含有可擴散的或不可濾出的氧化還原介質的小容積體外分析傳感器的制作方法

專利名稱：含有可擴散的或不可濾出的氧化還原介質的小容積體外分析傳感器的制作方法
技術領域：
本發明涉及用于檢測小體積樣品中生物分析物的分析傳感器。
背景技術：
分析傳感器在化學和醫學中可用于測定生物分析物的存在和濃度。例如，監測糖尿病患者的葡萄糖和在重癥護理期間監測乳酸需要這些傳感器。
現有的技術測定相對較大樣品體積的生物分析物，例如，通常需要3微升或更多的血液或其他生物流體。這些液體樣品從患者中獲得，例如，使用針頭和注射器，或刺破一部分皮膚如指尖并“擠”該區域而獲得有用的樣品體積。這些方法對于患者是不便的，且常常是痛苦的，特別是當頻繁需要樣品時。已知有較少痛苦的獲得樣品的方法，如刺破臂或大腿，它們有較低的神經末梢密度。但是，刺破優選區域的身體一般只得到亞微升的血樣，因為這些區域并不富含近表面毛細血管。
因此，十分希望發展一種相對無痛苦、易于使用的，能對小體積樣品中分析物濃度進行精確且敏感的分析的血液分析傳感器，并且是非常有用的。能電化學測定樣品中分析物的傳感器在本領域中已知。本領域所知的某些傳感器至少使用兩個電極，并可含有一種氧化還原介質以利于電化學反應。然而，電化學傳感器測定小體積中分析物的應用給測定中引入了誤差。一種類型的不準確性起因于可擴散的氧化還原介質的使用。因為在小容積傳感器中電極如此靠近，所以可擴散的氧化還原介質可在工作電極與對電極之間穿梭，并增加至分析物測定信號。小容積傳感器中不準確性的另一來源是測定小樣品的體積或確定樣品室是否充滿的困難。因此，希望發展一種能降低由傳感器和樣品大小引起的誤差的小容積電化學傳感器。
發明概述本發明的傳感器提供一種檢測并定量亞微升樣品中分析物的方法。通常，本發明包括通過如庫侖分析法、電流分析法和/或電勢分析法分析小體積樣品中的分析物的方法和傳感器。本發明的傳感器使用一種不可濾出的或可擴散的氧化還原介質。該傳感器也包括一個容納樣品使之與工作電極電解接觸的樣品室。在許多情況中，該傳感器也含有不可濾出的或可擴散的第二種電子轉移劑。
在一個優選的實施方案中，工作電極面對一個對電極，在兩個電極之間在樣品室內形成一個測定區，其大小可含有不超過約1μL的樣品，優選地不超過約0.5μL，更優選地不超過約0.25μL，最優選地不超過約0.1μL的樣品。在樣品室和測定區中任選地含有一種吸附劑，以減少充滿樣品室和測定區所需的樣品體積。
在本發明的一個實施方案中，提供了一種生物傳感器，其將庫侖分析電化學傳感與一種不可濾出的或可擴散的氧化還原介質相結合，以精確并有效地測定亞微升體積樣品中的生物分析物。優選的傳感器包括電極、電極上的不可濾出的或可擴散的氧化還原介質、用于容納樣品使之與電極電接觸的樣品室，和優選地，用于減小樣品室容積的置于樣品室內的吸附劑。含有任何吸附劑的樣品室的大小適于一般不超過約1μL，優選地不超過約0.5μL，更優選地不超過約0.25μL，最優選地不超過約0.1μL的樣品體積的分析。在某些情況中，該傳感器也含有不可濾出的或可擴散的第二種電子轉移劑。
本發明的一個實施方案包括一種測定樣品中分析物濃度的方法，首先，使樣品接觸電化學傳感器，然后測定分析物的濃度。電化學傳感器包括一個由工作電極和對電極組成的面對面電極對和一個位于兩個電極之間的樣品室，包括一個測定區。測定區的大小可含有不超過約1μL的樣品。
本發明也包括一種具有兩個或更多面對面電極對的電化學傳感器。每一電極對包括一個工作電極、一個對電極和位于兩個電極之間的測定區，該測定區的大小可容納不超過約1μL的樣品。另外，該傳感器也包括位于至少一個電極對的工作電極上的一種不可濾出的氧化還原介質，或位于樣品室表面上或樣品中的一種可擴散的氧化還原介質。
本發明的一個方面是一種測定樣品中分析物濃度的方法，包括使該樣品與電化學傳感器接觸，并用庫侖法測定分析物的濃度。電化學傳感器包括一個由工作電極和對電極組成的電極對。該傳感器也包括一個容納樣品使之與工作電極電解接觸的樣品室。樣品室內含有吸附劑，以減少充滿樣品室所需的樣品體積，以使樣品室的大小可含有不超過約1μL的樣品。樣品室也含有一種不可濾出的或可擴散的氧化還原介質，并任選地含有不可濾出的或可擴散的第二種電子轉移劑。
傳感器也可包含一個充滿指示器，如一個指示電極或第二個電極對，它們能確定測定區或樣品室何時充滿。指示電極或第二種電極對也可用來提高分析物濃度測定的精確性。傳感器也可包括一種加熱元件，用于加熱測定區或樣品室，以提高分析物的氧化或還原速度。
傳感器能為側面填充或頂部填充構造。另外，在某些實施方案中，傳感器可以是整合型樣品獲取和分析物測定裝置的一部分。整合型樣品獲取和分析物測定裝置可包括傳感器和皮膚穿刺構件，使該裝置能用來刺破使用者的皮膚，使流體樣品如血液流出，然后能用傳感器收集。至少在某些實施方案中，能在不移動整合型樣品獲取和分析物測定裝置的情況下收集流體樣品。
一種制成如上所述的傳感器的方法包括在第一個基底(substrate)上形成至少一個工作電極，并在第二個基底上形成至少一個對電極或對/參比電極。在第一個或第二個基底上放置間隔層。該間隔層界定了一個溝槽，當傳感器充滿時樣品能進入并容納于該溝槽中。一種氧化還原介質和/或第二種電子轉移劑被置于第一個或第二個基底上的當傳感器充滿時將暴露于該溝槽內的區域中。然后將第一個和第二個基底集合在一起，并用帶有溝槽的間隔層隔開，使得可接近至少一個工作電極和至少一個對電極或對/參比電極。在某些實施方案中，第一個和第二個基底是單片或連續網狀材料的一部分。
在附加的權利要求書中詳細說明了表征本發明的這些及其他多種特征。為了更好地理解本發明、其優點和應用它獲得的目標，應參考附圖及其說明，其中說明并描述了本發明優選的實施方案。
附圖簡述現在參照附圖，其中參照數字和字母在幾個視圖中表示相應的結構

圖1是根據本發明原理的電化學傳感器的第一個實施方案的示意圖，其具有彼此面對的一個工作電極和一個對電極；圖2是根據本發明原理的電化學傳感器的第二個實施方案的示意圖，其在共面結構中具有一個工作電極和一個對電極；圖3是根據本發明原理的電化學傳感器的第三個實施方案的示意圖，其具有彼此面對的一個工作電極和一個對電極，并具有一個擴大的樣品室；圖4是圖1或圖3的傳感器之一部分的不按比例的側剖面圖，顯示氧化還原介質、樣品室和電極的相對位置；圖5是根據本發明原理的電化學傳感器的第四個實施方案的俯視圖，該傳感器包括多個工作電極；圖6是根據本發明原理的分析物測定裝置的一個實施方案的透視圖，其具有一個樣品獲取裝置和圖4的傳感器；圖7是用葡萄糖氧化酶作為第二種電子轉移劑，用圖1的傳感器在電解質緩沖溶液(實心圓形)或血清溶液(空心圓形)中電氧化已知量的葡萄糖所需電荷的圖；圖8是圖7數據(只是緩沖溶液)的平均葡萄糖濃度的圖，帶有計算的校正曲線以擬合該平均值；對10-20mM濃度計算線性校正曲線，而對0-10mM濃度計算二階多項式校正曲線；圖9是分析圖7的葡萄糖量值的臨床相關性的克拉克型臨床柵格；圖10是用葡萄糖脫氫酶作為第二種電子轉移劑，用圖1的傳感器在電解質緩沖溶液中電氧化已知量的葡萄糖所需電荷的圖11A、11B和11C是根據本發明的交疊工作電極和對電極的三種構造的俯視圖；圖12A和12B是根據本發明用基層(base)材料凹槽構成的電極對的一個實施方案的橫斷面視圖；圖13A和13B是在基層材料凹槽中形成的本發明的電極對的另一個實施方案的橫斷面視圖；圖14A和14B是用基層材料凹槽和吸附劑構成的本發明的電極對的另一個實施方案的橫斷面視圖；圖15是對于幾種葡萄糖濃度，含有一種可擴散氧化還原介質的傳感器隨時間變化而釋放的電荷的圖；圖16是對于幾種葡萄糖濃度，含有一種可擴散氧化還原介質的傳感器所釋放的電荷的圖；圖17是含有不同量的可擴散氧化還原介質的傳感器隨時間變化而釋放的電荷的圖；圖18A顯示在根據本發明的傳感器的第五個實施方案中使用的具有工作電極的第一種膜的俯視圖；圖18B顯示將放置于圖18A的第一種膜上的間隔層的俯視圖；圖18C顯示將放置于圖18B的間隔層和圖18A的第一種膜上，具有對電極的第二種膜的底視圖(相對于圖18A和18B翻轉)；圖19A顯示在根據本發明的傳感器的第六個實施方案中使用的具有工作電極的第一種膜的俯視圖；圖19B顯示將放置于圖19A的第一種膜上的間隔層的俯視圖；圖19C顯示將放置于圖19B的間隔層和圖19A的第一種膜上，具有對電極的第二種膜的底視圖(相對于圖19A和19B翻轉)；圖20A顯示在根據本發明的傳感器的第七個實施方案中使用的具有工作電極的第一種膜的俯視圖；圖20B顯示將放置于圖20A的第一種膜上的間隔層的俯視圖；圖20C顯示將放置于圖20B的間隔層和圖20A的第一種膜上，具有對電極的第二種膜的底視圖(相對于圖20A和20B翻轉)；
圖21A顯示在根據本發明的傳感器的第八個實施方案中使用的具有工作電極的第一種膜的俯視圖；圖21B顯示將放置于圖21A的第一種膜上的間隔層的俯視圖；圖21C顯示將放置于圖21B的間隔層和圖21A的第一種膜上，具有對電極的第二種膜的底視圖(相對于圖21A和21B翻轉)；圖22A顯示在根據本發明的傳感器的第九個實施方案中使用的具有工作電極的第一種膜的俯視圖；圖22B顯示將放置于圖22A的第一種膜上的間隔層的俯視圖；圖22C顯示將放置于圖22B的間隔層和圖22A的第一種膜上，具有對電極的第二種膜的底視圖(相對于圖22A和22B翻轉)；圖23A顯示在根據本發明的傳感器的第十個實施方案中使用的具有工作電極的第一種膜的俯視圖；圖23B顯示將放置于圖23A的第一種膜上的間隔層的俯視圖；圖23C顯示將放置于圖23B的間隔層和圖23A的第一種膜上，具有對電極的第二種膜的底視圖(相對于圖23A和23B翻轉)；圖24A顯示在根據本發明的傳感器的第十一個實施方案中使用的具有工作電極的第一種膜的俯視圖；圖24B顯示將放置于圖24A的第一種膜上的間隔層的俯視圖；圖24C顯示將放置于圖24B的間隔層和圖24A的第一種膜上，具有對電極的第二種膜的底視圖(相對于圖24A和24B翻轉)；圖25顯示根據本發明的電化學傳感器的第十二個實施方案的俯視圖；圖26顯示一種整合型分析物獲取和傳感器裝置的一個實施方案的透視圖；圖27顯示根據本發明的傳感器的第十三個實施方案的橫斷面視圖；圖28顯示用本發明的傳感器對采自患者上臂的血樣中分析物濃度進行的測定與標準血試驗法測定相比較的圖；圖29顯示用本發明的傳感器對采自患者手指的血樣中分析物濃度進行的測定與標準血試驗法測定相比較的圖30顯示用本發明的傳感器對靜脈樣品中分析物濃度進行的測定與標準血試驗法測定相比較的圖；圖31A顯示根據本發明的一片傳感器組件的一個實施方案的俯視圖；圖31B顯示根據本發明的一片傳感器組件的另一個實施方案的俯視圖；圖32顯示從儀表內部向置于該儀表中的本發明的傳感器看去的橫斷面視圖；優選實施方案詳述當在此使用時，下列定義說明規定的術語“可空氣氧化的介質”是一種可被空氣氧化的氧化還原介質，優選地使得在空氣中作為固體或作為液體貯存一定時間后，例如，一個月或更短，優選地一周或更短，更優選地一天或更短，至少90％的介質成為氧化態。
“電流分析法”包括穩態電流分析法、計時電流法和科特雷耳型測定。
“生物流體”是能檢測其中的分析物的任何體液，例如血液、組織液、皮膚液、汗和淚。
本發明說明書中的術語“血液”包括全血及其無細胞成份，如血漿和血清。
“庫侖分析法”是在分析物完全或幾乎完全電解過程中，直接在電極上或通過一種或多種電子轉移劑傳遞或預計傳遞的電荷的測定。電荷的測定方法包括，對分析物部分或幾乎完全電解過程中傳遞的電荷的測定，或更常用的是，在電解過程中對衰減電流和實耗時間的多種測定。衰減電流是由電解引起的電解物種濃度的降低引起的。
“對電極”是指與工作電極配對的一個或多個電極，其中通過與通過工作電極的電流數值相同且符號相反的電化學電流。除非說明中指出“對電極”不包括參比電極或對/參比電極，否則術語“對電極”包括也起參比電極作用的對電極(即對/參比電極)。
“有效擴散系數”是表征物質如分析物、酶或氧化還原介質在電化學測定池電極之間的體積中運輸的擴散系數。至少在某些情況中，測定池體積可被多于一種的介質(如樣品液和聚合物膜)占據。物質通過每種介質的擴散可以不同的速率發生。有效擴散系數對應于通過這種多介質體積的擴散速率，并且一般不同于只充滿樣品液的測定池中物質的擴散系數。
“電化學傳感器”是一種用來通過電化學氧化和還原反應檢測分析物的存在和/或測定分析物濃度的裝置。這些反應轉化為可與分析物的量或濃度相關的電信號。
“電解”是化合物直接在電極處或通過一種或多種電子轉移劑(例如氧化還原介質和/或酶)的電氧化或電還原。
術語“面對面電極”是指工作電極與對電極的一種構造，其中工作電極的工作表面與對電極的表面基本相對。至少在某些情況中，工作電極與對電極之間的距離短于工作電極的工作表面的寬度。
當一種化合物被截留于表面上或與之化學結合時，其“固定”于該表面。
“指示電極”包括一個或多個檢測樣品室和/或測定區部分或完全充滿的電極。
“層”包括一個或多個層。
“測定區”在此定義為樣品室的一個區域，其大小只可含有分析物測定過程中待檢的樣品部分。
“不可擴散的”、“不可濾出的”或“不可釋放的”化合物是在分析物測定期間基本上不能從工作電極的工作表面擴散出去的化合物。
“對/參比電極的電勢”是當測定池中的溶液為pH7的0.1M NaCl溶液時，測定池的參比電極或對/參比電極的半電池電勢。
“電勢分析法”和“計時電勢法”是指在一個或多個時間點進行電勢測定。
“氧化還原介質”是在分析物和工作電極之間直接或通過第二種電子轉移劑運送電子的電子轉移劑。
除非說明中提出“參比電極”不包括對/參比電極，否則“參比電極”包括也起對電極作用的參比電極(即，對/參比電極)。
“第二種電子轉移劑”是在氧化還原介質和分析物之間運送電子的分子。
“吸附劑”是毛細作用吸收、保留液體樣品和/或被其濕潤的材料，其一般不能防止分析物向電極的擴散。
“樣品室表面”包括工作電極、對電極、對/參比電極、參比電極、指示電極、間隔區的表面，或圍成樣品室的其他任何表面。
“工作電極”是在或不在氧化還原介質的作用下分析物在該處電氧化或電還原的電極。
“工作表面”是覆蓋不可濾出的氧化還原介質并暴露于樣品的工作電極的部分，或者，如果氧化還原介質是可擴散的，“工作表面”是暴露于樣品的工作電極的部分。
本發明的小容積體外分析傳感器用來測定體積不超過約1μL，優選地不超過約0.5μL，更優選地不超過0.25μL，最優選地不超過0.1μL的樣品部分中分析物的濃度。目標分析物一般存在于溶液或生物流體如血液或血清中。參照附圖特別是圖1-4，本發明的小容積體外電化學傳感器20通常包括一個工作電極22、一個對(或對/參比)電極24和一個樣品室26(見圖4)。樣品室26的構造使得當樣品在樣品室中時樣品與工作電極22和對電極24均電解接觸。這使電流可在電極之間流動，從而實現分析物的電解(電氧化或電還原)。工作電極工作電極22可由模制的碳纖維復合材料制成，或者可由惰性絕緣基層材料如聚酯構成，其上放置適當的導電層。操作中在傳感器的電勢范圍內，導電層一般具有相對較低的電阻，并且一般是電化學惰性的。合適的導電層包括金、碳、鉑、二氧化釕、鈀，和導電的環氧類，如ECCOCOATCT5079-3填充碳的導電環氧涂層(可獲自W.R.Grace公司，Woburn，Massachusetts)，以及本領域技術人員所知的其他非腐蝕性材料。通過如蒸汽淀積或印刷的方法將電極(例如導電層)置于惰性材料的表面。
接頭23可位于工作電極22末端，以使電極與外部電子設備(未顯示)如電壓電源或電流測定裝置容易地連接。也可用其他已知的方法或結構(如接觸墊)連接工作電極22與外部電子設備。
為防止在未覆蓋介質的工作電極部分上發生電化學反應，當使用不可濾出的介質時，介電體40可置于電極上含氧化還原介質區域的上方、下方或周圍，如圖4所示。合適的介電材料包括蠟和絕緣的有機聚合物如聚乙烯。介電體40也可覆蓋電極上的一部分氧化還原介質。覆蓋的氧化還原介質部分將不接觸樣品，因此不是電極工作表面的一部分。傳感化學除了工作電極22之外，為了分析分析物在樣品室26中還應具有傳感化學材料。該傳感化學優選地包括一種氧化還原介質和第二種電子轉移介質，盡管在某些情況中，可單獨使用一種或另一種。氧化還原介質和第二種電子轉移劑可能獨立地是可擴散的或不可濾出的(即不可擴散的)，使得其一或兩者可以是可擴散的或不可濾出的。傳感化學成份的放置可取決于它們是可擴散的還是不可濾出的。例如，不可濾出的和/或可擴散的成份一般在工作電極上形成一個傳感層。此外，也可在加入樣品之前將一種或多種可擴散的成份置于樣品室的任一表面上。作為另一個實例，可在向傳感器中加入樣品之前將一種或多種可擴散的成份置于樣品中。
如果氧化還原介質是不可濾出的，則不可濾出的氧化還原介質一般置于工作電極22上作為傳感層32。在一個含有氧化還原介質和第二種電子轉移劑的實施方案中，如果該氧化還原介質和第二種電子轉移劑都是不可濾出的，則兩種不可濾出的成份都置于工作電極22上作為傳感層32。
例如，如果第二種電子轉移劑是可擴散的而氧化還原介質是不可濾出的，則至少將該氧化還原介質置于工作電極22上作為傳感層32。可擴散的第二種電子轉移劑不需要置于工作電極的傳感層上，但可置于樣品室的任一表面上，包括氧化還原介質傳感層內，或可置于樣品中。如果氧化還原介質是可擴散的，則該氧化還原介質可置于樣品室的任一表面上，或可置于樣品中。
如果氧化還原介質和第二種電子轉移劑都是可擴散的，則可擴散成份可獨立地或共同地置于樣品室的任一表面上，和/或置于樣品中(即，每種可擴散成份不需要置于樣品室的同一表面上或置于樣品中)。
氧化還原介質，不論是可擴散的還是不可濾出的，均可調節工作電極22與分析物之間的電流，并能電化學分析可能不適于在電極上直接電化學反應的分子。該介質作為電極與分析物之間的電子轉移劑起作用。
在一個實施方案中，氧化還原介質和第二種電子轉移劑都是可擴散的，并置于樣品室的同一表面如工作電極上。在這相同的裝置中，兩者都可置于例如對電極、對/參比電極、參比電極或指示電極上。在其他情況中，氧化還原介質和第二種電子轉移劑都是可擴散的，并獨立地置于樣品室的表面上和/或樣品中。例如，氧化還原介質可置于工作電極上，而第二種電子轉移劑置于除工作電極之外的任一表面上，或置于樣品中。類似地，相反情況也是一個合適的實施方案，其中第二種電子轉移劑置于工作電極上，而氧化還原介質置于除工作電極之外的任一表面上，或置于樣品中。作為另一個實例，氧化還原介質可置于對電極上，而第二種電子轉移劑置于除對電極之外的任一表面上，或置于樣品中。相反的情況也是合適的。
可擴散的氧化還原介質和/或第二種電子轉移劑可快速擴散到樣品中或可在一段時間內發生擴散。類似地，可擴散的氧化還原介質和/或第二種電子轉移劑可作為固體首先從所處的表面上溶解，然后可擴散的氧化還原介質和/或第二種電子轉移劑可快速地或經過一段時間擴散到樣品中。如果氧化還原介質和/或第二種電子轉移劑擴散需經歷一段時間，使用者可能被要求在測定分析物濃度之前等待一段時間，以使氧化還原介質和/或第二種電子轉移劑擴散。
本底信號至少在某些情況中，可擴散的氧化還原介質甚至在無分析物時仍可在工作電極與對電極之間往復穿梭。這一般產生本底信號。對于庫侖分析測定，該本底信號在此被稱為“QBack”。該本底信號對應于不含分析物時電化學測定中傳遞的電荷。本底信號一般包括瞬時成份和穩態成份。例如，至少一部分瞬時成份由于特定氧化態的介質濃度梯度的建立而產生。例如，至少一部分穩態成份可由在工作電極和對電極或對/參比電極之間穿梭的氧化還原介質產生。穿梭是指氧化還原介質在工作電極處被電氧化(或電還原)，然后在對電極或對/參比電極處被電還原(或電氧化)，從而使該氧化還原介質可在工作電極處再次電氧化(或電還原)，使得氧化還原介質在電氧化與電還原之間循環。
氧化還原介質穿梭的量，及本底信號的穩態成份隨下列條件而不同，例如氧化還原介質的有效擴散系數、樣品粘度、樣品溫度、電化學測定池的尺寸、工作電極與對電極或對/參比電極之間的距離和工作電極與對電極或對/參比電極之間的角度。
在某些情況中，本底信號的穩態成份可包含與下列條件有關的噪音(a)例如，樣品溫度、樣品粘度或本底信號所依賴的其他任何參數在測定期間的變異性，(b)電化學測定池的缺陷，例如，工作電極與對電極或對/參比電極的不均勻的間距、電極幾何形狀的變化，或工作電極、對電極和/或對/參比電極的突起。
盡管本底信號的穩態成份可以是可重復的，但任何噪音固然是不可重復的。所以，噪音對準確性有不利影響。在某些情況中，本底信號和噪音是相關的。因此，降低本底信號能降低噪音和它引起的誤差。例如，降低介質在工作電極與對電極或對/參比電極之間的穿梭可能將降低與可影響氧化還原介質擴散的樣品溫度和粘度改變有關的噪音。
因此，為了在降低本底信號時也降低噪音的情況中提高測定的準確性或降低測定誤差，中等到近零水平的本底信號是希望的。至少在某些情況中，傳感器構造為使本底信號至多5倍于一定量分析物電解產生的信號大小。優選地，本底信號至多為分析物電解所產生的信號的200％、100％、50％、25％、10％或5％。在電流分析法中，可通過測定氧化還原介質穿梭產生的電流與分析物電解產生的電流之比進行這種比較。在電勢分析法中，可通過測定氧化還原介質穿梭的電勢值和分析物電解產生的電勢值進行這種比較。在庫侖分析法中，可通過測定氧化還原介質穿梭在工作電極處轉移的電荷和分析物電解在工作電極處轉移的電荷進行這種比較。
本底信號的大小可與分析物的預定量相比。例如，樣品中分析物的預定量可以是分析物的預期或平均摩爾量。分析物的預期或平均摩爾量可測定為例如，使用者或個體的平均值；群體的平均值；正常生理范圍的最大、最小或平均值；群體的最大或最小生理值；使用者或個體的最大或最小生理值；使用者、個體或群體的正常生理范圍值之外的平均、最大或最小偏差；群體平均值之上或之下的偏差；或使用者或個體的平均正常生理值之上或之下的平均、最大或最小偏差。群體可按例如健康狀況、性別或年齡確定，如正常成人、兒童或新生兒群體。如果群體按健康狀況確定，則群體可包括缺乏特定病癥或具有特定病癥如糖尿病的人群。適合平均值或預期值的參考區間，如《Tietz臨床化學教科書》，附錄(2175-2217頁)(第二版，Carl A.Burtis和Edward R.Ashwood編，W.D.Saunders Co.，Philadelphia 1994)(在此引用作為參考)中所述的，可作為指標，但也可由醫生通過身體檢查或血液化學檢驗確定個體的平均值或預期值。例如，根據《Tietz臨床化學教科書》，成人禁食后在全血中可含有濃度為65-95mg/dL的葡萄糖，在靜脈全血中含有濃度為8.1-15.3mg/dL的L-乳酸。例如，成人的平均正常生理濃度可對應于80mg/dL的葡萄糖或12.7mg/dL的乳酸。其他實例包括患有幼年發作型糖尿病，但血糖控制較好，葡萄糖濃度為約50mg/dL～400mg/dL，因而平均摩爾量為225mg/dL的病人。在另一種情況中，非糖尿病成人可有約80mg/dL(禁食后)～140mg/dL(進食后)的葡萄糖濃度，從而有110mg/dL的平均摩爾量。
可測定的其他分析物包括，例如，乙酰膽堿、淀粉酶、膽紅素、膽甾醇、絨毛膜促性腺激素、肌酸激酶(例如CK-MB)、肌酸、DNA、果糖胺、葡萄糖、谷氨酰胺、生長激素、激素、酮類、乳酸、過氧化物、前列腺特異的抗原、凝血酶原、RNA、甲狀腺刺激激素和肌鈣蛋白。也可測定藥物如抗生素(例如慶大霉素、萬古霉素等)、毛地黃毒苷、地高辛、濫用的藥物、茶堿和華法令的濃度。在美國專利申請系列號09/138,888和09/145,776中公開并在美國臨時申請系列號60/090,517、60/093,100和60/114,919中敘述了適于測定DNA和/或RNA濃度的試驗，以此引用作為參考。
為了構建具有本底信號與分析物電解信號特定比值的傳感器，可考慮并選擇與氧化還原介質穿梭本底信號和/或分析電解產生的信號引起的電流和/或電荷有關的幾個參數，以獲得希望的比值。一般而言，對于庫侖分析法測定的信號是電荷；而對于電流分析法測定的信號是進行測定時的電流。因為電流和電荷取決于幾個參數，所以可用多種傳感器構造和操作傳感器的方法達到希望的氧化還原介質穿梭產生的本底信號與分析物電解產生的信號之比。
控制本底信號一種控制本底信號的方法包括使用一種氧化還原介質，該介質可a)如用循環伏安法在pH7的0.1M NaCl中測定的，以相對于參比或對/參比電極的電位不高于約+100mV的半波電位氧化分析物，或b)如用循環伏安法在pH7的0.1M NaCl中測定的，以相對于參比或對/參比電極的電位不低于約-100mV的半波電位還原分析物。可選用合適的參比或對/參比電極(例如銀/氯化銀電極)。優選地，氧化還原介質可a)如用循環伏安法在pH7的0.1M NaCl中測定的，以相對于參比或對/參比電極電位不高于約+50mV、+25mV、0mV、-25mV、-50mV、-100mV或-150mV的半波電位氧化分析物，或b)如用循環伏安法在pH7的0.1M NaCl中測定的，以相對于參比或對/參比電極電位不低于約-50mV、-25mV、0mV、+25mV、+50mV、+100mV、+150mV或+200mV的半波電位還原分析物。此外，在對電極對氧化還原介質的還原中，在工作電極與對電極或對/參比電極之間施加不高于約+100mV、+50mV、+25mV、0mV、-25mV、-50mV、-100mV或-150mV的電勢下操作傳感器。對于氧化還原介質在對電極處的氧化，在工作電極與對電極或對/參比電極之間施加不低于約-100mV、-50mV、-25mV、0mV、+25mV、+50mV、+100mV、+150mV或+200mV的電勢下操作傳感器。
另一種方法包括控制施加的電勢，使得對于電氧化測定，氧化還原介質在對電極或對/參比電極處不易還原，或對于電還原測定，氧化還原介質在對電極或/對/參比電極處不易氧化。其實現方法可以是，例如，在電氧化測定中使用含有可擴散的氧化還原介質的傳感器，相對于參比或對/參比電極的電勢與對電極(相對于參比電極)或對/參比電極的電勢相比為負。選擇工作電極(相對于參比或對/參比電極)的電勢為相對于氧化還原介質為正，并可相對于對電極或對/參比電極為負，使得氧化還原介質在工作電極處氧化。例如，當一種可擴散的氧化還原介質在相對于參比或對/參比電極為-200mV的電勢下介導分析物的電氧化，并且工作電極平衡時的電勢相對于參比或對/參比電極為-150mV時，該氧化還原介質在工作電極處基本上被氧化，并將氧化分析物。進而，如果某些氧化的氧化還原介質到達對電極或對/參比電極處，該氧化還原介質不易在對電極或對/參比電極處還原，因為對電極或對/參比電極被充分平衡，相對于氧化還原介質電勢為正(即150mV)。
在電還原測定中，使用一種含有可擴散的氧化還原介質的傳感器，其相對于參比或對/參比電極的表觀電位與對電極或對/參比電極的電勢相比為正。相對于參比或對/參比電極的工作電極電勢選擇為相對于氧化還原介質為負，并可平衡為相對于對電極或對/參比電極為正的，使得氧化還原介質在工作電極處氧化。
再另一種限制本底電流的方法包括當在對電極或對/參比電極上反應時用例如沉淀或聚合作用固定氧化還原介質。例如，該介質在氧化態時可以是陽離子，但在還原態時為中性且溶解度更低。在對/參比電極處的還原導致還原的中性介質在對/參比電極上的沉淀。
適用于控制本底信號的另一種傳感器構造包括一種含有一定摩爾量的氧化還原介質的傳感器，該介質在化學計量上等同于或低于分析物的預期或平均摩爾量。分析物的預期或平均摩爾量可如上所述測定。分析物的預期或平均摩爾量可測定為，例如，使用者或個體的平均值；群體的平均值；正常生理范圍的最大、最小或平均值；群體的最大或最小生理值；使用者或個體的最大或最小生理值；使用者、個體或群體的正常生理范圍值之外的平均、最大或最小偏差；群體平均值之上或之下的偏差；或使用者或個體的平均正常生理值之上或之下的平均、最大或最小偏差。例如，群體可按健康狀況、性別或年齡確定，如正常成人、兒童或新生兒群體。如果群體按健康狀況確定，則群體可包括缺乏特定病癥或具有特定病癥如糖尿病的人群。適于平均值或預期值的參考區間，如同上的《Tietz臨床化學教科書》中所述的，可作為指標，但身體檢查或血液化學檢驗也可確定平均值或預期值。例如，分析物的的生理平均摩爾量可取決于采取樣品的人的健康狀況或年齡。這種測定為醫生所了解。
通過降低氧化還原介質相對于分析物濃度的濃度，可歸因于分析物的信號相對于可歸因于氧化還原介質穿梭的信號而言提高了。為實現該方法，氧化還原介質的摩爾量在化學計量基礎上可不高于分析物的預期或平均摩爾量的50％、20％、10％或5％。
在這種傳感器構造中使用的氧化還原介質的量應在范圍內。測定該范圍的上限可根據，例如，由氧化還原介質穿梭引起的可接受的最大信號；電化學測定池的設計，包括例如，測定池的尺寸和電極的位置；氧化還原介質的有效擴散系數；測定所需的時間長度。而且，由氧化還原介質穿梭引起的可接受的最大信號可隨測定法而不同，這歸因于一種或多種測定參數，例如，測定是定性的、半定量的還是定量的；分析物濃度的小差別是否作為改變治療的基礎；和分析物的預期濃度。
盡管使所用的氧化還原介質的量最小是有利的，但氧化還原介質的可接受的量的范圍一般具有下限。可使用的氧化還原介質的最小量是在希望的測定時間內，如不超過約5分鐘或不超過約1分鐘內完成測定所需的氧化還原介質濃度。完成測定所需的時間取決于，例如，工作電極與對電極或對/參比電極之間的距離、氧化還原介質的有效擴散系數和分析物的濃度。例如在某些情況中，當不存在動力學限制時，即氧化還原介質的穿梭僅依賴于擴散時，氧化還原介質的最小濃度可用下列公式確定Cm＝(d2CA)/Dmt其中，Cm是所需介質的最小濃度；d是面對面排列的工作電極與對電極或對/參比電極之間的距離；CA是樣品中的平均分析物濃度；Dm是樣品中介質的有效擴散系數；t是希望的測定時間。
例如，當面對面電極對之間的距離為50μm，待測分析物是5mM葡萄糖，氧化還原介質的有效擴散系數是10-6cm2/sec，希望的響應時間不超過約1分鐘時，最小氧化還原介質濃度為2.08mM。在這些條件下，本底信號將低于分析物電氧化產生的信號。
限制可擴散的氧化還原介質產生的本底電流的另一種傳感器構造包括一個防止可擴散的介質向對電極流動的阻擋層。該阻擋層可以是，例如，氧化還原介質不能通過它擴散或氧化還原介質通過它緩慢擴散的薄膜。合適的薄膜的實例包括聚碳酸酯、聚乙烯醇和再生的纖維素或纖維素酯膜。另外，阻擋層也可包括帶電的或極性顆粒、化合物或官能團，其防止或減少帶電的氧化還原介質相對于電荷中性或弱荷電分析物流動的流動。如果氧化還原介質帶正電，如以下所述的多種鋨氧化還原介質，則阻擋層可以是帶正電的或極性的薄膜，如甲基化的聚(1-乙烯基咪唑)。如果氧化還原介質帶負電，則阻擋層可以是帶負電的或極性的薄膜，如Nafion_。合適的極性基質的實例包括雙極性膜—含有與陰離子聚合物交聯的陽離子聚合物的膜，等等。在某些情況中，阻擋層使可擴散的氧化還原介質在對電極處的氧化或還原降低了至少25％、50％或90％。
限制本底電流的另一種傳感器構造包括一種含有氧化還原介質的傳感器，該介質在工作電極上比在對電極上更易氧化或還原。氧化還原介質在電極處的反應速率可以為電極材料的函數。例如，某些氧化還原介質在碳電極處可比在Ag/AgCl電極處反應更快。電極的適當選擇可使一個電極處的反應速率明顯低于另一個電極處的速率。在某些情況中，可擴散的氧化還原介質在對電極處的氧化或還原速率比在工作電極處降低至少25％、50％或90％。在某些情況中，氧化還原介質在對電極或對/參比電極處的反應速率受控于，例如，為需要超電勢或比外加電勢更高的電勢的對電極或對/參比電極選擇材料，以提高對電極或對/參比電極處的反應速率。
限制本底電流的另一種傳感器構造包括適于降低氧化還原介質擴散的成份。例如，使用一種具有相對較低的擴散系數的氧化還原介質或提高測定區中樣品的粘度能降低擴散。在另一個實施方案中，選用具有高分子量如大于5000道爾頓，優選地大于25000道爾頓，更優選地大于100000道爾頓的氧化還原介質可降低氧化還原介質的擴散。氧化還原介質盡管能用任何有機或有機金屬氧化還原物質種類作為氧化還原介質，但一種合適的氧化還原介質是過渡金屬化合物或絡合物。適合的過渡金屬化合物或絡合物的實例包括鋨、釕、鐵和鈷化合物或絡合物。在這些絡合物中，過渡金屬與一個或多個配體配位結合。這些配體一般是單齒、二齒、三齒或四齒的。最優選的配體是雜環氮化合物，如吡啶和/或咪唑衍生物。多齒配體可包括多個吡啶和/或咪唑環。此外，也能使用金屬茂衍生物，如二茂鐵。
合適的氧化還原介質包括含有一個或多個配體的鋨或釕過渡金屬絡合物，每個配體都有一個或多個含氮雜環。這些配體的實例包括吡啶和咪唑環和含有兩個或多個吡啶和/或咪唑環的配體，如2，2’-聯吡啶、2，2’6’，2”-三聯吡啶、1，10-菲咯啉和具有下列結構的配體 及其衍生物，其中R1和R2各自獨立是氫、羥基、烷基、烷氧基、鏈烯基、乙烯基、烯丙基、酰氨基、氨基、乙烯基酮類、酮基或含硫基團。
術語“烷基”包括含有1-6個碳原子的直鏈或支鏈飽和脂族烴鏈，例如，甲基、乙基、異丙基(1-甲基乙基)、丁基、叔丁基(1，1-二甲基乙基)等。優選地，烴鏈含有1至3個碳原子。
術語“烷氧基”包括通過一個氧原子與該結構的其余部分連接的上述烷基，例如，甲氧基、乙氧基、丙氧基、異丙氧基(1-甲基乙氧基)、丁氧基、叔丁氧基等。
術語“鏈烯基”包括含2至6個碳原子的不飽和脂族烴鏈，例如，乙烯基、1-丙烯基、2-丙烯基、1-丁烯基、2-甲-1-丙烯基等。優選地，烴鏈含有2至3個碳原子。
術語“酰氨基”包括含有與羰基的碳原子鍵合的氮原子的基團，并包括具有下列通式的基團 其中R3和R4各自獨立地為氫、烷基、烷氧基或鏈烯基。
在此使用的術語“氨基”包括烷氨基，如甲氨基、二乙氨基、N，N-甲基乙氨基等；烷氧基烷氨基，如N-(乙氧基乙基)氨基、N，N-二(甲氧基乙基)氨基、N，N-(甲氧基乙基)(乙氧基乙基)氨基等；及含氮環，如哌啶子基、哌嗪基、嗎啡基等。
術語“乙烯基酮”包括具有下列通式的基團 其中R5、R6和R7各自獨立地是氫、烷基、烷氧基或鏈烯基。
術語“酮”包括具有下列通式的基團 其中R8是氫、烷基、烷氧基或鏈烯基。
術語“含硫基團”包括巰基、烷基巰基(如甲基巰基、乙基巰基等)、烷氧基烷基巰基(如甲氧基乙基巰基等)、烷基亞砜(如甲基亞砜和丙基亞砜等)、烷氧基烷基亞砜(如乙氧基乙基亞砜等)、烷基砜(如甲基砜、丙基砜等)，及烷氧基烷基砜(如甲氧基乙基砜等)。優選地，含硫基團是巰基。
其他適合的氧化還原介質包括具有一個或多個配體的鋨或釕過渡金屬絡合物，每個配體含有一個或多個含氮雜環，而每個含氮雜環含有選自氮、氧、硫和硒的第二個雜原子。
含有一個或多個含氮雜環且每個雜環含有第二個雜原子的配體的實例包括具有下列結構的配體 其中Y1、Y2、Y3和Y4各自獨立地是氧原子、硫原子、硒原子或具有通式NR9的取代氮原子，其中R9是氫、羥基、烷基、烷氧基、鏈烯基、酰氨基、氨基、乙烯基酮、酮基或含硫基團。術語“烷基”、“烷氧基”、“鏈烯基”、“酰氨基”、“氨基”、“乙烯基酮”、“酮基”和“含硫基團”如上定義。
這些配體的合適的衍生物包括，例如，向雜環的任何適當位點上添加烷基、烷氧基、鏈烯基、乙烯基酯和酰氨基官能團，這些位點包括，例如，吡啶環的4-位(即氮的對位)或咪唑環的氮原子之一。
可與鋨陽離子絡合的2，2’-聯吡啶的合適的衍生物包括，例如，單-、二-和聚烷基-2，2’-聯吡啶，如4，4’-二甲基-2，2’-聯吡啶；單-、二-和聚烷氧基-2，2’-聯吡啶，如4，4’-二甲氧基-2，2’-聯吡啶和2，6’-二甲氧基-2，2’-聯吡啶；單-、二-和聚乙酰氨基-2，2’-聯吡啶，如4，4’-二(乙酰氨基)-2，2’-聯吡啶；單-、二-、和聚烷基氨基烷氧基-2，2’-聯吡啶，如4，4’-二(N，N-二甲基氨基乙氧基)-2，2’-聯吡啶；和取代位的單-、二-和聚吡唑基-2，2’-聯吡啶，如4，4’-二甲氧基-6-(N-吡唑基)-2，2’-聯吡啶和4，4’-二甲氧基-6-(N-吡唑基甲基)-2，2’-聯吡啶。
可與鋨陽離子絡合的1，10-菲咯啉的合適的衍生物包括，例如，單-、二-和聚烷基-1，10-菲咯啉，如4，7-二甲基-1，10-菲咯啉，和單-、二-、聚烷氧基-1，10-菲咯啉，如4，7-二甲氧基-1，10-菲咯啉和5-甲氧基-1，10-菲咯啉。
2，2’6’，2”-三聯吡啶的合適的衍生物包括，例如，單-、二-、三-和聚烷基-2，2’6’，2”-三聯吡啶，如4，4’，4”-三甲基-2，2’6’，2”-三聯吡啶、4，4’，4”-三乙基-2，2’6’，2”-三聯吡啶；單-、二-、三-和聚烷氧基-2，2’6’，2”-三聯吡啶，如4，4’，4”-三甲氧基-2，2’6’，2”-三聯吡啶和4’-甲氧基-2，2’6’，2”-三聯吡啶；單-、二-、三-和聚氨基-2，2’6’，2”-三聯吡啶，如4’-氨基-2，2’6’，2”-三聯吡啶；單-、二-、三-和聚烷基氨基-2，2’6’，2”-三聯吡啶，如4’-二甲基氨基-2，2’6’，2”-三聯吡啶；單-、二-、三-和聚烷硫基-2，2’6’，2”-三聯吡啶，如4’-甲硫基-2，2’6’，2”-三聯吡啶和4-甲硫基-4’-乙硫基-2，2’6’，2”-三聯吡啶。
吡啶的合適的衍生物包括，例如單-、二-、三-和多取代吡啶，如2，6-雙(N-吡唑基)吡啶、2，6-雙(3-甲基-N-吡唑基)吡啶、2，6-雙(2-咪唑基)吡啶、2，6-雙(1-甲基-2-咪唑基)吡啶、2，6-雙(1-乙烯基-2-咪唑基)吡啶；單-、二-、三-和聚氨基吡啶，如4-氨基吡啶、4，4’-二氨基聯吡啶、4，4’-二(二甲基氨基)聯吡啶和4，4’，4”-三氨基三聯吡啶。
其他合適的衍生物包括含有三個雜環的化合物。例如，一種合適的衍生物包括具有下列通式的化合物 其中R10、R11、R12各自獨立地是氫、羥基、烷基、烷氧基、鏈烯基、乙烯基、烯丙基、酰氨基、氨基、乙烯基酮、酮基或含硫基團。
術語“烷基”、“烷氧基”、“鏈烯基”、“酰氨基”、“氨基”、“乙烯基酮”、“酮基”和“含硫基團”定義同上。
其他合適的氧化還原介質衍生物包括具有下列通式的化合物 其中R13是氫、羥基、烷基、烷氧基、鏈烯基、乙烯基、烯丙基、乙烯基酮、酮基、酰氨基、氨基或含硫基團；Y5和Y6各自獨立地是氮原子或碳原子。
術語“烷基”、“烷氧基”、“鏈烯基”、“酰氨基”、“氨基”、“乙烯基酮”、“酮基”和“含硫基團”定義同上。
其他合適的衍生物包括具有下列通式的化合物 其中R14如上所述，Y7和Y8各自獨立地是硫原子或氧原子。
合適的氧化還原介質的實例也包括，例如，與下列配體絡合的鋨陽離子(a)兩個二齒配體，如2，2’-聯吡啶、1，10-菲咯啉或其衍生物(兩個配體不必相同)，(b)一個三齒配體，如2，2’，2”-三聯吡啶和2，6-二(咪唑-2-基)-吡啶，或(c)一個二齒配體和一個三齒配體。合適的鋨過渡金屬絡合物包括，例如，[(bpy)2OsLX]+/2+、[(dimet)2OsLX]+/2+、[(dmo)2OsLX]+/2+、[terOsLX2]0/+、[trimetOsLX2]0/+和[(ter)(bpy)2LOs]2+/3+，其中bpy是2，2’-聯吡啶，dimet是4，4’-二甲基-2，2’-聯吡啶，dmo是4，4’-二甲氧基-2，2’-聯吡啶，ter是2，2’6’，2”-三聯吡啶，trimet是4，4’，4”-三甲基-2，2’6’，2”-三聯吡啶，L是含氮雜環配體，X是鹵素如氟、氯或溴。
氧化還原介質通常彼此并與電極快速交換電子，使得絡合物能快速氧化和/或還原。通常，鐵絡合物比釕絡合物更易氧化，而其比鋨絡合物更易氧化。另外，氧化還原電勢通常隨配位雜環的數量而增加；除了配位金屬的氮在形式上是陰離子的情況外，六元雜環比五元環更能提高電勢。只有當環中的氮通過單鍵與其相鄰的兩個碳原子結合時，才是如此。如果氮在形式上是陰離子，則通常在金屬離子配位后氧化還原電勢提高。
至少某些可擴散的氧化還原介質包含一個或多個吡啶或咪唑官能團。咪唑官能團也能包含其他取代基，并且可以是例如乙烯基咪唑如1-乙烯基咪唑或甲基咪唑如1-甲基咪唑。合適的可擴散介質的實例可包括[Os(dmo)2(1-乙烯基咪唑)X]X、[Os(dmo)2(1-乙烯基咪唑)X]X2、[Os(dmo)2(咪唑)X]X、[Os(dmo)2(咪唑)X]X2、[Os(dmo)2(1-甲基咪唑)X]X2和[Os(dmo)2(甲基咪唑)X]X2，其中dmo是4，4’-二甲氧基-2，2’-聯吡啶，X是如上所述的鹵素。
其他含鋨氧化還原介質包括[Os((甲氧基)2菲咯啉)2(N-甲基咪唑)X]+/2+、[Os((乙酰氨基)2聯吡啶)2(L)X]+/2+，其中L是為改進電勢而選擇的單齒含氮化合物(包括但不限于咪唑衍生物)；和Os(三聯吡啶)(L)2Cl，其中L是氨基吡啶，如二烷基氨基吡啶；N-取代的咪唑，如N-甲基咪唑；噁唑；噻唑；或烷氧基吡啶，如甲氧基吡啶。X是如上所述的鹵素。
不含鋨的可擴散氧化還原介質包括，例如，吩噁嗪，如7-二甲基氨基-1，2-苯并吩噁嗪(麥爾多拉藍)、1，2-苯并吩噁嗪和尼羅藍；3-β-萘酰(亮甲酚藍)；四甲基苯二胺(TMPD)；二氯靛酚(DCIP)；N-甲基二甲基苯基吡唑酮鎓鹽，如吩嗪硫酸二甲酯(PMS)、N-甲基吩嗪硫酸二甲酯和甲氧基吩嗪硫酸二甲酯；四唑鹽，如四唑藍或硝基四唑藍；和吩噻嗪，如甲苯胺藍O。
其他氧化還原種的實例包括穩定的醌和在其氧化態中含有醌型結構的物種，如尼羅藍和靛酚。合適的醌的實例包括，例如，萘醌、苯酚合苯醌、苯醌、環烷醌(naphthenequinone)等的衍生物。萘醌衍生物的實例包括胡桃醌(即，5-羥基-1，4-萘醌)及其衍生物，例如，2，3-二氯-5，8-二羥基-1，4-萘醌、2，3-二甲基-5，8-二羥基-1，4-萘醌、2-氯-5，8-二羥基-1，4-萘醌、2，3-甲氧基-5-羥基-1，4-萘醌等。其他實例包括氨基萘醌，例如，嗎啉代萘醌，如2-氯-3-嗎啉代-1，4-萘醌；哌啶子基萘醌，如2-甲基3-哌啶子基-1，4-萘醌；哌嗪萘醌，如2-乙氧基-3-哌嗪-1，4-萘醌；等等。
合適的苯酚合苯醌衍生物包括，例如，coerulignone(即3，3’，5，5’-四甲氧基聯苯酚合苯醌)及其衍生物，如3，3’，5，5’-四甲基聯苯酚合苯醌、3，3’，5，5’-四羥基聯苯酚合苯醌等。
合適的苯醌衍生物包括，例如，輔酶Q0(即2，3-二甲氧基5-甲基-1，4-苯醌)及其衍生物，如2，3，5-三甲基-1，4-苯醌、2，3-二甲基-5-甲氧基-1，4-苯醌、2，3-二甲基-5-羥基-1，4-苯醌等。
其他合適的醌衍生物包括，例如，二氫苊醌和泛醌，如輔酶Q，包括Q1、Q2、Q6、Q7、Q9和Q10。
其他合適的不含鋨可擴散氧化還原介質包括，例如，泰勒藍(即1，9-二甲基亞甲藍)、N，N’-二乙基噻花青碘和硫堇。
在另一種方法中，傳感層32含有一種不可濾出的(即不可釋放的)氧化還原介質，并置于工作電極22的一部分上。不可濾出的氧化還原介質可以是，例如，氧化還原聚合物(即含有一個或多個氧化還原物種的聚合物)。優選地，在測定過程中只有很少的或沒有不可濾出的氧化還原介質從工作電極22向樣品中濾出。測定過程一般短于約5分鐘。該實施方案的氧化還原介質可結合或以其他方式固定于工作電極22上，而防止該介質向樣品中的濾出。可用已知方法將氧化還原介質結合或以其他方式固定于工作電極上，例如，與帶相反電荷的聚電解質形成多離子橋、氧化還原介質與工作電極上的聚合物的共價結合、氧化還原介質在對該氧化還原介質有高親和力的基質中的截留，或氧化還原介質與工作電極上結合的化合物的生物結合。在一個實施方案中，可用一種陽離子交換膜截留陰離子氧化還原化合物。類似地，在另一個實施方案中，可用一種陰離子交換膜截留陽離子氧化還原化合物。在關于生物偶聯的另一個實施方案中，生物素結合的氧化還原介質能與靠近或固定于工作電極上的基質中的抗生物素蛋白或抗生蛋白鏈菌素結合。另一個實施方案包括地高辛或洋地黃毒苷氧化還原介質與靠近或固定于工作電極上的基質中的抗地高辛反應。
優選的不可濾出的氧化還原介質是氧化還原聚合物，如聚合過渡金屬化合物或絡合物。用來形成氧化還原聚合物的聚合物一般含有含氮雜環，如吡啶、咪唑或其衍生物，以作為配體與氧化還原種結合。與氧化還原種如上述過渡金屬絡合物絡合的合適的聚合物包括，例如，聚(1-乙烯基咪唑)的聚合物和共聚物(稱為“PVI”)和聚(4-乙烯基吡啶)的聚合物和共聚物(稱為“PVP”)，以及通過添加側含氮雜環如吡啶和咪唑修飾的聚(丙烯酸)或聚丙烯酰胺的聚合物和共聚物。聚(丙烯酸)的修飾可通過至少一部分羧酸功能基與氨基烷基吡啶或氨基烷基咪唑如4-乙基氨基吡啶反應形成酰胺來進行。合適的PVI、PVP和聚(丙烯酸)的共聚物取代基包括丙烯腈、丙烯酰胺、丙烯酰肼和取代的或季銨化的1-乙烯基咪唑。共聚物可以是隨機的或嵌段共聚物。
不可濾出的氧化還原聚合物的過渡金屬絡合物一般與聚合物的含氮雜環(例如咪唑和/或吡啶環)共價或配位結合。過渡金屬絡合物可含有乙烯基官能團，絡合物可通過該官能團共聚合。合適的乙烯基官能團包括，例如，乙烯雜環、酰胺、腈、羧酸、磺酸或其他極性乙烯化合物。這類氧化還原聚合物的一個實例是用來提高氧化還原聚合物在水中溶脹的聚(乙烯基二茂鐵)或聚(乙烯基二茂鐵)的衍生物。
另一類氧化還原聚合物含有一種通過形成多離子橋而離子結合的氧化還原種。這類介質一般包括與帶相反電荷的氧化還原種偶聯的帶電聚合物。這類氧化還原聚合物的實例包括與多種帶正電的氧化還原種如鋨或釕聚吡啶基陽離子偶聯的帶負電的聚合物如Nafion_(DuPont)。離子結合的介質的另一個實例是與帶負電的氧化還原種如鐵氰化物或亞鐵氰化物偶聯的帶正電的聚合物如季銨化聚(4-乙烯基吡啶)或聚(1-乙烯基咪唑)。優選的離子結合氧化還原種是在帶相反電荷的聚合物中結合的帶多價電荷的，通常是多陰離子的，氧化還原種。
另一種合適的氧化還原聚合物包括與聚合物配位結合的氧化還原種。例如，該介質可通過鋨、釕或鈷2，2’-聯吡啶絡合物與聚(1-乙烯基咪唑)或聚(4-乙烯基吡啶)配位或通過4-乙烯基-2，2’-聯吡啶鋨、釕或鈷絡合物與1-乙烯基咪唑或4-乙烯基吡啶共聚合而形成。
一般而言，鋨或釕過渡金屬絡合物與不可濾出的氧化還原聚合物的咪唑和/或吡啶基之比為1∶20～1∶1，優選地1∶15～1∶2，更優選地1∶10～1∶4。氧化還原電勢通常至少部分地取決于聚合物，氧化還原電勢的順序為聚(丙烯酸)＜PVI＜PVP。
可用多種方法將氧化還原聚合物固定于電極表面。一種方法是吸附固定。該方法特別可用于相對高分子量的氧化還原聚合物。例如，通過交聯可提高聚合物的分子量。氧化還原聚合物的聚合物可含有如酰肼、胺、醇、雜環氮、乙烯基、烯丙基和羧酸基的官能團，它們能用交聯劑交聯。這些官能團可位于聚合物或一種或多種共聚物上。另外，也可通過如季銨化的反應添加官能團。一個實例是用溴乙胺基對PVP的季銨化。
合適的交聯劑包括，例如，含有兩個或更多環氧化物(例如聚(乙二醇)二環氧甘油醚(PEGDGE))、醛、氮丙啶、烷基鹵和疊氮基官能團或其組合的分子。當聚合物含有多個丙烯酸功能基時，它可與二硫酚或聚硫醇交聯；當含有多個硫醇功能基時，能與二丙烯酸酯或聚丙烯酸酯交聯。交聯劑的其他實例包括為與胺或其他氮化合物縮合而可活化羧酸或其他酸官能團的化合物。這些交聯劑包括碳二亞胺或含有活性N-羥基琥珀酰亞胺或imidate官能團的化合物。交聯劑的其他實例是醌(例如，四氯苯醌和四氰醌二甲烷)和氰尿酰氯。也可使用其他交聯劑。在某些實施方案中，不需要另外的交聯劑。交聯與交聯劑的其他敘述和實例見美國專利號5,262,035；5,262,305；5,320,725；5,264,104；5，264,105；5,356,786和5,593,852，在此引用作為參考。
在另一個實施方案中，通過電極表面的官能作用，然后將氧化還原聚合物與官能團在電極表面上通常共價地化學鍵合，來固定氧化還原聚合物。這類固定的一個實例由聚(4-乙烯基吡啶)開始。聚合物的吡啶環與可還原/可氧化的物種如[Os(bpy)2Cl]+/2+部分絡合，其中bpy是2，2’-聯吡啶。吡啶環的一部分通過與2-溴乙胺反應季銨化。然后用雙環氧化合物如聚(乙二醇)二環氧甘油醚交聯該聚合物。
為了氧化還原聚合物結合可通過例如重氮鹽的電還原修飾碳表面。一個例子是，對氨基苯甲酸重氮化后形成的重氮鹽的還原修飾含有苯基羧酸官能團的碳表面。這些官能團能被碳二亞胺如1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸(EDC)活化。活化的官能團與胺官能化的氧化還原對如上述季銨化的含鋨氧化還原聚合物或2-氨基乙基二茂鐵結合，形成氧化還原對。
類似地，金與其他金屬表面也能用例如胺如胱胺，或用羧酸如硫辛酸官能化。氧化還原對如[Os(bpy)2(吡啶-4-羧酸)Cl]0/+可被1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亞胺鹽酸(EDC)活化，形成反應性鄰酰基異脲，其可與金結合的胺反應形成酰胺。硫辛酸的羧酸官能團能用EDC活化，以結合聚合物或蛋白胺形成酰胺。
當所用的酶為PQQ葡萄糖脫氫酶或葡萄糖氧化酶時，優選的不可濾出的氧化還原介質具有相對于標準甘汞電極(SCE)約-300mV到約+400mV的氧化還原電勢。最優選的不可濾出的氧化還原介質含有鋨氧化還原中心，有相對于SCE低于+100mV的氧化還原電勢，更優選地氧化還原電勢相對于SCE低于0mV，最優選地相對于SCE接近-150mV。
至少在某些情況中，傳感器的氧化還原介質是可空氣氧化的。即，氧化還原介質可被空氣氧化，優選地，使得在向傳感器中加入樣品之前至少90％的介質為氧化態。可空氣氧化的氧化還原介質包括與兩個單-、二-或聚烷氧基-2，2’-聯吡啶或單-、二-或聚烷氧基-1，10-菲咯啉配體絡合的鋨陽離子，這兩個配體不必相同，并進一步與含有吡啶和咪唑官能團的聚合物或其他配體絡合。特別是，與聚(4-乙烯基吡啶)或聚(1-乙烯基咪唑)絡合的Os[4，4’-二甲氧基-2，2’-聯吡啶]2Cl+/+2在空氣中可達約90％或更高的氧化。當氧化還原介質為固體時，如當以干燥狀態包被于傳感器上或貯存時，可發生氧化還原介質的空氣氧化。此外，當氧化還原介質在溶液中時，例如在將溶液加于傳感器上干燥之前，也可發生氧化還原介質的空氣氧化。氧化還原介質在溶液中空氣氧化時，含有該氧化還原介質的溶液可在生產過程中使用該溶液之前貯存足以空氣氧化該介質的一段時間。
第二種電子轉移劑在本發明的一個優選的實施方案中，傳感器包含一種氧化還原介質和能向該氧化還原介質和分析物中或從中向外轉移電子的第二種電子轉移劑。第二種電子轉移劑可以是可擴散的或可以是不可濾出的(例如，在氧化還原聚合物中截留或與之配位、共價或離子結合)。合適的第二種電子轉移劑的一個實例是可催化分析物反應的酶。例如，當分析物是葡萄糖時使用葡萄糖氧化酶或葡萄糖脫氫酶，如吡咯并喹啉醌葡萄糖脫氫酶(PQQ)。當分析物是乳酸時，乳酸氧化酶起這一作用。對于其他分析物可使用其他酶。這些酶通過經氧化還原介質在分析物與電極之間轉移電子催化分析物的電解。在某些實施方案中，第二種電子轉移劑是不可濾出的，更優選地固定于工作電極上，以防止該劑向樣品中的不希望的濾出。實現方法是，例如，將不可濾出的第二種電子轉移劑與不可濾出的氧化還原介質交聯，由此在工作電極上產生含有不可濾出成份的傳感層。在其他實施方案中，第二種電子轉移劑是可擴散的(并可置于樣品室的任一表面上或置于樣品中)。對電極如圖1-4所示的對電極24可用類似于工作電極22的方法構建。對電極24也可以是對/參比電極。此外，可提供一個分開的參比電極與樣品室接觸。適用于對/參比電極或參比電極的材料包括在印制于絕緣基層材料上的Ag/AgCl或Ag/AgBr或銀金屬基底上的氯化銀。可以用與構造工作電極22相同的材料和方法制造對電極，但也可使用不同的材料和方法。在電極上可有一個接頭25，以便于連接外部電子儀器(未顯示)，如庫侖計、恒電位儀或其他測量裝置。電極構造在本發明的一個實施方案中，工作電極22和對電極24彼此相對且面對面放置，形成如圖1和圖3所示的面對面電極對。在這種優選的結構中，樣品室26一般位于兩個電極之間。對于這種面對面電極結構，優選地電極分開不超過約0.2mm的距離(即，至少工作電極的一部分與對電極的一部分分開不超過200μm)，優選地不超過100μm，最優選地不超過50μm。
電極不需要彼此完全相對；它們可略微偏移。而且，兩個電極不需要為相同大小。優選地，對電極24至少如工作電極22的工作表面一樣大。對電極22也能形成如梳形的齒尖。對電極和工作電極的其他結構也屬于本發明的范圍之內。但是，對于這種具體實施方案，工作電極的至少一部分與對電極的某一部分之間分開的距離優選地不超過上文所述的限度。
如上所述，圖11A、11B、11C顯示面對面電極22、24對的不同實施方案。兩個電極22、24的重疊區21一般對應于將在其中測定樣品的測定區。電極22、24的每一個為導電表面，并作為電容器極板。電極22、24之間的測定區作為極板之間的介電層。因此，在兩個電極22、24之間存在電容。這種電容是交疊電極22、24的大小、電極22、24的間距和電極22、24之間物質的介電常數的函數。因此，如果交疊電極22、24的區域21的大小和電極之間物質(如空氣或吸附劑)的介電常數已知，則能計算電極之間的距離，而確定測定區的容積。
圖11A顯示本發明的一個實施方案，其中電極22、24面對面排列。為了在類似構造的具有這種特定傳感器結構的分析傳感器之間有均勻的電容，定位(即，兩個電極相對于另一個的定位)應是均勻的。如果任一個電極的位置在x-y平面上偏離在圖11A所示的位置，重疊區的大小因而電容的大小將改變。相同原則適用于測定區的容積。
圖11B和11C顯示具有面對面排列的電極22、24的本發明的其他實施方案。在這些特別排列中，任一個電極的位置可在x-y平面上相對于另一個電極移動至少某一最小距離，而不發生測定區電容和容積的改變。在這些電極排列中，每個電極22、24分別包含一個臂122、124，該臂與另一個電極的相應的臂交疊。兩個臂122、124彼此不平行(如圖11A所示)；相反，臂122、124以大于0的交角123放置。另外，兩個臂122、124延伸到重疊區21之外(即，每個臂具有對應于臂222、224各自長度與重疊區21的寬度121之差的超出長度)。使用這些電極排列，在電極22、24的定位中可有一定程度的允許的不精確性，這不改變電極排列的電容。通過改變臂122、124交錯的角度123和臂122、124相對于重疊區21的寬度121的超出長度，能為電極排列設計希望程度的允許的不精確性。一般而言，臂122、124越接近于垂直(即角度123為90°)，允許的不精確性越大。同樣，臂122、124各自(可以有相同的長度或不同的長度)相對于重疊區21寬度超出的長度越大，允許的不精確性越大。相反，允許的不精確性越大，電極的大小越大(對于特定電極的寬度、厚度和與另一電極的交角123)。因此，一個電極相對另一電極偏移的最小距離應與對電極所需材料的量相平衡。交角123一般為5-90度，優選地30-90度，更優選地60-90度。臂122、124的超出長度(對應于臂長222、224與重疊區21的寬度121的差)與重疊區21的寬度之比一般為0.1∶1-50∶1，優選地1∶1-15∶1，更優選地4∶1-10∶1。
在本發明的另一個實施方案中，兩個電極22、24如圖2所示共面。在這種情況中，樣品室26與兩個電極接觸，并通過絕緣惰性基質30結合于電極的對側。惰性基質的合適的材料包括絕緣材料如聚酯。
本發明的傳感器的其他結構也是可能的。例如，兩個電極可在平面上形成，彼此形成一個角度。一種這樣的結構在形成直角的表面上具有電極。另一種可能的結構在曲面如管的內表面上具有電極。工作電極和對電極可排列為使其從管的對側彼此面對。這是面對面電極對的另一個實例。此外，電極可在管壁上彼此靠近地放置(例如，一個位于另一個頂部或并排)。
在所有結構中，兩個電極必須構造為使其彼此不直接電接觸，以防止電化學傳感器的短路。當面對面電極分開平均不超過約100μm時這可能難以避免。
當電極如圖1和圖3所示彼此面對時，能用間隔層28使電極分開。間隔層一般用隋性絕緣材料制成，如為其化學惰性所選的壓敏粘合劑、聚酯、MylarTM、KevlarTM或其他任何強力薄聚合物膜或薄聚合物膜如TeflonTM膜。除了防止電極之間接觸之外，間隔層28通常作為樣品室26邊界的一部分，如圖1-4所示。其他間隔層包括粘合層和雙面粘合帶(例如，在膜的對側有粘合劑的底膜)。樣品室樣品室26一般由電極22、24、惰性基質30和間隔層28圍成，如圖1-4所示。該樣品室中含有一個測定區，它是在分析物測定過程中只含有待測樣品部分的樣品室區域。在圖1和圖2所示的本發明的實施方案中，樣品室26是兩個電極22、24和/或隋性基質30之間的空間。在該實施方案中，樣品室具有優選地不超過約1μl，更優選地不超過約0.5μl，最優選地不超過約0.25μl的容積。在圖1和圖2所示的本發明的實施方案中，測定區具有與樣品室容積大致相等的容積。在一個優選的實施方案中，測定區包括樣品室的80％，在更優選的實施方案中為90％，在最優選的實施方案中為約100％。
在圖3所示的本發明的另一個實施方案中，樣品室26包括比接近電極22、24的區域更大的空間。這種構造使得能夠提供與一個或多個樣品室接觸的多個電極，如圖5所示。在該實施方案中，樣品室26的大小優選地可含有不超過約1μl，優選地不超過約0.5μl，最優選地不超過約0.25μl的容積。測定區(即含有待測樣品體積的區域)的大小通常可含有不超過約1μl，優選地不超過約0.5μl，更優選地不超過約0.25μl，最優選地不超過約0.1μl的體積。該實施方案的一個特別有用的構造將工作電極22與對電極24彼此面對面放置，如圖3所示。在該實施方案中，相當于含有待測樣品部分的區域的測定區是由工作電極的工作表面界定并位于兩個面對面電極之間的樣品室26的一部分。
在上述兩個實施方案中，樣品室和測定區的厚度一般對應于間隔層28的厚度(例如，圖1和圖3中電極之間的距離，或圖2中電極與隋性基質之間的距離)。間隔層可以是例如粘合劑或雙面粘合帶或薄膜。優選地，該厚度較小，以促進分析物的快速電解，因為對于特定的樣品體積更多的樣品將與電極表面接觸。另外，薄樣品室有助于減少分析物測定過程中分析物從樣品室的其他部分向測定區中擴散的誤差，因為擴散時間長于測定時間。樣品室的厚度一般不超過約0.2mm。優選地，樣品室的厚度不超過約0.1mm，更優選地，樣品室的厚度約為0.05mm或更低。
樣品室可用其他方法制成。典型方法包括壓花、刻痕或以其他方式在基底中形成凹槽，在其中形成工作電極22或對電極24。圖12A和12B顯示這種結構的一個實施方案。首先，在惰性絕緣基層材料102上形成導電層100。如上所述，導電層100可包括金、碳、鉑、二氧化釕、鈀或其他非腐蝕性材料。惰性絕緣基層材料102能用聚酯、其他聚合物或其他絕緣的可變形材料制成。然后在絕緣基層材料102的區域中形成凹槽104，使得導電層100的至少一部分包含于凹槽104中。凹槽104可用多種技術形成，包括刻痕、變形或以其他方式在基層材料102上沖擊。形成凹槽的另一種典型方法包括壓花基層材料102。例如，基層材料102可與有凸起部分如穿孔膜或槽的壓花輥或印模接觸，形成凹槽104。在某些實施方案中，可加熱基層材料102以軟化該材料。
凹槽104可以是圓形、橢圓形、矩形或其他任何規則或不規則的形狀。此外，凹槽104也可形成為沿基層材料102的一部分延伸的溝槽。導電層100可沿整個溝槽或溝槽的一部分延伸。例如，通過將傳感層32僅沉積于溝槽特定區域內導電層100的部分上，可將測定區局限于該溝槽內的特定區域。此外，也可通過將第二個電極107僅置于第一個電極105的希望的區域之上限定測定區。
導電層100的至少一部分(在某些情況中是全部)位于凹槽104中。導電層100的這一部分可作為第一個電極105(對電極或工作電極)。如果導電層100形成工作電極，則可通過在凹槽104中沉積不可濾出的氧化還原介質和/或第二種電子轉移劑在導電層100的部分之上形成傳感層32，如圖12B所示。若使用一種可擴散的氧化還原介質或第二種電子轉移劑，則可將可擴散的材料置于樣品室的任一表面上或樣品中。
然后通過將第二個導電層沉積于第二個基層材料106上形成第二個電極107。然后將第二個電極107以面對面排列置于第一個電極105之上。盡管未加說明，但如果氧化還原介質是不可濾出的，則應當理解，如果第一個電極105用作對電極，則傳感層32將沉積于用作工作電極的第二個電極107上。然而，如果氧化還原介質是可擴散的，氧化還原介質可置于樣品室任一表面上或可置于樣品中。
在一個實施方案中，第二種基層材料106位于第一種基層材料102和/或未凹陷的導電層100的一部分上，使得第二個電極107延伸到凹槽中。在另一個實施方案中，在第一個和第二個基層材料102、106之間有一個間隔層(未顯示)。在該實施方案中，第二個電極107可以或可不延伸到凹槽中。在任何情況中，第一個和第二個電極105、107都不能接觸，否則兩個電極將短路。
凹槽104的深度和凹槽104中導電層100、傳感層32和第二個電極107的部分的體積決定了測定區的容積。因此，測定區容積的預測取決于凹槽104形成的均勻程度。
如圖14A所示，除了導電層100之外，也可在形成凹槽104之前，將以下詳述的吸附層103沉積于基層材料102上。如圖14B所示，可用導電層100和基層材料102刻痕、壓花或變形吸附劑103。此外，也可在刻痕、壓花或變形導電層100和基層材料102形成凹槽104之后沉積吸附劑103。
在制成分析傳感器的另一個示范方法中，如圖13A和13B所示，在第一種基層材料112中形成凹槽114。可通過刻痕、壓花、蝕刻(例如，用光刻法或激光去除基層材料的部分)，或以其他方式變形或除去基層材料112的一部分來形成凹槽。然后在凹槽114中形成第一個導電層110。可使用上述任何導電材料。優選的材料是導電墨水，如可從Ercon，Inc.(Wareham，MA)獲得的導電碳墨。導電墨水一般含有溶解或分散于溶劑或分散劑中的金屬或碳。當除去溶劑或分散劑時，金屬或碳形成導電層110，其能用作第一個電極115。如上所述，第二個電極117能在第二種基層材料116上形成，并位于凹槽114之上。在含有不可濾出的氧化還原介質的實施方案中，如圖13B所示，在第一個電極115上形成傳感層32，以構成工作電極。在含有不可濾出的氧化還原介質的其他實施方案中，可在第二個電極117上形成傳感層32，構成工作電極。此外，若使用可擴散的氧化還原介質，則工作電極不需要包括置于其上的傳感層。實際上，因為氧化還原介質可置于樣品中，所以不需要傳感層，對于可擴散的第二種電子轉移劑—如果存在的話—同樣如此。任何可擴散的成份可獨立地置于樣品室的任一表面上或置于樣品中。此外，吸附劑(未顯示)可形成于凹槽內，例如在第一個電極115上。
在導電墨水中也可包含粘合劑，如聚氨酯樹脂、纖維素衍生物、高彈體(例如，硅氧烷、聚合二烴或丙烯腈-丁二烯-苯乙烯(ABS)樹脂)、高度氟化的聚合物等。熟化粘合劑可提高導電層110的電導率，但熟化不是必需的。熟化粘合劑的方法可取決于所使用的特定粘合劑的性質。某些粘合劑通過加熱和/或紫外線熟化。
這些結構使得能形成這樣的電化學傳感器，其中測定區的容積至少部分取決于凹槽104的準確度和可重復性。能用壓花、激光蝕刻、光蝕刻及其他方法制成可重復的規格為200μm或更小的凹槽104。吸附劑在將樣品置于樣品室之前，樣品室可以是空的。此外，樣品室也可包含吸附劑34以在測定過程中吸附并容納液體樣品。合適的吸附劑包括聚酯、尼龍、纖維素和纖維素衍生物如硝基纖維素。吸附劑有利于通過毛細作用對小體積樣品的吸收，這可補充或優選地代替樣品室的毛細管作用。另外，一部分或全部樣品室壁可用表面活性劑如Zonyl FSO覆蓋。
在某些實施方案中，用其中溶解或分散有吸附劑的液體或漿液沉積吸附劑。然后可通過加熱或蒸發法除去液體或漿液中的溶劑或分散劑。合適的吸附劑包括，例如，溶解或分散于適當溶劑或分散劑如水中的纖維素或尼龍粉。特定溶劑或分散劑也應與工作電極22的材料相容(例如，溶劑或分散劑不應溶解電極)。
吸附劑的最重要的功能之一是減少充滿傳感器的樣品室和相應測定區所需的液體體積。測定區中樣品的實際體積部分取決于吸附劑內空隙空間的大小。合適的吸附劑一般包括約5％～約50％的空隙空間。優選地，吸附劑包括約10％～約25％的空隙空間。
用吸附劑代替液體是有利的。通過加入吸附劑，充滿樣品室26只需要較少的樣品。這減少了測定所需樣品的體積，也縮短了電解樣品所需的時間。
吸附劑34可包括一個接頭33，其由與吸附劑相同的材料制成，并從傳感器或從傳感器的開口伸出，使得樣品可接觸接頭33，被接頭吸收，并通過吸附劑34的毛細作用輸送到樣品室26中。這提供了一種優選的將樣品導入樣品室26中的方法。例如，傳感器可與用刺血針刺破采血的動物(包括人)的區域接觸。血液與接頭33接觸，并通過吸附劑34的毛細作用吸入樣品室26中。當樣品極少，如用刺血針刺破不富含近表面毛細血管的動物身體一部分并提供1μL或更少的血樣體積時，樣品向傳感器的直接轉移特別重要。
可用除吸附劑毛細作用之外的方法向樣品室或測定區中輸送樣品。這些輸送方法的實例包括對樣品施加壓力以將其壓入樣品室中，用泵或其他真空產生方法在樣品室中產生真空而將樣品吸入樣品室中，由樣品與薄樣品室壁的界面張力引起的毛細管作用，以及吸附劑的毛細作用。
傳感器也能與流動樣品流一起使用。在這種構造中，使樣品流流經樣品室。定時停止樣品流，并用電化學方法如庫侖法測定分析物的濃度。測定后重新開始流動，從而從傳感器中除去樣品。此外，樣品也可以極低的速率流經樣品室，使得所有分析物在輸送中電解，產生只取決于分析物濃度和流速的電流。
也可用其他填充材料填充測定區并降低樣品體積。例如，可在測定區中放置玻璃珠占據空間。優選地，這些填充材料是親水的，使得體液能容易地流入測定區中。在某些情況中，如具有大表面積的玻璃珠，這些填充材料也可由于其大表面積和親水性而將體液吸入測定區中。
全部傳感器組件緊固地結合在一起，以確保樣品與電極接觸，且樣品室和測定區保持相同的容積。在樣品的庫侖分析中這是一個重要的考慮因素，其中需要測定明確的樣品體積。圖1和圖2中顯示了一種將傳感器結合在一起的方法。兩個極板38位于傳感器的相對端。這些極板一般由絕緣材料如塑料制成。這些極板設計為使其能與兩個極板之間的傳感器固定在一起。合適的固定裝置包括粘合劑、夾子、螺帽和螺栓、螺釘等。備擇的傳感器設計圖18A-18C顯示形成薄膜傳感器的一種備擇傳感器設計。該傳感器包括第一個基底500，在其上形成工作電極502。工作電極502包括一個用來連接外部電子儀器的接觸區503。間隔層504(圖18B)如粘合層或雙面粘合帶界定了溝槽506，產生傳感器的樣品室。如圖18C(相對于圖18A和18B翻轉，以顯示電極上側)所示在第二個基底508上形成兩個對(或對/參比)電極510、512。如下所述，這種多對電極排列可具有充滿指示功能。每個對電極510、512具有用來接觸外部電子儀器的接觸區511、513。將第二個基底508翻轉并置于第一個基底500之上，之間為間隔層504，使得工作電極502和兩個對電極510、512在溝槽506的區域中面對。
在某些情況中，最靠近溝槽506的入口514的對電極510在樣品室內具有至少兩倍于另一個對電極512的表面積，并可至少大5或10倍。如上所述在第一個或第二個基底500、508上對應于溝槽506的區域中可含有不可濾出的或可擴散的氧化還原介質和/或第二種電子轉移劑。
能形成工作電極和對電極，覆蓋全部溝槽區(除了兩個對電極之間的小空間之外)。在該實施方案中，樣品室和測定區同樣有效并有相同的容積。在其他實施方案中，測定區占有例如樣品室容積的80％或90％。應當理解，用一個對電極或三個或更多的對電極能構成類似的傳感器。也應當理解，在傳感器上也可有多個工作電極。
對于圖18A-18C所示的傳感器排列描述了制造薄膜傳感器的方法的一個實例，能用該方法制造多種其他的傳感器排列，包括前面所述。提供了基底如塑料基底。基底可以是單片或卷材上的連續的輥。能用該基底制造單個傳感器或制造多傳感器。多傳感器能在基底1000上形成工作電極1010和對電極1020。在某些實施方案中，能刻痕和折疊基底，使工作電極1010和對電極1020靠近形成傳感器。在某些實施方案中，如圖31A所示，各工作電極1010(在個別章節中，對電極1020)能在基底1000上彼此緊接地形成，以減少廢料，如圖31A所示。在其他實施方案中，各工作電極1010(在個別章節中，對電極1020)能空間分隔，如圖31B所示。對多電極的制造敘述了該方法的其余部分，但能容易地改變而形成單個傳感器。
碳或其他電極材料(例如金屬如金或鉑)在基底上形成，為每個傳感器提供工作電極。能用多種方法沉積碳或其他電極材料，包括印染碳或金屬墨水、蒸氣淀積和其他方法。
任選地，能緊靠工作電極形成絕緣材料如絕緣墨水，提供沿樣品流體運動路徑的平面。絕緣材料適用于產生平滑表面，以利于通過毛細管作用填充，和/或適用于降低氣泡在工作電極附近被截留的可能性。這種絕緣材料可以是有色或無色的，并可通過印花或其他技術在基底上形成。絕緣材料可在形成工作電極之前或之后沉積。
一個或多個對電極可在基底上形成。對電極通過在基底上沉積碳或其他電極材料而形成。在一個實施方案中，對電極的材料是Ag/AgCl墨水。可用多種方法包括印刷或蒸汽淀積法沉積對電極的材料。在某些實施方案中，對電極由不同材料構成，和/或一個電極是對電極或對/參比電極，而一個電極是參比或對/參比電極。在一個實施方案中，在聚合物片或卷材的第一半上形成工作電極，而在聚合物片或卷材的另一半上形成對電極，使得能折疊片或卷材而以面對面排列疊置工作與對電極。
可鄰近對電極和/或在其之間沉積第二種絕緣材料，以提供沿樣品流體運動路徑的平面。在將是樣品室一部分的對電極之間的區域中這是特別希望的，以使樣品室表面成為平面。絕緣材料適用于產生平滑表面，以利于通過毛細管作用填充，和/或適用于降低氣泡在工作電極附近被截留的可能性。這種絕緣材料可以是有色或無色的，并可通過印刷或其他技術在基底上形成。絕緣材料可在形成對電極之前或之后沉積。
至少在基底/工作電極和基底/對電極之一上形成粘性間隔層。粘性間隔層可以是單層粘合劑或雙面粘合帶(例如含有置于相對面上的粘合劑的聚合物底膜)為形成溝槽，可切開(如沖切)任選地具有一個或多個隔離襯墊的間隔層，以在將間隔層置于基底上之前除去對應于溝槽的粘合劑部分。此外，也可按照確定溝槽區域的樣式在基底上印刷或以其他方式放置粘合劑。間隔層的厚度一般決定工作與對電極之間的間距。當傳感器之間的間距的一致性必需時(例如，對于庫侖測定)，間隔層厚度的一致性是重要的。優選地，在單個傳感器中和/或在一批中的各個傳感器之間厚度變化不超過±5％。
不可濾出的或可擴散的氧化還原介質和/或第二種電子轉移劑置于基底上至少樣品室區域中。如果這兩種成份之一或兩者都是不可濾出的，則該一種或多種成份必須置于工作電極上。如果這兩種成份之一或兩者都是可擴散的，則該成份可置于溝槽區中基底的任一表面上。氧化還原介質和/或第二種電子轉移劑能在間隔層安置之前或之后獨立地或一起置于基底上。可用多種方法放置氧化還原介質和/或第二種電子轉移劑，包括，例如，篩網印花、噴墨印刷、噴射、涂抹、沿相對和/或相鄰電極的行或列制成條紋等。其他成份可分開或與氧化還原介質和/或第二種電子轉移劑如表面活性劑、聚合物、聚合物膜、防腐劑、粘合劑、緩沖液和交聯劑一起放置。
安放間隔層、氧化還原介質和第二種電子轉移劑之后，可折疊基底形成傳感器。用間隔層的粘合劑將基底的表面結合在一起。待表面結合后，能用多種方法切開傳感器，包括，例如，沖切、縱切或用其他方式切去多余的基底并分離各傳感器。在某些實施方案中，可使用這些方法的組合。例如，某些部件可沖切，而傳感器的其余部分可縱切。另外，可首先從基底上切下傳感器組件(例如，圖18A和18C中所示的組件)，然后用間隔層粘合劑粘合兩個組件將其結合形成傳感器。
圖18A-18C中顯示的傳感器實施方案是頂部填充傳感器的一個實例。圖19A-19C顯示另一種傳感器結構。這是一種側面填充傳感器。圖19A顯示具有工作電極522的第一個基底520。圖19B顯示限定溝槽526的間隔層524。圖19C(相對于圖19A和19B翻轉以顯示電極)顯示具有三個對(或對/參比)電極530、532、534的第二個基底528。
該傳感器能如上所述制造。對電極的對稱放置使傳感器能從左側或右側填充而便于左手和右手之人。然而應當理解，能用一個、二個或四個或更多的對電極和/或兩個或更多的工作電極構成類似的傳感器排列。扇形區536、538可通過例如沖切形成，并且至少在某些情況中，可精確控制以產生可重復的溝槽長度。作為另一種排列，傳感器側面可以是直線，使得可用如gang arbor blade系統以平行方向切開基底而使傳感器與基底的其余部分和/或其他傳感器斷開。如圖19A、19B和19C所示，傳感器的邊緣能確定樣品室和/或測定區的邊緣。通過精確控制切口之間的距離，通常能減少樣品室容積的變化。在某些情況中，這些切口優選地彼此平行，因為平行的切口可能最易于重復形成。
圖20A、20B和20C顯示側面填充的傳感器排列的另一個實例。圖20A顯示具有工作電極542的第一個基底540。圖20B顯示限定了溝槽546的間隔層544。圖20C(相對于圖20A和20B翻轉)顯示具有三個對(或對/參比)電極550、552、554的第二個基底548。
圖21A、21B和21C顯示頂部填充的傳感器排列的另一個實例。圖21A顯示具有工作電極562的第一個基底560。圖21B顯示限定了溝槽566的間隔層564。圖21C(相對于圖21A和21B翻轉)顯示具有兩個對(或對/參比)電極570、572的第二個薄膜基底568。穿過第二個基底有一個通風孔574(在圖21C中以陰影區表示)。在所示實施方案中，只穿過具有對電極和任選地間隔層564的基底568形成通風孔574。在該實施方案中，例如，可通過沖切基底的一部分形成通風孔。這種沖切可切掉至少一個對電極的一部分，但應有足夠數量的對電極與溝槽中的樣品接觸并與傳感器另一端的接觸區電連接。在另一個實施方案中，可穿過所有層或穿過第一個基底而不是第二個基底形成通風孔574。
圖22A、22B和22C顯示具有不同形狀的另一個實施方案。該傳感器包括具有至少一個工作電極580的第一個基底579，如圖22A所示。該傳感器也包括在間隔層581中形成溝槽582的間隔層581，如圖22B所示。該傳感器還包括具有兩個對電極584、585的第二個基底583，如圖22C所示(相對于圖22A和22B翻轉)。通風孔586一般穿過所有層切成，并從傳感器的一側伸出。在某些實施方案中，將傳感器的通風孔和前部587同時切割為在傳感器的通風孔和前部587之間有可重復的距離，而使溝槽582和工作電極580有可重復的長度。圖22A、22B和22C也顯示任何傳感器排列能用的另一個特征。凹穴588可在溝槽582的注入口處形成，以利于流體向傳感器中吸引。在該構造中，液體沒有平面，而是有助于溝槽(即樣品室)的毛細作用或毛細管作用填充的鋸齒面。這種構造也可降低傳感器的使用者在收集樣品過程中阻塞溝槽的可能性。側面對準皮膚按壓傳感器的尖端可阻塞平面傳感器。
圖23A、23B和23C顯示側面填充的傳感器排列的另一個實例。圖23A顯示具有工作電極642的第一個基底640。圖23B顯示限定了溝槽646的間隔層644。圖23C(相對于圖23A和23B翻轉)顯示具有三個對(或對/參比)電極650、652、654的第二個基底648。該傳感器可通過對基底制造直切口形成。如圖31A所示，這些傳感器能彼此相鄰地制成，這可產生較少的廢料。溝槽646的長度一般由沿傳感器側面656、658的兩個平行切口限定。另一個任選的加工優點，特別是在傳感器彼此相鄰時，是能通過沿相鄰傳感器的行或列添加氧化還原介質和/或第二種轉移劑的連續流而將這些成份置于溝槽中。與其他技術如將這些成份單個置于單個溝槽中相比，這可產生更高的效率和較低的氧化還原介質和/或第二種電子轉移劑的浪費。
圖24A、24B和24C顯示另一種傳感器構造。該傳感器包括具有至少一個工作電極602的第一個基底600，如圖24A所示。該傳感器也包括在間隔層604中形成溝槽606的間隔層604，如圖24B所示。該傳感器還包括具有兩個對(或對/參比)電極610、612的第二個基底608，如圖24C所示(相對于圖24A和24B翻轉)。該傳感器也可包括，例如，一個指示器，如槽614或傳感器主體的延伸部分616，它能為使用者指明哪一側應與樣品相鄰放置。當傳感器讀數只有在樣品從特定一側進入時才正確時，這是特別重要的。
圖24B也顯示可在任何傳感器構造中使用的另一個任選的部件。在該圖例中，樣品室606不是由直線構成的，而是在樣品室中有一個膨脹區618。這可有較大的樣品室而不必形成較大的開口。該膨脹區能為任何形狀，包括圓形、正方形、矩形及其他規則和不規則的形狀。
圖25是裝配的傳感器的一個實例，顯示側面填充傳感器620的另一種傳感器排列。該傳感器包括傳感器主體624的延伸部分622，其為使用者指明樣品室626的開口位于何處。
圖32顯示一個任選的部件，它是從儀表內部看去的傳感器的側面視圖。圖32顯示從傳感器1100的其余部分(即，在圖32中部分1140相對于基底1120和1130凹進)延伸到儀表中的第一個基底1120和第二個基底1130。圖18A-18C和24A-24C顯示這一構造的實例。一般而言，傳感器1100與儀表1110相連，后者包括接觸傳感器1100的電極接觸區(例如，圖18A和18C中的區域503、511和513)的接觸墊(未顯示)。具有接觸區的傳感器1100的末端能滑入儀表1110中。儀表1110的接觸墊接觸傳感器的正確接觸區而使工作電極和對電極與儀表正確連接一般是重要的。在某些情況中，傳感器構造為使第一個基底1120上的工作電極的接觸區具有寬度w1，其不同于帶有對電極的第二個基底1130的接觸區的寬度w2。圖18A-18C和24A-24C中顯示具有這種結構的電極構造的實例。為了確保傳感器1100正確插入儀表1110中，儀表1110可包括可防止或阻止傳感器以不正確方向插入的凸起區域1140。例如，第二個基底1130的接觸區的寬度w2可寬于第一個基底1120的接觸區的寬度w1，如圖32所示。在這種情況中，凸起區域1140的位置使傳感器1100滑入儀表中而使第一個基底1120緊接凸面1140從中突出的表面1150，但可防止或阻止第二個基底1130緊接凸面1140從中突出的表面1150。也能用除凸面之外的物體指導使用者將傳感器正確置入儀表中。整合型樣品獲取和分析物測定裝置在本領域中已知多種方法可獲取小樣品和/或將其從體內輸送到傳感器中。例如這包括美國專利號5,746,217、5,820,570、5857983和5879311，在此引用作為參考。本發明的傳感器可適用這些樣品獲取和/或輸送方法的任一種。
在本發明的一個優選的實施方案中，根據本發明的原則構建的分析物測定裝置52包括如上所述的傳感器20，其連接一個樣品獲取裝置50，形成整合型取樣與測定裝置。圖6所示的樣品獲取裝置50包括，例如，皮膚穿刺組件54，如刺血針，其連接一個彈性可彎曲簧片56(或其他類似的裝置，如彈簧)，其可將刺血針注射到患者皮膚中獲得血流。
然后釋放彈性簧片56，縮回皮膚穿刺組件54。然后可利用例如吸附劑34的毛細作用將組件54刺破的皮膚區域流出的血液輸送到傳感器20中進行分析物的分析。然后可將分析物測定裝置52置于讀數器中(未顯示)，它將庫侖計或其他電化學分析裝置與電極接頭23、25連接，以通過電分析方法測定分析物的濃度。優選地，當與庫侖計或其他電化學分析裝置連接時，分析物測定裝置封裝于讀數器中。
在一個優選的實施方案中，整合型樣品獲取和分析物測定裝置包括一個固定刺血針與測定簧片的穿刺裝置。該穿刺裝置優選地需要激活擊發。由于需要使用者在使用前旋緊該裝置，所以無意觸發刺血針的危險減為最小。
優選地，當以足夠的壓力對皮膚緊壓穿刺裝置時，穿刺裝置自動觸發。本領域中已知，當在皮膚上產生孔的部位周圍施加壓力時，可壓出較多的體液樣品如血液或組織液。例如，見上述頒給Integ和Amira的美國專利，以及Becton Dickenson所售穿刺裝置的尖端設計。所有這些穿刺裝置都有一個環繞切割部位的突出環，用來產生將樣品壓出傷口的壓力。然而，所有這些裝置都需要使用者對創傷部位施加足夠的壓力才能壓出樣品，并且所有穿刺裝置都由使用者用按扭觸發。適當壓力觸發器的設計為本領域技術人員所周知。
優選地，穿刺裝置也可允許使用者調節刺血針刺入皮膚的深度。這些裝置已可從如Boehringer Mannheim和Palco的公司商品獲得。該部件使使用者能根據身體上的不同部位和不同使用者之間皮膚厚度、皮膚耐久性和疼痛敏感性的不同調節穿刺裝置。
在一個更優選的實施方案中，穿刺裝置和檢測讀數器與單個裝置整合。為了操作該裝置，使用者只需將含有測定簧片和穿刺裝置的一次性筒插入整合型裝置中，旋緊穿刺裝置，對皮膚按壓將其激發，并讀取測定結果。這種整合型穿刺裝置和檢測讀數器為使用者簡化了檢測步驟并使體液的處理減至最少。
圖26顯示整合型樣品獲取和傳感器裝置700的另一個實例。該整合型樣品獲取和傳感器裝置700包括一個機箱702、一個皮膚穿刺組件(例如刺血針)704、一個穿刺/收集孔706、一個可任意移除的傳感器708、一個傳感器導桿710和一個皮膚穿刺組件的回縮機件714。該裝置700能設計為重復使用(例如，使皮膚穿刺組件704和傳感器708成為可移除的)或一次性使用。
機箱702可由多種材料包括金屬和塑料制成。機箱702可包括一個合頁716或其他構造(例如粘合劑或聯鎖部分)將機箱的各部分結合在一起。
機箱702中具有穿刺/收集孔706，使皮膚穿刺組件704通過孔706伸出，并刺入使用者的皮膚，由此獲得血流(或其他體液)。傳感器708也可延伸到孔706的邊緣或之外，通過傳感器尖端的開口(未顯示)收集血液(或其他體液)。這可使使用者在不移動裝置700的情況下穿刺皮膚收集流體樣品。此外，皮膚穿刺組件704和傳感器708可具有不同的開孔。傳感器導桿可構造于機箱702中或添加于機箱中，以在傳感器插入并通過機箱時將傳感器708導入位置，和/或在機箱中和在樣品收集過程中支持傳感器。
皮膚穿刺組件704可包括一個啟動器(未顯示)，其包括一個可旋緊和釋放皮膚穿刺組件704的機件，或者皮膚穿刺組件可外部啟動。例如，傳感器讀數器(未顯示)或其他裝置可與樣品獲取和傳感器裝置、傳感器讀數器或包括可旋緊和/或釋放皮膚穿刺組件704的機件在內的其他裝置連接。
裝置700的回縮機件714可以是，例如，在穿入使用者皮膚后可使皮膚穿刺組件704縮回機箱中的彈簧或彈性金屬簧片。這可允許無阻礙地收集樣品，和/或防止再次穿刺使用者或其他人的皮膚，從而降低或防止了體液轉移或其他有害試劑轉移引起的污染或感染。此外，皮膚穿刺組件的回縮也可用外部裝置或儀器實現。
操作的一個實例包括旋緊皮膚穿刺組件704，然后釋放皮膚穿刺組件704，使其穿過穿刺/收集孔706伸出機箱702外，并刺入使用者的皮膚中。皮膚穿刺組件704在伸出機箱之外時任選地將傳感器推離正軌。用回縮機件714將皮膚穿刺組件704縮回機箱702內。皮膚穿刺組件回縮后，傳感器通過傳感器708上的開口從刺破的皮膚中收集樣品流體。
如果使用傳感器讀數器，則傳感器讀數器也可構造為與傳感器的接觸端連接。傳感器讀數器可包括一個恒電位儀或其他組件來為傳感器的電極提供電勢和/或電流。傳感器讀數器也可包括一個處理器(例如，微處理器或硬件)，用于由傳感器信號測定分析物濃度。傳感器讀數器可包括一個顯示器或連接顯示器與傳感器的端口。顯示器可顯示傳感器信號和/或由傳感器信號確定的結果，包括例如，分析物濃度、分析物濃度改變速度和/或分析物濃度超出閾值(例如，表明血糖過低或過高)。該傳感器讀數器可與整合型樣品獲取和傳感器裝置一起使用，或者傳感器讀數器可只與傳感器一起使用，傳感器的接觸區可與傳感器讀數器的接觸區連接。傳感器的操作本發明的一種電化學傳感器可在施加或不施加電勢的情況下操作。在一個實施方案中，電化學反應自然發生，且不需要在工作電極與對電極之間施加電勢。
在另一個實施方案中，在工作電極與對電極之間施加電勢。但電勢不需要保持恒定。所需電勢的量值取決于氧化還原介質。電極本身平衡時，或通過施加外部偏離平衡時，和分析物電解時的電勢一般為，使得電化學反應趨于或接近完成，但優選地不能氧化足以導致明顯的干擾物如尿酸鹽、抗壞血酸和乙酰氨基苯酚的電化學反應，其可影響所測定的信號。對于不可濾出的氧化還原介質，電勢一般為相對于標準甘汞電極(SCE)約-350mV～約+400mV。優選地，氧化還原介質的電勢低于+100mV，更優選地電勢低于0mV，最優選地電勢為相對于SCE約-150mV。
當施加外部電勢時，可在向樣品室中加入樣品之前或之后施加。如果測定區只包括樣品室的一部分，則優選地在樣品在樣品室中靜止后施加電勢，以防止當樣品室充滿時通過測定區的樣品的電解。此外，如果測定區包括樣品室的大部分或全部，則任選地可在樣品室充滿之前或期間施加電勢，而不影響測定的準確性。當施加電勢且樣品在測定區中時，電流將在工作電極與對電極之間流動。該電流至少部分地是樣品中分析物電解的結果。這種電化學反應借助于氧化還原介質和任選的第二種電子轉移劑發生。對于多種生物分子B，該過程可用下列反應方程式表示(2)在適當酶的存在下生物化學物B被氧化還原介質物種A氧化為C。然后氧化還原介質A在電極處氧化。電極收集電子，并測定產生的電流。測定的電流也可包括導致測定的本底電荷的本底電流，其至少部分上是由于可擴散的氧化還原介質在工作電極與對電極之間的穿梭。能如上所述最小化或解決該本底電流。
一個實例是，本發明的一種傳感器基于葡萄糖分子與兩個[Os(dmo-phen)2(NMI)Cl]2+陽離子的反應，其中dmo-phen是4，8-二甲氧基菲咯啉，NMI是N-甲基咪唑，在葡萄糖氧化酶的存在下產生兩個[Os(dmo-phen)2(NMI)Cl]+陽離子、兩個質子和葡萄糖的氧化產物，例如，葡糖酸內酯或另一種酮。通過將[Os(dmo-phen)2(NMI)Cl]+陽離子電氧化為[Os(dmo-phen)2(NMI)Cl]2+陽離子并測定傳遞的總電荷來測定存在的葡萄糖的量。
本領域的技術人員應當認識到，有許多不同的反應可產生相同的結果；即分析物通過氧化還原介質參與的反應途徑的電解。方程式(1)和(2)是這種反應的非限制性實例。
庫侖法在本發明的一個優選的實施方案中，用庫侖法測定分析物的濃度。這種測定技術利用在測定過程中以一定間隔獲得的電流量值來測定分析物的濃度。隨時間積分這些電流量值而獲得傳遞到或離開電極的電荷的量Q。然后以下列方程式(當氧化還原介質是不可濾出的時)用Q計算分析物的濃度(CA)CA＝Q/nFV (3a)其中n為電解分析物所需的電子當量數，F是法拉第常數(每當量約96500庫侖)，V是測定區中的樣品體積。當使用可擴散的介質時，能由下列方程式獲得分析物濃度CA＝(Qtot-Qback)/nFV (3b)其中Qtot是測定過程中轉移的總電荷，Qback是不由分析物引起的轉移的電荷量，例如，可擴散介質在工作電極與對電極之間穿梭轉移的電荷。至少在某些情況中，傳感器構造為使本底電荷至多5倍于一定量分析物電解產生的電荷的大小。優選地，本底信號至多為分析物電解產生的電荷的200％、100％、50％、25％、10％或5％。
測定本底信號與分析物電解所產生信號之比的方法的一個實例對于面對面電極對而言描述如下。如果施加的電勢不能使氧化還原介質無法穿梭，則氧化還原介質穿梭產生的電荷可用下列公式表示Qback＝(AFDMCM/d)(tnM)其中A是工作電極的面積；F是法拉第常數(96500庫侖/當量)；DM是氧化還原介質的有效擴散系數；CM是測定區中氧化還原介質的濃度；d是面對面電極的間距；t是測定時間長度；nM是氧化還原介質獲得或丟失的電子數。
另外，當分析物在測定過程中電氧化完成約90％時，分析物例如葡萄糖的電荷可用下列公式表示QG＝Ad(0.90)CGnGF其中A是工作電極的面積；d是面對面電極的間距；CG是葡萄糖的濃度；n是電解分析物所需的電子數(例如每個葡萄糖分子2個電子)；F是法拉第常數。當CG為5mM(或5×10-6mol/cm3)，t為60秒，nG為2，nM為1時，氧化還原介質產生的電荷與分析物電解所產生電荷之比可用下列公式表示QBack/QG＝(DMCM/d2)(tnM/(0.9nGCG))＝(DMCM/d2)×(6.7×106)例如，如果QBack/QG的比值為5，則(DMCM)/d2為7.5×10-7mol/(cm3sec)。同樣例如，如果QBack/QG的比值為1，則(DMCM)/d2為1.5×10-7mol/(cm3sec)。另一個例子是，如果比值為0.1，則(DMCM)/d2為1.5×10-8mol/(cm3sec)。因此，根據希望的比值，可通過選擇DM、CM和d構造傳感器使之具有希望的比值。例如，可降低氧化還原介質的濃度(即可降低CM)。另外，例如，通過在可擴散介質向對電極的流動中放置阻擋層(即降低氧化還原介質的有效擴散系數-DM)可降低氧化還原介質的擴散。其他傳感器構造也適用于控制本底信號與分析物產生的信號之比，并將在下面描述。
能以多種方法解決本底電荷Qback。例如，通過只使用有限量的可擴散氧化還原介質，通過在對電極之上加一個限制氧化還原介質向對電極擴散的膜，或通過在工作電極與對電極之間產生相對較小的電勢差，能使Qback變小。適于減少Qback的傳感器構造和方法的其他實例包括已描述的，如在工作電極處氧化還原介質反應速率明顯快于對電極處；在工作電極上固定氧化還原介質；氧化還原介質在對電極或對/參比電極處反應后，固定于對電極或對/參比電極上；或減緩氧化還原介質擴散的傳感器。
此外，可單個或分批校準傳感器，確定校正曲線或Qback的值。另一個選項包括第二個電極對，其缺少分析物電解所需的成份，如第二種電子轉移劑，而使第二個電極對產生的完整信號對應于Qback。
對于庫侖測定，至少20％的分析物電解。優選地至少50％，更優選地至少80％，再更優選地至少90％的分析物電解。在本發明的一個實施方案中，分析物完全或幾乎完全電解。然后能由電化學反應中得到的電流量值計算電荷，并用方程式(3a)或(3b)確定分析物的濃度。當電流達到穩態值時，一般指示電化學反應的完成。這表明所有或幾乎所有分析物已被電解。對于這種測定，一般至少90％的分析物被電解，優選地至少95％的分析物電解，更優選地至少99％的分析物電解。
對于庫侖法，一般希望分析物快速電解。電化學反應的速度取決于幾個因素，包括在電極之間施加的電勢和反應(1)和(2)的動力學。(其他重要因素包括測定區的大小和測定區中吸附劑的存在。)通常，電勢越大，通過細胞的電流越大(可達輸送最高限值)，因此一般反應發生得越快。然而，如果電勢太大，其他電化學反應可在測定中產生明顯誤差。一般選擇電極之間的電勢及特異的氧化還原介質和任選的第二種電子轉移劑，使分析物在不到5分鐘內幾乎完全電解，這取決于樣品中預期的分析物濃度。優選地，分析物在約2分鐘內，更優選地在約1分鐘內幾乎完全電解。
在本發明的另一個實施方案中，分析物只部分電解。在部分反應期間測定電流，然后用本領域技術人員所知的數學方法外推，確定分析物完全或幾乎完全電解的電流曲線。如果分析物完全或幾乎完全電解，該曲線的積分可得到傳遞的電荷量，并用方程式(3a)或(3b)計算分析物的濃度。
盡管庫侖法具有需要已知待測樣品體積的缺點，但庫侖法是一種優選的分析少量樣品的技術，因為它具有下列優點，例如對測定無溫度依賴性，對測定無酶活性依賴性，對測定無氧化還原介質活性依賴性，在樣品中分析物損耗的測定中無誤差。如以上所述，庫侖法是一種測定在分析物完全或幾乎完全電解過程中傳遞或預計傳遞的電荷量的方法。一種電量分析技術包括在工作電極上電解分析物，并在電解過程中兩次或多次測定在工作電極和對電極之間產生的電流。當電流達到穩態時電解完全。然后通過對時間積分測定的電流并考慮任何本底信號計算用于電解樣品的電荷。因為電荷直接與樣品中分析物的量有關，所以測定無溫度依賴性。另外，酶活性不影響測定的值，而只影響獲得量值所需的時間(即，活性較低的酶需要較長的時間實現樣品的完全電解)，使得酶隨時間的衰減不會使分析物濃度測定不準確。最后，電解對樣品中分析物的消耗不是誤差的原因，而是該技術的目的。(然而，如果根據眾所周知的電化學原理由部分電解曲線外推電解曲線，則分析物不需要完全電解)非庫侖測定盡管庫侖測定是有用的，但本領域技術人員應認識到，本發明的傳感器也可利用電勢分析、電流分析、伏安法及其他電化學技術測定樣品中分析物的濃度。這些非庫侖分析法獲得的量值不象電量測定一樣可能是溫度依賴的。
另外，這些非庫侖分析電化學技術獲得的量值可對傳感器中的活性酶的量敏感。如果酶經過一定時間滅活或衰變，則可影響得到的量值。這可限制這些傳感器的保存期，除非酶非常穩定。
最后，如果在測定過程中大部分分析物和/或氧化還原介質電解，則可不利地影響非庫侖分析電化學技術如穩態電流分析法獲得的量值。精確的穩態量值可能是不可獲得的，除非有足夠的分析物和/或氧化還原介質，使得在測定過程中只有相對少部分的分析物和/或氧化還原介質電解。這在不超過1μl的樣品容量中可能有前途。
在某些情況中利用非庫侖測定如電流分析法或電勢分析技術可能是希望的。例如，庫侖法需要已知待測樣品的體積。而且，如果測定區的一個或多個維數的制造公差具有明顯變化，則小容積傳感器(即不超過1微升)測定區中的樣品體積可能難以精確再現。
如對于庫侖測定所述，在薄層電化學測定池中對不超過1μl的樣品的電流測定或電勢測定中，氧化還原介質在電極之間穿梭產生的本底信號可能是測定誤差的來源。通常希望在測定期間介質在一對電極之間穿梭不超過10次，優選地不超過1次，更優選地平均不超過0.1次。為了降低本底信號引起的誤差，可使用類似于，在某些情況中相同于，庫侖測定所用的方法和傳感器構造。實例包括上述所有方法和結構，如在施加的相對較低的電勢下進行電化學測定，在施加的負電勢下電氧化分析物，或在施加的正電勢下電還原分析物，使用氧化還原介質反應相對較慢的對電極(特別是與氧化還原介質在工作電極處的反應相比)，和/或使用在對電極處經歷不可逆反應的氧化還原介質。以下討論了其他實例。
如對于庫侖測定所述，優選地設計并操作傳感器，使得本底信號至多5倍于分析物電解所產生的信號大小。優選地，本底信號至多為一定量分析物電解產生的信號的200％、100％、50％、25％、10％或5％。以上在題目為“本底信號”的章節中敘述了與本底信號相比的分析物的量。對于電流分析法，一定量的分析物電解產生的信號是進行測定時的電流。對于電勢分析法，一定量的分析物電解產生的信號是進行測定時的電勢。
在特定的一組操作條件下，例如，溫度、測定池的幾何形狀和電極大小，本底電流的數值Iback用下列表達式得出iback＝KCMDM/d其中K是比例常數；CM是測定區中的介質濃度；DM是在正常操作條件下測定區中介質的有效擴散系數；d是電極之間的距離。
對于非庫侖測定希望降低本底電流。上述傳感器構造和方法通常是有用的，包括，例如，相對于分析物的濃度，使用低濃度的氧化還原介質和/或第二種電子轉移劑(例如酶)，和/或使用具有相對較低有效擴散常數的較大氧化還原介質。上述其他有用的方法包括降低氧化還原介質擴散的方法，例如，為可擴散的介質的流動放置阻擋層(例如帶電的或極性阻擋層)，或使用具有相對較低有效擴散常數的氧化還原介質。
在某些情況中，有效擴散系數不超過約1×10-6cm2/sec，不超過約1×10-7cm2/sec，或不超過約1×10-8cm2/sec。而且在某些情況中，CMDM的乘積(氧化還原介質的濃度乘有效擴散系數)不超過約1×10-12mol/cm·sec，不超過約1×10-13mol/cm·sec，或不超過約1×10-14mol/cm·sec。
以下提供了進行60秒的葡萄糖電流測定的具體實例，測定期間10％的葡萄糖在1微升測定池中電解，面對面電極的間距為d＝0.01cm。如果在下列條件下進行測定葡萄糖濃度CG＝5mM(或5×10-6mol/cm3)，面積A＝0.1cm2，來自于氧化還原介質的電子數nM＝1，來自于葡萄糖的電子數nG＝2，則如下確定氧化還原介質和葡萄糖所產生的本底電流。
iback＝AFnMDMCM/d＝(0.1)(96500)(1)DMCM/(0.01)＝9.65×105CMDMiG＝nGAd(0.1)FCG/t＝(2)(0.01)(0.1)(96500)(5×10-6)/60＝1.61μamps因此，如果iback/iG＝5，則CMDM的值等于8.34×10-12mol/cm2.sec。另一個實例是，如果iback/iG＝0.5，則CMDM的值等于8.34×10-13mol/cm2·sec。另外，如果iback/iG＝0.05，則CMDM的值等于8.34×10-14mol/cm2.sec。
在某些電流分析或電勢分析實施方案中，通過將工作電極與對電極或對/參比電極分開，使測定過程中氧化還原介質擴散的距離不大于例如電極之間的距離，從而降低氧化還原介質循環。氧化還原介質能擴散等于(DMt)1/2的距離，其中DM是電極之間介質的有效擴散系數，t是時間。對于30秒的測定時間和有效擴散系數為10-5～10-4cm2/sec的氧化還原介質，電極應分開至少100μm，優選地至少200μm，更優選地至少400μm。
分開工作電極與對電極的一種方法是在電極之間使用一個較厚的間隔層。圖27顯示了一種備擇方法。在該實施方案中，工作電極740置于第一個基底742上，對電極744置于第二個基底746上(備擇地，電極也可置于同一基底上)。工作電極742和對電極744偏移，使兩個電極之間的有效距離d大于間隔層748的厚度w。在一個實施方案中，電極的間距d選擇為25-1000μm、50-500μm或100-250μm。
另外，對于穩態電流分析法和電勢分析法，在測定期間，如30秒、1分鐘、5分鐘或10分鐘內，可通過限制電解速度，使速度低到足以防止分析物濃度降低超過約20％、10％或5％或更低，來控制本底信號。在某些情況中，為了控制電解速度，可降低第二種電子轉移劑的濃度或活性，和/或可降低工作電極的面積。
例如，第二種電子轉移劑可以是酶，而酶活性可能是電解速度的限制因素。例如，如果分析物濃度為5mM葡萄糖(即5×10-9mol/μl葡萄糖)，并且在30秒測定過程中將有不超過10％的葡萄糖(5×10-10摩爾)被電氧化，則對1μl而言電流應不超過3.3×10-6安培。酶的一個單位是于pH7.4和37℃下在HEPES緩沖液中在60秒鐘內催化1μmol底物電解的酶量。因此，對于葡萄糖能產生每1cm3(即1mL)可達3.3×10-3安培的電流。因此，在通過控制酶量限制電解程度的傳感器中使用的最大酶量應為1單位/cm3或更低。
也可利用相對較小的工作電極面積限制電解速度。當工作電極面積足夠小時(例如，不超過約0.01cm2，不超過約0.0025cm2，或不超過約0.001cm2)，在施加的恒定電勢下，分析物向電極的徑向擴散可產生穩態電流，這代表分析物的濃度。對于盤狀電極，可用半徑不超過60μm、不超過30μm或不超過20μm的電極達到適當的表面積。分析物的徑向擴散包括分析物從所有方向而不是從垂直于電極表面的方向運送，因此能減少或防止電極表面附近分析物的消耗。平面上的小電極允許徑向擴散。在具有較大表面積電極的傳感器中，分析物向電極的運送模式可以是半無限線性擴散而不是徑向擴散。因此，分析物向電極的運送受垂直于電極表面的方向的擴散所控制。因此，降低的輸送速度一般不能克服靠近電極表面的分析物的損耗，并且在施加的恒定電勢下，電流按照t-1/2隨時間t降低。
對于Yarnitzky和Heller，物理化學雜志(J.Phys.Chem.)10210057-61(1998)提出的類型的電勢分析法，其中電勢隨分析物濃度線性變化，分析物和/或特定氧化態的氧化還原介質的濃度在測定期間變化不應超過約20％。如果濃度變化超過20％，則分析物向氧化還原介質的擴散應受例如控制樣品室和/或測定區的溫度和/或容積的影響。
盡管本說明書中已敘述了分析物的電解，但本領域的技術人員應當認識到，相同的裝置和技術也將適用于介質平均氧化態的測定，如科特雷耳型反應。可空氣氧化的氧化還原介質在含有氧化還原介質的傳感器中，測定誤差的潛在來源是未知混合氧化態的氧化還原介質(即，不能以已知氧化態再現的介質)的存在。當氧化還原介質在工作電極處電氧化或電還原時，傳遞的電荷受其初始氧化態的影響。參考標題為“傳感器操作”的章節中的上述方程式(1)和(2)，由于氧化還原介質的部分A-即在加入樣品前為還原形式的部分-的電氧化，無法歸因于生物化學劑B氧化的電流將流動。因此，在向傳感器中加入樣品前知曉分析物的氧化態是重要的。此外，在樣品加入傳感器之前，希望所有或幾乎所有氧化還原介質具有相同的氧化狀態或程度。
每種氧化還原介質都具有還原形式或狀態和氧化形式或狀態。優選地在加入樣品之前還原形式的氧化還原介質的量顯著低于樣品中預期的分析物的量，以避免對測定電流的明顯的本底影響。在本發明的該實施方案中，在加入分析物之前還原形式的氧化還原介質的摩爾量以化學計量計對于預期的分析物濃度優選地不超過分析物摩爾量的約10％，更優選地不超過約5％，最優選地不超過約1％。(根據適用的氧化還原反應的化學計算法，比較分析物和氧化還原介質的相對摩爾量。例如，如果電解一摩爾的分析物需要兩摩爾的氧化還原介質，則加入分析物之前還原形式的氧化還原介質的摩爾量對于預期的分析物濃度優選地不超過分析物摩爾量的20％，更優選地不超過約10％，最優選不超過約2％。)以下敘述了控制還原介質的量的方法。
在本發明的另一方面，在向傳感器中加入樣品之前，氧化的氧化還原介質的量與還原的氧化還原介質的量之比優選地在類似構造的傳感器之間相對恒定。使該比值相對恒定的任何偏差都可增加用多種類似構造的傳感器對相同樣品獲得的結果的離散。對于本發明的該方面，在向傳感器中加入樣品之前，還原形式的氧化還原介質的百分數在類似構造的傳感器之間變化不超過約20％，優選地不超過約10％。
在向傳感器中加入樣品之前控制還原的氧化還原介質的量的一種方法是添加一種氧化劑來氧化還原形式的介質。最方便的一種氧化劑是O2。氧通常易于獲得而行使這種氧化功能。能通過使傳感器暴露于空氣而提供氧。另外，大多數聚合物和液體可從空氣中吸收O2，除非采取特殊的預防措施。一般而言，在貯存或暴露于空氣一定時間后，如一個月或更短，優選地一周或更短，更優選地一天或更短，至少90％的可空氣氧化(即可O2氧化的)的固態介質呈氧化態。空氣氧化可在固態時發生，或當溶液在沉積于傳感器上之前貯存足以空氣氧化該介質的一定時間后發生。對于溶液中的可空氣氧化的氧化還原介質，氧化還原介質完成至少80％，優選地至少90％的氧化所需的時間希望地至少10倍于預期的測定時間，并且也短于溶液的貯存期。優選地，至少80％，更優選地至少90％的氧化還原介質在不到1周，優選地不到1天，更優選地不到8小時，再更優選地不到1小時內被空氣氧化。
盡管希望使一批中生產的傳感器的介質為相同的氧化狀態或程度，但介質完全氧化為更高價的狀態是不必要的。另外，希望溶解的氧化還原介質的空氣氧化不要太快，以免測定期間的空氣氧化可干擾測定或產生誤差。
以上已敘述了可空氣氧化(即可O2氧化)并具有電子轉移能力的合適的介質。有用介質的一個特定家族是與多電子含氮雜環結合的鋨絡合物或多電子含氮雜環與鹵化物的組合物。多電子含氮雜環包括但不限于含有供電子取代基如烷基、烷氧基、氨基、烷氨基、酰氨基和巰基的咪唑衍生物和吡啶或菲咯啉衍生物。優選地，鋨絡合物含有不超過一個的與金屬配位的鹵化物，使得介質總體上帶正電，因而是水溶性的。一個實例是與單-、二-和聚烷氧基-2，2’-聯吡啶絡合的鋨。其他實例包括單-、二-和聚烷氧基-1，10-菲咯啉，其中烷氧基具有足以保持水中溶解度的碳氧比，它們是可空氣氧化的。這些鋨絡合物一般含有兩個取代的聯吡啶或取代的菲咯啉配體，這兩個配體不必相同。這些鋨絡合物進一步與含有一個或多個含氮雜環(如吡啶或咪唑)的單體或聚合配體絡合。優選的聚合配體包括聚(4-乙烯基吡啶)和，更優選地，聚(1-乙烯基咪唑)或其共聚物。與聚(1-乙烯基咪唑)或聚(4-乙烯基吡啶)絡合的[Os[4，4’-二甲氧基-2，2’-聯吡啶]2Cl]+/+2顯示特別可用作Os+2陽離子，其可被O2氧化為Os+3。對于[Os(4，7-二甲氧基-1，10-菲咯啉)2Cl]+/+2和其他單-、二-和聚烷氧基聯吡啶和菲咯啉與相同聚合物的絡合物預期有類似的結果。可用其他鹵素基團如溴代替氯。如上所述，對于包含下列結構的絡合物預期也有類似的結果 如果氧化還原介質的空氣氧化快得使大部分分析物還原的氧化還原介質在分析物測定期間被O2氧化，則發生與可空氣氧化的介質有關的問題。這將導致不準確的測定，因為由于介質將被空氣氧化而不是在電極處電氧化，所以分析物的量將被低估。優選地氧化還原介質與O2的反應進行得比介質的電氧化更慢，因為如果介質的空氣氧化加快，則溶解的空氣和空氣的內擴散可影響測定結果。
因為測定一般需要約10分鐘或更短，優選地5分鐘或更短，最優選地約1分鐘或更短，故優選地盡管介質在貯存中可被空氣氧化，但在測定期間不被溶解氧氧化。因此，當溶解于血漿或血清中時在1分鐘優選地甚至在10分鐘后仍未空氣氧化的介質是優選的。一般而言，在測定期間少于5％優選地少于1％的還原介質應被空氣氧化。
介質空氣氧化的反應速度能通過選擇適當的絡合聚合物來控制。例如，與聚(1-乙烯基咪唑)配位偶聯的[Os(4，4’-二甲氧基-2，2’-聯吡啶)2Cl]+/+2的氧化反應比與聚(4-乙烯基吡啶)偶聯的相同Os絡合物更快。適當聚合物的選擇將取決于預期的分析物濃度和在電極之間施加的電勢，這兩者都決定了電化學反應的速度。
因此，在本發明的一個實施方案中，優選的氧化還原介質具有下列特征1)該介質不與樣品中或傳感器中除分析物之外的任何分子反應(任選地，通過第二種電子轉移劑)；2)在向傳感器中加入樣品前，幾乎全部氧化還原介質都被氧化劑如O2氧化；3)氧化劑對氧化還原介質的氧化慢于電極對介質的電氧化。
此外，如果氧化還原介質將在分析物存在下氧化并在電極處電還原，則需要還原劑而不是氧化劑。適當選擇還原劑和介質的相同考慮因素如上所述適用于氧化劑。
在本發明的電化學傳感器中使用穩定的可空氣氧化的氧化還原介質在貯存與包裝期間具有另一個優點。包含可空氣氧化的氧化還原介質的本發明的傳感器能包裝于含分子氧的空氣中，并貯存較長時間，例如長于1個月，而使至少80％，優選地至少90％的氧化還原物種保持氧化態。可空氣氧化的介質在光學傳感器中的應用本發明的可空氣氧化的氧化還原物種能在其他類型的傳感器中使用。由于絡合的Os+2和Os+3物種的吸收光譜、發光和/或熒光特征的差異，上述鋨絡合物適用于光學傳感器。氧化還原物種的吸收、發射、透射、發光和/或熒光測定將與樣品中分析物的量相關聯(在分析物與氧化還原物種直接或通過第二種電子轉移劑如酶反應后)。在這種構造中，氧化還原介質的摩爾量以化學計量計應大于預計將充滿傳感器測定區的分析物的摩爾量。
包括光導光纖傳感器在內的標準光學傳感器和測定技術能適于使用可空氣氧化的介質。例如，本發明的光學傳感器可包括光透射或光反射支架，其上覆蓋有可空氣氧化的氧化還原物種和優選地分析物反應性酶，形成薄膜。支承薄膜構成測定區的一個邊界，樣品置于其中。測定區的其他邊界取決于測定池的構造。待含分析物的樣品充滿測定區后，分析物優選地通過與分析物反應性酶反應對可空氣氧化的介質的還原導致介質氧化態的轉變，這可根據介質在一種或多種波長的光下光透射、吸收或反射光譜或發光和/或熒光的改變來檢測。多電極傳感器和校準可由于多種原因使用多電極傳感器。例如，多電極傳感器可用于使用單一樣品檢測多種分析物。圖5顯示的多電極傳感器的一個實施方案含有一個或多個樣品室，該室又可含有一個或多個工作電極22，每個工作電極22界定了不同的測定區。如果氧化還原介質是不可濾出的，則一個或多個工作電極含有適當的化學試劑如適當的酶用于檢測第一種分析物，而其余的一個或多個工作電極含有適當的化學試劑用于檢測第二種分析物。這些化學試劑(例如氧化還原介質和/或第二種電子轉移劑)能在工作電極上沉積為傳感層，或者，若使用可擴散的試劑，則它們能沉積于樣品室的任一表面上或置于樣品中。例如，一個多電極傳感器可包括1)一個或多個工作電極，其在傳感層中含有葡萄糖氧化酶用來測定葡萄糖濃度，和2)一個或多個工作電極，其在傳感層中含有乳酸氧化酶用來測定乳酸濃度。
多電極傳感器也可用來提高所得讀數的精度。可平均得自(全部或檢測相同分析物的)每個工作電極的量值，獲得更精確的讀數。在某些情況中，如果數值與平均值的差超過閾限，則可舍棄該量值。例如，該閾限可根據統計學參數如平均量值的標準差來確定。然后可忽略舍棄的數值重新計算平均值。而且，如果假定特定電極有問題，可在后面的檢測中忽略產生棄值的電極的讀數。此外，只有在根據其他電極的讀數舍棄預定量的讀數后才可舍棄特定的電極。
除了使用多電極傳感器提高精度外，也可對每一電極進行多次測定，并將其平均以提高精度。該技術也可用于單電極傳感器來提高精度。
當使用大量生產的傳感器時，由于傳感器測定區容積的變化，可發生測定誤差。測定區三個維度中的兩個—長度和寬度—通常相對較大，約為1-5mm。能以2％或更低的變度容易地產生這種尺寸的電極。但是，亞微升測定區容積需要第三個維度比長度或寬度小一或兩個數量級。如上所述，樣品室的厚度一般為約50-約200μm。厚度的制造偏差可為約20-50μm。因此，希望提供一種方法以適合測定區內樣品體積的這種不確定性。
在圖5所示的本發明的一個實施方案中，基層材料48上具有多個工作電極42、44、46。這些電極被另一種基底(未顯示)覆蓋，該基底具有置于其上的對電極(未顯示)，產生多個面對面電極對。特定傳感器中電極對之間工作電極與對電極間距的變異明顯降低，因為工作電極和對電極均位于一種基底上，在每一電極對之間有相同的間隔層28(見圖3)。
在此展示了能用于精確測定電極對測定區容積，并也可用于降低噪音的多電極傳感器的一個實例。在該實例中，一種工作電極42含有一種不可濾出的氧化還原介質和不可濾出的第二種電子轉移劑(如酶)。工作電極42與相應的對電極之間可放置吸附劑。另一種工作電極44包括不可濾出的氧化還原介質，但在電極上無第二種電子轉移劑。此外，這第二種電極對可在工作電極44與相應的對電極之間含有吸附劑。任選的第三種工作電極46不含氧化還原介質并且無第二種電子轉移劑與電極結合，在工作電極46與相應的對電極之間也無吸附劑。能用可擴散的氧化還原介質和/或可擴散的第二種電子轉移劑構造類似的結構，盡管可擴散的成份不只限于置于工作電極上。在某些情況中，電極對之間的距離足以使得氧化還原介質和/或酶在測定期間和/或從向樣品室中加入相同樣品到測定結束為止的時間內基本上不在電極對之間擴散。
通過同時電解靠近電極42和44的測定區中的樣品，能測定在加入樣品之前不均一氧化態的氧化還原介質引起的傳感器誤差。在電極42處，分析物電解產生樣品信號。在電極44處，由于不存在第二種電子轉移劑(假定第二種電子轉移劑是必需的)故分析物不電解。然而，由于在加入樣品之前為混合氧化態的氧化還原介質(即一些氧化還原中心為還原態，一些為氧化態)的電解，和/或可擴散的氧化還原介質在工作電極與對電極之間的穿梭，將通過電荷(且將流過電流)。能從第一個電極對之間通過的電荷中減去第二個電極對中電極之間通過的少量電荷，以基本上消除由氧化還原介質的氧化態引起的誤差，和/或消除由可擴散的氧化還原介質引起的本底電流。該方法也可降低與其他電解的干擾物如抗壞血酸、尿酸鹽和乙酰氨基苯酚有關的誤差，以及與電容充電和法拉第電流有關的誤差。
優選地能通過在無任何液體時測定電極46(或在不含吸附劑時測定任一其他電極42、44)與相應的對電極之間的電容測定樣品室的厚度。電極對的電容取決于電極的表面積、電極間距和極板之間物質的介電常數。空氣的介電常數是一致的，這通常意味著該電極構造的電容為幾個皮法(或者，假定大多數生物液體的介電常數約為75，如果電極與對電極之間存在液體，則為約100-1000皮法)。因此，由于電極的表面積已知，故電極對電容的測定使測定區厚度的測定在約1-5％內。
通過在加入液體之前和之后測定電極44(不含第二種電子轉移劑)與相關對電極之間的電容能測定吸附劑中空隙容積的大小。加入液體后，由于液體具有更高的介電常數，電容明顯提高。測定含或不含液體時的電容使得能測定電極之間的間距和吸附劑的空隙容積，從而測定反應區中液體的體積。
其他電極構造也能利用這些技術(即，在不含主要成份時的電容測定和庫侖測定)降低背景噪音和由干擾物和不準確了解被測樣品體積引起的誤差。能發展包括一個或多個電極對和一個或多個上述測定的方案，其屬于本發明的范圍內。例如，電容測定只需要一個電極對，而為了方便可使用其他電極對。填充指示器當使用填充有1μL或更少液體的樣品室時，通常希望能確定樣品室何時充滿。圖18A-18C顯示一種具有填充指示器結構的傳感器。圖18A顯示第一個基底500，其上印制有一個工作電極502。在第一個基底500和工作電極502上形成一個間隔層504(圖18B)，例如粘合劑或雙面粘合帶層，在該層中形成一個溝槽506，形成樣品室。第二個基底508上印有兩個對電極510、512，如圖18C所示(相對于圖18A和18B翻轉，以顯示電極側面)。在某些情況中，最靠近溝槽506的入口514的對電極510在樣品室中具有至少兩倍于，優選地至少5倍或10倍于另一個對電極512的表面積。
通過觀察當傳感器充滿液體時能第二個對電極512與工作電極502之間的信號，能指示傳感器充滿。當液體到達第二個對電極512時，對電極產生的信號應改變。合適的觀察信號包括，例如，第二個對電極512與工作電極502之間的電壓、電流、電阻、阻抗或電容。此外，充滿后可觀測傳感器，以確定信號值(例如，電壓、電流、電阻、阻抗或電容)是否達到指示樣品室充滿。
在另一個實施方案中，對電極和/或工作電極可分成兩個或更多部分，并觀測來源于各部分的信號以確定傳感器是否充滿。在一個實施例中，工作電極與對電極和指示電極為面對面關系。在另一個實施例中，對電極、工作電極和指示電極不是面對面關系，但可能是例如并排的。在其他情況中，第二個電極對可利用來源于監測改變和/或接近特定值的第二個電極對的信號，確定傳感器已充滿。相比于工作電極和對電極，指示電極一般位于樣品入口的更下游。
對于如圖19A-19C和圖20A-20C所示的側面填充傳感器，可在主對電極的任一側放置兩個指示電極。這使使用者可從左側或右側填充樣品室，而指示電極位于更上游。這種三電極構造不是必需的。側面填充傳感器也可具有單一指示電極，和優選地指明哪個側面應當與樣品液體接觸的標志。
在一個實施方案中，使用三個對/參比電極和/或指示電極檢測樣品室何時開始填充，樣品室何時充滿，以防止樣品室的部分填充。在該實施方案中，兩個指示電極保持與最大對/參比電極不同的電勢。用指示電極與對/參比電極之間的電流指示樣品室填充的開始與完成。
在其他情況中，每個對/參比電極的電勢可以相同。當所有三個對/參比電極處的電勢相同如為0伏時，則測定區開始填充，液體使工作電極與第一個對/參比電極之間有電接觸，由于分析物與酶和介質的反應在第一個對/參比電極處產生電流。當液體到達第三個對/參比電極時，類似于第一個對/參比電極可檢測到另一種電流，表明測定區充滿。當測定區充滿時，三個對/參比電極可一起短路，或者其信號可加成或以其他方式合并。
根據以上對多電極傳感器所述的方法，也可用指示電極提高分析物測定的精度。指示電極可作為工作電極或作為對電極或對/參比電極。在圖18A-18C的實施方案中，指示電極512能作為相對于工作電極502而言的第二個對電極或對/參比電極。來源于指示電極/工作電極對的量值能與來源于第一個對電極或對/參比電極/工作電極對的量值合并，獲得更準確的量值。在一個實施方案中，指示電極可作為相對于對電極或對/參比電極的第二個工作電極。在另一個實施方案中，指示電極可作為帶有第二個對電極或對/參比電極的第二個工作電極。在再一個實施方案中，指示電極可作為帶有第二個工作電極的第二個對電極或對/參比電極。
傳感器或傳感器讀數器可包括一種標記(例如可視標志或聲音信號)，其可響應指示電極而激活，警告使用者測定區已充滿。在某些情況中，傳感器或傳感器讀數器可構造為，當指示電極表明測定區已充滿時，在警告或不警告使用者的情況下開始讀數。例如，可通過在工作電極與對電極之間施加電勢，并開始監測工作電極產生的信號，來開始讀數。樣品的加熱可加熱樣品以提高分析物擴散、氧化或還原速度。這種加熱可經多種技術實現，包括將傳感器置于加熱環境中或在傳感器中使用加熱裝置。
另一種技術包括在傳感器上添加一種加熱元件，如能將電能轉化為熱能的金屬線或印劑(ink)。這種金屬線或印劑能添加在例如基層材料如聚合物膜相對于一個或多個工作、對、參比或對/參比電極的對側，或添加于工作、對、參比或對/參比電極外周。在某些情況中，樣品可加熱至達初始溫度以上5-20℃。在其他情況中，可不知樣品溫度，但可對金屬線或印劑使用恒定量的功率或電流。
實施例本發明通過下列實施例進一步表征。這些實施例不是意在限制前面充分敘述的本發明的范圍。本發明的概念的變化為本領域技術人員所明知。
實施例1用于葡萄糖濃度測定的小容積體外傳感器的制造構造一種對應于圖1所示本發明的實施方案的傳感器。工作電極構建于MylarTM膜(DuPont)上，MylarTM膜厚度為0.175mm，直徑約2.5cm。在MylarTM膜上篩網印制直徑約1cm約12微米厚的碳墊。碳電極上覆蓋厚度為12μm，在中心有一個直徑4mm的開口的水溶性介電絕緣體(Insulayer)。
未覆蓋介電體的碳電極的中心覆蓋有一種不可濾出的氧化還原介質。該氧化還原介質的形成方法是，如Taylor等人，電分析化學雜志(J.Electroanal.Chem.)396511(1995)所述，將聚(1-乙烯基咪唑)與Os(4，4’-二甲氧基-2，2’-聯吡啶)2Cl2絡合，隨后用聚乙二醇二縮水甘油醚(PEGDGE)交聯葡萄糖氧化酶與鋨聚合物。氧化還原介質中鋨與咪唑官能基之比接近1∶15。介質沉積于工作電極上形成厚度0.6μm、直徑4mm的層。電極上介質的覆蓋度約為60μg/cm2(干重)。間隔層材料置于電極上介質覆蓋的電極表面周圍。間隔層由聚四氟乙烯(PTFE)制成，厚度約為0.040mm。
吸附劑與介質覆蓋的工作電極表面接觸。吸附劑由尼龍(Tetko Nitex尼龍3-10/2)制成。吸附劑直徑為5mm，厚度為0.045mm，空隙容積約為20％。由吸附劑和電極的尺寸和特征計算測定區中樣品的體積。測定區直徑為4mm(介質覆蓋的電極表面的直徑)，厚度為0.045mm(尼龍吸附劑的厚度)，體積為0.57μL。在該間隙中，約80％充滿尼龍，其余20％為尼龍吸附劑內的空隙空間。測定區內的樣品體積約為0.11μL。
對/參比電極與間隔層和吸附劑相對于工作電極的一側接觸，使得兩個電極彼此面對。對/參比電極構建于厚度為0.175mm，直徑約為2.5cm的MylarTM膜上，其上篩網印制了直徑約1cm、12微米厚的銀/氯化銀層。
用電極組件任一側上的極板將電極、吸附劑和間隔層壓在一起。極板由聚碳酸酯塑料制成，牢固夾緊使傳感器結合在一起。電極在使用前在空氣中貯存48小時。
接頭從工作電極和對/參比電極中伸出，并將與分析裝置電接觸。用一個恒電位儀在工作電極與對/參比電極之間施加+200mV的電勢差，工作電極為陽極。無樣品時電極之間無電流，這是預期的，因為在電極之間不存在導電通路。
樣品經尼龍吸附劑的小接頭加入，該接頭形成為樣品室尼龍吸附劑的伸出部分。當樣品與吸附劑接頭接觸時，液體經毛細作用吸入吸附劑中。當樣品室充滿且樣品接觸電極時，電流在電極之間流動。當樣品中的葡萄糖分子接觸工作電極上的葡萄糖氧化酶時，葡萄糖分子被電氧化為葡糖酸內酯。氧化還原介質中的鋨氧化還原中心然后再氧化葡萄糖氧化酶。鋨中心隨后通過與工作電極反應被再氧化。這產生電流，可用庫侖計(EG&G Princeton Applied Research#173型)測定并同時綜合。
電化學反應繼續進行，直到電流達到穩態值，這表明超過95％的葡萄糖已被電還原。積分以特定間隔測定電流所獲得的電流曲線，來確定電化學反應過程中傳遞的電荷量。然后將這些電荷對已知的葡萄糖濃度作圖，得到校正曲線。
用0.5lμL等份在人造腦脊髓液中或對照血清(Baxter-Dade，MonitrolLevel 1，Miami，FL)中含3-20mM已知濃度葡萄糖的溶液測試該傳感器。人造腦脊髓液制備成下列鹽的混合物126mM NaCl、27.5mMNaHCO3、2.4mM KCl、0.5mM KH2PO4、1.1 M CaCl2·2H2O和0.5mMNa2SO4。
分析結果示于表1和圖7中。在表1中，Qavg是用來電解3～6份相同待測樣品中葡萄糖的平均電荷(圖7對每份待測樣品的電荷作圖)，90％的上升時間對應于90％葡萄糖被電解所需的時間長度。數據顯示10-20％的傳感器精度，表明傳感器對于低葡萄糖濃度及在生理相關范圍(30μg/dL～600μg/dL)中有足夠的靈敏度。
表1使用葡萄糖氧化酶的傳感器結果
用一種或多種方程式擬合葡萄糖濃度的平均測定值以產生校正曲線。圖8顯示表1的葡萄糖/緩沖液數據的校正曲線。從這些計算中忽略15.0mM葡萄糖的量值之一，因為它比測定平均值高兩個標準差。較高的葡萄糖濃度(10-20mM)用線性方程式擬合。較低的葡萄糖濃度用二階多項式擬合。
圖9顯示在誤差網格上作圖的表1的數據，該誤差網格由Clarke等人，糖尿病護理(Diabetes Care)5，622-27，1987提出，用于根據不精確的葡萄糖濃度測定法測定誤差的結果。該圖將“真實”的葡萄糖濃度對測定的葡萄糖濃度作圖，其中通過對圖7的每一數據點用圖8的校正曲線計算葡萄糖濃度，來確定測定的葡萄糖濃度。A區中的點是準確的，B區中的點是臨床可接受的，C、D和E區中的點可引起越來越不恰當且最終危險的處理。
有34個數據點。這些數據點中的91％落入A區，6％落入B區，3％落入C區。只確定了一個讀數在C區中。該讀數超出范圍，未在圖9中顯示。因此，97％的讀數落入臨床可接受的A區和B區。
通過還原所有Os，然后在樣品室中用不含葡萄糖的緩沖液電氧化，測定Os原子的總數。這產生59.6±5.4μC的電荷。該結果與表1中不含葡萄糖緩沖液的結果的對比表明，在加入樣品之前不到20％的Os為還原形式。還原態鋨數量的變異性不到存在的鋨的總量的5％。
實施例2葡萄糖傳感器對干擾物的反應用與以上實施例1所述相同的方法構造的傳感器測定傳感器對干擾物的反應。血糖測定的主要電化學干擾物是抗壞血酸、乙酰氨基苯酚和尿酸。這些常見干擾物的正常生理或治療(對于乙酰氨基苯酚)濃度范圍為抗壞血酸0.034-0.114mM乙酰氨基苯酚0.066-0.200mM尿酸(成年男性)0.27-0.47mMTietz，《臨床化學教科書》，C.A.Burtis和E.R.Ashwood編，W.B.Saunders Co.，Philadelphia，1994，2210-12頁。
在以上列出的生理或治療范圍的高限之干擾物濃度檢測不含葡萄糖的緩沖干擾物溶液。每種情況中注射的樣品體積均為0.51μl。在電極之間施加+100mV或+200mV的電勢。通過從用存在的干擾物記錄的平均信號中減去從只含緩沖液(即不含干擾物)的溶液中獲得的平均本底電流，計算平均電荷(Qavg)。將得到的平均電荷與表1中4mM和10mM葡萄糖濃度的信號比較，確定由干擾物引起的百分誤差。
表2葡萄糖傳感器的干擾物反應
這些結果表明，尤其對于低電勢測定而言，抗壞血酸和乙酰氨基苯酚不是葡萄糖傳感器構造的明顯干擾物。然而，尿酸導致明顯的干擾。通過校準傳感器對0.37mM尿酸濃度的反應，例如，通過從傳感器的所有葡萄糖測定結果中減去用外推法確定的適量電荷，能使這種干擾減至最小。由尿酸濃度(成年男性尿酸濃度為0.27～0.47)0.10mM變化引起的誤差在4mm葡萄糖和100mV時約為6％。
實施例3含葡萄糖脫氫酶的傳感器制造一種類似于實施例1所述的傳感器并用于本實施例，不同之處在于將葡萄糖氧化酶替換為吡咯并喹啉醌葡萄糖脫氫酶，與實施例1中的+200mV電勢不同，只施加+100mV的電勢。結果示于下面的表3中并在圖10中作圖。
表3應用葡萄糖脫氫酶的傳感器結果
結果表明，由葡萄糖脫氫酶傳感器獲得的電荷大大高于相應的葡萄糖氧化酶傳感器，尤其是對于低濃度葡萄糖而言。對于4mM葡萄糖濃度，兩種傳感器所獲得的量值相差5倍。另外，葡萄糖脫氫酶傳感器在較低電勢下操作，因而降低了干擾物反應的影響。
另外，與實施例1的結果不同，表3的結果全部用線性校正曲線擬合，如圖10所示。為簡化傳感器結構和操作，特別優選單一線性校正曲線。
同樣，假定表2的干擾結果適用于該傳感器，則對于100mV電勢時的3mM葡萄糖溶液，所有干擾物都將產生不到7％的誤差。
實施例4液流中乳酸濃度的測定用具有玻璃態碳電極的流動測定池(BioAnalytical Systems，Inc，#MF-1025)構建該實施例的傳感器。在流動測定池的電極上包涂有一種氧化還原介質，形成工作電極。在此情況中，氧化還原介質是一種聚合物，它是通過將聚(1-乙烯基咪唑)與Os(4，4’-二甲基-2，2’-聯吡啶)2Cl2以每15個咪唑官能基1個鋨的比例絡合形成的。乳酸氧化酶與該聚合物通過聚乙二醇二縮水甘油醚交聯。該介質以500μg/cm2的覆蓋度和5Tm的厚度包涂于電極上。該介質覆蓋有一層徑跡蝕刻的聚碳酸酯膜(Osmonics-Poretics #10550)以改善在液流中的粘性。該膜然后再覆蓋一層50Tm厚的間隔墊圈(BioAnalytical Systems，Inc，#MF-1062)，其含有限定了樣品室和相應測定區的空隙。傳感器的裝配通過連接含有流動測定池的參比電極與輔助電極的測定池組件(BioAnalytical Systems，Inc，#MF-1005)完成。
在此情況中，樣品室對應于與表面積為0.031cm2的介質包被的電極接觸的50Tm厚圓筒(間隔墊圈的厚度)。該傳感器測定區中的計算樣品體積約為0.16TL。
液流的流速為5TL/min。標準三電極恒電位儀與測定池導線連接，并在氧化還原介質包被的玻璃態碳電極與參比電極之間施加+200mV的電勢。該電勢足以引發酶介導的乳酸氧化。
當液流流經傳感器時，測定與乳酸濃度成比例的穩態電流。以周期性間隔停止液流，并使電流在電極之間流動，直到測定區中幾乎全部乳酸被電氧化，這由達到穩定的穩態電流指示。通過積分從流動停止到電流達到穩態所記錄的不同電流得到乳酸電氧化所需的總電荷Q。然后用下列方程式計算濃度[乳酸]＝Q/2FV (4)其中V是測定區中的樣品體積，F是法拉第常數。
用標稱乳酸濃度為1.0、5.0和10.0mM的乳酸溶液進行該測定。該試驗所測濃度分別為1.9、5.4和8.9mM。
實施例5與聚(1-乙烯基咪唑)絡合的Os(4，4’-二甲氧基-2，2’-聯吡啶)2Cl+/+2氧化態的測定具有三電極設計的傳感器從英格蘭Long Hanborough的EcossensorsLtd.商品獲得，其模型名稱為“大面積一次性電極”。該傳感器含有平行的和共面的工作、參比和對電極。工作表面積(0.2cm2)和對電極由印制的碳構成，參比電極由印制的Ag/AgCl構成。碳工作電極上覆蓋一種氧化還原介質。該氧化還原介質的形成方法是，將聚(1-乙烯基咪唑)與Os(4，4’-二甲基-2，2’-聯吡啶)2Cl2以每個Os陽離子15個咪唑基的比例絡合，隨后用聚乙二醇二縮水甘油醚將鋨聚合物與葡萄糖氧化酶交聯。
該電極在室溫下熟化24小時。然后將共面電極陣列浸入緩沖電解液中，并在工作電極與參比電極之間施加+200mV的電勢(足以使Os(II)轉化為Os(III))。
一施加電勢，即有低于1μC的不可檢測的電荷通過。隨后氧化還原介質的還原和再氧化產生足以使全部Os從Os(II)轉化為Os(III)的65TC的電荷。因此，氧化還原介質中超過98％的Os陽離子為希望的Os(III)氧化態。
實施例6與聚(4-乙烯基吡啶)絡合的Os(4，4’-二甲氧基-2，2’-聯吡啶)2Cl+/+2氧化態的測定用相同的工作/對/參比電極構造進行與實施例5類似的實驗，不同之處在于工作電極上的氧化還原介質改為Os(4，4’-二甲氧基-2，2’-聯吡啶)2Cl2與聚(4-乙烯基吡啶)的絡合物，它是以每個Os陽離子12個吡啶基的比例絡合，并經聚乙二醇二縮水甘油醚與葡萄糖氧化酶交聯的。
構造兩種傳感器。這兩種傳感器的電極在室溫下熟化24小時。然后將電極浸入緩沖電解液中，并在工作電極與參比電極之間施加+200mV的電勢。
對電極施加電勢后，兩個傳感器中即分別通過2.5TC和3.8TC的電荷。隨后氧化還原介質的還原和再氧化分別產生27.9TC和28.0TC的氧化電荷。因此，傳感器最初含有91％和86％的為希望的Os(III)氧化態的Os陽離子。
實施例7光學傳感器通過向透光支持物(如載玻片上)添加含交聯的酶的氧化還原聚合物膜構造一種光學傳感器。氧化還原介質的量等于或大于(在化學計量意義上)預計可充滿測定區的分析物的最大量。間隔材料、吸附劑和面對面支持物牢固夾緊。使樣品室通過裝配的傳感器向光密度檢測器或向發光和/或熒光檢測器透光。當樣品充滿樣品室且氧化還原介質氧化時，樣品室中氧化還原介質的吸收、透射、反射或發光和/或熒光的改變與樣品中葡萄糖的量相關聯。
實施例8上臂刺血針穿刺得到的血液體積用刺血針多次刺破個體的前臂，以確定用該方法獲得的血液體積的可重復性。盡管在每個前臂的前部和左前臂的背部進行超過30次的刺血針穿刺，但個體自稱每次穿刺實際上無痛苦。
前臂用Payless Color刺血針刺破。用1μL毛細管收集每次穿刺的血液，并通過測定血柱的長度確定體積。每次穿刺獲得的體積示于以下的表4中。
表4刺血針穿刺的體積
實施例9含有可擴散的氧化還原介質的傳感器通過在聚酯基底上印染石墨墨水(石墨#G4491，Ercon，Wareham，MA)制成一種傳感器。5.5μg/cm2[Os(二甲氧基聯吡啶)2(乙烯基咪唑)Cl]Cl、23.7μg/cm2PQQ-葡萄糖脫氫酶和18.2μg/cm2Zonyl FSO_表面活性劑(E.I.duPont de Nemours & CO.，Inc.，Wilmington，DE)的混合物沉積于工作電極的一部分上。然后在工作電極上使用150μm厚的壓敏膠粘帶，使得只有工作電極的一部分暴露，形成樣品室。在壓敏膠粘帶之上具有置于該膜上、具有對電極的第二種聚酯膜。該對電極是通過將Ag/AgCl墨水(銀/氯化銀#R414，Ercon，Wareham，MA)置于第二種聚酯膜上形成的。Ag/AgCl對電極上覆蓋約100μg/cm2用PEGDGE交聯的甲基化聚(乙烯基咪唑)。
實施例10在0V電勢下用含可擴散氧化還原介質的傳感器測定葡萄糖如實施例9所述制造傳感器，并用于測定葡萄糖濃度為0、90、180、270和360mg/dL的葡萄糖/緩沖溶液。在圖15中用圖表示了對每一溶液隨時間測定的電荷。在不含葡萄糖時，傳感器指示約3mg/dL的葡萄糖濃度。圖16顯示在每一葡萄糖濃度時三種傳感器測定的相對于葡萄糖濃度的電荷。測定的電荷隨葡萄糖濃度線性變化，這類似于應用不可濾出的氧化還原介質的傳感器所觀察到的。
實施例11用可擴散的氧化還原介質制成的其他傳感器傳感器A和B通過聚酯基底上印染石墨墨水(石墨#G4491，Ercon，Wareham，MA)制成。對于傳感器A，8.0μg/cm2[Os(二甲氧基聯吡啶)2(乙烯基咪唑)Cl]Cl、34.7μg/cm2PQQ-葡萄糖脫氫酶和26.6μg/cm2ZonylFSO_表面活性劑(E.I.duPont de Nemours & CO.，Inc.，Wilmington，DE)的混合物沉積于工作電極的一部分上。對于傳感器B，24μg/cm2[Os(二甲氧基聯吡啶)2(乙烯基咪唑)Cl]Cl、104μg/cm2PQQ-前萄糖脫氫酶和80μg/cm2Zonyl FSO_表面活性劑(E.I.duPont de Nemours &CO.，Inc.，Wilmington，DE)的混合物沉積于工作電極的一部分上。然后在每一傳感器的工作電極之上使用200μm的壓敏膠粘帶，使得只有工作電極的一部分暴露，形成樣品室。在壓敏膠粘帶之上具有置于該膜上、具有對電極的第二種聚酯膜。每一傳感器的對電極是通過將Ag/AgCl墨水(銀/氯化銀#R414，Ercon，Wareham，MA)置于第二種聚酯膜上形成的。Ag/AgCl對電極上覆蓋約100μg/cm2用PEGDGE交聯的甲基化聚(乙烯基咪唑)。
實施例12改變傳感器中可擴散的氧化還原介質的量測試傳感器A和B，確定分析物電解所需的時間長度。圖17顯示其結果。提高樣品中可擴散的氧化還原介質的量可降低傳感器的響應時間。
實施例13小容積傳感器的臨床準確度對應于圖24A、24B和24C所示的本發明的實施方案構建該實施例的傳感器。如實施例11所述，在MelinexTM聚酯膜(DuPont，Wilmington，Delaware)上印制碳工作電極。碳電極上覆蓋有18μg/cm2Os[(MeO)2bpy]2(1-乙烯基咪唑)Cl3、162μg/cm2GDH(東京，日本)、1.35μg/cm2PQQ(Fluka，Mila，Wisconsin)和60μg/cm2Zonyl FSO (DuPont，Wilmington，Delaware)。在18℃和50％相對濕度下對工作電極進行包被。在碳電極上放置粘合劑(50μm厚)，圍繞包被的表面并形成寬度約為0.04英寸的溝槽。
如實施例11所述，兩個Ag/AgCl對/參比電極印制于第二個MelinexTM聚合物膜上。然后使該膜接觸粘合劑和工作電極膜，使工作電極和兩個對電極彼此面對。對/參比電極上覆蓋142μg/cm2甲基化的聚乙烯基咪唑、18μg/cm2PEGDGE(PolySciences，Warington，Pennsylvania)和7μg/cm2Zonyl FSO(DuPont，Wilmington，Delaware)。在其他對電極下游的一個對電極用作指示電極，以確定樣品室何時充滿。用手壓滾經三次輥壓將傳感器制成薄層，并在室溫下于CaSO4上老化3天。
構建傳感器，使得當指示電極與對/參比電極之間流過足夠的電流時，外電路能發出可見信號，指示工作電極上的溝槽中充滿了血液。
在使用該傳感器前幾天，進行干電容測量來確定樣品室容積的一致性。電容的變化反映電極的失調和/或粘合劑厚度的變化。測定的平均電容為7.49pF，標準差為0.28pF或3.8％。測定的最大電容為8.15pF，測定的最小電容為6.66pF。
用該傳感器測定采自23人的血樣中的葡萄糖濃度。在該研究中，人們為26～76歲，14人為男性，9人為女性。6人診斷為1型糖尿病，16人診斷為2型糖尿病，1人不知糖尿病分型。受試者的平均血細胞比容為40.7％，標準差為3.9％。最大血細胞比容為49％，最小血細胞比容為33.2％。
通過刺破受試者的手指收集每人的一份血樣。小容積傳感器中填充剩余的血液。
然后用2mm CareletTM刺臂將每人的三份血樣收集于小容積傳感器中。如果在10秒鐘內未獲得足夠的樣品，則按揉穿刺傷口的區域，然后填充傳感器。69份樣品中的16份需要按揉傷口。
經靜脈穿刺收集每人三份血樣。至少對一份樣品進行YSI血糖測定和血細胞比容測定。46個小容積傳感器中也填充這些樣品的血液。
在施加的0mV電勢下進行傳感器測定。在加入任何樣品之前BAS恒電位儀(CV50W，West Lafayette，Indiana)為“開”，使得當條帶充滿時立即電解。集電持續150秒(該電荷被稱為“完全”電解)，但大多數測定基本上在150秒前完成。未舍棄任何結果。進行三次連續的傳感器血糖測定。
用YSI血糖測定儀(Yellow Springs Instruments，2300型化學葡萄糖分析儀)進行對照樣品的測定。
將數據對YSI靜脈結果作圖，并由這些數據確定線性函數。所有數據均收集自傳感器中葡萄糖的“完全”(150秒)電解。
圖28顯示69個小容積傳感器檢測采自臂的血液的數據。R2為0.947，平均CV(變異系數)為4.8％，RMS(均方根)CV為5.7％。
圖29顯示23個小容積傳感器檢測采自手指的血液的數據。R2為0.986。
圖30顯示46個小容積傳感器檢測靜脈血的數據。R2為0.986。平均CV為3.8％。RMS CV為4.6％。
已參照多種具體和優選的實施方案和技術敘述了本發明。然而，本領域技術人員應當明白，在本發明的精神和范圍內可進行多種變化和修改。
本說明書中的所有公開文本和專利申請均表現出本發明所屬領域中技術人員的水平。所有公開文本和專利申請均在此引用作為參考，以使每一公開文本或專利申請均具體且單獨地引用作為參考。
權利要求
1.一種用于測定樣品液中分析物濃度的傳感器，該傳感器包括一個包括工作電極和對電極的電極對，其中至少工作電極的一部分距對電極的一部分不超過200μm，任選地，該對電極是一種對/參比電極；一個任選的參比電極；一個樣品室，其用于使樣品液與工作電極、對電極和參比電極—如果有的話—電解接觸，該樣品室包括一個與工作電極、對電極和參比電極—如果有的話—相鄰的測定區，其中該測定區的大小可含有體積不超過約1μL的樣品液，任選地，該樣品室的大小可含有不超過約1μL的樣品液；和位于測定區中的一種分析物反應性酶和一種可擴散的氧化還原介質；其中構造并排列該傳感器，使得可擴散的氧化還原介質產生的本底信號不超過平均正常生理量的分析物氧化或還原所產生信號的5倍。
2.一種用于測定樣品液中分析物濃度的傳感器，該傳感器包括一個包括工作電極和對電極的電極對，其中至少工作電極的一部分距對電極的一部分不超過200μm，任選地，對電極是一種對/參比電極；一個任選的參比電極；一個樣品室，其用于容納樣品液使之與工作電極、對電極和參比電極—如果有的話—電解接觸，該樣品室包括一個與工作電極、對電極和參比電極—如果有的話—相鄰的測定區，其中該測定區的大小可含有體積不超過約1μL的樣品液，任選地，該樣品室的大小可含有不超過約1μL的樣品液；和置于測定區中的一種分析物反應性酶和一種可擴散的氧化還原介質；其中構造并排列該傳感器，使得可擴散的氧化還原介質產生的本底信號不超過相應于正常生理量的分析物的平均偏差的一定量分析物氧化或還原所產生信號的5倍。
3.根據權利要求1和2任一項的傳感器，其中構建并排列該傳感器，使得可擴散的氧化還原介質產生的本底信號相同或低于平均正常生理量的分析物氧化或還原所產生的信號，優選地不超過預期量的分析物氧化或還原所產生信號的25％，更優選地不超過預期量的分析物氧化或還原所產生信號的5％。
4.一種用于測定樣品液中分析物濃度的傳感器，該傳感器包括一個包括工作電極和對電極的電極對，其中至少工作電極的一部分距對電極的一部分不超過200μm，任選地，對電極是一種對/參比電極；一個任選的參比電極；一個樣品室，其用于容納樣品液使之與工作電極、對電極和參比電極—如果有的話—電解接觸，該樣品室包括一個與工作電極、對電極和參比電極—如果有的話—相鄰的測定區，其中該測定區的大小可含有體積不超過約1μL樣品液，任選地，該樣品室的大小可含有不超過約1μL的樣品液；和置于測定區中的一種分析物反應性酶和一種可擴散的氧化還原介質；其中該分析物是葡萄糖，構建并排列該傳感器，使得可擴散的氧化還原介質產生的本底信號不超過5mM葡萄糖氧化或還原所產生信號的5倍。
5.根據權利要求1-4中任一項的傳感器，其中該傳感器包括(a)具有一個近端和一個遠端的第一個基底，這第一個基底限定了從第一個基底近端延伸到遠端的電化學傳感器的第一個側邊和第二個側邊，構建并排列遠端以用于插入傳感器讀數器；(b)置于第一個基底上的第二個基底，工作電極置于第一個和第二個基底之一上，而對電極置于第一個和第二個基底之一上；(c)置于第一個和第二個基底之間的間隔層，其形成了沿傳感器第一個側邊的第一個孔和沿傳感器第二個側邊的第二個孔，樣品室從第一個孔延伸到第二個孔；和(d)至少一個指示電極，其置于第一個和第二個基底中的至少一個上，并相對于樣品室放置，用來確定樣品室何時含有樣品。
6.根據權利要求1-4中任一項的傳感器，其中該傳感器包括(a)具有一個近端和一個遠端的第一個基底，構建并排列遠端以用于插入傳感器讀數器，第一個基底限定了從第一個基底近端延伸到遠端的電化學傳感器的第一個側邊和第二個側邊；(b)置于第一個基底上的第二個基底，工作電極置于第一個和第二個基底之一上，而對電極置于第一個和第二個基底之一上；(c)置于第一個和第二個基底之間的間隔層，其形成了沿傳感器近端的第一個孔和沿傳感器第一個側邊的第二個孔，樣品室從第一個孔延伸到第二個孔；和(d)至少一個指示電極，其置于第一個和第二個基底中的至少一個上，并相對于樣品室放置，用來確定樣品室何時含有樣品。
7.根據權利要求1-4中任一項的傳感器，其中該傳感器包括一個置于傳感器中的指示電極，用來指示測定區中何時含有樣品。
8.根據權利要求5-7中任一項的傳感器，其中該指示電極也是一個工作電極或對電極。
9.根據權利要求5-8中任一項的傳感器，其還包括一種與指示電極連接的視覺或聽覺標志，其在指示電極指示測定區中含有樣品時激活。
10.根據權利要求5-9中任一項的傳感器，其中指示電極以與工作電極和對電極之一面對面的關系放置。
11.根據權利要求1-10中任一項的傳感器，其中該傳感器含有至少兩個置于傳感器中的指示電極，其中第一個指示電極指示測定區中何時開始填充樣品，而第二個指示電極指示測定區中何時基本上充滿樣品。
12.根據權利要求1-11中任一項的傳感器，其中該傳感器包括至少兩個置于傳感器中的指示電極，其中兩個指示電極包括第一個對/指示電極和第二個對/指示電極，對電極置于每一個和第二個對/指示電極之間。
13.根據權利要求1-12中任一項的傳感器，其中測定區和樣品室具有相同的容積。
14.根據權利要求1-3和5-13中任一項的傳感器，其中分析物是葡萄糖，而分析物反應性酶是葡萄糖反應性酶。
15.根據權利要求1-13中任一項的傳感器，其中分析物是一種藥物。
16.根據權利要求1-15中任一項的傳感器，其中測定區至少兩側被工作電極和對電極定界，任選地，工作電極和對電極形成面對面電極對，測定區位于工作電極和對電極之間。
17.根據權利要求1-16中任一項的傳感器，其中構建并排列該傳感器，使得介質氧化分析物，并且如用循環伏安法在pH7的0.1M NaCl中測定的，氧化還原介質的半波電位相對于對/參比電極的電位不超過約+100毫伏。
18.根據權利要求1-17中任一項的傳感器，其中構建并排列該傳感器，使得介質氧化分析物，并且如用循環伏安法在pH7的0.1M NaCl中測定的，氧化還原介質的半波電位約與對/參比電極的電位相同。
19.根據權利要求1-18中任一項的傳感器，其中構建并排列該傳感器，使得介質氧化分析物，并且如用循環伏安法在pH7的0.1M NaCl中測定的，氧化還原介質的半波電位相對于對/參比電極的電位不超過約-150毫伏。
20.根據權利要求1-19中任一項的傳感器，其中在該傳感器內，氧化還原介質通過樣品液的有效擴散系數低于分析物通過樣品液的有效擴散系數，并且優選地，至少比分析物通過樣品液的有效擴散系數低10倍。
21.根據權利要求1-20中任一項的傳感器，其中可擴散的介質具有至少5000道爾頓的分子量。
22.根據權利要求1-21中任一項的傳感器，其中構建并排列該傳感器，使得氧化還原介質在工作電極上比在對電極上更易電解。
23.根據權利要求1-21中任一項的傳感器，其中該傳感器包含一定摩爾量的氧化還原介質，其以化學計量計不多于平均正常生理量的分析物，優選地，該傳感器包含一定摩爾量的氧化還原介質，其以化學計量計不多于平均正常生理量的分析物的20％。
24.根據權利要求1-23中任一項的傳感器，其中工作電極具有暴露于測定區中的不超過約0.01cm2的表面積。
25.根據權利要求1-24中任一項的傳感器，其中酶活性不超過1單位/cm3。
26.根據權利要求1-25中任一項的傳感器，其中構建并排列該傳感器，使得可擴散的氧化還原介質在對電極處反應時沉淀。
27.根據權利要求1-26中任一項的傳感器，其中構建并排列該傳感器，使得當樣品液充滿測定區時氧化還原介質的有效擴散系數和氧化還原介質濃度的數學乘積不高于1×10-12mol cm-1sec-1。
28.根據權利要求1-27中任一項的傳感器，其中可擴散的氧化還原介質置于工作電極上。
29.根據權利要求1-28中任一項的傳感器，其中分析物反應性酶置于工作電極上。
30.一種用于測定樣品中分析物濃度的傳感器，該傳感器包括(a)具有一個近端和一個遠端的第一個基底，第一個基底限定了從第一個基底近端延伸到遠端的電化學傳感器的第一個側邊和第二個側邊，構建并排列遠端以用于插入傳感器讀數器；(b)置于第一個基底之上的第二個基底；(c)置于第一個與第二個基底之間的間隔層，其形成了沿傳感器第一個側邊的第一個孔，沿傳感器第二個側邊或近端的第二個孔，和從第一個孔延伸到第二個孔的樣品室；(d)至少一個置于第一個和第二個基底至少之一上的工作電極；(e)至少一個置于第一個和第二個基底至少之一上的對電極，其中至少一個工作電極和至少一個對電極相對于樣品室放置，以便當含分析物的樣品處于樣品室之中時產生分析物反應性信號；和(f)至少一個指示電極，其置于第一個和第二個基底至少之一上，并相對于樣品室放置，用來確定樣品室何時含有樣品。
31.一種用于測定樣品中分析物濃度的傳感器，該傳感器包括一個包括工作電極和對電極的電極對，任選地，工作電極與對電極以面對面關系放置；一個包含與工作電極和對電極相鄰的測定區的樣品室，其中該測定區的大小可含有體積不超過1μL的樣品，任選地，該樣品室的大小可含有體積不超過1μL的樣品；置于樣品室中的氧化還原介質；和一個置于傳感器中的指示電極，用于指示測定區中何時含有樣品，并助于分析物的電解。
32.根據權利要求30和31任一項的傳感器，其中該傳感器包含指示測定區中何時開始填充樣品的第一個指示電極和指示測定區中何時充滿樣品的第二個指示電極。
33.根據權利要求31和32任一項的傳感器，其進一步包括其上放置有工作電極的第一個基底；其上放置有對電極的第二個基底；放置于第一個基底上并與工作電極電連接的工作電極接觸墊；放置于第二個基底上并與對電極電連接的對電極接觸墊；和一個與指示電極電連接的指示電極接觸墊，該指示電極和指示電極接觸墊放置于第一個和第二個基底之一上，該指示電極接觸墊靠近工作電極接觸墊和對電極接觸墊之一放置；其中工作電極接觸墊、對電極接觸墊和指示電極接觸墊暴露，用于通過第一個和第二個基底構成的切口區與儀表電連接。
34.根據權利要求30-33中任一項的傳感器，其中該傳感器含有至少兩個放置于傳感器中的指示電極，其中這兩個指示電極包含第一個對/指示電極和第二個對/指示電極，對電極位于第一個和第二個對/指示電極之間。
35.一種測定樣品中分析物濃度的方法，其包括下列步驟使樣品與權利要求1-34的任一種電化學傳感器接觸；在工作電極處產生傳感器信號，其中可擴散的氧化還原介質產生的本底信號不超過平均正常生理量的分析物氧化或還原所產生信號的5倍，和利用傳感器信號確定分析物濃度。
36.根據權利要求35的方法，其中測定分析物的濃度包括經庫侖法用傳感器信號確定分析物的濃度。
37.根據權利要求35的方法，其中測定分析物的濃度包括經電流分析法用傳感器信號確定分析物的濃度。
38.根據權利要求35的方法，其中測定分析物的濃度包括經電勢分析法用傳感器信號確定分析物的濃度。
39.根據權利要求35-38中任一項的方法，其進一步包括為測量儀器提供關于一批電化學傳感器的校準數據，該校準數據包括關于該批電化學傳感器的本底電荷數值的信息；其中測定分析物濃度的步驟包括用傳感器信號和校準數據測定分析物濃度。
40.一種測定樣品中分析物濃度的方法，該方法包括下列步驟使樣品與權利要求5-12和30-34的任一種電化學傳感器接觸；觀測顯示測定區含有樣品的指示電極信號；在工作電極與對電極之間施加電勢，以電解樣品中的分析物；由于樣品中分析物的電解，傳感器產生分析物反應性信號；和用分析物反應性信號確定分析物濃度。
41.一種制造權利要求1-34的任一種電化學傳感器的方法，該方法包括(a)在第一個基底上形成多個工作電極；(b)在第二個基底上形成多個對電極；(c)在第一個和第二個基底之一上放置一個間隔層；(d)除去間隔層的一部分，形成樣品室區；(e)將第一個和第二個基底一起制成薄層；和(f)將多個電化學傳感器從制成薄層的基底分開，每個電化學傳感器包含至少一個工作電極、至少一個對電極和至少一個樣品室區。
42.根據權利要求41的方法，其中第一個基底是一個基底的第一個區域，而第二個基底是該基底的第二個區域，且進一步包括折疊該基底，以覆蓋該基底的第一個和第二個區域。
43.根據權利要求41和42任一項的方法，其中分開多個電化學傳感器包括切開第一個和第二個基底，以分開電化學傳感器，并形成電化學傳感器的樣品室的至少一端。
44.根據權利要求41-43中任一項的方法，其進一步包括在第一個和第二個基底之一上形成多個指示電極。
45.根據權利要求41-44中任一項的方法，其中在將間隔層置于第一個和第二個基底之一上之后除去間隔層的一部分以形成樣品室區。
全文摘要
描述了一種使用不可濾出的或可擴散的氧化還原介質的傳感器。該傳感器包括一個容納樣品使之與工作電極電解接觸的樣品室,并且至少在某些情況中,該傳感器也含有不可濾出的或可擴散的第二種電子轉移劑。該傳感器和/或所用的方法因應分析物產生傳感器信號,其能與介質引起的本底信號區分。本發明能用于使用如庫侖分析法、電流分析法和電勢分析法的技術測定生物流體如血液或血清中生物分子如葡萄糖或乳酸的濃度。能催化生物分子電氧化或電還原的酶一般用作第二種電子轉移劑。
文檔編號C12Q1/00GK1322254SQ99811815
公開日2001年11月14日 申請日期1999年10月8日 優先權日1998年10月8日
發明者B·J·費爾德曼, A·海勒, E·海勒, 毛飛, J·A·維沃羅, J·V·方德伯克, F·C·科爾曼, R·克里什南 申請人:特拉森斯公司