聚乙二醇或聚環氧乙烷－尿酸氧化酶結合物及其應用的制作方法

專利名稱：聚乙二醇或聚環氧乙烷－尿酸氧化酶結合物及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及用化學方法修飾蛋白，以延長蛋白的循環生命期并降低其免疫原性。更具體而言，本發明涉及將聚乙二醇或聚環氧乙烷結合到尿酸氧化酶上，這樣的結合基本上消除了尿酸氧化酶的免疫原性，而尿酸氧化酶分解尿酸的活性并不受影響。
背景技術：
背景部分的陳述并不是對現有技術的全盤接受，相反，它反映了發明人員對進行此項發明時的技術情況的主觀評價和解釋。這些解釋可能包括發明人員自己的、迄今為止尚未透露的對現有技術的洞悉。而這些洞悉本身并不是現有技術的一部分。
尿酸氧化酶(尿酸酶；E.C.1.7.3.3)是一類酶，這類酶催化尿酸氧化，氧化產物是更易于溶解的尿囊素。尿囊素屬嘌呤類代謝物，更易于排泄。因為在高等靈長類動物進化過程中，使尿酸氧化酶具有活性的基因已發生數次突變，所以人類自身并不產生具有酶活性的尿酸酶。Wu，X等(1992)J Mol Evol 3478-84。其結果是，在那些易受影響的人的體內，血液(血尿酸過多癥)及尿液(hyperuricosuria)中過高的尿酸濃度可能會導致關節疼痛(痛風)、損傷性尿酸沉淀(結節瘤)和腎衰的發生。對于有些易受影響個人，現可買到的藥物，如別嘌呤醇(尿酸合成抑制劑)，會產生治療允許范圍內的副作用或不能充分緩解病情。Hande，KR等(1984)Am J Med 7647-56；Fam，AG(1990)Bailliere’s Clin Rheumatol 4177-192。注射尿酸氧化酶可以降低血液及尿液中的尿酸濃度，至少是暫時性降低。但是，由于對于人體來說尿酸氧化酶屬外源蛋白，因此，即使是第一次注射來源于黃曲霉(Aspergillus flavus)的未經修飾的尿酸氧化酶，也有百分之幾接受治療的病人發生過敏反應(Pui，C-H等(1997)Leukemia 111813-1816)，免疫反應制約了尿酸氧化酶在長期治療和間斷性治療方面的應用。Donadio，D等(1981)Nouv PresseMed 10711-712；Leaustic，M等(1983)Rev Rhum Mal Osteoartic50553-554。
現在可行的、治療高尿酸血的亞優選方法已被接受好幾十年了。Kissel，P等(1968)Nature 21772-74。類似地，一些患有嚴重痛風病的病人可以獲得安全有效的注射尿酸氧化酶的可能性早已既成事實數年了。Davis，FF等(1978)in GB Broun等，(Eds.)EnzymeEngineering，Vol 4(pp.169-173)New York，Plenum Press；Nishimura，H等(1979)Enzyme 24261-264；Nishimura，H等(1981)Enzyme 2649-53；Davis，S等(1981)Lancet 2(8241)281-283；Abuchowski，A等(1981)J Pharmacol Exp Ther 219352-354；Chen，RH-L等(1981)Biochim Biophys Acta 660293-298；Chua，CC等(1988)Ann Int Med 109114-117；Greenberg，ML等(1989)AnalBiochem 176290-293。來源于動物器官的尿酸氧化酶在安全注射量的溶劑中幾乎是不可溶的。美國專利3,616,231。特定的來源于植物或微生物的尿酸氧化酶在醫學上可接受的溶劑中易溶些。但是，注射來源于微生物的尿酸氧化酶會很快引發免疫反應，從而可能導致威脅生命的過敏反應的發生，或者導致循環中的尿酸氧化酶失活和/或尿酸氧化酶從體內清除的速度加快。Donadio，D等(1981)；Leaustic，M等(1983)。根據源于哺乳動物，包括豬和狒狒，或源于昆蟲，如黑尾果蠅(Drosophila melanogaster)或假暗腹果蠅(Drosophilapseudoobscura)(Wallrath，LL等，(1990)Mol Cell Biol 105114-5127)的尿酸氧化酶的氨基酸序列而制備的酶，由于免疫原性和在生理pH條件下的不可溶等問題，至今還不能用于臨床。
用聚乙二醇或聚環氧乙烷(都以PEG來表示)對蛋白進行共價修飾，這種方法已被用來延長蛋白的半壽期和降低蛋白的免疫原性。美國專利4,179,337、4,766,106和4,847,325；Saifer，MGP等(1994)Adv Exp Med Biol 366377-387。高分子量的PEG與蛋白結合后生成的結合物，循環生命期延長和/或免疫原性下降，并且仍保持著蛋白的功能。這一結論已在另一種酶，超氧化物歧化酶(Somack，R等(1991)Free Rad Res Commun 12-13553-562；美國專利5,283,317和5,468,478)以及其他類型的蛋白，如細胞因子(Saifer，MGP等(1997)Polym Preprints 38576-577；Sherman，MR等(1997)in JM Harris等(Eds.)Poly(ethylene glycol)Chemistry and BiologicalApplications.ACS Symposium Series 680(pp.155-169)Washington，DCAmerican Chemical Society)中得到證實。除PEG以外的多聚體與尿酸氧化酶的結合物在美國專利4,460,683也有陳述。
在幾乎所有報導過的將尿酸氧化酶PEG化(如將PEG共價偶聯到尿酸氧化酶上)的嘗試中，PEG總是最先與氨基結合，包括氨基末端殘基和可用的賴氨酸殘基。常用的尿酸氧化酶，四個單獨的亞基中每個亞基的賴氨酸的總數為25-29(黃曲霉(美國專利5,382,518))(豬，Wu，X等(1989)Proc Natl Acad Sci USA 869412-9416))。在天然尿酸氧化酶的結構中，有些賴氨酸殘基不參與PEG化。降低尿酸氧化酶免疫原性的最常用的方法是大量結合由低分子量PEG組成的PEG鏈。但是，由這種方法得到的結合物，其酶活性也總是大大下降。
先前的研究人員曾在離體條件下注射尿酸氧化酶以催化尿酸轉化成尿囊素(見Pui等(1997))。這為法國和意大利應用來源于真菌黃曲霉的尿酸氧化酶(Uricozyme)防治或暫時緩解由細胞毒素治療壞血病而引起的高尿酸血，以及暫時降低痛風病人血液中嚴重超量的尿酸提供了理論基礎。Potaux，L等(1975)Nouv Presse Med 41109-1112；Legoux，R等(1992)J Biol Chem 2678565-8570；美國專利s 5,382,518和5,541,098。由于Uricozyme的循環生命期很短，所以需要每天注射。更進一步，由于Uricozyme具有免疫原性，所以它并不適用于長期治療。
將來源于單假絲酵母(Candida utilis)的尿酸氧化酶與分子量為5KD的PEG結合，制備物單次靜脈注射到五名實驗者身上，這五名實驗者在注射前血清中尿酸的平均濃度為6.2mg/dL，屬正常水平。注射后，實驗者血清中的尿酸濃度降低到了檢測不出的水平。Davis等(1981)。四星期后再次注射。文章中沒有報導他們的反應。第二次(也是最后一次)注射后，用靈敏度相對不高的凝膠擴散分析方法沒有檢測到尿酸氧化酶的抗體。該文獻沒有報導接受長期治療或次長期治療的病人或實驗動物的結果。
將來源于球節細菌(Arthrobacter protoformiae)的尿酸氧化酶與分子量為5KD的PEG結合，制備物用來暫時性控制一名淋巴瘤患者血液中的尿酸高濃度，該患者在注射前血清中的尿酸濃度為15mg/mL。Chua等(1988)。由于病人病情的危急以及治療期之短(14天注射四次)，不可能評估結合物治療的長期效果或安全性。
在本申請中，術語“免疫原性”指的是由注射經PEG修飾的或未經修飾的尿酸氧化酶(抗原)制備物而引起的免疫反應。“抗原性”指的是抗原與已存在抗體的反應。抗原性和免疫反應統稱為“免疫反應性”。在先前有關PEG-尿酸氧化酶的研究中，評價免疫反應性的方法有很多種，包括1)離體條件下，PEG-尿酸氧化酶與預先存在的抗體的反應；2)檢測經誘導而產生的抗體的合成；3)重復注射后加快了的清除速率。
通過用不同的連接物結合不同數量的PEG鏈到尿酸氧化酶上，以消除不同來源尿酸氧化酶的免疫原性的嘗試已取得了一定的成功。第一次將PEG-尿酸氧化酶公諸于眾的是FF Davis和Y Inada以及他們的同事們。Davis等(1978)；美國專利4,179,337；Nishimura等(1979)；日本專利55-99189和62-55079。美國專利4,179,337中所述的結合物是這樣合成的將1mol非特異來源的尿酸氧化酶與2000倍過量摩爾量的分子量為750D的PEG反應，這意味著個尿酸氧化酶亞基都可能結合大量的多聚分子。美國專利4,179,337揭示了各種多肽類激素和酶，包括氧化還原酶(其中尿酸氧化酶是三個例子中的一個)結合分子量為500D-20,000D，優選分子量為500D-5,000D的PEG或聚丙二醇后，可以產生有活性的、水溶性的，沒有免疫原性的結合物。另外，美國專利4,179,337還強調每個酶分子結合10-100個多聚鏈而使得至少40％的酶活性得以保留。專利文獻中沒有關于尿酸氧化酶中可用的氨基末端PEG結合的程度、結合產物水解尿酸的活性或結合物免疫反應性的檢測結果。
與PEG化尿酸氧化酶有關的十三個引證中的數據都列在表1中。這些結果中有一些也以圖的形式出現在

圖1A-2B中。這些引證中，有七篇文章都寫明將不同數量的PEG鏈與來源于單假絲酵母(Candidautilis)的尿酸氧化酶偶聯后，離體檢測的結合物水解尿酸的活性都有很大程度的降低。將大量的分子量為5KD的PEG與豬肝臟尿酸氧化酶偶聯也得到了類似的結果，這在Chen發表的文章和他們的討論報告上都有記載。參見Chen等(1981)；Davis等(1978)。
在表1總結的研究中，有七項研究報導PEG化的尿酸氧化酶的免疫反應性降低，五項報導免疫反應性消除。后五項研究中有三項，免疫反應性消除的同時也伴隨著水解尿酸活性顯著降低——至多達到最初活性的15％、28％或45％。參見Nishimura等(1979)(15％活性)；Chen等(1981)(28％活性)；Nishimura等(1981)(45％活性)。第四項研究報導PEG與61％的可用賴氨酸殘基結合，但沒有關于剩余酶活性的陳述。參見Abuchowski等(1981)。然而，一支包括這同樣兩名科學家的研究小組，用同樣的方法，在另一刊物上報導以這種程度結合，剩余的活性只能達到23-28％。參見Chen等(1981)。從Abuchowski等和Chen等在1981年發表的文章可以看出，要基本上降低尿酸氧化酶的免疫原性，PEG必須與將近60％的可用賴氨酸殘基結合(表1)。在報導尿酸氧化酶的活性已被消除的第五項研究中，PEG結合的程度、剩余的水解尿酸的活性或PEG-蛋白連接的本質都沒有說明。參見Veronese，FM等(1997)in JM Harris等(Eds.)，Poly(ethylene glycol)Chemistryand Biological Applications.ACS Symposium Series 680(pp.182-192)Washington，DCAmerican Chemical Society。
研究表明，尿酸氧化酶中結合PEG的賴氨酸殘基低于60％時，在實驗動物體內，結合物的免疫反應性降低但并沒有消除。參見Tsuji，J等(1985)Int J Immunopharmacol 7725-730(28-45％的氨基被結合)；Yasuda，Y等(1990)Chem Pharm Bull 382053-2056(38％的氨基被結合)。相應化合物的剩余水解尿酸的活性范圍從小于33％(Tsuji，T等)到60％(Yasuda，Y等)不等，此值相對于它們的最初活性值而言。Tsuji，J等合成PEG-尿酸氧化酶用的PEG除5KD的外，還有7.5KD和10KD的PEG。所有的連接產物都有一定程度的免疫原性和抗原性，同時酶活大大降低(表1；圖1A-1B)。
將來源于單假絲酵母的尿酸氧化酶PEG化后的制備物，給五人每人安全施藥兩次。這種制備物據報導只保留了其最初活性的11％。Davis等(1981)。幾年后，經PEG修飾的來源于球節細菌的尿酸氧化酶被四次用于同一病人，該病人患有嚴重的淋巴瘤和高尿酸血。參見Chua等(1988)。Chua等沒有檢測酶制備物剩余的活性，但是他們用酶連免疫吸附測定法(ELISA)證實了在第一次注射PEG化尿酸酶后的26天，病人血清中的抗-尿酸氧化酶抗體不見了。
如在表1中所總結的，先前的關于PEG化尿酸酶的研究表明，要基本上降低尿酸氧化酶的免疫反應性，需要結合足量的PEG鏈，但這又會大大降低其水解尿酸的活性。更進一步，最先合成PEG-尿酸氧化酶是用氰尿酰氯，一種三嗪衍生物(2，4，6-三氯-1，3，5-三嗪)來活化PEG的。已證實在兔子體內，氰尿酰氯會引起新的抗原因子的產生，并會誘導新的抗體的形成。參見Tsuji，J等(1985)。表1先前研究中PEG-尿酸氧化酶的特征
A Sana等在日本專利3-148298中揭示了修飾蛋白，包括用分子量為1-12KD的PEG衍生的尿酸氧化酶，表現出降低了的抗原性和“改進的、延長的”作用，以及制備這樣的衍生多肽的方法。然而，專利中并沒有關于鏈數、酶分析、生物檢測或“改進的、延長的”的含義的說明。Y Inada在日本的專利55-99189和62-55079中揭示了分別由PEG-三嗪或雙-PEG-三嗪(表1中表示為PEG2)制備的尿酸氧化酶結合物。見Nishimura等(1979和1981)。在第一種類型的連接物中，PEG的分子量為2KD和5KD，而在第二種類型的連接物中，只用了分子量為5KD的PEG。Nishimura等(1979)報導用線形、分子量為5KD的PEG修飾43％的賴氨酸后，還有15％的水解尿酸的活性。Nishimura等(1981)報導用PEG2分別修飾46％或36％的賴氨酸后，還有31％或45％的水解尿酸的活性。
發明概述先前的研究告訴我們，PEG化雖然可以大大降低尿酸氧化酶的免疫原性和/或抗原性，但總是伴隨著尿酸裂解活性的顯著降低。生物藥物的安全、方便和劃算總是受到效價降低的不利影響，而效價降低就需要增加用藥劑量。因此，需要有一種安全有效的替代療法來降低體液(包括血液和尿液)中尿酸的高濃度。
本發明的一個實施方案是一種尿酸氧化酶的結合物，它保持了至少大約75％的未結合尿酸氧化酶的尿酸裂解的活性，而且免疫原性基本上降低。本實施方案包括一種純化了的尿酸氧化酶，該酶的每個亞基都與平均2-10個PEG鏈共價結合，這些PEG鏈可以是線型鏈，也可以是分支鏈，鏈中每個PEG分子的分子量為5KD-100KD。在本實施方案中，本發明的尿酸氧化酶可以是重組尿酸氧化酶。不管是不是重組體，尿酸氧化酶都可以來源于哺乳動物。本實施方案的一個方面，尿酸氧化酶可以來源于豬肝、牛肝或綿羊肝臟。另一個方面，尿酸氧化酶也可以是嵌合的。嵌合尿酸氧化酶可以包括部分豬肝和/或狒狒肝尿酸氧化酶序列。例如，嵌合的尿酸氧化酶可以是豬-狒狒嵌合尿酸氧化酶(PBCuricase)或包含了R291K和T301S突變的豬尿酸氧化酶(PKS uricase)(序列見圖6，生理和免疫方面的研究結果見圖7-12)。另外，尿酸氧化酶也可以是狒狒肝臟尿酸氧化酶，其中97位酪氨酸被組氨酸代替，這樣得到的尿酸氧化酶活性上升到至少約60％。本發明中的尿酸氧化酶，不管是什么來源的，都以平截形式存在，截去的可能是氨基端，也可能是羧基端，還可能是兩端。同樣，尿酸氧化酶也可以是真菌或微生物尿酸氧化酶。本實施方案的一個方面是真菌或微生物尿酸氧化酶可以是來源于黃曲霉，球節桿菌和單假絲酵母的，其形式可以是天然形式或重組形式。另外，尿酸氧化酶可以是無脊椎動物的尿酸氧化酶，例如，來源于大豆(Glycine max)根瘤的天然形式或重組形式的尿酸氧化酶。PEG的平均分子量介于5KD-100KD；PEG的優選平均分子量介于10KD-60KD；PEG的更優選平均分子量介于20KD-40KD，例如30KD。共價結合的PEG鏈的平均數目為2-10個鏈/尿酸氧化酶亞基；共價結合的PEG鏈的優選平均數目為3-8個鏈/尿酸氧化酶亞基；共價結合的PEG鏈的更優選平均數目是4-6個鏈/尿酸氧化酶亞基。在本實施方案的一個方面中，尿酸氧化酶可以是四聚體。PEG鏈可以通過氨酯鍵(氨基甲酸酯)，仲胺鍵，和/或酰胺鍵共價偶聯到尿酸氧化酶上。本文中所提到的任意一尿酸氧化酶，當它以重組形式存在時，重組形式與天然形式的尿酸氧化酶在序列上基本上是相同的。
本發明的另一實施方案是一種藥物組合物，用該組合物降低體液中的尿酸水平，包括上述提到的任一PEG-尿酸氧化酶結合物和藥學上可接受的載體。冷凍干燥條件下該組合物可以穩定存在。而配制適用于腸胃外注射的溶劑時，該組合物又能迅速溶解。
本發明還提供了一種降低哺乳動物體液和組織中尿酸水平的方法。該方法包括給哺乳動物施用PEG-尿酸氧化酶，其量可有效降低尿酸水平。PEG-尿酸氧化酶可以是一種很純的、有兩個或更多亞基的尿酸氧化酶，其中每個亞基可以共價結合到平均2-10個線形或分支PEG鏈上。PEG鏈上每個PEG分子的分子量介于5KD-100KD，在藥學上可接受的載體中。哺乳動物可以是人。用藥步驟可以是，例如，靜脈注射、皮內注射、皮下注射、肌肉內注射或腹腔進入或吸入霧狀制備物。尿酸水平升高可能是在血液中、尿中和/或其它體液和組織中，而且可能與痛風、結節瘤、腎功能不全、器官移植或惡性疾病有關。
本發明的其它實施方案是一種將四聚體形式的尿酸氧化酶從含有多種形式的尿酸氧化酶溶液中分離出來的方法以及該方法的產物。最初的溶液可能含有一定的四聚體尿酸氧化酶和其他尿酸氧化酶聚合物。該方法可包括如下步驟將溶液加到至少一個分離柱上，分離柱的pH介于9-10.5，例如10.2；收集洗脫級分，鑒別出那些可能含有分離出的四聚體尿酸氧化酶，且基本上不含其他尿酸氧化酶聚合物的級分；把含有分離出的四聚體尿酸氧化酶的級分合并。分離柱可以是離子交換、大小排除或其他有效的分離方法。本方法還包括為確定四聚體尿酸氧化酶的存在和/或不存在其他尿酸氧化酶聚合體而采用的級分分析。例如，這樣的分析方法包括高效液體層析法(HPLC)、其它層析法、光散射、離心和/或電泳。本實施方案的一個方面，經純化的四聚體尿酸氧化酶可以含有少于約10％的尿酸氧化酶聚合物。
附圖簡述圖1A表示來源于單假絲酵母的尿酸氧化酶經PEG化后仍保留的活性作為每個亞基結合的PEG鏈數的函數。圖1B表示來源于單假絲酵母的尿酸氧化酶經PEG化后仍保留的活性作為每個亞基結合的PEG總數的函數。圖2A表示來源于豬肝的尿酸氧化酶經PEG化后仍保留的活性作為每個亞基結合的PEG鏈數的函數。圖2B表示來源于豬肝的尿酸氧化酶經PEG化后仍保留的活性作為每個亞基結合的PEG總數的函數。圖3A表示豬-狒狒嵌合(PBC)尿酸氧化酶經PEG化后仍保留的活性作為每個亞基結合的PEG鏈數的函數。圖3B表示PBC尿酸氧化酶經PEG化后仍保留的活性作為每個亞基結合的PEG總數的函數。圖4A表示來源于黃曲霉的尿酸氧化酶經PEG化后仍保留的活性作為每個亞基結合的PEG鏈數的函數。圖4B表示來源于黃曲霉的尿酸氧化酶經PEG化后仍保留的活性作為每個亞基結合的PEG總數的函數。圖5A表示重組大豆根瘤尿酸氧化酶經PEG化后仍保留的活性作為每個亞基結合的PEG鏈數的函數。圖5B表示重組大豆根瘤尿酸氧化酶經PEG化后仍保留的活性作為每個亞基結合的PEG總數的函數。圖6表示推測出的豬-狒狒嵌合尿酸氧化酶(PBC uricase)的序列，PBC尿酸氧化酶在N-末端和C-末端都切去了頂端(PBC-NT-CT)，而且將豬和狒狒的序列作一比較，可看出豬尿酸氧化酶含有R291K和T301S突變(PKS uricase)。圖7表示四次或五次向小鼠腹腔注射經PEG修飾的PBC尿酸氧化酶，每次注射24小時后小鼠血清中尿酸氧化酶的活性，相對于第一次注射24小時后的值。圖8表示尿酸缺陷型小鼠血清中所注射的PEG修飾的PBC尿酸氧化酶的活性與血清及尿液中的尿酸濃度間的反相關。圖9表示用PEG修飾的PBC尿酸氧化酶處理后，尿酸氧化酶缺陷型小鼠(uox-/-)因尿濃縮造成的機體損傷程度的減輕。圖10表示用PEG修飾的PBC尿酸氧化酶處理后，尿酸氧化酶缺陷型小鼠(uox-/-)的腎性尿崩癥的減輕。圖11表示磁共振顯微術所顯示的用PEG修飾的PBC尿酸氧化酶處理后，尿酸氧化酶缺陷型小鼠(uox-/-)的尿酸引發的腎病的減輕。圖12表示BALB/c小鼠體內所注射的八聚體PBC尿酸氧化酶相對四聚體而言在循環中的清除速率要快許多，雖然二者的每個亞基上都偶聯了5-6條鏈10kDa的PEG。
優選實施方案詳述本發明提供了水溶性高分子，尤其是聚乙二醇或聚環氧乙烷與尿酸氧化酶的改良偶聯物。本發明也提供了該改良偶聯物的藥物組合物。這些偶聯物基本上無免疫原性，而保留了未修飾酶的至少75％的尿酸裂解活性，優選的可保留85％的酶活性，更優選的保留的酶活性可達95％或更高。可與水溶性聚合物偶聯的尿酸氧化酶包括從細菌、真菌、植物和脊椎與無脊椎動物中分離出的天然的尿酸氧化酶以及突變、雜交和/或截短的具有酶活性的尿酸氧化酶變體等重組尿酸氧化酶。適用于本發明的水溶性聚合物，包括線性和分支的聚乙二醇類或聚環氧乙烷類，通常都稱為PEGs。有關分支的PEG的實施例參見美國第5,643,575號專利。線性PEG的一個優選實施例是單甲氧基PEG，其化學通式是CH3-(CH2CH20)nH，其中n的取值范圍約為100～2300。
一種優選哺乳類尿酸氧化酶是重組的豬-狒狒嵌合尿酸氧化酶，該酶由豬肝和狒狒肝的尿酸氧化酶的部分序列嵌合而成，豬肝尿酸氧化酶及狒狒肝尿酸氧化酶首先由Wu，et al.，(1989)鑒定。該嵌合尿酸氧化酶的一個實施例是由豬尿酸氧化酶序列(SEQ ID NO1)的前225個氨基酸和狒狒尿酸氧化酶序列(SEQ ID NO2)的后79個氨基酸組成(豬-狒狒尿酸氧化酶或PBC尿酸氧化酶；圖6)。該嵌合尿酸氧化酶的另一個實施例由豬序列(SEQ ID NO1)的7-225號殘基和狒狒序列(SEQ ID NO2)的226-301號殘基組成；這就等同于氨基和羧基端都被平截的PBC尿酸氧化酶(PBC-NT-CT；圖6)。還有一個該嵌合尿酸氧化酶的實施例是由豬序列(SEQ ID NO1)的前288個氨基酸和狒狒序列(SEQ ID NO2)的后16個氨基酸所組成。由于后面序列與豬序列僅存在兩個位點的差異，即豬序列291位精氨酸殘基被賴氨酸殘基(K)替代，301位蘇氨酸被絲氨酸(S)所替代，該突變型被稱為豬-K-S或PKS尿酸氧化酶。PKS、PBC和PBC-NT-CT尿酸氧化酶分別含有一個以上的賴氨酸殘基；因而比豬或狒狒的序列多出了一個潛在的PEG化位點。
現已亞克隆出包括PBC、PKS尿酸氧化酶和一種類似狒狒尿酸氧化酶的重組酶在內的不同哺乳動物來源的尿酸氧化酶的cDNA，而且通過常規方法確定了它們在大腸桿菌中表達的最佳條件。參見Erlich，HA，(Ed.)(1989)PCR Amplification.New YorkStockton Press；Sambrook，J.Et al.，(1989)Molecular Cloning.A LaboratoryManual，Second Edition，Cold Spring Harbor，NYCold Spring HarborLaboratory Press。現已提純出這些重組尿酸氧化酶，并用修飾標準試驗評估了其穩定性及活性。參見Fridovich，I，(1965)J BiolChem2402491-2494；Nishimura，et al.，(1979)以及實施例1。
本發明的一項實施方案通過與無毒的、生物穩定的、分子鏈數相對比較少的PEG共價結合的方法得到了偶聯尿酸氧化酶。這種化學鍵包括氨基甲酸乙酯(氨基甲酸酯)鍵、仲胺鍵以及酰胺鍵。各種適用于這種偶聯的活化的PEG都可以從Shearwater Polymers，Huntsville，AL購得。
例如，在琥珀酰亞氨基酸碳酸(SC)或4-硝苯基碳酸酯(NPC)這些PEG衍生物存在的條件下將尿酸氧化酶進行孵育，就可以形成與尿酸氧化酶相連的氨酯鍵。SC-PEG的合成程序見本文參考文獻中的美國第5,612,460號專利。NPC-PEG可以依據Veronese，FM，et al.，(1985)Appl Biochem Biotechnol 11141-152所述方法將PEG與4-硝苯基氯甲酸酯反應制備，或按本文參考文獻中美國第5,286,637號專利中的方法制備。只要調節反應物的濃度以維持相似的化學計量，‘637號專利所述方法可適用于更高分子量的PEG。合成NPC-PEG的另一種方法見Büttner，W，et al.，East German Patent Specification DD279，486 AL。
可用一種PEG羧酸衍生物(Shearwater Polymers)的N-羥基琥珀酰亞胺基酯形成與尿酸氧化酶相連的酰胺鍵。可用2，2，2-三氟乙磺酰基PEG(tresyl PEG；Shearwater Polymers)或PEG醛(ShearwaterPolymers)與氰基氫硼化鈉發生還原烷基化反應形成仲胺鍵。
由5kDa～30 kDa的PEG組成的偶聯物中，每個亞基所偶聯的PEG的最大鏈數可從大豆尿酸氧化酶的平均2條到PBC尿酸氧化酶的平均10多條(見實施例1的試驗條件及圖1A-5B的結果)，而保留了未修飾的尿酸氧化酶至少75％的尿酸分解活性。后者PEG化的程度將近總氨基數的三分之一。本發明的一項實施方案中，每個尿酸氧化酶亞基偶聯的PEG的平均鏈數為2-10。在一項優選的實施方案中，每個尿酸氧化酶亞基偶聯的PEG平均鏈數為3-8。而一項更優選的實施方案中，每個尿酸氧化酶亞基共價偶聯的PEG平均鏈數為4-6。在另一項實施方案中，用于偶聯反應的PEG的分子量為5kDa-100kDa，優選分子量為10kDa-60kDa，更優選分子量為20kDa-40kDa，例如30kDa。
某一形式的尿酸氧化酶的偶聯反應所用的PEG的鏈數及最適分子量的選擇受幾個因素的影響。一般而言，要降低或消除免疫原性而基本上不改變尿酸裂解活力，可能需要偶聯上鏈數相對更多的小分子量的PEG，反之可用鏈數相對少些的大分子量的PEG。例如，每個亞基上偶聯6條鏈的20kDa的PEG或每個亞基偶聯4條鏈的30kDa的PEG效果最佳。同樣，每一種不同形式的尿酸氧化酶就所偶聯的PEG的分子量大小和鏈數而言，存在不同的最適點。參見圖1A-5B。
將被檢測的尿酸氧化酶溶解于一種生理酸堿度的緩沖液中，該緩沖液不含用于穩定法國、意大利的Sanofi Winthrop所售的真菌尿酸氧化酶(Uricozyme)所需要的8-雜氮磺嘌呤等外加類似底物或抑制因子，該尿酸氧化酶可穩定存在，并因與PEG的偶聯而性質有所改變。兩種不同的PBC尿酸氧化酶偶聯物，其中一種的每個亞基偶聯6條鏈10kDa PEG而另一種每個亞基大約偶聯2分子的19kDa PEG，將它們在鼠血清中孵育1個多月后還保持了較顯著的酶活。另外本發明的幾種偶聯物在鼠體內循環的半壽期超過2天，而過去報導的PEG修飾的哺乳類和微生物尿酸氧化酶的半壽期將近8或24小時。參見Chen，et.，(1981)；Fuertges，F，et al.，(1990)J Contr Release 11139-148；Fujita，T，et al.，(1991)J Pharmacobiodyn 14623-629。注射用的蛋白藥物的半壽期的延長減少了藥物成本，而且患者的順應性更好。半壽期延長也是更易于機體耐受的藥物的一個指征。
用純化后的四聚體形式的酶(4個35kDa的亞基)制備PBC尿酸氧化酶的PEG偶聯物，發現這些偶聯物在鼠體內的免疫原性大大減弱(圖7)，而更多亞基的尿酸氧化酶PEG偶聯物具有中等程度的免疫原性(例如35kDa亞基八聚體；見圖12)，未修飾的酶有著很高的免疫原性。給尿酸氧化酶缺陷性小鼠反復注射本發明的PEG-尿酸氧化酶，可以在2個多月內消除它們的高尿酸血癥狀，保護其腎臟結構功能免受尿酸造成的傷害(圖8-11)。
注射全活性的PBC尿酸氧化酶與10kDa PEG的偶聯物(圖3A-3B)，大大減輕了尿酸氧化酶缺陷型純合小鼠的高尿酸血癥狀(圖8)。所有用PEG化的PBC尿酸氧化酶治療的尿酸氧化酶缺陷型小鼠尿液中的尿酸水平顯著下降。用相似的PEG尿酸氧化酶對尿酸氧化酶缺陷型小鼠進行一系列的注射試驗所得數據參見圖8。分別對正常生活條件、經過12小時斷絕飲水(圖9)、水分消耗和排尿后(圖10)的接受注射治療的病鼠進行尿液的重量摩爾滲透壓濃度測定，所得結果與基本上相似的未經藥物治療的病鼠相應狀況下的測量結果相比較，證實了注射PEG-尿酸氧化酶的確減輕了尿濃縮所引起的不良反應。而且用本發明的一種PEG-尿酸氧化酶對出生10日后的純合尿酸氧化酶缺陷型(uox-/-)的基因“敲除”小鼠進行為期10周的注射治療，并用磁共振顯微術觀察，結果也證實了尿酸引發的腎結構的破壞程度減輕了(圖11)。至于顯微技術方法參見Hedlund，LW，et al.，(1991)Fund Appl Toxicol16787-797；Johnson，GA，et al.，(1992)in JC Gore，(Ed.)，Reviewsof Magnetic Resonance in Medicine，Vol.4(pp.187-219)New YorkPergmon Press。
天然及重組尿酸氧化酶提純物中常常除了四聚體(140kDa)形式之外還混有其他形式的酶聚合物。純化物中四聚體形式的酶所占的百分比一般為20％-90％。盡管有證據表明幾種未PEG化的其他蛋白聚合物具有高免疫原性，(例如，見Moore，WV，et al.，(1980)J Clin EndocrinolMetab 51691-697)，以往的PEG-尿酸氧化酶的研究并未著力于其他聚合物含量的限制，這表明研究者并沒有考慮到PEG修飾的聚合物還具有潛在的免疫原性。本發明研究人員觀察到以前制備PEG尿酸氧化酶所用的尿酸氧化酶中存在這樣的聚合物。這些聚合物的出現可能增加了制備非免疫原性偶聯物的難度。而且在以往的尿酸氧化酶PEG化實驗中出現的尿酸分解活力大幅下降現象似乎與這些酶偶聯上的低分子量的PEG鏈數過多有關。另一方面，本文所述的尿酸氧化酶純化及PEG化方法允許在每個亞基上共價結合10條鏈的PEG而保持了75％以上的尿酸水解活力，至少對于豬-狒狒嵌合尿酸氧化酶以及源于黃曲霉的尿酸氧化酶這樣的尿酸氧化酶可以這么做(見圖3A、4A)。
在另一項優選的實施方案中，可以在將制備的基本為四聚體的尿酸氧化酶與PEG偶聯之前，通過離子交換或大小排阻層析法把幾乎所有的四聚體尿酸氧化酶洗脫下來，洗脫液pH9～10.5，優選pH為10.2。從制備柱洗脫下的每一種組分的尿酸氧化酶分子量可以用任何一種分子量大小依賴的分析方法檢測到，包括高效液相層析法、常規大小分離層析法、離心、光散射、區帶電泳或非變性凝膠電泳。將大小排阻層析法分離出的只含有四聚體尿酸氧化酶，即140kDa的酶級分收集，備偶聯PEG之用。用離子交換層析法分離四聚體尿酸氧化酶的過程中，從離子交換柱洗脫下的級分可進行大小分析以確定哪個級分含有大量的四聚體尿酸氧化酶而不需要的其他聚合物只占10％、5％、2％或更少。
本文的試驗結果表明，比四聚體更大的PBC尿酸氧化酶即便是已經充分PEG化了，仍能在小鼠體內保持高免疫原性(圖12)。而且，向曾注射過PEG尿酸氧化酶聚合物的小鼠再注射PEG化的四聚體或PEG化的其他尿酸氧化酶聚合物，這些偶聯聚合物在循環體系中很快就被清除。而非四聚體含量低于5％的尿酸氧化酶所制得的PEG偶聯物可以多次注射而清除速率沒有加快(圖7)，而且高靈敏度酶聯免疫分析檢查不出抗體的產生。用高純度四聚體尿酸氧化酶也使本發明的改良偶聯物較以往所說的PEG-尿酸氧化酶優點更顯著。相反，以往的一些研究者由于使用了含有高比率(如＞10％)的非四聚體尿酸氧化酶的尿酸氧化酶制備物制取PEG-尿酸氧化酶，為了降低免疫原性而不得不增加偶聯的PEG的鏈數。結果生成的偶聯物的酶活力顯著降低。在另一項實施方案中，在確保制得的尿酸氧化酶偶聯物保留了至少75％的尿酸分解活性而基本上無免疫原性的前提下，本發明還特別考慮到了非四聚體形式的PEG化的尿酸氧化酶，例如二聚體尿酸氧化酶。
本發明的另一個實施方案提供了一種比突變的酶效價顯著增高的突變型狒狒肝尿酸氧化酶。這種改良的靈長類尿酸氧化酶可通過DNA重組技術制取。尤其出乎意料的是在狒狒尿酸氧化酶中發生單個氨基酸殘基突變(94位酪氨酸被組氨酸所代替)后，可引起特定酶活力的大幅度增強。在大腸桿菌中表達的這種突變蛋白的特定的酶活較突變前的狒狒尿酸氧化酶增加了至少60％。
在另一個實施方案中，表達了一種至少去除了氨基端前6個氨基酸和/或至少去除了羧基端后3個氨基酸的截短的豬或豬-狒狒嵌合尿酸氧化酶變體，發現這種未PEG化的特定的酶活性有所增加和/或可溶性有所提高(參見圖6)。羧基端平截的重組尿酸氧化酶也許在PEG化之前就具有了更好的可溶性，因為去除了過氧化靶序列。見Miura，S，etal.，(1994)Eur J Biochem 223141-146。
本發明的PEG-尿酸氧化酶可有效降低哺乳動物，尤其是人類體液及組織中的尿酸水平，因此可用于治療痛風、結節瘤、腎功能不全、器官移植和惡性疾病等病癥中并發的高尿酸癥。可以通過靜脈內、皮下、皮內、肌肉及腹膜內等多種途徑將PEG-尿酸氧化酶注射到尿酸水平過高的哺乳動物體內。另外，也可以將之煙霧化以后吸入體內。見Patton，JS，(1996)Adv Drug Delivery Rew 193-36和美國第5,458,135號專利。本發明的PEG-尿酸氧化酶的有效劑量取決于尿酸水平及個體大小。本發明此方面的一項實施方案中，PEG-尿酸氧化酶按照大約10μg-1g的用量與一種藥學上可接受的的賦形劑或稀釋劑共同服用。在一個優選的實施方案中，PEG-尿酸氧化酶的用量大約為100μg-500mg。更優選的則為1mg-100mg，例如5mg，20mg或50mg。實施方案中的PEG-尿酸氧化酶的用量范圍根據偶聯物中酶蛋白的含量而定。
可通過常規方法配制含有PEG-尿酸氧化酶的藥劑，例如Gennaro，AR(Ed.)(1990)Remington’s Pharmaceutical Sciences，18thEditionEaston，PAMack Publishing Co所述方法。配制注射用藥劑可使用的賦形劑包括磷酸緩沖鹽溶液、乳酸化林格溶液、水、多元醇和甘油等。用于腸胃外注射藥劑的成份包括藥學上可接受的無菌水或非水劑、分散劑、懸浮液或乳劑以及現配現用的與無菌注射溶液或分散劑混合的無菌粉劑。這些制劑可添加別的一些成份，比如防腐劑、增溶劑、穩定劑、潤濕劑、乳化劑、緩沖液、抗氧化劑和稀釋劑。
PEG-尿酸氧化酶也可作為控釋成分植入個體，以便持續控制體液中的高尿酸水平。例如，聚乳酸、聚乙醇酸、再生膠原蛋白、多聚-L-賴氨酸、藻酸鈉、吉蘭糖膠、脫乙酰殼多糖、瓊脂糖、多層脂質體以及許多其他常規處方，包括可以與具有生物活性成份配合使用的，可以生物腐蝕或可生物降解的材料。這些材料在植入或注入體內后，會逐漸分解，并向其周圍組織釋放活性物質。例如，一種把PEG-尿酸氧化酶膠囊化的方法，該方法包括本文參考文獻中收錄的美國第5,653,974號專利所披露的方法。本發明特別重視可生物腐蝕、降解的處方。關于運載PEG-尿酸氧化酶的灌輸泵和運載基質體系也在本發明的考慮范圍之中。PEG-尿酸氧化酶也可很好的封入膠粒或脂質體中。脂質體包裹技術在制藥業已為人們所熟知。例如參見Lasic，D，et al.，(Eds.)(1995)Stealth Liposomes.Boca Raton，FLCRC Press。
本發明的PEG-尿酸氧化酶藥物成分可降低因尿酸引起腎功能不全的高危病人，如接受器官移植者(見Venkataseshan，VS，et al.，(1990)Nephron 56317-321)及惡性疾病患者對血液滲析的依賴性。對體內大量積累尿酸晶體的病人(如結節瘤患者)而言，這種藥物組合物可以比目前可行的其他治療方法更快的改善患者的新陳代謝狀況。
以下的實施例不應被視為本發明的局限性，而是為了說明上述各方面而例舉的。這些實施例敘述了幾種大小和成分的活化的(亦即親電子的)PEG衍生物和天然的豬、真菌或細菌尿酸氧化酶或重組的大豆、豬或豬-狒狒嵌合尿酸氧化酶發生偶聯反應制備PEG-尿酸氧化酶的方法。在這些實施例中還包括有關活性、可溶性、穩定性、藥物代謝動力學、藥效動力學以及免疫原性的研究結果。圖8-11的數據證實了本發明的PEG-PBC尿酸氧化酶治療血內尿酸過多以及多尿酸尿，保護因血內尿酸過多和多尿酸尿造成的嚴重腎損傷的動物體系中腎臟的結構功能的作用。參見Wu，X，et al.，(1994)Proc Natl Acad Sci USA 91742-746。這些實施例可以指導本行業中的普通技術人員生產基本上無免疫原性，而保留了未修飾酶至少75％的尿酸分解活力的尿酸氧化酶偶聯物。
實施例1四聚體形式尿酸氧化酶的純化四聚體尿酸氧化酶(分子量約為140kDa)是通過先制備大小分離或離子交換層析后分析大小分離層析兩個步驟從豬肝尿酸氧化酶溶液中純化的。豬肝尿酸氧化酶購自Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，catalogNo.U2350或Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN。
制備及分析大小分離層析的pH值范圍為pH10-pH10.5，優選的為pH10.2，層析緩沖液是含0.1M NaCl的10mM的碳酸鈉緩沖液，使用已經用已知分子量的蛋白校準過的Superdex200層析柱。Superdex購自Amersham Pharmacia，Piscataway，NJ。任何可以保持所需酸堿度，并與后續的PEG偶聯化學反應相匹配的緩沖液都是適用的。這樣的緩沖液在本領域已為人們所熟知。在280nm波長處檢測洗脫液的紫外吸收值，收集洗脫液終于所需四聚體尿酸氧化酶分子量一致且無更高分子量的尿酸氧化酶的部分，用于合成實施例2所述的基本無免疫原性的PEG-尿酸氧化酶。另外，也可通過其他大小分離介質分離四聚體尿酸氧化酶，例如Superose12(Amersham Pharmacia)或其他任何可耐受弱堿性溶液且篩選范圍合適的介質。這樣的介質很容易購得，在本領域也廣為人知。
離子交換層析的pH為10-10.5，優選的為10.2，適用經0.1M的碳酸鈉緩沖液平衡過的MonaQ層析柱(Amersham Pharmacia，Piscataway，NJ)。任何與PEG偶聯反應相匹配且可以維持所需pH的緩沖液都是適用的。而為了使尿酸氧化酶吸附到柱子上，緩沖液的離子濃度應盡可能低。在本領域中這種緩沖液已為人們所熟知。逐漸增加緩沖液離子強度，如含0～0.5M線性梯度濃度的NaCl的碳酸鈉緩沖液，使尿酸氧化酶從離子交換樹脂上洗脫下來的同時，測定洗脫液在280nm波長處的紫外吸收值。然后通過大小分離高效液相層析確定洗脫液中含所需四聚體尿酸氧化酶而檢測不出其他聚合物的部分，收集之以備合成無免疫原性的PEG-尿酸氧化酶之用。另外，也可用其他離子交換介質分離出四聚體尿酸氧化酶，如Q-Sepharose(Amersham Pharrmacia)或其他任何可耐受弱堿性溶液的介質。這樣的介質很容易購得，在本領域也廣為人知。
尿酸氧化酶的活性可通過改進的方法測定。如Fridovich(1965)；Nishimura，et al.，(1979)所述方法。用pH9.2的50mM硼酸鈉緩沖液配制尿酸溶液，尿酸終濃度為6-150μM，現配現用。將制得的尿酸氧化酶用含牛血清白蛋白(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，catalogNo.A-7030)的50mM硼酸鈉緩沖液稀釋，白蛋白的終濃度為0.1mg/mL。25℃條件下將各種稀釋度的酶與微量板讀數器上的微量滴定板小孔中的底物混合，然后在292nm波長處每4秒鐘測定一次尿酸消失的速率，連續測定3分鐘。從3分鐘內就有10％～40％的底物被降解的樣品得到的數據中至少取20個數據點用來計算每分鐘吸光值下降的最大速率。一個尿酸氧化酶活的國際單位(IU)指的是每分鐘消耗1微摩尿酸所需酶量；比活度用IU/mg蛋白表示。圖1A-5B中的一些尿酸氧化酶相對酶活數據是用100μM尿酸測定所得。其他的100μM尿酸速度(V100)的是通過米氏常數(κM)值和相應的酶制備物的最大反應速度(Vmax)計算得到的，所用公式如下V100＝100×Vmax/(κM+100)公式中的κM以微摩爾為單位表示。
實施例2四聚體豬尿酸氧化酶的PEG偶聯以每摩爾尿酸氧化酶亞基(分子量35kDa)添加10-200摩爾活化的PEG的比例，將不同分子量的(5-30kDa)單甲氧基PEG衍生物，如4-硝苯基碳酸PEG(NPC-PEG)添加進溶有四聚體尿酸氧化酶的0.1M、pH10.2的碳酸鈉緩沖液中。這種及其它適用的活化PEG可從ShearwaterPolymers購得。有關這些PEG與蛋白的偶聯反應的說明書請見因特網www.swpolymers.com上的Shearwater Polymers目錄以及JM Harris，et al.，(Eds.)(1997)Poly(ethylene glycol)Chemistry andBiological Applications.ACS Symposium Series 680，Washington，DCAmerican Chemical Society。偶聯反應的溫度為0-8℃，直到PEG偶聯程度不再隨時間而變化。然后通過色譜法和/或超濾法將未反應的PEG從反應產物中去除。
每個尿酸氧化酶亞基所偶聯的PEG鏈數確定是通過Kunitani，M，etal.，(1991)J Chromatogr 588125-137；Saifer，et al.，(1997)和Sherman，et al.，(1997)所述方法改進后確定的。簡而言之，PEG化反應混合物的各成分或制備離子交換或大小分離柱上洗脫下來的部分通過室溫下進行的大小分離高壓液相色譜法鑒定，適用的是TSK5,000 PWXL層析柱。緩沖液為pH10.2、含0.1M NaCl的碳酸鈉溶液。該高效液相層析柱購自TosoHaas，Montgomeryville，PA。通過測定紫外吸收值和利用折射率檢測器檢測蛋白和PEG。偶聯物中的蛋白含量通過紫外吸收值計算出，以合適的未修飾的尿酸氧化酶標準溶液作為參照。偶聯物中PEG的量通過折射率峰的面積計算出，所得結果以適當的PEG標準溶液的折射率峰面積為參照，最后結果是考慮了蛋白質對折射率的影響后的修正值。
圖2A反應的是尿酸氧化酶的每個亞基偶聯的PEG鏈數對PEG化豬肝尿酸氧化酶活力的改變作用。本發明的數據(▲，□)與Chen，et al.，(1981)的進行了比較。大圓圈中的數據表示的是Chen，et al.，(1981)所報道的非免疫反應性偶聯物。如圖2所示，每個亞基偶聯6條鏈30kDa的PEG或7條鏈的50kDa的PEG的四聚體豬尿酸氧化酶偶聯物保留了至少75％的未修飾酶活。隨著5kDa或30kDa PEG鏈數的增加(大約每個亞基4條鏈)，尿酸分解活力明顯增強的現象可能反應了未修飾的酶的可溶性或穩定性比偶聯物的要差。如圖2B所示，平均每個亞基偶聯了5個以上30kDa的PEG的豬尿酸氧化酶偶聯物所含的PEG量比Chen，et al.，(1981)發現的消除免疫反應性所需的PEG量要多一些。
實施例3四聚體重組PBC尿酸氧化酶的PEG偶聯物之特性將重組豬-狒狒嵌合(PBC)尿酸氧化酶cDNA克隆入pET3d表達載體(Novagen，Madison，WI)，重組質粒結構被轉入大腸桿菌BL21(DE3)pLysS(Novagen)菌株中進行表達。這些步驟按分子生物學領域常用方法實施。見Erlich(1989)；Sambrook，et al.，(1989)；Ausubel，F，et al.，(Eds.)，(1997)Short Protocols in Molecular Biology.New YorkJohn Wiley & Sons。
圖6展示了推導的PBC尿酸氧化酶氨基酸序列(SEQ ID N01的1-225位氨基酸以及SEQ ID NO2的226-304位氨基酸)，以豬的(SEQ IDNO1)及狒狒的(SEQ ID NO2)序列為對照。用粗體字表示狒狒序列與豬序列相異的氨基酸殘基。Wu，et al.，(1989)首次確認了豬與狒狒的尿酸氧化酶序列本發明的研究者進一步肯定了這兩種酶的序列。除缺少基因庫序列中的起始的甲硫氨酰殘基之外，SEQ ID NO1與GenBank中收錄的編號為p16164的序列幾乎完全一致。SEQ ID NO2除了缺少起始的甲硫氨酰殘基以及Gen Bank序列第153號組氨酸(圖6種的第154個氨基酸殘基)變成了蘇氨酸之外，幾乎與Gen Bank收錄的編號為p25689的序列完全一樣。
分離出四聚體PBC尿酸氧化酶，將之與實施例1及實施例2所述的不同分子量的PEG相偶聯。偶聯用的PEG分子量為5kDa、10kDa、19kDa或30kDa，每個亞基所連的PEG鏈數多達10條。那些用分子量大于或等于10kDa的PEG制得的偶聯物保留了未修飾重組酶的95％以上的酶活(圖3A-3B)。
每個亞基偶聯有將近6條鏈的10kDaPEG的一種四聚體PBC尿酸氧化酶偶聯物的特征如標注的圖所示無免疫原性(圖7)以及對尿酸氧化酶缺陷型小鼠的療效1)治療血內尿酸過多及高尿酸尿(圖8)；2)減輕尿濃縮造成的損傷(圖9)；及3)減輕腎性尿崩癥(圖10)。另外，磁共振顯微證實該PEG-尿酸氧化酶減輕了尿酸相關的腎損傷(圖11)。
圖7反映了腹膜注射PEG-尿酸氧化酶4或5次，每次注射24小時后取樣測得的鼠血清中的PEG-尿酸氧化酶的活性，以第一次注射24小時后鼠血清中的尿酸氧化酶活力為對照。用三種不同的PBC與兩種方法活化的PEG制取偶聯物。其中一種偶聯物(●)是在尿酸缺陷型小鼠(uox-/-)體內進行檢測的，另兩種(△，■)則是在正常的BALB/c鼠體內檢測的。免疫反應性最高的偶聯物(△)是用純化的含有未知數量的其他聚合物的PBC尿酸氧化酶與PEG的琥珀酰亞胺基碳酸衍生物(SC-PEG)偶聯制得，平均每個亞基連有7條鏈的5kDa的PEG。見參考文獻中的Zalipsky，美國專利5,612,460。免疫反應性居中的偶聯物(■)是用含11％其他聚合物的尿酸氧化酶溶液與PEG的4-硝苯基碳酸衍生物(NPC-PEG)偶聯所得，平均每個亞基連有2條鏈的19kDa的PEG。見Sherman et al.，(1997)。免疫反應性最低的偶聯物(●)是用其他聚合物含量低于5％的PBC尿酸氧化酶溶液制備的，平均每個亞基連有6條鏈的10kDa的NPC-PEG。
圖8反映了尿酸缺陷型(uox-1-)小鼠血清及尿液中尿酸的濃度與注射的PEG-尿酸氧化酶活性的反相關關系。在時間零點進行注射，72小時后檢測發現血清中含有0.43個國際單位的PBC尿酸氧化酶偶聯物，該偶聯物平均每個亞基上連有6條鏈的10kDa的PEG。
圖9反映了用PEG修飾過的PBC尿酸氧化酶可以減輕尿酸缺陷型小鼠因尿酸濃縮造成的損傷。測定兩只含有一份正常鼠基因的小鼠(uox+/-)、六只未處理的純合尿酸氧化酶缺陷型小鼠(uox-/-)、以及在出生后的第3天到第72天期間注射過10次95mIU或190mIU劑量PEG-尿酸氧化酶的六只純合尿酸氧化酶缺陷型小鼠尿液的重量克分子滲透濃度，并求其平均差和標準差。每個遺傳背景的小鼠要么可以隨意飲水(實心柱)，要么在收集尿液前的12個小時內禁止飲水(陰影柱)。
圖10反映了PEG修飾過的PBC尿酸氧化酶可以減輕尿酸缺陷型小鼠的腎性尿崩癥狀，腎性尿崩的特征是動物的飲水量和排尿量均高于正常水平。所用實驗小鼠的遺傳背景以及處理方案同圖9。對每組6只的三組小鼠的日飲水量(實心柱)及日排尿量(陰影柱)求平均差和標準差。
圖11表明PEG修飾過的PBC尿酸氧化酶可以減輕尿酸缺陷型小鼠因尿酸引起的腎病，如磁共振顯微所示。三組小鼠的遺傳背景及處理方案同圖9及圖10。磁共振顯微是在卡洛林納杜爾漢姆的公爵大學醫學中心的在體顯微中心進行的。
除了圖8-11總結的結果之外，本發明也證實了用PEG修飾過的PBC尿酸氧化酶治療過的所有尿酸氧化酶缺陷型小鼠的尿液中的尿酸水平都明顯下降。最后，圖12表明，與PEG修飾過的四聚體PBC尿酸氧化酶不同的是，八聚體(分子量＝280kDa)尿酸氧化酶即便是充分PEG化后，在小鼠體內還是具有免疫原性。腹膜內注射的PEG八聚體尿酸氧化酶在注射后五天內就被清除的現象映證了這一特性。將同一只小鼠在第8天和第15天注射同樣劑量的同種PEG尿酸氧化酶。24小時后，第二次及第三次注射的PEG八聚體尿酸氧化酶在鼠血清中就檢測不到尿酸分解活性了，而用四聚體注射的小鼠徐輕重很容易就檢測出尿酸氧化酶活性。這些發現，結合第一次折射觀察到的PEG八聚體尿酸氧化酶快速清除現象(圖12)，為在將尿酸氧化酶PEG化之前應該把所有分子量比四聚體尿酸氧化酶大的聚合物除去這一經驗方法提供了依據。
實施例4單假絲酵母尿酸氧化酶的PEG偶聯單假絲酵母(Candida utilis)的尿酸氧化酶可以從Sigma-Aldrich(St.Louis，MO；catalog No.U1878)或Worthington BiochemicalCorporation(Freehold，NJ；catalog No.URYW)購買。步驟如實施例1和實施例2所述，分離四聚體，然后用5kDa、10kDa或30kDa的PEG合成偶聯物(圖1A-1B)。圖1A反映了單假絲酵母PEG尿酸氧化酶每個亞基所連的PEG鏈數對保持酶活性的作用。本發明的數據(▲，●，□)與Nishimura，et al.，(1979)、Nishimura，et al.，(1981)、Chen et al.，(1981)、Davis，et al.，(1981)；Tsuji，et al.，(1985)；Yasuda，et al.，(1990)以及Fujita，et al.，(1991)等所得結果進行了比較。大圓圈中的數據表示的是Nishimura，et al.，(1979或1981)所報道的非抗原性偶聯物。
圖1B反映了單假絲酵母PEG化尿酸氧化酶每個亞基所連的PEG的量對保持酶活性的影響。本發明的數據(▲，●，□)也與圖1A上的那些報道進行了比較。大圓圈中的數據所表示的偶聯物同圖1A中的。
如圖1A及圖1B所示，每個亞基平均有6條鏈5kDa或30kDaPEG或者連有9條鏈的10kDa PEG的偶聯物至少保留了未修飾酶的75％的活性。隨著30kDaPEG鏈數的增加(達到每個亞基5或6鏈)，偶聯物的酶活明顯增強的現象可能反映了未修飾酶相對于修飾后的偶聯物而言，可溶性及穩定性都較差。
實施例5黃曲霉尿酸氧化酶的PEG偶聯黃曲霉(Aspergillus flavus)的尿酸氧化酶可以從Sanofi Withrop(Gentilly Cédex，France)購的。步驟如實施例2所述，合成了具有不同分子量的PEG的偶聯物(圖4A-4B)。偶聯物通過將黃曲霉尿酸氧化酶每個亞基上平均連接12鏈5kDa PEG或7鏈30kDa PEG相偶聯制備，至少保留了該真菌尿酸氧化酶的75％的酶活。
實施例6大豆尿酸氧化酶的PEG偶聯大豆根瘤的重組尿酸氧化酶由Tipton博士(University ofMissouri，Columbia，MO)提供，按照Kahn和Tipton(Kahn，K，etal.，(1997)Biochemistry 364731-4738)的方法從大豆根瘤(也稱作根瘤35)提取和純化所得。步驟同實施例1和實施例2，先分離四聚體，再用不同分子量PEG進行偶聯(圖5A-5B)。與單假絲酵母尿酸氧化酶(圖1A)、豬尿酸氧化酶(圖2A)、豬-狒狒嵌合尿酸氧化酶(圖3A)以及黃曲霉尿酸氧化酶(圖4A)相比，只有每個亞基連接將近2條鏈5kDa或30kDa PEG的大豆尿酸氧化酶可以保持75％以上的酶活力。
實施例7球形節桿菌尿酸氧化酶的PEG偶聯球形節桿菌(Arthrobacter globiformis)的尿酸氧化酶購自Sigma-Aldrich(catalog No.U7128)。見日本第9-154581號專利。步驟如實施例1及實施例2所述，先分離四聚體，然后用5kDa或30kDaPEG制備偶聯物。每個亞基平均偶聯至少3條鏈5kDa PEG的偶聯物保留的酶活不到60％，而每個亞基平均連接有將近2條鏈的30kDa PEG的偶聯物保留了85％以上的酶活。
實施例8氨基端平截的豬及PBC尿酸氧化酶的PEG偶聯用實施例3所述的常規方法將豬及PBC尿酸氧化酶的氨基端前6的氨基酸殘基去除，并讓重組尿酸氧化酶在大腸桿菌中表達并純化。步驟如實施例1和實施例2所述，結果合成了基本上無免疫原性而保留了至少75％的酶活的截去了部分氨基酸的尿酸氧化酶偶聯物。
實施例9羧基端平截或氨基端和羧基端同時平截的豬及PBC尿酸氧化酶的PEG偶聯用實施例3所述的常規方法將豬及PBC尿酸氧化酶的羧基端最后3個氨基酸去除，并讓重組尿酸氧化酶在大腸桿菌中表達并純化。這種羧基端的截短可能增加了酶的可溶性，因為去除了過氧化物酶體靶向信號。見Miura，et al.，(1994)。步驟如實施例1和2所述，合成了基本上無免疫原性而保留了75％以上酶活性的羧基端發生平截的尿酸氧化酶PEG偶聯物。圖6顯示了氨基端截去6個殘基，羧基端截去3個殘基的重組PBC尿酸氧化酶(PBC-NT-CT)的氨基酸序列。該尿算酶按照實施例1、2及實施例3所述方法進行表達、純化以及PEG化，結果制得了基本上無免疫原性而保留了75％以上的酶活的偶聯物。
實施例10具有更多PEG結合位點的豬尿酸氫化酶突變體的PEG偶聯用實施例3所述方法制備重組豬尿酸氧化酶，通過將一個或一個以上的精氨酸殘基用賴氨酸代替的方式增加了潛在的PEG結合位點。見Hershfield，MS，et al.，(1991)Proc Natl Acad Sci USA 887185-7189。這種突變體的一個實施例(PKS尿酸氧化酶)的氨基酸序列中的291位精氨酸被賴氨酸所替代，301位蘇氨酸被絲氨酸所代替，如圖6所示。步驟同實施例1和實施例2，該偶聯物基本無免疫原性而保留了75％以上的酶活。
實施例11
重組狒狒尿酸氧化酶突變體的PEG偶聯用實施例3的分子生物學常規方法構造出97位發生一個氨基酸的替代(蘇氨酸被組氨酸代替)的重組狒狒尿酸氧化酶(見圖6中的狒狒序列)。步驟同實施例1、2所述，結果合成了免疫原性顯著下降而保留了75％以上的酶活的四聚體重組狒狒尿酸氧化酶PEG偶聯物。
實施例12單假絲酵母、黃曲霉及球節細菌的PEG尿酸氧化酶偶聯物的免疫原性按照實施例4、5及實施例7所述方法獲得單假絲酵母、黃曲霉及球節細菌的尿酸氧化酶。步驟同實施例1、2所述，用5kDa、10kDa、20kDa或30kDa的PEG制備尿酸氧化酶偶聯物。結果這些偶聯物的免疫原性顯著降低或基本上消除。
序 列 表<110>Williams，L.DavidHershfield，Michael S.
Kelly，Susan J.
Saifer，Mark G.P.
Sherman，Merry R.
<120>PEG尿酸氧化酶接合物及其應用<130>MVIEW.001VPC<140>
<141>
<150>09/130,392<151>1998 08-06<160>2<170>FastSEQ for Windows Version 3.0<210>1<211>304<212>蛋白質<213>野豬<400>1Met Ala His Tyr Arg Asn Asp Tyr Lys Lys Asn Asp Glu Val Glu Phe1 5 10 15Val Arg Thr Gly Tyr Gly Lys Asp Met Ile Lys Val Leu His Ile Gln20 25 30Arg Asp Gly Lys Tyr His Ser Ile Lys Glu Val Ala Thr Ser Val Gln35 40 45Leu Thr Leu Ser Ser Lys Lys Asp Tyr Leu His Gly Asp Asn Ser Asp50 55 60Val Ile Pro Thr Asp Thr Ile Lys Asn Thr Val Asn Val Leu Ala Lys65 70 75 80Phe Lys Gly Ile Lys Ser Ile Glu Thr Phe Ala Val Thr Ile Cys Glu85 90 95His Phe Leu Ser Ser Phe Lys His Val Ile Arg Ala Gln Val Tyr Val100 105 110Glu Glu Val Pro Trp Lys Arg Phe Glu Lys Asn Gly Val Lys His Val115 120 125His Ala Phe Ile Tyr Thr Pro Thr Gly Thr His Phe Cys Glu Val Glu130 135 140Gln Ile Arg Asn Gly Pro Pro Val Ile His Ser Gly Ile Lys Asp Leu145 150 155 160Lys Val Leu Lys Thr Thr Gln Ser Gly Phe Glu Gly Phe Ile Lys Asp165 170 175Gln Phe Thr Thr Leu Pro Glu Val Lys Asp Arg Cys Phe Ala Thr Gln180 185 190Val Tyr Cys Lys Trp Arg Tyr His Gln Gly Arg Asp Val Asp Phe Glu195 200 205Ala Thr Trp Asp Thr Val Arg Ser Ile Val Leu Gln Lys Phe Ala Gly210 215 220Pro Tyr Asp Lys Gly Glu Tyr Ser Pro Ser Val Gln Lys Thr Leu Tyr225 230 235 240Asp Ile Gln Val Leu Thr Leu Gly Gln Val Pro Glu Ile Glu Asp Met245 250 255Glu Ile Ser Leu Pro Asn Ile His Tyr Leu Asn Ile Asp Met Ser Lys260 265 270Met Gly Leu Ile Asn Lys Glu Glu Val Leu Leu Pro Leu Asp Asn Pro275 280 285Tyr Gly Arg Ile Thr Gly Thr Val Lys Arg Lys Leu Thr Ser Arg Leu290 295 300<210>2<211>304<212>蛋白質<213>埃及狒狒<400>2Met Ala Asp Tyr His Asn Asn Tyr Lys Lys Asn Asp Glu Leu Glu Phe1 5 10 15Val Arg Thr Gly Tyr Gly Lys Asp Met Val Lys Val Leu His Ile Gln20 25 30Arg Asp Gly Lys Tyr His Ser Ile Lys Glu Val Ala Thr Ser Val Gln35 40 45Leu Thr Leu Ser Ser Lys Lys Asp Tyr Leu His Gly Asp Asn Ser Asp50 55 60Ile Ile Pro Thr Asp Thr Ile Lys Asn Thr Val His Val Leu Ala Lys65 70 75 80Phe Lys Gly Ile Lys Ser Ile Glu Ala Phe Gly Val Asn Ile Cys Glu85 90 95Tyr Phe Leu Ser Ser Phe Asn His Val Ile Arg Ala Gln Val Tyr Val100 105 110Glu Glu Ile Pro Trp Lys Arg Leu Glu Lys Asn Gly Val Lys His Val115 120 125His Ala Phe Ile His Thr Pro Thr Gly Thr His Phe Cys Glu Val Glu130 135 140Gln Leu Arg Ser Gly Pro Pro Val Ile His Ser Gly Ile Lys Asp Leu145 150 155 160Lys Val Leu Lys Thr Thr Gln Ser Gly Phe Glu Gly Phe Ile Lys Asp165 170 175Gln Phe Thr Thr Lys Pro Glu Val Lys Asp Arg Cys Phe Ala Thr Gln180 185 190Val Tyr Cys Lys Trp Arg Tyr His Gln Cys Arg Asp Val Asp Phe Glu195 200 205Ala Thr Trp Gly Thr Ile Arg Asp Leu Val Leu Glu Lys Phe Ala Gly210 215 220Pro Tyr Asp Lys Gly Glu Tyr Ser Pro Ser Val Gln Lys Thr Leu Tyr225 230 235 240Asp Ile Gln Val Leu Ser Leu Ser Arg Val Pro Glu Ile Glu Asp Met245 250 255Glu Ile Ser Leu Pro Asn Ile His Tyr Phe Asn Ile Asp Met Ser Lys260 265 270Met Gly Leu Ile Asn Lys Glu Glu Val Leu Leu Pro Leu Asp Asn Pro275 280 285Tyr Gly Lys Ile Thr Gly Thr Val Lys Arg Lys Leu Ser Ser Arg Leu290 295 300
權利要求
1.一種尿酸氧化酶結合物，該結合物相對于未結合的尿酸氧化酶仍保留至少約75％的裂解尿酸的活性，而且該結合物基本上沒有免疫原性，包括純化的含有亞基的尿酸氧化酶，其中每個亞基以共價形式結合到平均2-10個PEG鏈上，其中每個PEG分子的分子量為5KD-100KD。
2.權利要求1的結合物，其中尿酸氧化酶是哺乳動物的尿酸氧化酶。
3.權利要求2的結合物，其中尿酸氧化酶是豬肝、牛肝或綿羊肝的尿酸氧化酶。
4.權利要求1的結合物，其中尿酸氧化酶是重組的。
5.權利要求4的結合物，其中尿酸氧化酶基本上含有豬肝、牛肝、綿羊肝或狒狒肝的尿酸氧化酶序列。
6.權利要求4的結合物，其中尿酸氧化酶是嵌合體。
7.權利要求6的結合物，其中嵌合尿酸氧化酶含有豬肝和狒狒肝尿酸氧化酶的一部分。
8.權利要求7的結合物，其中嵌合尿酸氧化酶是PBC尿酸氧化酶。
9.權利要求7的結合物，其中嵌合尿酸氧化酶是PKS尿酸氧化酶。
10.權利要求4的結合物，其中尿酸氧化酶基本上含有狒狒肝尿酸氧化酶的序列，其中97位的酪氨酸被組氨酸代替。
11.權利要求4的結合物，其中尿酸氧化酶包括N-末端和C-末端，其中尿酸氧化酶在一端或兩端都被截短。
12.權利要求1的結合物，其中尿酸氧化酶是真菌或微生物尿酸氧化酶。
13.權利要求12的結合物，其中真菌或微生物尿酸氧化酶是從黃曲霉，球形節桿菌或單假絲酵母中分離得到，或者是基本含有這些尿酸氧化酶之一序列的重組酶。
14.權利要求1的結合物，其中尿酸氧化酶是無脊椎動物尿酸氧化酶。
15.權利要求14的結合物，其中無脊椎動物尿酸氧化酶是從黑尾果蠅或假暗腹果蠅中分離得到，或者是基本含有這些尿酸氧化酶之一的序列的重組酶。
16.權利要求1的結合物，其中尿酸氧化酶是植物尿酸氧化酶。
17.權利要求16的結合物，其中植物尿酸氧化酶是從大豆的根瘤中分離得到或者是基本含有該酶序列的重組酶。
18.權利要求1的結合物，其中PEG的平均分子量為10KD-60KD。
19.權利要求18的結合物，其中PEG的平均分子量為20KD-40KD。
20.權利要求1的結合物，其中每個尿酸氧化酶亞基上共價結合的PEG鏈的數目為3-8個。
21.權利要求20的結合物，其中其中每個尿酸氧化酶亞基上共價結合的PEG鏈的數目為4-6個。
22.權利要求1的結合物，其中尿酸氧化酶是四聚體。
23.權利要求1的結合物，其中PEG鏈通過選自氨酯鍵、仲胺鍵和酰胺鍵的鍵共價偶聯到尿酸氧化酶上。
24.權利要求1的結合物，其中PEG是線形的。
25.權利要求1的結合物，其中PEG是有分支的。
26.一種用來降低體液或組織中尿酸水平的藥物組合物，包括權利要求1的結合物和一種藥學上可接受的載體。
27.權利要求26的藥物組合物，其中所說的組合物經冷凍干燥而穩定化，為提供適用于不經腸胃的溶劑而要重建時，該組合物又能迅速溶解。
28.一種降低哺乳動物體液或組織中升高的尿酸水平的方法，包括給所說的哺乳動物施用降低尿酸有效量的PEG-尿酸氧化酶，所說的尿酸氧化酶包括純化的尿酸氧化酶，含有至少兩個亞基，其中每個亞基共價連接到平均2-10個PEG上，其中每個PEG分子的分子量為5KD-100KD，存在于一藥學上可接受的載體中。
29.權利要求28的方法，其中所說的哺乳動物是人。
30.權利要求28的方法，其中給藥步驟選自靜脈注射、皮內注射、皮下注射、肌內注射和腹腔注射或吸入霧狀制劑。
31.權利要求28的方法，其中所說的高尿酸水平與選自痛風、結節瘤、腎功能不全、器官移植和惡性疾病的疾病相關。
32.權利要求28的方法，其中PEG是線形的。
33.權利要求28的方法，其中PEG是有分支的。
34.一種從尿酸氧化酶溶液中分離四聚體尿酸氧化酶的方法，所說的溶液包含四聚體尿酸氧化酶和尿酸氧化酶凝集物，包括步驟將所說的溶液加到至少一個分離柱上，分離柱的pH介于9-10.5；從所說的柱子上收集一份或多份的洗脫級分，級分含有分離的四聚體尿酸氧化酶，其中所說一份或多份的級分基本不含尿酸氧化酶凝集物。
35.權利要求34的方法，其中所說的尿酸氧化酶的溶液被加到所說的pH為10.2的柱子上。
36.權利要求34的方法，其中所說的分離是以選自離子交換和大小排阻的特性為基礎的。
37.權利要求34的方法，還包括分析所說級分的步驟以便確定從由所說四聚體尿酸氧化酶的存在和尿酸氧化酶凝集物的缺乏而帶來的特性所組成的組中選出的至少一種特性。
38.權利要求37的方法，其中分析步驟包括選自層析、離心、光散射和電泳中的至少一種。
39.權利要求38的方法，其中所說的層析法是高效液體層析法。
40.權利要求34的方法，其中所說的分離出的四聚體尿酸氧化酶含有少于約10％的尿酸氧化酶凝集物。
41.由權利要求34的方法分離得到的四聚體尿酸氧化酶。
全文摘要
和聚乙二醇或聚環氧乙烷(都稱為PEG)共價偶聯的天然或重組的尿酸氧化酶(尿酸酶),其中每個尿酸氧化酶亞基平均結合2－10條鏈的PEG并且PEG的平均分子量為大約5－100KD。得到的PEG－尿酸酶結合物基本上是非免疫原性的,并保留未修飾酶大約75%的尿酸分解活性。
文檔編號C12N9/02GK1322141SQ99811845
公開日2001年11月14日 申請日期1999年8月2日 優先權日1998年8月6日
發明者L·D·威廉斯, M·S·赫爾斯菲爾德, S·J·凱利, M·G·P·塞菲爾, M·R·舍爾曼 申請人:山景藥品公司, 杜克大學