專利名稱：用于食品發酵的新型枯草芽孢桿菌菌株的制作方法
技術領域：
本發明涉及能夠發酵豆子的新型芽孢桿菌菌株，其基本上不產生任何的異-戊酸。本發明特別涉及新型納豆芽孢桿菌(Bacillusnatto)的菌株，其中產生異-戊酸的生物合成途徑所涉及的一個或多個基因基本上是非-功能性的。
人類長期以來使用各種微生物，如酵母、真菌或細菌來生產食料，以便改良、制備或改變食品的性能/味道。這種微生物中的一種是屬于用于不同植物組織(如豆，例如大豆和(非洲)角豆莢，和種子，例如非洲油料豆的種子、棉花籽、瓜子等)發酵的枯草芽孢桿菌的土壤細菌。在發酵過程中，枯草芽孢桿菌降解含在起始原料中的纖維素或/和蛋白質，從而產生可被進一步加工或即可食用的發酵產品。
與枯草芽孢桿菌緊密相關的一種細菌被稱作納豆芽孢桿菌菌株，一種主要用于大豆發酵的食品級的、革蘭氏陽性的微生物，其發酵過程最終產生廉價和富含氨基酸的營養食品。術語納豆芽孢桿菌來源于商業生產和早餐上常吃的日本大豆發酵產品“納豆”(見K.H.Steinkraus等，Handbook of Indigenous Fermented Food,第9卷.(1983),530-547)。
采用用于食品生產的微生物進行生物起始原料的發酵過程中存在的缺點是產生了多種不受消費者歡迎的副產物，如味道差的或硬度不合適的產物。
為此，JP-08275772描述了特定枯草芽孢桿菌菌株用于降低終產物“納豆”中氨含量的用途。通過在發酵早期將蛋白酶活性保持在高水平，以使全部的大豆蛋白基本上被充分降解來達到此目的，而在發酵后期蛋白酶活性顯著下降以致于不會產生大量的最終破壞食品味道的氨。
在JP-09009903中描述了另外一種改進了半纖維素的降解特性以致于增加了終產物柔軟度的枯草芽孢桿菌菌株。
然而，盡管微生物如枯草芽孢桿菌的發酵食品的性能在多方面得到了改進，但仍需要進一步改進終產品的味道/氣味。
因此本發明的目的在于進一步改進通過采用枯草芽孢桿菌進行發酵所得到的食品的性能，尤其是改進其味道。
通過提供一種新型的能夠發酵豆子，優選地是發酵大豆的枯草芽孢桿菌的微生物菌株來解決上述目的，所述菌株不會產生大量的異-戊酸。
附圖中
圖1表示ywfL破裂產物的構建流程圖。
圖2表示含有圖1中的ywfL破裂產物的重組載體pMZ66。
圖3表示由野生型納豆芽孢桿菌和ywfL破裂等基因衍生物產生的發酵產物的色譜圖。
在本發明的進一步實驗中，發現通過采用枯草芽孢桿菌，尤其是采用納豆芽孢桿菌進行發酵所得到的產物香味受到繁殖期間由微生物產生的被稱作異-戊酸(2-甲基丁酸和3-甲基丁酸)的特殊化合物的不利影響，該化合物使得發酵產物粘稠、質硬和具有刺激性的氣味。
已知在微生物中支鏈脂肪酸如異-戊酸的主要用途在于合成其中支鏈脂肪酸的組成大約為90％的細胞膜。細胞膜的合成是任何細胞的基本功能。由于用于形成細胞膜的任何脂肪酸的產量降低或甚至于全部耗盡而可能最終導致微生物在正常條件下不能成活或不能完成它們作為發酵劑的功能，因此，一種組分的生物合成所受到的影響預計是一項繁瑣的事情。
盡管不清楚枯草芽孢桿菌產生異-戊酸的確切生物合成途徑，但根據新近獲得的枯草芽孢桿菌的全部基因組信息設計了可能的合成途徑(Kunst,F.等的“完整的革蘭氏陽性細菌枯草芽孢桿菌的基因組序列”，自然390(1997),249-256)。
為此，還假設了在由細菌生產異-戊酸和類似支鏈脂肪酸的過程中，源自于基因ywfL的多肽可能起著重要的作用。
為了達到這一目的，異-戊酸合成的生物合成途徑所涉及的主題-枯草芽孢桿菌菌株的一個或多個基因基本上是以非功能狀態提供的，因此其各自的基因產物顯示了較低的活性或著本身可能就根本沒有被翻譯成基因產物。
在一個優選的實施方案中，這可以通過例如修飾異-戊酸合成的生物合成途徑所涉及的主要枯草芽孢桿菌菌株的一個或多個基因來達到，優選地ywfL基因(自然，出處同上)是這樣的方式即其基因產物僅顯示了降低的活性，優選地強烈降低的活性或是非-功能性的。這些基因產物可含有在合成途徑中起著酶作用或起著異-戊酸生產調節劑作用的多肽。在一個優選的實施方案中，ywfL基因可能會從基因組中缺失或被修飾以致于基因不能被轉錄成功能蛋白質。
在另一個優選的實施方案中，屬于枯草芽孢桿菌的修飾菌株是納豆芽孢桿菌，最優選地是納豆芽孢桿菌BN10，其已遵照布達佩斯條約被保藏在巴斯德學院(Institute Pasteur)中，保藏號是I-2077。
使用新型枯草芽孢桿菌菌株的目的是用于食料，進一步優選在枯草芽孢桿菌中不含外源序列，如載體序列或編碼選擇標記如抗生素抗性的基因。這同樣適用于存在這樣的序列如染色體外DNA或整合到染色體中的DNA的情況。
新型菌株可以通過已知技術如采用已知誘變劑誘變普通枯草芽孢桿菌菌株并選擇所需要的特征，即在發酵過程中異-戊酸合成低或缺陷。使用的誘變劑和技術是本技術領域已知的并且非限制性的實例是例如DMSO(二甲亞砜)、MNNG(N-甲基-N’-硝基-N-亞硝基胍)、甲胺或放射性處理等。
而且，目的枯草芽孢桿菌菌株還可通過重組基因技術獲得，優選地沒有任何外源DNA插入其中，這將在下文中詳細描述。
本發明的新型枯草芽孢桿菌菌株可被用于植物原料的發酵來最終由此生產出食料、食用香料，或更優選地為納豆。
下文中，新型和穩定的、食品級、遺傳修飾的生物體-納豆芽孢桿菌的構建被描述為包括一個染色體ywfL基因的等基因缺失。這一缺失被發現是穩定的和不含有不需要的DNA序列，如用于構建的載體序列或抗生素抗性標記。而且，通過缺失ywfL基因所獲得的微生物顯示了與已知納豆芽孢桿菌菌株相同的功能，表明新型菌株的發酵特性并沒有因ywfL基因產物的缺失而受損。
除非另外說明，全部技術、條件和培養基都如Sambrook等在《分子克隆實驗室手冊，第二版》(1992)，冷泉港實驗出版社，紐約中所描述的。
質粒、細菌菌株和培養基在大腸桿菌菌株BZ234中進行(重組)大腸桿菌載體pBSSK(+)(Stratagene，產品號212205)的DNA擴增(Mollet,B.等“嗜熱鏈球菌中直接的基因組整合、基因置換和整合基因的表達”，細菌學雜志175(14)(1993),4315-4324)而通過抗生素氨芐青霉素Boehringer Mannheim、產品號835242)的手段來選擇重組菌株。重組質粒采用X-gal(5-溴-4氯-3-吲哆-β-D-吡喃半乳糖苷，Boehringer Mannheim，產品號1680293)和IPTG(異丙基-β-D-硫代半乳糖苷，Boehringer Mannheim，產品號1411446)來鑒定。
質粒pG+host9(Maguin,E.等“在乳球菌和其它革蘭氏-陽性細菌中的有效插入誘變”細菌學雜志178(3)(1996),931-935)是一種含有抗生素紅霉素(Fluka，產品號E6376)抗性基因和溫度敏感性質粒復制蛋白質的革蘭氏-陽性/革蘭氏陰性穿梭載體。pG+host9在大腸桿菌EC101中進行繁殖(Law,J.等“在乳酸乳球菌中發生突變的系統允許進行定向基因的快速分析”，細菌學雜志177(24)(1995),7011-7018)，提供了為了適于保留和擴增質粒而整合在基因組中的非溫度敏感性復制蛋白。
這項工作中使用的納豆芽孢桿菌菌株(稱作BN1)是從市場上購買的發酵納豆中分離出來的。
生長培養基是LB培養基，培養大腸桿菌的溫度是37℃，培養納豆芽孢桿菌的溫度是28℃或37℃，同時進行攪拌。培養大腸桿菌時加入紅霉素的量是150μg/ml，培養納豆芽孢桿菌時加入紅霉素的量是2-4μg/ml。
納豆芽孢桿菌染色體DNA的提取進行用于PCR的納豆芽孢桿菌染色體DNA的提取，并且對在根據需要加入或沒有加入抗生素的LB培養基中培養16小時的培養物進行DNA印跡分析。在6000rpm的條件下離心培養物8分鐘來沉淀細菌。將沉淀物懸浮在500μl的50mM葡萄糖、25mM Tris-HCl pH8.0、10mM EDTA加上500μg/ml的溶菌酶(Boehringer Mannheim,1243004)中并在37℃下溫育30分鐘。變溶菌素(Fluka,M9901)被加到1μg/ml并繼續在37℃下溫育30分鐘。蛋白酶K(Fluka,P6556)被加到20μg/ml,EDTA加到2.5mM并且最后通過加入0.1％SDS(Serva,20763)將細胞進行裂解。將該溶液在60℃條件下溫育1小時并且用等體積的苯酚-氯仿再一次對裂解物進行提取。混合物在14000rpm下離心8分鐘來分相。小心除去水相并通過加入2體積的95％的乙醇(Fluka,02860)來沉淀染色體DNA。用滅菌牙簽纏繞DNA沉淀，將收集到的DNA沉淀轉移到400μl的10mM Tris-HCl pH8.0、10mM EDTA和50μg/ml RNA酶(Boehringer,109169)中并在60℃條件下溫育1小時。用苯酚-氯仿提取溶液。將DNA進行沉淀，纏繞并最終懸浮在200μl的TE緩沖液中(10mM Tris-HCl PH8.0,1mMEDTA)。
ywfL缺失質粒pMZ66的構建ywfL基因側翼的DNA片段由納豆芽孢桿菌菌株BNl進行擴增并最終通過其摻入同源物的引物結合在一起(Fusion Cycle PCR)以便創建一種適于這種細菌中的ywfL基因破裂的DNA片段。這在圖1中進行了圖示說明。
采用從Microsynth、Balgach、瑞士獲得的寡核苷酸6624(SEQ.ID.NO.1)和6626(SEQ.ID.NO.2)擴增5’側翼區，其中所述的6624在ywfL基因起始端的上游大約950bp處引入了一個BamHⅠ限制性酶切位點，而所述的6626為一種含有離ywfL基因的起始端50bp區域的22bp的序列和離ywfL基因的末端100bp區域的22bp的組合寡核苷酸。該寡核苷酸序列限定了缺失的區域，即組合引物兩個區段間刪除的序列。寡核苷酸6626的第二個區段還被設計成引進了兩個TGA終止密碼子以便終止截斷的ywfL基因的翻譯。
采用寡核苷酸6625(SEQ.ID.NO.3)和6627(SEQ.ID.N0.4)擴增3’側翼區，其中所述的6625在ywfL基因末端的下游大約1000bp處引進了一個EcoRⅠ限制性酶切位點，而所述的6627為第二種基本上是寡核苷酸6626(SEQ.ID.NO.2)之反向-互補序列的組合寡核苷酸。這些互補的寡核苷酸序列提供了5’和3’片段間的同源性，所述5’和3’片段被用于無引物、Pwo指導的延伸反應中來完成第二條鏈。最終加入了所述兩種寡核苷酸6626和6625并且特別擴增了正確的缺失片段。
PCR反應按如下方式進行。將500ng的染色體DNA和100μl體積的含有80μl無菌水、6μl 2mM dNTPs、10μl Pwo聚合酶反應緩沖溶液、2μl的大約100nM的每種寡核苷酸和0.5μl的Pwo聚合酶(Boehringer Mannheim，產品號1644 947)進行混合。采用一種Perkin Elmer DNA熱循環儀擴增所要的片段，擴增條件是95℃、1分鐘，40℃、1分鐘，72℃、2分鐘和最終維持在4℃，循環20次。在100μl體積的含有80μl無菌水、6μl 2mM dNTPs、10μl Pwo聚合酶反應緩沖溶液和0.5μl的Pwo聚合酶(不含任何寡核苷酸)中制備來源于每一PCR反應的1μl樣品。在上述熱循環儀中，將這種對照反應循環兩次來延伸同源誘導的寡核苷酸。最后，加入2μl的大約100nM的每一寡核苷酸6624和6625并繼續進行20次循環的PCR反應。
采用一種QIAquikPCR純化試劑盒(Qiagen，產品號28104)來純化最終PCR產物。用限制酶EcoRⅠ和BamHⅠ消化樣品并在1％的瓊脂糖凝膠上進行電泳。從凝膠上切下相應的2kb片段并利用QIAquik凝膠提取試劑盒(Qiagen，產品號28704)洗脫DNA。獲得的DNA片段用限制酶EcoRⅠ和BamHⅠ消化后與相應預處理過的大腸桿菌載體pBS SK+(用EcoRⅠ/BamHⅠ消化并去磷酸化)進行連接。連接混合物被電轉化入大腸桿菌菌株BZ234中并且在補充了100μg/ml氨芐青霉素、Xgal和IPTG的LB平板上選擇轉化子。通過限制性分析由此分離的質粒(Sambrook，出處同上)篩選出潛在陽性的、白色菌落。測定陽性克隆插入片段的DNA序列以便證實PCR的構建。用限制酶EcoRⅠ和SpeⅠ消化這一質粒并且在1％的瓊脂糖凝膠上分離片段。從凝膠上切下相應的2kb片段并利用QIAquick凝膠提取試劑盒洗脫DNA。
用限制酶EcoRⅠ和SpeⅠ消化復制-溫度敏感載體pG+Host9并且通過采用蝦堿性磷酸酶(USB，產品號70092)來去除末端磷酸。ywfL缺失片段與如此預處理的pG+Host9載體混合并由此進行連接。連接混合物被電轉化到大腸桿菌宿主EC101中。通過分離質粒的限制性分析來篩選菌落。一個陽性質粒被命名為pMZ66(圖2)。
為了轉化到BN1中，用Jetstar Maxi制備試劑盒(Genomed,220010)分離大量的pMZ66。
納豆芽孢桿菌的轉化根據以下方案進行轉化實驗溶液培養基Ⅰ:Spizizen的鹽5x,2ml；葡萄糖50％,0.1ml；酪蛋白氨基酸20％,0.01ml；酵母抽提物5％,0.02ml；硫酸鎂1M 0.05ml；用蒸餾水調到10ml。
培養基Ⅱ:Spizizen的鹽5x,2ml；葡萄糖50％,0.1ml；酪蛋白氨基酸20％,0.005ml；硫酸鎂1M 0.05ml；用蒸餾水調到10ml。
Spizizen的鹽5x:(NH4)2SO410g,K2HPO470g,KH2PO430g,檸檬酸三鈉·2H2O 5g，硫酸鎂·7H2O 1g，添加蒸餾水到1升。
納豆芽孢桿菌的天然感受態將37℃培養過夜的LB平板上的2-3個菌落重新懸浮到2.5ml的培養基Ⅰ中并在10ml無菌玻璃試管中在37℃下通氣(240rpm)培養4至5小時。
納豆芽孢桿菌的轉化在加入了質粒DNA(在最多50μl中5至10μg)的培養基Ⅱ(0.45ml中0.05ml)中進行10倍稀釋。在30℃下通氣(240rpm)培養過夜。然后將等分試樣或全部體積平鋪在選擇培養基上(具有4μg/ml紅霉素的用于pG+Host9的LB)并在28℃下培養兩天。
以分離的兩個步驟進行納豆芽孢桿菌ywfL基因的缺失。在第一個步驟(環入)中，選擇了通過同源重組(由側翼DNA同源性定向)的pMZ66的整合。在第二個步驟(環出)中，利用了便于基因組切除的質粒復制并鑒定了所需要的細菌克隆。
pMZ66的環入用質粒pMZ66轉化的納豆芽孢桿菌菌株BN1被接種到補充了2μg/ml紅霉素的新鮮LB培養基中并在42℃下培養16小時。將培養物進行稀釋并平鋪到補充了2μg/ml紅霉素的LB平板上并在42℃下進行培養。在這一溫度下，pG+Host9質粒復制蛋白不再具有活性。因此，那些選擇的細菌極少在ywfL基因上發生質粒整合。這一整合由與ywfL缺失片段同源的DNA序列來定位并在5’或3’同源區域內進行。采用特別設計的PCR引物、在小規模的整合體培養物上測定5’或3’整合的發生(42℃)。這說明大多數染色體整合的事件發生在ywfL基因的5’區，只有約1096的整合發生在3’端。通過DNA印跡分析確定這些克隆。
pMZ66的環出在ywfL基因的5’端整合了pMZ66的陽性克隆以1％的接種量接種到含有2μg/ml紅霉素的LB培養基中并在42℃下培養16小時。然后將這一培養物以1％的量接種到LB培養基的新鮮培養物上并在28℃下培養16小時。稀釋培養物，平鋪到LB平板上，然后在42℃下培養。
過程的論據如下在28℃下，pG+Host9質粒復制蛋白又有活性了并且復制的恢復增強了從基因組中切除質粒的能力，而最終的鋪平板和在42℃下的培養再次切除了引起任意復制質粒丟失的pG+Host9質粒復制蛋白(非紅霉素選擇)。
當在環入反應中，質粒pMZ66被認為對通過兩個不同途徑的環出具有兩個選擇ⅰ)在相同5’側翼DNA中通過重組，如通過整合，而返回到最初的親本BN1，或ⅱ)在3’側翼DNA中通過重組，就是通過將缺失片段摻入到基因組中并除去pG+Host9載體的染色體ywfL基因。
在42℃下培養產生的菌落主要顯示了大菌落中有一些較小菌落存在。劃在LB平板和補充了2μg/ml紅霉素的LB平板上的復制物確定了所有的小菌落和一些檢測的大菌落是紅霉素敏感型。
采用被設計成通過缺失點擴增的引物的PCR擴增被用來測定所有的大菌落攜帶野生型-BN1 ywfL基因，而小菌落全部含有所設計ywfL基因的缺失。
通過測定在ywfL基因缺失點的DNA的序列來確定PCR結果，其顯示了構建體的預測序列。通過DNA印跡雜交確定ywfL基因周圍區域的排列并通過與其質粒雜交測得沒有pG+Host9載體序列存在。從獨立實驗鑒定出五種這樣的ywfL缺失菌株并命名為BN10(I-2077)到BN14。
ywfL缺失菌株的HPLC分析將獲得的納豆芽孢桿菌菌株BN1和5ywfL缺失菌株(BN10到BN14)在LB培養基中、37℃下培養16小時。通過0.2微米的過濾器(Schleicher & Schuell.FP030/3)過濾來除去該細菌并通過HPLC分析脂肪酸的組成。HPLC是通過HPLC Hewlett Packard系列1100儀器進行的，該儀器采用了在40℃下進行穩定的和用10mM H2SO4以1ml/分鐘的流速進行洗脫的Aminex快速酸100×7.5mm柱(Bio-Rad，產品號125-0100)。采用也是在40℃下進行穩定的HP1047A折射計(Hewlett Packard)獲得了檢測結果。
所述結果見表1，從中可明顯看出異戊酸是通過納豆芽孢桿菌的發酵產生的，而ywfL基因的缺失將該發酵產物的產生降低到最低值。
表1通過BN1和5ywfL缺失衍生物BN10-BN14產生異戊酸的水平測定
下列實施例是來說明本發明的而不是用來限制所附權利要求的保護范圍。
實施例1立方體的制備根據本技術領域已知的技術，將大豆粉碎、煮熟并接種納豆芽孢桿菌菌株BN10(I-2077)的孢子，接著在30-50℃下進行固態發酵(曲型發酵)2-5天。向得到的發酵混合物中加入鹽水(NaCl飽和溶液)。將產物進行干燥，壓成立方體或以粉末的形式使用，例如用作湯產品。最終的產品不具有含異戊酸的普通產品的味道。
因此與通常使用的枯草芽孢桿菌相比，新型枯草芽孢桿菌在大豆發酵過程中同樣進行得很好。
實施例2重復與實施例1相同的過程，其條件是接種的是野生型納豆芽孢桿菌(BN1)。得到的產品具有含異戊酸的產品的典型味道。
序列表(1)總體信息(ⅰ)申請人Societe des Produits Nestlé,S.A.
P.O.Box353CH-1800 Vevey發明人B.MolletR.D.PridmoreM.-C-Zwahlen(ⅱ)發明名稱用于食品發酵的新型枯草芽孢桿菌菌株(ⅲ)序列的數目4(ⅳ)地址(A)地址Kirschner & Kurig(B)街道Sollnerstr.38(C)城市慕尼黑(D)州Bavaria(E)國家德國(F)區號81479(ⅴ)計算機可讀形式(A)介質類型軟盤(B)計算機IBMPC兼容機(C)系統PC-DOS/MS-DOS(D)軟件Patentin公布Nr.1，版本Nr.1,25(ⅵ)申請的信息(A)申請號已獲得(B)申請日同此(C)分類(ⅶ)優先權日無(ⅷ)代理人/代理機構信息(A)姓名Straus,Alexander(B)注冊號85880(C)案卷號80,032(ⅸ)電訊(A)電話(089)749858-0(B)電傳(089)749858-11(2)序列1的信息(ⅰ)序列特征(A)長度30核苷酸(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型DNA(ⅹⅰ)序列描述序列1GCGGCGGATCCGCTGATGATCTCCCACCCC 30(3)序列2的信息(ⅰ)序列特征(A)長度44核苷酸(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型DNA(ⅹⅰ)序列描述序列2CTCAAATTCCATTTCCTCATCAGGACATGCATAGCGTATCATCC44(3)序列3的信息(ⅰ)序列特征(A)長度31核苷酸(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型DNA(ⅹⅰ)序列描述序列3GGGGTCGAATTCCACGAGATATCrAACTGCC 31(4)序列4的信息(ⅰ)序列特征(A)長度44核苷酸(B)類型核酸(C)鏈型單鏈
(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型DNA(ⅹⅰ)序列描述序列4GGATGATACGCTATGCATGTCCTGATGAGGAAATGGAATTTGAG4權利要求
1．一種能夠發酵豆子的枯草芽孢桿菌的細菌菌株，其不產生大量的異戊酸。
2．根據權利要求1所述的枯草芽孢桿菌菌株，其為納豆芽孢桿菌。
3．根據權利要求1或2所述的枯草芽孢桿菌菌株，其中一種或多種源自于異-戊酸生物合成過程中所涉及的基因的基因產物具有降低的活性，基本上是非-功能性的或缺失的。
4．根據權利要求3所述的枯草芽孢桿菌菌株，其中活性降低的、基本上是非-功能性的或缺失的基因產物源自于ywfl基因。
5．根據前面任意一項權利要求所述的枯草芽孢桿菌菌株，其不含外源DNA序列。
6．根據前面任意一項權利要求所述的枯草芽孢桿菌菌株，其通過重組基因技術來制備。
7．根據權利要求1至5中的任意一項權利要求所述的枯草芽孢桿菌，其通過誘變和選擇來制備。
8．根據權利要求6所述的枯草芽孢桿菌菌株，其為納豆芽孢桿菌I-2077。
9．前面任意一項權利要求所述的枯草芽孢桿菌用于發酵植物原料的用途。
10．根據權利要求9所述的用途，其用于食品的制備。
11．根據權利要求9所述的用途，其用于香料化合物的制備。
12．根據權利要求10所述的用途，其用于納豆的制備。
全文摘要
本發明涉及能夠發酵豆子的新型枯草芽孢桿菌菌株,其基本上不產生任何的異－戊酸。本發明特別涉及新型納豆芽孢桿菌菌株,其中產生異－戊酸的生物合成途徑中所涉及的一個或多個基因基本上是非－功能性的。
文檔編號A23L1/20GK1321192SQ99811687
公開日2001年11月7日 申請日期1999年9月15日 優先權日1998年10月2日
發明者B·莫萊特, R·D·普里德莫雷, M·C·茲瓦倫 申請人:雀巢制品公司