表達盒含有與編碼信號肽的第一DNA序列有效連接的啟動子，所述第一DNA序列以合適的讀框與編碼所述蛋白的第二DNA序列連接。
在合適的培養基中體外增殖雜交瘤細胞或哺乳動物宿主細胞，所述培養基是常規標準培養基，例如Dulbecco改良的Eagle培養基(DMEM)或RPMI 1640培養基，在培養基中任選加入哺乳動物血清例如胎牛血清或微量元素和持續生長添加物，例如飼養細胞如正常小鼠腹膜滲出物細胞、脾細胞、骨髓巨噬細胞、2-氨基乙醇、胰島素、轉鐵蛋白、低密度脂蛋白、油酸等。同樣在本領域已知的合適培養基中增殖細菌或酵母宿主細胞，例如在培養基LB、NZCYM、NZYM、NZM、Terrific Broth、SOB、SOC、2×YT或M9基本培養基中增殖細菌細胞，而在培養基YPD、YEPD、基本培養基或CompleteMinimal Dropout培養基中增殖酵母細胞。
體外生產提供相對純的抗體制劑，使得可以放大產生大量的所需抗體。細菌細胞、酵母細胞或哺乳動物細胞培養技術是本領域已知的，包括例如在氣升式反應器或持續攪拌反應器中的均一懸浮培養；或者例如在中空纖維、微囊、瓊脂糖微珠和陶瓷盒(cartridge)中的固定或截留細胞培養。
通過在體內增殖哺乳動物細胞也可以獲得大量需要抗體。為此，可將產生需要抗體的雜交瘤細胞注射入組織型匹配的哺乳動物，使產生抗體的腫瘤生長。注射前任選用碳氫化合物尤其是礦物油如降植烷(四甲基-十五烷)激發(prime)所述動物。1-3周后，從這些哺乳動物的體液分離所述抗體。例如通過將合適的骨髓瘤細胞與產生抗體的Balb/c小鼠的脾細胞融合獲得的雜交瘤細胞或衍生自產生需要抗體的雜交瘤細胞系Sp2/0的轉染細胞注入Balb/c小鼠腹膜內，所述小鼠任選用降植烷預處理，1-2周后，從所述動物取出腹水。
上述技術以及其它技術，例如在Kohler和Milstein,(1975)Nature256:495-497；US4,376,110；Harlow和Lane,Antibodies:a LaboratoryManual,(1988)Cold Spring Harbor中所討論的技術，均通過引用將它們結合到此處。制備重組抗體分子的技術描述于上述參考文獻，另外還描述于例如EP0623679；EP0368684和EP0436597，均通過引用將其結合到此處。
最好通過免疫印跡、酶免疫測定(例如夾層測定或點測定)或放射免疫測定經免疫熒光染色表達TPL-2的細胞篩選細胞培養上清液中的需要抗體。
為了分離所述抗體，例如可用硫酸銨沉淀、對疏水性物質如聚乙二醇進行透析、通過選擇性膜過濾等濃縮培養上清液或腹水中的免疫球蛋白。必要和/或需要時，用常規層析方法如凝膠過濾、離子交換層析、經DEAE-纖維素層析和/或(免疫)親和層析(例如用TPL-2分子或A蛋白進行親和層析)純化所述抗體。
本發明還涉及分泌本發明單克隆抗體的雜交瘤細胞。本發明的優選雜交瘤細胞是分泌具有需要特異性的本發明單克隆抗體的遺傳穩定細胞，而且可通過解凍和再克隆深度冰凍的培養物進行活化。
本發明還涉及制備分泌針對TPL-2分子的單克隆抗體的雜交瘤細胞系的方法，該方法的特征在于用純化的TPL-2分子、含純化TPL-2分子的抗原性載體或用帶有TPL-2的細胞免疫合適的哺乳動物如Balb/c小鼠，將得自免疫哺乳動物的產抗體細胞與合適的骨髓瘤細胞系細胞融合，克隆融合中獲得的雜種細胞，選擇分泌需要抗體的細胞克隆。例如將得自用帶有TPL-2細胞免疫的Balb/c小鼠的脾細胞與骨髓瘤細胞系PAI或骨髓瘤細胞系Sp2/0-Ag14的細胞融合，從所獲得的雜種細胞篩選分泌需要抗體的雜種細胞，克隆陽性雜交瘤細胞。
制備雜交瘤細胞系的優選方法的特征在于用含有合適佐劑的表達TPL-2的人腫瘤來源的107-108細胞皮下和/或腹膜內注射免疫Balb/c小鼠，在數月(例如2-4個月)內免疫注射數次例如4-6次，而且在最后一次注射后2-4天從免疫的40只小鼠中取出脾細胞，在融合起動物質、優選聚乙二醇存在下將其與骨髓瘤細胞系PAI細胞融合。最好在含有約30％-約50％分子量約4000的聚乙二醇溶液中將所述骨髓瘤細胞與3-20倍過量的得自免疫小鼠的脾細胞融合。融合后以規律的間隔在補加選擇培養基(例如HAT培養基)的如前所述的合適培養基中對所述細胞進行擴增，以防止正常骨髓細胞生長超過所需要的雜交瘤細胞。
本發明還涉及包含編碼針對本文前述TPL-2分子的抗體的重鏈可變域和/或輕鏈可變域的插入片段的重組DNA。根據定義，這類DNA包括編碼的單鏈DNA、由所述編碼DNA和其互補DNA或這些互補(單鏈)DNA本身組成的雙鏈DNA。
此外，編碼針對TPL-2分子的抗體的重鏈可變域和/或輕鏈可變域的DNA可以是具有編碼重鏈可變域和/或輕鏈可變域或其突變體的真實DNA序列的酶學合成DNA或化學合成DNA。真實DNA的突變體是編碼上述抗體的重鏈可變域和/或輕鏈可變域的DNA，其中缺失一個或多個氨基酸或一個或多個氨基酸與一個或多個其它氨基酸交換。所述修飾最好在所述抗體的重鏈可變域和/或輕鏈可變域的CDR之外。也可以使這種突變的DNA成為沉默突變，其中一個或多個核苷酸被含有編碼相同氨基酸的新密碼子的其它核苷酸替代。這種突變序列也可以是簡并序列。簡并序列是在遺傳密碼意義上的簡并，因為沒有限制的核苷酸數可被其它核苷酸取代，而不會改變原來編碼的氨基酸序列。這種簡并序列是有用的，這歸因于其不同的限制位點和/或具體的密碼子的頻率，所述密碼子是所述特定宿主、尤其是大腸桿菌優選密碼子，以達到最佳表達鼠類重鏈可變域和/或鼠類輕鏈可變域。
術語突變體包括按照本領域已知的方法體外誘變真實DNA獲得的DNA突變體。
為了裝配完整四聚體免疫球蛋白分子和表達嵌合型抗體，將編碼重鏈和輕鏈可變域的重組DNA插入片段與相應的編碼重鏈和輕鏈恒定域的DNA融合，然后例如在導入雜合載體中后轉移入合適宿主細胞中。
所以本發明還涉及包含編碼針對TPL-2的抗體的鼠類重鏈可變域的插入片段的重組DNA，所述重鏈可變域與人類恒定γ域融合，γ域例如為γ1、γ2、γ3或γ4，其中優γ1或γ4。同樣，本發明涉及包含編碼針對TPL-2的抗體的鼠類輕鏈可變域的插入片段的重組DNA，該輕鏈可變域與人類恒定域κ或λ融合，其中恒定域優選為恒定域κ。
在另一實施方案中，本發明涉及編碼重組多肽的重組DNA，其中所述重鏈可變域和輕鏈可變域借助于間隔基連接，所述重組DNA任選包含促進所述抗體在所述宿主細胞中加工的信號序列和/或編碼促進所述抗體純化的肽的DNA和/或切割位點和/或肽間隔基和/或效應分子。
編碼效應分子的DNA是指編碼在診斷和治療應用中有用的效應分子的DNA。因此特指毒素或酶尤其是能夠催化前體藥物活化的酶的效應分子。編碼這種效應分子的DNA具有天然產生的酶或毒素的編碼DNA或其突變體的序列，而且可用本領域周知的方法制得。
按照本發明的抗體和抗體片段在診斷和治療中是有用的。因此本發明提供用于治療或診斷的組合物，包括按照本發明的抗體。
如果是診斷用組合物時，所述抗體最好與檢測所述抗體的物質一起提供，所述檢測物質可以是酶物質、熒光物質、放射性物質或其它物質。所述抗體和所述檢測物質可以以診斷用診斷試劑盒提供，以同時應用、同時分別應用或序貫應用。3b．肽按照本發明的肽有效衍生自TPL-2、p105或參與有功能的TPL-2/p105相互作用的另一種多肽。所述肽優選衍生自與p105/TPL-2相互作用有關的所述TPL-2或p105結構域。例如Thomberry等，(1994)Biochemistry 33:39343940和Milligan等，(1995)Neuron 15:385-393描述了應用修飾的四肽抑制ICE蛋白酶。例如可用醛基、氯甲基酮、(酰氧基)甲基酮或CH2OC(0)-DCB基以類似的方式修飾衍生自TPL-2、p105或相互作用蛋白的肽，以抑制TPL-2/p105相互作用。
為了有助于將肽化合物傳遞至細胞，可修飾肽以提高其跨過細胞膜的能力。例如US5,149,782公開了應用融合形成肽、構成離子通道的肽、膜肽、長鏈脂肪酸和其它膜融合劑以增強蛋白跨過所述細胞膜。在WO97/37016和US5,108,921中也描述了這些以及其它方法，該文獻通過引用結合到本文中。
按照本發明的許多化合物可以是用于藥物開發的前導化合物。有用的前導化合物特別為抗體和肽，尤其是在基因治療細胞中表達的細胞內抗體，所述前導化合物可用作開發肽或低分子量治療藥物的典型化合物。在本發明的一個優選實施方案中，前導化合物和TPL-2/p105或其它靶肽可共結晶，以有助于設計模擬用所述前導化合物觀測到的相互作用的合適低分子量化合物。
結晶涉及制備結晶緩沖液，例如用形成結晶必需的低濃度沉淀劑優選以1∶1比率混合所述肽或肽復合物溶液與“貯藏緩沖液”。為了形成結晶，例如通過加入沉淀劑、滴定或通過結晶緩沖液和貯藏緩沖液之間的擴散平衡沉淀劑的濃度，提高所述沉淀劑的濃度。在合適條件下沿沉淀劑梯度產生這種沉淀劑的擴散，例如從含有較高濃度沉淀劑的貯藏緩沖液擴散入沉淀劑濃度較低的結晶緩沖液中。例如通過允許常規氣相擴散的蒸汽擴散技術可達到擴散。已知技術例如為蒸汽擴散法，如“懸滴”或“連續滴(sitting drop)”法。在蒸汽擴散法中，含有所述蛋白的結晶滴懸掛在大得多的貯藏緩沖液池之上或連續滴在貯藏緩沖液池的旁邊。另一方面，通過分隔結晶緩沖液和貯藏緩沖液而且防止所述蛋白稀釋性進入貯藏緩沖液中的半透膜可達到平衡所述沉淀劑。
在所述結晶緩沖液中，所述肽或肽/結合配偶體復合物的濃度優選高達30mg/ml，優選為約2mg/ml-約4mg/ml。
在基本上由以下參數決定的不同條件下可達到形成結晶，所述參數為pH、存在的鹽和添加劑、沉淀劑、蛋白質濃度和溫度。pH范圍為4.0-9.0。緩沖劑的濃度和類型不是非常重要，所以例如可根據需要的pH改變緩沖劑的濃度和類型。合適的緩沖系統包括磷酸鹽、醋酸鹽、檸檬酸鹽、Tris、MES和HEPES緩沖液。有用的鹽和添加劑包括例如鹽酸鹽、硫酸鹽和本領域技術人員已知的其它鹽。所述緩沖液含有沉淀劑或合適的鹽，所述沉淀劑選自水混溶性有機溶劑，優選為100-20000、優選4000-10000分子量的聚乙二醇，所述鹽例如硫酸鹽特別是硫酸銨、鹽酸鹽、檸檬酸鹽或酒石酸鹽。
例如通過重原子衍生作用可化學修飾按照本發明的肽或肽/結合配偶體復合物的晶體。簡而言之，這種衍生作用可通過將晶體浸在含有重金屬原子鹽或能夠擴散通過所述晶體并結合在所述蛋白表面的有機金屬化合物實現，所述有機金屬化合物例如氯化鉛、硫羥蘋果酸金、乙基汞硫代水楊酸鈉或乙酸雙氧鈾。通過對浸泡晶體進行X射線衍射分析可確定結合的重金屬原子的部位，該信息可用來例如構建所述肽的三維模型。
例如通過晶體的重金屬原子衍生物和/或所述結晶作用提供的全部或部分結構數據可獲得三維模型。構建這種模型最好包括同源性模型和/或分子置換。
通過綜合與任何一種MAPKK激酶或其結構已知的NFκB(包括IκBα,Bauerle等/，(1998)Cell95:729-731)的序列對比、預期的二級結構以及篩選結構文庫可建立初步的同源性模型。例如可用合適的軟件程序對比TPL-2和候選肽的序列。
也可以用計算機軟件預測所述肽或肽復合物的二級結構。所述肽序列可加入TPL-2結構中。通過篩選具有需要長度和合適構象的肽結構文庫可模擬結構不相干性例如在插入/缺失附近的結構片段。為了預測側鏈構象，可利用側鏈旋轉異構體文庫。
最終的同源性模型用來通過用合適計算機軟件經分子置換解決所述肽的晶體結構問題。根據分子置換結果決定同源性模型的位置，并對其進行進一步的精確定位，包括分子力學計算和將結晶用抑制劑轉化為電子密度的模型設計。3c．其它化合物在一個優選的實施方案中，上述測定用來鑒定肽，而且也用來鑒定可調節TPL-2活性(例如激酶活性、靶多肽的相互作用或信號活性)的不是基于肽的受試化合物。采用包括本領域已知的組合文庫法的許多方法中的任何一種可獲得本發明的受試化合物，所述方法包括生物文庫、可訪問空間平行固相(spatially addressable parallel solid phase)或溶液相文庫；需要去卷積的合成文庫法；‘一珠一化合物’文庫法以及利用親和層析選擇的合成文庫法。這些方法適用于肽、非肽寡聚體或小分子化合物文庫(Lam,K,S.(1997)Anticancer Drug Des.12:145)。
在本領域中可找到合成分子文庫的方法實例，例如在以下文獻中有這樣的實例DeWitt等(1993)Proc.Natl.Acad Sci.US.A.90:6909；Erb等(1994)Proc.Natl.Acad Sci.USA 91:11422；Zuckermann等(1994)J.Med.Chem.37:2678；Cho等(1993)Science 261:1303；Carrell等(1994)Angew.Chem.Int.Ed.Engl.33:2059；Carell等(1994)Angew.Chem.Int.Ed.Engl.33:2061；和Gallop等(1994)，Med.Chem.37:1233。
化合物文庫可存在于溶液中(例如Houghten(1992)Biotechniques13:412-421)、存在于珠子上(Lam(1991)Nature 354:82-84)、存在于碎片上(Fodor(1993)Nature 364:555-556)、存在于細菌上(Ladner USP5,223,409)、存在于孢子上(Ladner USP’409)、存在于質粒上(Cull等(1992) Prac Natl Acad Sci USA 89:1865-1869)或存在于嗜菌體上(Scott和Smith(1990)Science 249:389-390)；(Devlin(1990)Science 249:404-406)；(Cwirla等(1990)Proc.Natl.Acad Sci87:6378-6382)；(Felici(1991)J.Mol.Biol.222:301-310)；(Ladner同上)。
需要的話，可將本文所述的任何一種化合物文庫分為包括例如具有特定化學結構或特定活性如激酶抑制活性的化合物的預選文庫。預選化合物文庫可還包括使用任何本領域已知的分子模型，以便鑒定可能具有特定活性、反應位點或其它需要化學官能度的特定化合物或特定組別化合物或特定組合的化合物。在一個實施方案中，使用用來鑒定具有或可能具有激酶抑制活性的分子模型預選TPL-2的調節劑。
本領域已知的合適方法可用來選擇與TPL-2或靶組分例如p105的特定結構域相互作用的特定部分。例如可用特別利用三維模型的目測檢查。最好用計算機模型程序或軟件選擇可與特定結構域作用的一個或多個部分。合適的計算機模型程序包括QUANTA(MolecularSimulations,Inc.,Burlington,MA(1992))、SYBYL(Tripos Associates,Inc.,St.Louis,MO(1992))、AMBER(Weiner等，J.Am.Chem.Soc.106:765-784(1984))和CHARMM(Brooks等，J.Comp.Chem.4:187-217(1983))。可用來選擇相互作用部分的其它程序包括GRID(OxfordUniversity,U.K.；Goodford等，J.Mod.Chem.28:849-857(1985))；MCSS(Molecular Simulations,Inc.,Burlington,MA；Miranker,A.和M.Karplus,Proteins:Structure,Function and Genetics 11:29-34(1991))；AUTODOCK(Scripps Research Institute,La Jolla,CA；Goodell等，Proteins:Structure,Funtions and Genetics:195-202(1990))；和DOCK(University of Califomia,San Francisco,CA；Kuntz等，J.Mol.Biol.161:269-288(1982)。
在選定有效的相互作用部分后，可將其連接至可以適于與選定結構域作用的方式提供它們的支架上。例如用物理或計算機產生的三維模型或用合適的計算機程序如CAVEAT(University of Califomia,Berkeley,CA；Bartlett等，“Molecuar Recognition of in Chemecal andBiological Problems”,Special Pub.,Royal Chemical Society 78:182-196(1989))、三維數據庫系統如MACCS-3D(MDL Information Systems,SanLeandro,CA(Martin,Y.C.,J.Mod.Chem.35:2145-2154(1992))；以及HOOK(Molecular Simulations,Inc.)可目測確定合適支架和其上的作用部分的空間分布。可用于設計和/或評價有效TPL-2抑制劑的其它計算機程序包括LUDI(Biosym Technologies,San Diego,CA；Bohm H.J.,J.Comp.Aid.Molec.Design:61-78(1992))、LEGEND(MoleculaarSimulations,Inc.；Nishibata等，Tetrahedron 47:8985-8990(1991))和LeapFrog(Tripos Associates,Inc.)。
另外，模擬蛋白-藥物相互作用的各種技術是本領域已知的，并可在本發明方法中使用(Cohen等，J.Med.Chem.33:883-894(1994)；Navia等Current Opinions in Structural Biology 2:202-210(1992)；Baldwin等，J.Mod.Chem.32:2510-1513(1989)；Appelt等，J.Mod.Chem.34:1925-1934(1991)；Ealick等，Proc.Nat.Acad.Sci USA 88:11540-11544(1991))。
所以，可裝配化合物文庫，所述化合物例如是基于蛋白質、基于碳水化合物、基于脂質、基于核酸、基于天然有機物、基于合成產生的有機物或基于抗體的化合物，而且如果需要的話，使所述化合物文庫進一步進行包括上述模型技術中的任何一種的預選步驟。然后可以從本領域已知的來源如商業來源選定用這些模型技術確定為TPL-2調節劑的合適候選化合物，或者用本領域已知的技術合成所述候選化合物，所述化合物含有用所述分子模型預測的具有活性例如TPL-2抑制劑活性的需要部分。然后可使用這些化合物構建用本文所述的測定進行篩選的較小或較大的靶向受試化合物文庫。
因此，需要的TPL-2激酶抑制劑的受試文庫可包括例如化合物N-(6-苯氧基-4-喹啉基)-N[4-(苯硫基)苯基]胺。如下一般合成4-(4-苯基硫代-苯胺基)-喹啉基衍生物。向在1,2-二甲氧基乙烷和二氯乙烷的1∶1(v/v)混合物中的0.1M 4-羥基-5-氧代-5,6,7,8-四氫-3-喹啉羧酸乙酯溶液中加入四氯化碳(10mol相當量)和結合聚合物的三苯膦(3-6相當量；Fluka)。于80℃在密封管形瓶中振搖下加熱混合物36小時。加入4-(苯硫代)苯胺(2-6mol相當量；0.5M叔丁醇溶液)并在密封管形瓶中振搖下加熱混合物至90℃24小時。然后，濾除聚合物樹脂并用甲醇洗滌。在高真空下濃縮合并的濾液和洗滌物，并用RP-HPLC層析殘余物。通過進行分析性RP-HPLC/MS(0-100％乙腈/pH4.5,50mM醋酸銨，流速為3.5mL/min,Perkin Elmer Pecosphere柱(4.6mm×3cm)),5-氧代-4-[4-(苯硫基)苯胺基]-5,6,7,8-四氫-3-喹啉羧酸乙酯的保留時間為3.85分鐘，MH+m/z419。
為了特別制備N-(6-苯氧基-4-喹啉基)-N-[4-(苯硫基)苯基]胺(分析性RP-HPLC RT:4.32分鐘；MS:MH+421)，利用4-羥基-6-苯氧基-喹啉和4-(苯硫代)苯胺進行上述方法。
也可選擇一種相關化合物5-氧代-4-[4-(苯硫基)苯胺基]-5,6,7,8-四氫-3-喹啉羧酸乙酯和/或其變異體用于所述文庫，可用標準技術和以下方法產生該化合物。簡而言之，在0.1M 4-羥基-5-5,6,7,8-四氫-3-喹啉羧酸乙酯的乙二醇二甲醚和二氯乙烷的1∶1混合物溶液中加入10相當量的四氯化碳和3-6相當量的結合聚合物的三苯膦。然后將混合物加熱至80℃36小時。加入過量的4-硫代苯基苯胺(2-6相當量)的250μl叔丁醇溶液，并加熱混合物至90℃24小時。然后濾除聚合物樹脂，用甲醇洗滌，在高真空下去除殘留溶劑獲得所需要的受試化合物。
預測4-(4-苯硫代-苯胺基)-喹啉基(及其衍生物)代表一類化合物物質，在這一類物質中包含適用于抑制激酶例如色氨酸/蘇氨酸激酶的化合物(如COT)。因此本發明包括含有圖14所示核心結構的任何化合物。在一個實施方案中，所述喹啉環系統可以是例如二氫喹啉環系統或四氫喹啉環系統(參見圖14的例如虛線)。此外，R和R’基可獨立選自羥基、鹵基、-NHC(O)烷基、-COOH、-C(O)O-烷基、-C(O)NH-烷基、C1-C6-鏈烯基、C1-C6-鏈炔基、C1-C6-烷基、C1-C6-烷氧基、芳氧基、取代的芳氧基、C1-C6-烷基硫代基、C1-C6-烷基氨基、氰基、全鹵代甲基、全鹵代甲氧基、氨基、一或二烷基氨基、芳基、取代的芳基、ara-烷基和ara-烷氧基。另外，應該指出的是R’也可以是(R’)n，其中n=0,1,2等，使得允許例如多個R’取代。還應該指出的是烷基、鏈烯基和/或烷酰基(alkyonyl)可以是直鏈或支鏈。而且本發明包括含有或衍生自圖14所示通式結構的任何鹽或者適當時包括例如類似物、游離堿形式、互變異構體、對映體外消旋物或它們的組合。
受試文庫的另一種合適化合物是3-(4-吡啶基)-4,5-二氫-2H-苯并[g]吲唑甲磺酸鹽和/或其變異體，該化合物一般可從Aldrich ChemicalCo.,Inc.購買獲得(登記號80997-85-9)。
所述文庫還可包括化合物2-氯苯并[l][1,9]菲咯啉-7-羧酸鈉和/或其變異體，可用標準的本領域已知的技術和采用圖12所示的結構產生該化合物。
本領域技術人員知道可用各種本領域已知的技術對前述化合物進行所需要的標準修飾，本發明包括這些修飾化合物。
在一個實施方案中，一種測定是基于細胞的測定或無細胞測定，其中使表達例如TPL-2多肽的細胞或含有TPL-2的細胞裂解液/或純化蛋白與受試化合物接觸，并檢測所述受試化合物改變TPL-2活性例如激酶活性、靶多肽相互作用或信號活動的能力。
基于細胞測定中的任何一種測定可用例如真核生物或原核生物來源的細胞。例如通過將受試化合物與放射性同位素或酶標記物偶聯，使得可通過檢測復合物中的標記化合物檢測受試化合物與所述多肽的結合，從而可檢測所述受試化合物結合TPL-2或TPL-2靶多肽的能力。例如可用125I、35S、14C、33P、32P或3H直接或間接標記受試化合物，并通過直接計數輻射放射或液閃計數檢測放射性同位素。或者可用例如辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶或熒光素酶酶學標記受試化合物，并通過適當底物轉化為產物的測定檢測酶標記物。
測定受試化合物與靶多肽相互作用的能力而沒有標記任何反應物也屬于本發明范圍。例如可用微型生理儀(microphysiometer)檢測受試化合物與TPL-2或靶多肽的相互作用而沒有標記所述受試化合物、TPL-2或靶多肽(McConnell,H.M.等(1992)Science 257:1906-1912)。在再一實施方案中，本發明的測定是無細胞測定，其中使例如TPL-2和靶多肽與受試化合物接觸，并測定受試化合物改變所述作用的能力。這種相互作用包括或不包括TPL-2和/或TPL-2靶多肽的磷酸化。可直接或間接測定所述受試化合物與所述靶多肽的結合。也可用技術如實時生物分子相互作用分析(BIA)(Sjolander,S.和Urbaniczky,C.(1991)Anal.Chem.63:2338-2345和Szabo等(1995)Curr.Opin.Struct.Biol.5:699-705)檢測所述候選化合物結合所述兩種多肽中的任何一種多肽的能力。本文使用的“BIA”是實時研究雙特異性的相互作用而不標記任何一種反應物的技術(例如BIAcoreTM)。光學現象表面質粒基因組共振(SPR)的變化可用于指示生物分子之間的實時反應。
在測試化合物和天然提取物文庫的許多藥物篩選程序中，最好是高效測定以便使在特定時間內測量的化合物數最多。在無細胞系統中進行的測定，例如可用純化或半純化蛋白進行的測定，它們通常稱為“初級”篩選，因為所述測定的進行可允許快速展開和相對容易檢測受試化合物介導的分子靶的變化。而且，在體外系統中一般可忽略受試化合物的細胞毒性和/或生物利用度作用，相反體外測定主要關注所述藥物對所述分子靶的作用，該作用可表現為與上游或下游元件的結合親和力的變化。因此，在本發明的典型篩選測定中，使目的化合物與TPL-2多肽接觸，同時與或者不與TPL-2靶多肽例如p105(Kieran等，1990,Cell 62:1007-1018，另外參見登記號M37492)或IκB-α(Zabel等，1990,Cell 61:255-265)接觸，并用例如放射性同位素通過評價化合物抑制磷酸化TPL-2和/或TPL-2靶多肽形成的效力，從而測定以及定量TPL-2和/或靶多肽的磷酸化。通過根據用不同濃度的受試化合物獲得的數據產生的劑量反應曲線可評價所述受試化合物的效力。而且也可進行對照測定以提供比較基礎。在另一實施方案中，測試不同候選化合物并與已知活性的對照化合物例如具有已知普通活性或特異性活性的抑制劑進行比較，從而可確定所述受試化合物的特異性。所以，需要的話，可使用一般的激酶抑制劑例如星形孢菌素(參見例如Tamaoki等，1986,Biochem.Biophys.Res.Comm.135:397-402；Meggio等，1995,Eru.J.Biochem.234:317-322)或例如特異性激酶抑制劑如可市售獲得的抑制劑PD98059(一種有效的MEK抑制劑，參見例如Dudley等，1995,P.N.A.S.92:7686-7689)和SB203580(一種有效的p38 MAP激酶抑制劑，參見例如Cuenda等，1995,FEBSLett.364:229-233)。
在本發明的上述測定法的一個以上的實施方案中，最好固定所述靶多肽，以有助于分離復合形式與非復合形式或者適應所述測定的自動化(參見例如實施例4)。可在適合裝量所述反應物的任何容器中完成存在或缺乏所述受試化合物的情況下TPL-2和靶多肽的磷酸化或結合。這種容器的實例包括微量滴定板、試管和微量離心管。在一個實施方案中，可提供加入允許所述蛋白中的一種或兩種均與一種基質結合的結構域的融合蛋白。例如谷胱甘肽S轉移酶/靶多肽融合蛋白可吸附在谷胱甘肽瓊脂糖珠(Sigma Chemical,St.Lousis,MO)或谷胱甘肽衍生的微量滴定板，然后將其與受試化合物混合并在有助于磷酸化或復合物形成的條件(例如鹽和pH的生理條件)下進行溫育。溫育后，洗滌所述珠或微量滴定板孔去除任何未結合的組分，如果是珠子則固定所述基質，而且例如如上所述直接或間接檢測所述復合物。或者所述復合物可與所述基質解離，用標準技術可測定靶多肽的結合或磷酸化活性水平。在本發明的篩選測定中也可用將蛋白質固定在基質上的其它技術。
在本發明的再一方面，TPL-2和靶多肽可用作雙雜交或三雜交測定中的“餌蛋白”(參見例如美國專利第5,283,317號；Zervos等(1993)Cell 72:223-232；Madura等(1993)J.Biol.Chem.268:12046-12054；bartel等(1993)Biotechniques 14:920-924；Iwabuchi等(1993)Oncogene8:1693-1696；和Brent WO94/10300)，以鑒定與TPL-2和/或TPL-2靶多肽結合或相互作用的其它蛋白或化合物。
本發明還涉及用上述篩選測定鑒定的新物質以及涉及利用這些測定產生這類物質的方法。因此，在一個實施方案中，本發明包括可用包括任何一種上述篩選測定(例如基于細胞的測定或無細胞測定)步驟的方法獲得的化合物或物質。例如在一個實施方案中，本發明包括可用本文所述的任何一種方法獲得的化合物或物質。
因此，進一步在合適的動物模型中應用按本文所述鑒定的一種物質例如TPL-2分子或化合物屬于本發明范圍。例如可在動物模型中應用按本文所述鑒定的物質以確定用這種物質治療的效力、毒性或副作用。或者可在動物模型中應用按本文所述鑒定的物質以確定這種物質的作用機理。此外，適當時可將這種物質給予人類個體，優選給予炎癥性疾病風險個體。
本發明還涉及應用上述篩選測定鑒定的新物質診斷、預測預后和治療本文所述的任何一種疾病。因此，在設計、配方、合成、制備和/或生產用于診斷、預測預后和治療本文所述任何一種疾病的藥物或藥用組合物中應用這類物質屬于本發明范圍。4．藥用組合物在一個優選的實施方案中，提供包含可用本發明前述方面定義的測定方法鑒定的化合物的藥用組合物。
按照本發明的藥用組合物是包括作為活性成分能夠調節TPL-2的p105磷酸化活性的一種或多種化合物組成的組合物。通常所述化合物為藥學上可接受的任何鹽形式或者例如適當時為其類似物、游離堿形式、互變異構體、對映體外消旋物或它們的組合。設計包括按照本發明的活性成分在內的藥用組合物的活性成分，使其例如當以取決于特定病例的劑量給予時在腫瘤或與細胞增殖有關的其它疾病、感染和炎癥性病癥治療中具有良好的治療活性。例如本發明包括能夠改變TPL-2信號活動的任何化合物。在一個實施方案中，所述化合物能夠抑制TPL-2活性，導致參與炎癥的基因的調節異常。例如抑制TPL-2活性而由此降低TNF基因表達的化合物是治療例如炎癥性疾病的優選化合物。在一個優選實施方案中，按照本發明的方法鑒定的化合物可用于治療炎癥性疾病例如類風濕性關節炎、多發性硬化癥(MS)、炎癥性腸病(IBD)、胰島素依賴性糖尿病(IDDM)、膿毒病、牛皮癬、TNF介導的疾病和移植排斥反應。在另一實施方案中，本發明的一種或多種化合物可與在治療任何一種上述病癥時已知適合治療具體適應癥的本領域已知的任何化合物聯合使用。因此，本發明的一種或多種化合物可與已知適合治療上述適應癥的本領域已知的一種或多種化合物混合，使得可以方便地給予所述對象單一組合物。
可以調節劑量方案以獲得最佳治療反應。例如每日可給予幾個分劑量或者根據治療情況的要求指征可按比例降低劑量。
可以以常規方式例如口服、靜脈內(當是水溶性藥物時)、肌內、皮下、鼻內、皮內或栓劑途徑或植入(例如用緩釋分子)給予所述活性成分。根據給予途徑，可能需要用一種材料包衣所述活性成分，保護該成分不受酶、酸和可以使所述成分失活的其它天然條件的作用。
為了胃腸內給予所述活性成分，用避免其失活的材料將其包衣或者與避免其失活的材料一起給予。例如所述活性成分可用輔助劑給予、與酶抑制劑共同給予或以脂質體給予。在其最廣義上使用輔助劑，包括任何免疫刺激化合物例如干擾素。本文涉及的輔助劑包括間苯二酚、非離子表面活性劑例如聚氧乙烯油醚和正十六烷基聚乙烯醚。酶抑制劑包括胰腺胰蛋白酶。
脂質體包括水包油包水CGF乳劑以及常規脂質體。
也可以胃腸外或腹膜內給予所述活性成分。也可以在甘油、液體聚乙二醇和它們的混合物中以及在油中制備分散劑。在常規貯藏和使用條件下，這些制劑含有防腐劑以防止微生物生長。
適合注射用的藥物形式包括無菌水溶液(當是水溶性的時)或分散劑和用于臨時制成無菌注射溶液或分散劑的無菌粉。在所有情況下，所述形式必須是無菌的而且必須是容易注射的流體。在制造和貯藏條件下必須穩定而且必須防腐抵抗微生物如細菌和真菌的污染作用。所述載體可以是溶劑或含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液體聚乙二醇等)、它們的合適混合物以及植物油的分散介質。例如可以通過使用包衣如卵磷脂包衣、如果是分散劑通過保持需要的顆粒大小以及通過應用表面活性劑能夠維持適當的流動性。
可用各種抗細菌劑和抗真菌劑例如對羥基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、thirmerosal等防止微生物的作用。在許多情況下最好包含等滲劑，例如糖或氯化鈉。在所述組合物中應用延遲吸收的物質例如單硬脂酸鋁和明膠能夠延長注射組合物的吸收。
用合適溶劑混合需要量的所述活性成分和以上列舉的各種其它成分制得無菌注射溶液，然后根據需要過濾除菌。一般而言，在含有基本分散介質和以上列舉的其它需要成分的無菌溶媒中加入無菌活性成分制得分散劑。如果是用于制備無菌注射溶液的無菌粉時，制備的優選方法是真空干燥以及冷凍干燥技術，由前述其除菌過濾溶液獲得所述活性成分粉和其前任何其它需要成分。
當所述活性成分如上所述經適當保護時，可以用例如惰性稀釋劑或可吸收食用載體口服給予，或者所述活性成分可裝入硬殼或軟殼明膠膠囊中，或者可壓入片劑中，或者可直接摻入日常飲食的食物中。對于口服治療藥物的給予，所述活性成分可摻入賦形劑中，而且使用的形式可以是攝食片、頰片、錠劑、膠囊、酏劑、懸浮劑、糖漿劑、糯米紙囊劑等。將獲得的在這些治療性應用的組合物的活性成分的量是合適的劑量。
所述片劑、錠劑、丸劑、膠囊劑等也可以含有以下組分粘合劑例如西黃蓍樹膠、金合歡膠、玉米淀粉或明膠；賦形劑例如磷酸二鈣；崩解劑例如玉米淀粉、馬鈴薯淀粉、藻酸等；潤滑劑例如硬脂酸鎂；以及甜味劑例如蔗糖、乳糖或者可加入糖精，或者調味劑例如薄荷、冬青油或櫻桃調味劑。當所述單位劑型是膠囊時，除了上述類型的物質之外，它還可以含有液體載體。
各種其它物質可以作為包衣存在或者相反改進所述劑型的物理形式。例如可用蟲膠、糖或此二者對片劑、丸劑或膠囊劑進行包衣。糖漿劑或酏劑可以含有所述活性成分、作為甜味劑的蔗糖、作為防腐劑的對羥基苯甲酸甲酯和對羥基苯甲酸丙酯、染料和調味劑如櫻桃或橙調味劑。當然，在制備任何劑型中使用的任何物質應該是藥物純而且在使用量情況下基本無毒。此外，所述活性成分可摻入緩釋制劑以及配方中。
本文使用的“藥學上可接受的載體和/或稀釋劑”包括任何以及所有溶劑、分散介質、包衣、抗細菌劑和抗真菌劑、等滲劑和吸收延遲劑等。這樣的用于藥物活性物質的介質和各種添加劑是本領域周知的。除了在任何常規介質或添加劑與所述活性成分不匹配的情況之外，在所述治療藥物組合物中均可應用它們。也可以在所述組合物中加入輔助活性成分。
特別優選將胃腸外組合物配制成單位劑型以便易于給藥以及劑量均一。本文使用的單位劑型是指適合用作所治療哺乳動物對象的單位劑量的物理性分開的單位；每一個單位含有經計算將結合需要的藥用載體產生需要治療效應的預定量的活性物質。本發明的新單位劑型的規格取決于以及直接依賴于(a)所述活性物質的獨特特性以及需要達到的具體治療效應，和(b)配方技術固有的限制，例如用于在惠有影響機體健康的疾病的活的個體治療疾病的活性物質。
對所述主要活性成分進行配方，以單位劑型中的有效量和合適的藥學上可接受的載體常規而有效地給予。如果是含有輔助活性成分的組合物時，參考常規劑量和給予所述成分的方式確定劑量。
再一方面提供單獨或聯合適合治療特定適應癥的本領域已知的化合物用于治療疾病的本文前面定義的本發明的活性成分。因而提供應用本發明的活性成分生產用于治療與NFκB誘導或抑制有關的疾病的藥物。
此外，提供治療與NFκB誘導或抑制有關的病癥的方法，包括給予受試者有效治療量的可用上述測定方法鑒定的化合物。
用以下實施例進一步描述本發明，其目的只是闡明本發明。
從平板上的22×106二倍體酵母集落獲得68個HIS3選擇和LacZ表達的陽性克隆。通過DNA測序鑒定互作蛋白，并通過再轉化入酵母證實互作蛋白。
在所獲得的68個陽性克隆中的32個克隆編碼NF-κBl p105的IκB-樣C末端(圖2a)。p105與TPL-2的共免疫沉淀，它們通過無細胞翻譯一起合成，證實這兩種蛋白以高化學計量相互作用(圖1b)。用Promega TNT偶聯的兔網織紅細胞系統經無細胞翻譯一起合成TPL-2和p105，并用[35S]-Met(Amersham-Pharmacia Biotech)進行標記。用裂解緩沖液A(Salmeron,A.等(1996)EMBO J.15:817-826)和0.1mg/mlBSA稀釋翻譯的蛋白，并按以上引用的參考文獻所述的方法進行免疫沉淀。用SDS-PAGE解析分離蛋白并用熒光自顯影顯示。
在其中翻譯的p105超過TPL-2的試驗中，用抗TPL-2抗體分離的TPL-2/p105復合物的化學計量估計約為1∶1。激酶失活的TPL-2突變體以相似的化學計量和p105結合。
為了在體內證實TPL-2/p105相互作用，從HeLa細胞免疫沉淀內源蛋白。用緩沖液A提取并以100,000g離心15分鐘后按文獻(Kabouridis等，(1997)EMBO J.16:4983-4998)所述對融合HeLa細胞(90mm培養皿；Gibco BRL)的細胞溶解產物的內源蛋白進行免疫沉淀和蛋白質印跡分析。已經描述了(Salmeron,A等(1996)EMBO J.15:817-826)抗TPL-2抗體TSP3。從所述商業供應商可獲得針對NF-κBl(N)(Biomol Research labs)、Rel-A(Santa Cruz)和c-Rel(Santa Cruz)的抗體。抗-myc MAb 3E10(G.Evan博士，ICRF,London)用于myc-p105/myc-p50的免疫沉淀和免疫熒光測定，而抗myc抗血清(Santa Cruz)用于免疫印跡。抗-HA MAb 12CA5用于免疫熒光染色HA-p50。
蛋白質印跡清楚證實p105與TPL-2的特異性共免疫沉淀(圖3a)。p105、Rel-A和c-Rel也特異性與TPL-2共免疫沉淀。但是體外試驗不能檢測到TPL-2和p50(產生自p48突變體；圖2b，泳道14)、Rel-A或c-Rel之間的任何直接關系。因此在體內與TPL-2締合的p105可能通過p105的N末端Rel同源結構域(RHD)與Rel亞單位結合(Ghosh等，(1998)Annu.Rev.Immunol.16:225-260)。
通過用抗-NFκB(N)抗血清免疫耗竭HeLa細胞溶胞產物研究體內TPL-2與p105的相互作用的化學計量。抗-TPL-2免疫沉淀的蛋白質印跡證實實際上在耗竭NF-κBl的細胞溶胞產物中消除了所有可檢測到的TPL-2(圖3b，最下面一組)。免疫耗竭TPL-2去除了細胞總p105的約50％。所以在HeLa細胞中，基本上全部TPL-2與大部分的總p105復合，與體外結果數據一致，說明發生了高化學計量相互作用(圖1b和c)。
用TPL-2和p105的缺失突變體按實施例1所述進行免疫沉淀試驗表明，這兩種蛋白通過其C末端相互作用(圖1和2)。其中特別令人感興趣的是，缺乏所述C末端的TPL-2的致瘤突變體TPL-2AC(Salmeron,A等(1996)EMBO J.15:817-826)不能有效與p105共免疫沉淀(圖1b，泳道5和6)。此外，在酵母雙雜交測定中剛好在TPL-2C末端的92氨基酸的GAL4融合物與p105C末端(殘基459-969)相互作用。在體外TPL-2似乎與p105的C末端中的兩個區(一個是最后89個氨基酸而另一個是殘基545-777)相互作用(圖2b，右側組)。分離的p105C末端足以與TPL-2形成穩定的復合物(圖2c)。B．顯性失活的TPL-2重要的是確立TPL-2表達對p105蛋白酶解的作用(參見下文)反映其正常生理功能。為此，測試激酶失活的TPL-2(A270)阻斷激動劑誘導的p105降解的能力。用亞克隆在PMT2載體中的TPL-2(A270)cDNA(5pg)和選擇載體J6-Hygro(0.5pg)一起通過電穿孔共轉染1×107JurkatT細胞。用PMT2對照載體和J6Hygro共轉染對照細胞。通過限制性稀釋克隆轉染細胞，并對潮霉素抗性(0.5mg/ml)進行選擇。用蛋白質印跡測定TPL-2(A270)在所產生的克隆中的表達。用每點8×1063T3細胞對Jurkat克隆進行脈沖追蹤代謝標記。
與早期的研究(Mellits等，(1993)Nuc.Acid.Res.21,5059-5066)一樣，在穩定表達對照空載體的JurkatT細胞或未轉染的原細胞中，TNF-a刺激p105降解(圖7a)。但是，TNF-a對轉染表達TPL-2(A270)的JurkatT細胞的刺激作用對p105的轉換幾乎沒有影響(圖7a)。因此，TNF-a誘導p105降解需要TPL-2活性，而其顯性失活突變體的表達可阻斷TPL-2活性。
該結果在進一步的試驗中得到證實，說明顯性失活的TPL-2抑制p105/TNF的轉錄激活潛力。用驅動熒光素酶基因的TNF誘導的報道構建物如上所述轉染Jurkat T細胞。沒有激酶結構域的激酶失活的TPL-2或TPL-2的截短C末端的共表達顯著降低熒光素酶基因表達(見圖8)。
TPL-2表達激活報道基因增加140倍(圖3c)，其激活水平與通過刺激降解IκB-a激活NF-κB的相關的MAP 3K酶NIK誘導的水平(Malinin等，(1997)；May,M.J.&Ghosh,S.(1998)Immunol.Today 19,80-88)相似。激酶失活的點突變的TPL-2(A270)對NF-κB誘導沒有作用。在體外(圖1b)或體內不能與p105形成穩定復合物的TPL-2AC的表達只對NF-κB報道基因產生非常適度的激活作用(12倍)(圖3c)。為了證實TPL-2必須與p105復合才能有效激活NF-κB，將p105的C末端片段3’NN(圖2a)與TPL-2共表達。此C末端片段與體內共轉染的TPL-2相互作用，競爭性結合內源p105。3’NN的共表達明顯抑制TPL-2對NF-κB報道基因的激活作用，但是對NIK的激活作用沒有影響(圖3d)。總而言之，這些數據表明轉染的TPL-2有效激活NF-κB，而且這似乎需要與內源p105直接作用。這意味著TPL-2可能直接激活p105。(B)NFκB的核轉運如果TPL-2表達確實激活p105，則會發生NF-κBl核轉運。為了研究此作用，用3T3成纖維細胞進行免疫熒光測定，因為在3T3細胞中容易區分胞質和核。簡而言之，用指定載體瞬時轉染NIH-3T3細胞，并在蓋玻片上培養24小時。然后固定、透化處理細胞，并如前所述(Huby等，(1997)J.Cell Biol.137,1639-1649)用指定抗體和合適熒光標記的第二階段的抗體染色。用Leica TCS NT聚焦顯微鏡觀察一個光區的染色轉染細胞。
在用myc-p105單獨或和激酶失活的TPL-2(A270)一起轉染的細胞中，抗-myc染色限于細胞質(圖4a，上面一組)，符合p105作為IκB的作用。然而，與TPL-2共表達導致抗-myc染色基本上定量向核轉移(圖4a，下面一組)。細胞分級分離和蛋白質印跡證實在TPL-2轉染的細胞中的核NF-κB信號是myc-p50而不是限于胞質的myc-p105(圖4b)。這些數據提示，TPL-2表達因為共轉染的myc-p105加工為myc-p50的增多或者因為其降解釋放伴生的myc-p50導致myc-p50的核轉運。
為了確定TPL-2是否必須誘導p105蛋白酶解加工以促進p50的核轉運，用編碼不能加工為myc-p50的myc-p105AGRR的載體和獨立質粒上的HA-p50一起轉染3T3細胞。當HA-p50與TPL-2(A270)(圖5，頂上一組)或空載體共表達時HA-p50定位在核中。myc-p105ΔGRR將HA-50保留在與TPL-2(A270)共轉染的細胞質中(圖5，中間一組)。然而，TPL-2與myc-p105ΔGRR共表達導致HA-p50染色基本上定量向核轉移(圖5，下面一組)。所以TPL-2激活的p50核轉運不需要刺激p105加工為p50。這些數據支持以下觀點TPL-2誘導p105降解釋放伴生的p50或其它相關Rel亞單位，轉運到核，由此產生活性NF-κB。(C)NFκB的生物活性為了證實在共表達TPL-2的細胞中myc-p105產生的核myc-p50具有生物活性，用相對于小鼠Igκ增強子的NF-κB結合位點(Lenardo,M.J.&Baltimore,D.,(1989)Cell 58,227-229)的放射性標記的雙鏈寡核苷酸(Promega)，按文獻(Alkalay,I.等，(1995)Mol.Cell.Biol.15,1294-1301)所述進行電泳遷移率變動分析(EMSA)。
TPL-2表達導致兩種κB結合復合物的顯著增加(圖4c，泳道2)，與TPL-2在JurkatT細胞中激活NF-κB報道基因一致(圖3c)。單獨的myc-p105表達只適度增加較小的κB復合物的結合活性(圖4c，泳道3)。然而，myc-p105與TPL-2共表達協同增加較小的κB復合物的結合活性(圖4c，泳道4)。激酶失活的TPL-2(A270)對κB結合活性沒有作用(圖4c，泳道5)。p105的加工缺陷型突變體myc-p105AGRR(Watanabe等，(1997)EMBO J.16:3609-3620)在存在或缺乏共表達的TPL-2的情況下也不能產生κB結合活性(圖4c，泳道6和7)。
在TPL-2和myc-p105共轉染的細胞中抗-myc MAb與誘導的較小κB復合物強反應，引起超漂移(圖4c，泳道8)。證實在該復合物中存在加工的myc-p50。產生的較小復合物不與針對Rel-A(圖4c，泳道9)或c-Rel的抗體反應。因此，TPL-2和myc-p105共表達刺激產生NF-κB活性復合物，主要包括在myc-p105轉染細胞中過量產生的myc-p50二聚體。對單獨用TPL-2轉染(圖4c，泳道2)的細胞的核提取物進行超漂移分析顯示，誘導的主要內源NF-κB復合物由p50/Rel-A二聚體組成(圖4c，泳道9)。(D)TPL-2對p105的生物效應進行脈沖追蹤代謝標記，以確定TPL-2是否調節3T3成纖維細胞中的myc-p105的蛋白酶解。為了進行脈沖追蹤代謝標記，用脂質轉染胺(Gibco-BRL)瞬時轉染NIH-3T3成纖維細胞(Huby等，(1997)J.Cell.Biol.137,1639-1649)。按文獻(Watanabe等，(1997)EMBO J.16,3609-3620)所述方法制備胞質和核部分。為了進行脈沖追蹤代謝標記，用指定表達載體轉染2.7×1053T3細胞/60mm培養皿(Nunc)。24小時后，洗滌細胞，并在不含Met/Cys的培養基中培養1小時。然后每個培養皿用145 MBq[35S]-Met/[35S]-Cys(Pro-Mix,Amersham-Phamacia Biotech)標記細胞30分鐘，洗滌后在完全培養基中追蹤指定時間。用加有0.1％SDS和0.5％脫氧膽酸鹽的緩沖液A(RIPA緩沖液)(Salmeron等)裂解細胞，并通過熒光自顯影顯示免疫沉淀蛋白。在Met/Cys饑餓期的最后15分鐘加入2O’1M MG132蛋白酶體抑制劑(Biomol Researchlabs)，并在整個脈沖追蹤期間進行保持。用分子動力學專用光密度計通過激光光密度測定法定量標記帶。進行全部脈沖追蹤試驗，至少兩次獲得相似結果。
與TPL-2共表達降低myc-p105半衰期約5.5-1.8小時(圖5a和b)。比較myc-p105降低速率和myc-p50產生速率提示，如前所述(Lin等，(1998)Cell 92,819-828)，大部分myc-p105簡單降解而不是轉化為myc-p50(圖6a)。但是TPL-2共表達不改變產生myc-p50總速率，myc-p50在這些細胞中主要由myc-p105翻譯后產生(圖6a)，而不是通過最近描述的共同翻譯機制產生(Lin等，1998)。因為在TPL-2轉染細胞與在對照細胞中的myc-p50產生速率相似，而myc-p105的量進行性減少(圖6c)，說明TPL-2顯著增加myc-p105加工效率。TPL-2共表達促進myc-p105AGRR的降解(圖6d)，類似于野生型p105(圖6b)。然而，激酶失活TPL-2(A270)對共表達的myc-p105的降解(圖6e)或加工均沒有可檢測到的效應。
測定蛋白酶體有效抑制劑肽醛MG132的作用，以研究TPL-2誘導的myc-p105蛋白酶解是否是通過蛋白酶體介導的。MG132處理阻斷myc-p105的轉換增加(圖6f)而且在TPL-2共表達細胞中完全阻斷產生myc-p50。總之，脈沖追蹤代謝標記試驗表明TPL-2表達的主要作用是增強蛋白酶體對myc-p105的降解速率。而同時蛋白酶體由myc-p105產生myc-p50的總速率不變。
為了測定TPL-2表達對穩態水平的myc-p105/myc-p50的影響，用指定載體瞬時共轉染3T3細胞，并在24小時后用RIPA緩沖液溶解細胞。然后用抗-myc抗血清探測細胞溶胞產物的蛋白質印跡。用激光光密度測定法定量條帶。瞬時轉染3T3細胞的溶胞產物的蛋白質印跡證實，與對照相比，TPL-2共表達顯著增加myc-p50/myc-p105的穩態比(圖6g)。
因此在TPL-2轉染細胞中，myc-p50表達的摩爾顯著超過myc-p105(myc-p50/myc-p105均值=10.3+/-SE 1.3；n=2)，而對照細胞中的myc-p105和myc-p50幾乎等摩爾(myc-p50/myc-p105均值=0.93+/-SE 0.07；n=2)。所以，myc-p50轉移到TPL-2共轉染細胞核中，因為沒有足量的myc-p105保持在細胞質中。
NIK磷酸化并激活稱為IKK-a(IKK-1)和IKK-α(IKK-2)的兩種相關激酶，它們又磷酸化IκB-αN末端的調節性絲氨酸。這引發蛋白酶體的IκB-α遍在作用和降解作用。為了研究磷酸化是否引起與TPL-2共表達的myc-p105的遷移率變動，將洗滌后的抗-myc免疫沉淀物重懸浮在含有50mM Tris-pH7.5、0.03％Brij-96、0.1mM EGTA、1mM DTT、0.1mg/ml BSA的緩沖液中。在適當的樣品中加入400U/ml小牛腸道磷酸酶(CIP；Boehringer-Mannheim)，其中含有或沒有磷酸酶抑制劑原釩酸鈉(1mM)、氟化鈉(5mM)和okadaic酸(0.1μm)。于37℃溫育1小時后，對免疫沉淀蛋白進行蛋白質印跡分析，并用抗-NF-κBl(N)抗血清探測。
TPL-2對myc-p105降解的刺激作用需要其激酶活性(圖6b和e)，說明磷酸化對該作用同樣是必需的。總是發現與TPL-2共表達的myc-p105在SDS-PAGE中的遷移更慢(圖6a)。這種TPL-2誘導的遷移率變化是由于myc-p105磷酸化所致，正如對磷酸酶體外處理的敏感性所示一樣(圖7b)。相反，激酶失活TPL-2(A270)不會導致共表達myc-p105的遷移率變化(圖7b)。因此，TPL-2對myc-p105蛋白酶解的刺激作用與其誘導的磷酸化有關。與IκB-α類似，可能TPL-2誘導的p105磷酸化促進其遍在作用，由此刺激蛋白酶體對p105的蛋白酶解。
所以，TPL-2是新的信號通路中的一個組分，它通過刺激對NF-κB抑制蛋白p105的蛋白酶體介導的蛋白酶解激活NF-κB。TPL-2增強對p105的降解，而保持p50產生的總速率(圖6a)。因此，相關的Re1亞單位本身(可能為二聚體)或者移入細胞核或者與p50產物復合。因為TPL-2與p50、Rel-A和c-Rel特異性共免疫沉淀(圖3a)，所以它可以調節存在于細胞中的所有主要p105復合物的蛋白酶解(Rice等，(1992)Cell 71,243-253；Mercurio等，(1993)Gene.Devel.7,705-718)。有趣的是，TPL-2是與NIK最密切同源的激酶(Malinin,1997),NIK調節對IκB-α誘導性降解。所以，導致NF-κB活化的兩個信號通路均受相關的MAP 3K-家族酶的調節。
最后，這些數據提出了TPL-2致瘤性活化的潛在機制，它需要TPL-2缺失其C末端(Ceci等，(1997)Gene.Devel.11,688700)。因此，C末端缺失既增強TPL-2表達又使其由于與p105的化學計量作用而釋放(圖1b)，它們一起可促進不適當的靶蛋白磷酸化。所述靶蛋白可能包括MEK，突變激活時MEK是致瘤性的(Cowley等，(1994)Cell 77,841-852)而且被TPL-2強激活(Salmeron,A等，(1996)EMBO J.15,817-826)。
免疫沉淀FLAG標記的COT蛋白在溶胞緩沖液(1％Troton X-100,50mM Tris-HCl pH7.5,150mMNaCl,1mM EDTA,1mM EGTA,20mM NaF,10mM Na4P2O7,50mMNa3VO4和完全蛋白酶抑制劑(Boehinger))中于冰上溶解表達FLAG-COT(30-397)的293A轉染細胞15分鐘，離心(14,000rpm,10分鐘，4℃)溶胞產物，收集上清液。于4℃攪拌下用FLAG Ab凝膠(Sigma)以50μgAb/ml溶胞產物進行免疫沉淀。于4℃用溶胞緩沖液洗滌凝膠珠兩次，然后用洗滌緩沖液(50mM Tris-HCl pH7.5,100mM NaCl,0.1mM EGTA和1mM DTT)洗滌兩次。然后將凝膠珠重懸浮在洗滌緩沖液中，并等分到裝有不同激酶反應物的試管中。
TPL-2/COT激酶測定和抑制劑篩選用TPL-2/COT激酶測定篩選不同候選TPL-2/COT激酶抑制劑。如下進行激酶測定。于25℃在合適放射性標記物(30μM ATP和5μCiγ-32P-ATP(Amersham))存在下，在激酶緩沖液(50mM Tris-HCl pH7.5,10mM MgCl2,1mM EGTA,2mM DTT和0.01％Brij35)中將結合在凝膠珠的TPL-2激酶(即FLAG-COT(30-397))與2μg靶多肽底物(即GSTIκB-α(1-50))(Boston Biologicals)溫育10分鐘。在用100％DMSO配制成為10mM母液的抑制劑活性的候選化合物存在或缺乏下進行反應。在激酶反應混合物中加入所述受試化合物后，立即加入γ-32P-ATP。加入5×SDS樣品緩沖液、于100℃加熱3分鐘終止反應，利用離心收集上清液。通過凝膠電泳(10％SDS-PAGE)，然后轉移到硝酸纖維素膜上并進行放射自顯影，分析COT的自身磷酸化以及靶多肽即GST-IκB-α的磷酸化。作為用于證實的對照，在不同激酶反應中使用相同水平的FLAG-COT(30-397)和GST-IκB-α蛋白以及使用相同的凝膠加樣量，在用于放射自顯影的相同膜上分別用抗-FLAG和抗-GST抗體進行免疫印跡。通過對放射性自顯影圖片的掃描定量對COT激酶活性、靶多肽GST-IκB-α的自身磷酸化活性或磷酸化活性的抑制作用(圖13)。如下所述進一步分析改變這些活性水平的化合物。
利用桿狀病毒表達的重組COT蛋白的TPL-2/COT激酶測定與以上所述相似，在候選調節劑化合物存在或缺乏下用靶多肽測試在昆蟲細胞中表達的TPL-2多肽的激酶活性。在該測定中，采用標準技術從用表達COT激酶的桿狀病毒感染的昆蟲細胞制備TPL-2激酶即COT(30-397)。在激酶測定緩沖液(50mM Tris-HCl pH7.5,10mMMgCl2,1mM EGTA,2mM DTT,0.01％Briji 35,5mM β-磷酸甘油)中，在受試化合物存在或缺乏以及放射性標記物([33P]-γ-ATP 3×母液60μM冷ATP和50μCi/ml[33P]-γ-ATP)存在下將TPL-2激酶(100ng,5μg/ml的50mM Tris-HCl pH8.0)與包括p105典型蛋白的靶多肽(即1μgGST-P105Δ1-497,1.4mg/ml的PBS溶液)溫育。另外，在缺乏靶多肽(即p105典型多肽)情況下進行該測定，以確定任何一種受試化合物是否改變TPL-2自身磷酸化活性。
在96孔板中進行測定以便可以有效篩選大量化合物。例如在10μl化合物、10μl[33P]-γ-ATP存在下在96孔板的每孔中通常溫育10μl激酶和底物，并于25℃溫育30分鐘。用100μl 5mM ATP的75mMH3PO4溶液終止反應。然后將反應混合物各120μl轉移到96孔磷酸纖維素濾膜板上，于25℃溫育30分鐘，洗滌(6×100μl 75mM H3PO4/孔)，(用25μl閃爍混合物)測定為以閃爍計數器測定的回收標記蛋白的函數的激酶活性結果。
用上述測定，從用分子模型選定的化學文庫鑒定能夠調節TPL-2激酶活性的幾種化合物，因為所述分子模型包括有效的ATP競爭性TPL-2激酶抑制劑。所鑒定的化合物顯示對以GST-IκB-α為代表的IκB-α靶多肽的COT介導的磷酸化具有作用。
TPL-2/COT激酶調節劑開始以100μM濃度復份篩選具有TPL-2作用的化合物對激酶活性的抑制作用。在圖13中顯示了選定化合物的TPL-2激酶抑制劑篩選數據的實例。為了確定所測試的化合物是TPL-2特異性抑制劑還是普通激酶抑制劑，另外平行測試了特異性的已知激酶抑制劑。普通激酶抑制劑星形孢菌素、MEK抑制劑PD98059和p38MAP激酶抑制劑SB203580顯示對COT自身磷酸化和COT靶(即IκB-α)的磷酸化幾乎沒有或沒有抑制活性。相反，每種受試化合物顯示不同水平的特異性抑制活性(參見圖13)。與只含有DMSO溶媒(終濃度為5％)的對照激酶反應相比，對100μM時抑制TPL-2活性大于50％的活性化合物，再測試3個濃度100μM、10μM和1μM以確定抑制TPL-2的IC50值。鑒定的TPL-2抑制劑包括IC=50μM的N-(6-苯氧基-4-喹啉基)-N-[4-(苯硫基)苯基]胺、IC=10μM的5-氧代-4-[4-(苯硫基)苯胺基]-5,6,7,8-四氫-3-喹啉羧酸乙酯、IC50=100μM的3-(4-吡啶基)-4,5-二氫-2H-苯并[g]吲唑甲磺酸鹽和IC50=100μM的2-氯苯并[l]1,9]菲咯啉-7-羧酸鈉。這些化合物中的每種化合物的化學結構見圖9-12。等同實施方案本領域技術人員最多用常規試驗就可知道或能夠確定本文所述的本發明具體實施方案的無數等同實施方案。以下權利要求書包括這類等同實施方案。
序列表<110>MRC and BASF<120>TPL-2/COT激酶和使用方法<130>BBI-110CPPC<140><141><160>4<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>2720<212>DNA<213>褐鼠<220><221>CDS<222>(318)..(1742)<400>1ggaatttccc atcgcggggg ctcgggtgtt ctgggccagc cggcaggccc tttctgttta 60cggagagaaa ggggaaatgg aaaaggcggg gaggacgctg gcgtcggcta cgccgccccg 120gggccagttc agacgccgag agtccggggc tgcagcgtac cgctcctccc gctgcggatc 180gcccggcctt tggtcggccg ccggtcgtcc ggacgcccgt acgtctggct cccgctggca 240agccacccgc tgcccaccaa gcccgagctc cgggcgggca cacggaacac tcagactccc 300cagcaggcac cacagtg atg gag tac atg agc acc gga agc gac gag aaa350Met Glu Tyr Met Ser Thr Gly Ser Asp Glu Lys1 5 10gaa gag att gat tta tta att aac cat tta aac gtg tcg gaa gtc ctg 398Glu Glu Ile Asp Leu Leu Ile Asn His Leu Asn Val Ser Glu Val Leu15 20 25gac atc atg gag aac ctt tat gca agt gaa gag cct gca gtg tat gag 446Asp Ile Met Glu Asn Leu Tyr Ala Ser Glu Glu Pro Ala Val Tyr Glu30 35 40ccc agt ctg atg acc atg tgt cca gac agc aat caa aac aag gaa cat 494Pro Ser Leu Met Thr Mat Cys Pro Asp 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225 230 235aag gga ctt gat ttt cta cac tca aag aaa gtg atc cat cat gat att1128Lys Gly Leu Asp Phe Leu His Ser Lys Lys Val Ile His His Asp Ile240 245 250aaa cct agc aac att gtt ttc atg tcc aca aaa gct gtt ttg gtg gat1176Lys Pro Ser Asn Ile Val Phe Met Ser Thr Lys Ala Val Leu Val Asp255 260 265 270ttt ggc cta agt gtt caa atg acc gaa gat gtc tat ttt cct aag gac1224Phe Gly Leu Ser Val Gln Met Thr Glu Asp Val Tyr Phe Pro Lys Asp275 280 285ctc cga gga aca gag att tac atg agc cca gag gtc atc ctg tgc agg1272Leu Arg Gly Thr Glu Ile Tyr Met Ser Pro Glu Val Ile Leu Cys Arg290 295 300ggc cat tca acc aaa gca gac atc tac agc ctg ggg gcc acg ctc atc1320Gly His Ser Thr Lys Ala Asp Ile Tyr Ser Leu Gly Ala Thr Leu Ile305 310 315cac atg cag acg ggc acc cca ccc tgg gtg aag cgc tac cct cgc tca1368His Met Gln Thr Gly Thr Pro Pro Trp Val Lys Arg Tyr Pro Arg Ser320 325 330gcc tat ccc tcc tac ctg tac ata atc cac aag caa gca cct cca ctg1416Ala Tyr Pro Ser Tyr Leu Tyr Ile Ile His Lys Gln Ala Pro Pro Leu335 340 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1．調節NFκB活性的方法，它包括使TPL-2分子與NFκB調節組分接觸，使得產生對NFκB活性的調節作用。
2．按照權利要求1的方法，其中所述TPL-2分子是野生型TPL-2。
3．按照權利要求1的方法，其中所述TPL-2分子保留野生型TPL-2的p105-磷酸化活性。
4．按照權利要求1的方法，其中所述TPL-2分子是顯性失活TPL-2突變體。
5．按照權利要求1的方法，其中所述TPL-2分子保留野生型TPL-2的C-末端。
6．鑒定能夠直接或間接調節p105活性的一種或多種化合物的方法，包括以下步驟(a)使TPL-2分子與待評價的一種或多種化合物溫育；和(b)鑒定影響所述TPL-2分子的活性的化合物。
7．按照權利要求6的方法，其中所述一種或多種化合物與所述TPL-2分子結合。
8．按照權利要求6或權利要求7的方法，還包括(c)評價影響TPL-2活性的化合物在基于細胞的測定中調節NFκB活化的能力。
9．鑒定可用于治療涉及或利用炎癥反應的疾病的藥物的前導化合物的方法，包括在其中除了存在一種或多種待測化合物之外，TPL-2與具有參考親和力的p105締合的條件下，使所述一種或多種待測化合物與TPL-2分子和p105溫育；測定TPL-2與p105在所述一種或多種待測化合物存在下的結合親和力；以及參照參考結合親和力，選擇調節TPL-2與p105結合親和力的化合物。
10．鑒定可用于治療涉及或利用炎癥反應的疾病的藥物的前導化合物的方法，包括在其中除了存在一種或多種待測化合物之外，TPL-2與具有參考親和力的p105締合的條件下，使所述一種或多種待測化合物與TPL-2分子和p105溫育；測定TPL-2與p105在所述一種或多種待測化合物存在下的結合親和力；以及參照參考結合親和力，選擇調節TPL-2與NFκB結合親和力的化合物。
11．鑒定藥物前導化合物的方法，包括在其中除了存在一種或多種待測化合物之外，腫瘤壞死因子(TNF)和TPL-2相互作用誘導可測量化學或生物效應的條件下，使所述一種或多種待測化合物與TPL-2分子和TNF溫育；測定在所述一種或多種待測化合物存在下TNF直接或間接與TPL-2相互作用誘導可測量化學或生物效應的能力；以及選擇調節TNF與TPL-2的相互作用的化合物。
12．按照權利要求11的方法，它在體內細胞中進行。
13．鑒定藥物前導化合物的方法，包括以下步驟提供純化的TPL-2分子；使TPL-2分子與被TPL-2磷酸化的已知底物和一種或多種受試化合物溫育；和鑒定能夠調節所述底物磷酸化的一種或多種受試化合物。
14．按照權利要求13的方法，其中所述底物是MEK。
15．可用權利要求6-14中任意一項的方法鑒定的化合物，它能夠調節TPL-2與p105的直接或間接相互作用。
16．按照權利要求15的化合物，它是一種抗體。
17．按照權利要求16的抗體，它是TPL-2特異性的抗體。
18．按照權利要求15的化合物，它是一種多肽。
19．按照權利要求18的多肽，它是TPL-2分子。
20．按照權利要求19的多肽，它是TPL-2的組成型活性突變體或顯性失活突變體。
21．調節細胞內的p105活性的方法，包括給予所述細胞按照權利要求15-20中任意一項的化合物。
22．一種藥用組合物，它含有作為活性成分的有效治療量的按照權利要求15-20中任意一項的化合物。
23．按照權利要求15-20中任意一項的化合物的用途，用于治療與NFκB誘導或抑制有關的病癥。
24．治療與NFκB誘導或抑制有關的病癥的方法，包括給予受試者有效治療量的按照權利要求15-20中任意一項的化合物。
25．鑒定調節TPL-2介導的炎癥反應的化合物的方法，包括使含有TPL-2多肽或其片段的反應混合物與受試化合物接觸；以及測定所述受試化合物對NFκB活性指標的效應，由此鑒定調節TPL-2介導的NFκB活性的化合物。
26．鑒定調節TPL-2介導的NFκB活性的化合物的方法，包括使含有TPL-2多肽或其片段的反應混合物與受試化合物接觸；以及測定所述受試化合物對NFκB活性指標的效應，由此鑒定調節TPL-2介導的NFκB活性的化合物。
27．鑒定調節TPL-2的信號轉導的化合物的方法，包括使含有TPL-2多肽或其片段的反應混合物與受試化合物接觸；以及測定所述受試化合物對所述反應混合物中的TPL-2多肽信號轉導指標的作用，由此鑒定調節TPL-2信號轉導的化合物。
28．鑒定調節TPL-2多肽與TPL-2調節作用的靶組分相互作用的的化合物的方法，包括使含有TPL-2多肽或其片段的反應混合物與所述TPL-2調節作用的靶組分和受試化合物在以下條件下接觸，所述接觸條件是除了存在所述受試化合物之外，所述TPL-2多肽或其片段與參考水平的所述靶組分特異性相互作用；以及測定在所述受試化合物存在下相互作用的水平變化，其中變化水平差值說明所述受試化合物調節TPL-2多肽或其片段與TPL-2調節作用的靶組分之間的相互作用。
29．按照權利要求25、26、27和28中任意一項的方法，其中所述TPL-2多肽包含與選自SEQ ID NO:2和4的多肽具有至少75％同一性的氨基酸序列。
30．按照權利要求25、26、27和28中任意一項的方法，其中所述TPL-2多肽由在高嚴格條件下與選自SEQ ID NO:1和3的核酸分子雜交的核酸分子編碼。
31．按照權利要求25、26、27和28中任意一項的方法，其中所述反應混合物是無細胞反應混合物。
32．按照權利要求25、26、27和28中任意一項的方法，其中所述反應混合物是基于細胞的混合物。
33．按照權利要求32的方法，其中所述反應混合物是一種重組細胞。
34．按照權利要求33的方法，其中所述重組細胞含有編碼TPL-2多肽的異源核酸。
35．按照權利要求25、26、27和28中任意一項的方法，其中所述測定包括測量選自激酶活性、結合活性和信號活性的TPL-2活性。
36．按照權利要求35的方法，其中所述TPL-2活性是激酶活性。
37．按照權利要求25、26、27和28的方法，其中所述重組細胞含有報道基因構建物，該構建物含有與對TPL-2或NFκB轉導的細胞內信號敏感的轉錄調節序列有效連接的報道基因。
38．按照權利要求37的方法，其中所述轉錄調節序列包括TNF轉錄調節序列。
39．按照權利要求28的方法，其中所述靶組分選自p105、IκB-α、IκB-β、MEK-1、SEK-1和NFκB。
40．按照權利要求25、26、27和28中任意一項的方法，其中所述TPL-2分子是重組多肽。
41．按照權利要求40的方法，其中所述TPL-2多肽包括選自SEQID NO:2和4的氨基酸序列。
42．按照權利要求35的方法，其中所述信號活動包括TNF表達。
43．按照權利要求37的方法，其中所述重組細胞含有對TPL-2信號轉導敏感的報道基因。
44．按照權利要求25、26、27和28中任意一項的方法，其中所述測定包括測定細胞凋亡。
45．按照權利要求25、26、27和28中任意一項的方法，其中所述測定包括測定細胞增殖。
46．按照權利要求25、26、27和28中任意一項的方法，其中所述測定包括測定免疫反應。
47．按照權利要求25、26、27和28中任意一項的方法，其中所述TPL-2多肽是純化的TPL-2多肽。
48．按照權利要求28的方法，其中所述靶組分以純化的多肽提供。
49．按照權利要求28的方法，其中所述靶組分是選自p105、IκB-α、IκB-β、MEK-1、SEK-1和NFκB的多肽或其片段。
50．按照權利要求49的方法，其中所述靶組分是IκB-α。
51．按照權利要求49的方法，其中所述靶組分是p105。
52．按照權利要求25、26、27和28中任意一項的方法，其中所述受試化合物選自基于蛋白質、基于碳水化合物、基于脂質、基于核酸、基于天然有機物質、基于合成有機物質和基于抗體的化合物。
53．按照權利要求25、26、27和28中任意一項的方法鑒定的化合物。
54．按照權利要求25、26、27和28中任意一項的方法鑒定的化合物，其中所述化合物適用于治療選自類風濕性關節炎、多發性硬化癥(MS)、炎癥性腸病(IBD)、胰島素依賴性糖尿病(IDDM)、膿毒病、牛皮癬、調節異常的TNF表達和移植排斥反應的病癥。
55．按照權利要求25、26、27和28中任意一項的方法鑒定的化合物，其中所述化合物適用于治療類風濕性關節炎。
56．按照權利要求25、26、27和28中任意一項的方法鑒定的化合物，其中所述化合物適用于治療調節異常的TNF表達。
57．通過調節TPL-2活性治療其需要對象的免疫系統病癥的方法，包括給予能夠調節TPL-2的藥用組合物，所述給予量足以調節所述患者免疫系統反應。
58．治療患者TPL-2介導病癥的方法，該方法包括給予足以調節所述對象的所述TPL-2介導病癥的有效治療量的能夠調節TPL-2的組合物。
59．在其需要對象調節TPL-2介導的NFκB調節作用的方法，該方法包括給予所述人類對象有效治療量的藥用組合物，使其發揮調節作用。
60．調節細胞內TPL-2介導的NFκB調節作用的方法，該方法包括給予細胞能夠調節TPL-2的組合物，給予量足以導致TPL-2介導的NFκB調節作用的變化。
61．按照權利要求57和58任意一項的方法，其中所述病癥選自類風濕性關節炎、多發性硬化癥(MS)、炎癥性腸病(IBD)、胰島素依賴性糖尿病(IDDM)、膿毒病、牛皮癬、調節異常的TNF表達和移植排斥反應。
62．權利要求61的方法，其中所述病癥是類風濕性關節炎。
63．權利要求61的方法，其中所述病癥是調節異常的TNF表達。
64．按照權利要求57-59中任意一項的方法，其中所述組合物選自N-(6-苯氧基-4-喹啉基)-N-[4-(苯硫烷基)苯基]胺、5-氧代-4-[4-(苯硫烷基)苯胺基]-5,6,7,8-四氫-3-喹啉羧酸乙酯、3-(4-吡啶基)-4,5-二氫-2H-苯并[g]吲唑甲磺酸鹽和2-氯苯并[l][1,9]菲咯啉-7-羧酸鈉。
65．治療TNF調節異常的方法，該方法包括給予TNF調節異常風險個體有效治療量的TPL-2調節劑，從而實現治療。
66．權利要求65的方法，其中所述TPL-2調節劑選自N-(6-苯氧基-4-喹啉基)-N-[4-(苯硫烷基)苯基]胺、5-氧代-4-[4-(苯硫烷基)苯胺基]-5,6,7,8-四氫-3-喹啉羧酸乙酯、3-(4-吡啶基)-4,5-二氫-2H-苯并[g]吲唑甲磺酸鹽和2-氯苯并[l][1,9]菲咯啉-7-羧酸鈉。
67．治療類風濕性關節炎的方法，該方法包括以下步驟給予類風濕性關節炎風險個體有效治療量的TPL-2調節劑，從而實現治療。
68．權利要求67的方法，其中所述TPL-2調節劑選自N-(6-苯氧基-4-喹啉基)-N-[4-(苯硫烷基)苯基]胺、5-氧代-4-[4-(苯硫烷基)苯胺基]-5,6,7,8-四氫-3-喹啉羧酸乙酯、3-(4-吡啶基)-4,5-二氫-2H-苯并[g]吲唑甲磺酸鹽和2-氯苯并[l][1,9]菲咯啉-7-羧酸鈉。
全文摘要
證實了TPL－2與p105的磷酸化及其產生的蛋白酶解有關,蛋白酶解導致p50Rel轉運至核。因此本發明提供的TPL－2是激活NFkB的特異性調節劑,因此它是p105參與的炎癥反應調節劑并且是開發能夠影響NFkB活化的化合物的靶。
文檔編號C12N5/10GK1323346SQ99812172
公開日2001年11月21日 申請日期1999年8月13日 優先權日1998年8月18日
發明者H·J·阿倫, R·W·迪克松, J·S·卡門斯, D·維科拉馬辛赫, Y·徐, M·P·貝利克, L·H·約翰斯頓, S·C·利, A·薩爾梅隆 申請人:Basf公司, 醫療研究局