肽基脯氨酰基順反異構酶的制作方法

專利名稱：肽基脯氨酰基順反異構酶的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種新酶，具體的說，本發明涉及一種新的親環蛋白樣肽基脯氨酰基順反異構酶。
在大多數過量生產蛋白的策略中，能指導極高水平轉錄的強啟動子被用于過量表達編碼異源和同源的蛋白質基因。蛋白分泌的局限性可能是緣于翻譯及翻譯后水平的瓶頸作用(Tsuchiya K.等(1992)應用微生物與生物技術38:109-114)。蛋白的正確折疊對于輸出能力是必需的。過量表達的異源蛋白可能折疊不正確，而且此后在通過分泌途徑的蛋白運輸過程中會被降解。因此，為了增加蛋白的分泌作用，折疊缺陷的矯正是令人期待的。
一種蛋白的折疊被許多因子催化，包括兩個異構酶家族，即蛋白質二硫鍵異構酶家族，其催化二硫鍵的形成，和肽基脯氨酰基順反異構酶家族，其催化x氨基酸-脯氨酸鍵的異構化。
在啤酒酵母中蛋白二硫鍵異構酶的過量表達導致人血小板衍生生長因子的分泌增加(Robinson等1994)。但是，黑曲霉蛋白二硫鍵異構酶的過量產生并不導致雞蛋清溶菌酶(HEWL)或葡糖淀粉酶分泌的增力(Ngiam C.,Jeenes,D.J.J.Punt,P.J.,Van den Hondel,C.A.M.J.J.,Archer,D.A.(1998)在黑曲霉蛋白分泌途徑中一種折疊酶PDIA的特性，已提交)。
在蛋白折疊過程中最慢的一步是x氨基酸-脯氨酸鍵的順反異構化。當肽基脯氨酰基順反異構酶存在時，這種異構化作用明顯地被加速。來源于不同有機體的親環蛋白家族的肽基脯氨酰基順反異構酶已被表明在體外具有折疊酶活性(Schohhrunner E R.,MayerS.,Tropschug M.,Fischer G.,Takahashi N.,Schmid F.,(1991)由來源于不同種的親環蛋白的蛋白折疊的催化。生物化學雜志266:3631-3637)。這些異構酶被免疫抑制劑藥物環孢菌素A抑制。但是，肽基脯氨酰基順反異構酶的過量表達對異源肽的分泌的影響在現有技術中是不知道的。
在內質網中起作用的蛋白由C末端4個氨基酸的延伸定位于此間隔區。在黑曲霉中HDEL和KDEL已被報道起類似于ER(內質網)保留信號的功能(Jeenes D.J.等(1997)基因193:151-156)。
發明概述本發明的第一個方面提供一種在一種宿主細胞中生產可分泌的多肽的方法，包括在該細胞中過量表達一種肽基脯氨酰基順反異構酶，因此增加分泌多肽的產量。
本發明的第二方面本發明涉及一種具有折疊酶活性的多肽，該多肽的特征在于能催化多肽中脯氨酸殘基N端肽鍵的順反異構化，在其N端有一個信號序列，在其C端有一個內質網保留信號，分子量為20.7kDa，推測的等電點為6.27。
本發明的第三方面本發明涉及一種具有折疊酶活性的多肽，該多肽的特征在于能催化多肽中脯氨酸殘基N端肽鍵的順反異構化，它由一個核酸編碼，該核酸能在低、中或高度嚴格的條件下與衍生自序列SEQ ID NO.1的17個堿基的寡核苷酸雜交。
本發明的第四方面本發明涉及一種具有折疊酶活性的多肽，該多肽的特征在于能催化多肽中脯氨酸殘基N端肽鍵的順反異構化，它由一個核酸編碼，該核酸能在低、中或高度嚴格的條件下與序列與衍生自序列SEQ ID NO.2的20個堿基的寡核苷酸雜交。
本發明的第五方面本發明涉及一種具有折疊酶活性多肽，該多肽的特征在于能催化多肽中脯氨酸殘基N端肽鍵的順反異構化，其至少與序列SEQ ID NO.2有40％的同源性。
附圖簡述

圖1是一個質粒pPD23的限制性圖譜，其編碼黑曲霉的cypB。
圖2顯示cypB基因和來自Orpinomyces,M.musculus及人的肽基順反異構酶的的序列對比。
圖3顯示cypB基因和Orpinimyces PPI基因間的最佳序列對比圖4代表pLIP4質粒，其編碼lipA基因。
圖5代表ppd23d13質粒。
圖6代表ppd23d14質粒。
圖7代表ppd38d3質粒。
發明詳述本發明涉及一種肽基脯氨酰基順反異構酶多肽(PPI)的過量表達，以增加宿主細胞中分泌多肽的表達。已發現在細胞中增加PPI的水平可有效促進多肽從細胞分泌。PPI被認為是通過降低多肽的錯誤折疊水平阻止了多肽產物在內質網中的保留和它們隨后的降解。因此本發明尤其適合于增加來自細胞的分泌多肽的產量。
在本文中，術語“肽基脯氨酰基順反異構酶”多肽(PPI)被用于表示一種酶，該酶能催化多肽中脯氨酸殘基N端肽鍵的順反異構化。PPIs無所不在，并且在本領域中幾個實例是熟知的，實例包括親環蛋白(見，例如，Bergsma等(1991)生物學和生物化學雜志。266:23204-23214)，小小菌素(parvulin)、SurA(Rouviere和Gross,(1996)基因發育10:3170-3182)及FK506結合蛋白FKBP51和FKBP52。PPI負責多肽中肽基脯氨酰基鍵的順反異構化，因而促進折疊的正確性。本發明包括任何含有PPI活性的多肽。這包括可能具有PPI活性的伴侶多肽或其片段(Wang和Tsou,(1998)FEBS Lett.425:382-384)。優選地，本發明涉及親環蛋白家族的PPI多肽。
有利的是，宿主細胞是表達一種異源基因產物的轉化宿主細胞。尤其是異源基因產物被過量表達的情況下，最終的多肽產物被錯誤折疊的傾向和如前所述在內質網中被降解的傾向增加。因此在這些情況下，根據本發明的PPI的過量表達是非常有利的。
然而，本發明也可被用于增加宿主細胞中同源多肽的產量。例如，本發明對如由自然生物作用引起的或由能引起調節基因轉錄上升的藥劑的給藥而引起的細胞活性增加而導致的同源多肽的轉錄的增加是有用的。此外，細胞也能用能引起內源基因上調的表達系統轉化，例如表達系統編碼轉錄因子，該轉錄因子作用于內源啟動子。
同樣地，PPI表達的上調也可以通過增加內源PPI的表達或用能提高PPI產量水平的一個編碼序列轉化宿主細胞來實現。用一個PPI編碼序列轉化宿主細胞是有利的。
因此在一個優選的方案中，本發明涉及一種在宿主細胞中生產一種分泌多肽的方法，包括用一個編碼該多肽的第一編碼序列和編碼肽基脯氨酰基順反異構酶的第二編碼序列共轉染該細胞。
有利的是，本發明涉及在一種宿主細胞中表達一種分泌多肽的方法。該方法包括以下步驟a)用一個表達本發明的肽基脯氨酰基順反異構酶的編碼序列轉化該細胞；
b)用一個表達一種目的多肽的編碼序列轉化該細胞；c)培養該細胞以生產該多肽。
用于此處的轉染和轉化可考慮為等同的，且包括任何形式的向細胞中插入DNA，包括病毒的轉導，電穿孔和傳統的轉染技術。編碼肽基脯氨酰基順反異構酶和目的多肽的編碼序列可以使用載體或獨立地如以裸露的DNA被插入細胞。優選使用載體。在此肽基脯氨酰基順反異構酶和目的多肽存在于獨立的載體上時，任意一個獨立的載體可先于另一個載體被插入到宿主細胞。只要在細胞中，在目的多肽的表達過程中獲得了肽基脯氨酰基順反異構酶的增加水平，插入順序是不重要的。
有利的是，肽基脯氨酰基順反異構酶和目的多肽可以存在于同一載體上。
優選地，構建宿主細胞，其中一種表達肽基脯氨酰基順反異構酶的編碼序列被整合進宿主細胞和基因組。這能通過用一個所說編碼序列的整合表達載體去轉化該細胞而實現。
如上所指出的，該表達肽基脯氨酰基順反異構酶的編碼序列優選整合入一個適當的載體。用于此處的載體(或質粒)是指分立的元件，這些元件被用于引入異源DNA進入細胞，在此表達或復制。對于本領域的技術人員來說，選擇和使用這樣的載體是容易的。許多載體可以利用，且適當載體的選擇將依賴于載體的打算用途和待用載體轉化的宿主細胞。每種載體含有依賴于它的作用和相容宿主細胞的不同成分，這種載體成分一般包括但并不限于以下的一種或多種成分復制起點，一個或多個標記基因，增強子元件，啟動子，轉錄終止序列和信號序列。
大多數的表達載體是穿梭載體，即它們至少能在一類生物體中復制，但能被轉染進另一類生物體中表達。例如，一種載體能在大腸桿菌中被克隆，然后同樣的載體被轉染進酵母或其它真菌細胞，即使它必需依賴于宿主細胞染色體而獨立地復制。DNA也能被擴增，例如通過PCR，和不用任何復制成分而被直接轉染進宿主細胞。
有利的是，一個表達載體含有一個選擇基因，也稱為可選擇的標記。該基因編碼一種轉化宿主細胞在選擇培養基上生長或生存必須的蛋白。不用含有選擇基因的載體轉化的宿主細胞在培養基上將不存活。典型的選擇基因編碼蛋白，該蛋白授予抗生素和其它毒素抗性，如氨芐青霉素，新霉素，氨甲蝶呤或四環素，補充營養缺陷型缺乏，或提供從復合培養基無法獲得的關鍵營養成分。
至于適合于酵母和其它真菌有機體的選擇性基因標記，由于標記基因的表型的表達有利于轉化子篩選的任何標記基因都能使用。例如適合于酵母的標記基因包括賦予抗生素G418、潮霉素或博來霉素抗性的基因或在營養缺陷型的酵母突變株中提供原養型的基因，如URA3,LEU2,LYS2,TRP1或HIS3基因。
由于載體的復制在大腸桿菌中可方便地進行，包括一個大腸桿菌遺傳標記和大腸桿菌的復制起點是有利的。這些能從大腸桿菌質粒如pBR322,Bluescrip載體或pUC質粒如pUC18或pUC19獲得，這些質粒都含有大腸桿菌復制起點和賦予抗生素抗性如氨芐青霉素抗性的大腸桿菌遺傳標記。
表達和克隆載體通常含有一個啟動子，該啟動子能被宿主有機體識別并有效連接至編碼肽基脯氨酰基順反異構酶的核酸。這樣的一個啟動子可以是誘導或是組成型的。該啟動子有效連接至編碼肽基脯氨酰基順反異構酶的DNA，方法是通過限制性酶消化除去了來源DNA的啟動子并插入分離的啟動子序列至載體。天然啟動子序列和許多外源啟動子兩者都能被用作直接擴增和(或)肽基脯氨酰基順反異構酶編碼序列的表達。術語“有效連接”是指并置，其中描述的成分是在允許它們以打算方式發揮作用的一種關系中。一個控制序列“有效連接”到一個編碼序列是指以這樣一種方式連接，即編碼序列的表達是在與控制序列相容的條件下被完成的。
用于酵母宿主的適合的啟動子序列是可調節的或組成型的，并且優選來源于高度表達的真菌基因。真菌啟動子在文獻中是熟知的(例如，見Gurr等(1987)絲狀真菌核基因的結構和組織。King horn編著，真核微生物基因結構，IRL出版，牛津93-139頁)。酵母啟動子也可被使用，如酵母的TRP1基因，ADHI或ADHⅡ基因，酸性磷酸化酶(PHO5)基因的啟動子，編碼a或α因子的酵母交配信息素基因啟動子或來源于編碼糖酵解酶的基因的啟動子如烯醇化酶，3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAP),3-磷酸甘油酸激酶(PGK)，己糖激酶，丙酮酸脫羧酶，磷酸果糖激酶，6-磷酸葡萄糖異構酶，3-磷酸甘油變位酶，丙酮酸激酶，磷酸丙糖異構酶，磷酸葡萄糖異構酶或葡萄糖激酶基因的啟動子，釀酒酵母GAL4基因，非洲栗酒酵母(S.ponbe)nmt1基因的啟動子或來源于TATA結合蛋白(TBP)基因的啟動子。另外，用雜合啟動子也是可能的，包括一種酵母基因的上游激活序列(UAS)和含有功能性TATA框的另一酵母基因下游啟動子元件，如一個包含有酵母PHO5基因的UAS和含有功能性TATA框的酵母GAP基因的下游啟動子元件的雜合啟動子(PHO5-GAP雜合啟動子)。一種適合的組成型PHO5啟動子是沒有上游調控元件(UAS)的短的酸性磷酸酶PHO5啟動子，如PHO5(-173)啟動子元件開始于PHO5基因的-173核苷酸，終止于-9核苷酸。
在本發明中，優選使用真菌有機體，如一種絲狀真菌，例如那些用于生物技術工業的，優選曲霉(Asperillus)、木霉(Trichoderma)、脈孢菌屬(Neurospora)、毛霉(Mucor)或青霉(Penicillium)。更具體地說，優選宿主有機體包括構巢曲霉、塔賓曲霉、醬油曲霉、泡盛曲霉、米曲霉、日本曲霉、棘孢曲霉、粗糙脈孢菌、T.reesei和綠色木霉。一種用于本發明核酸構建體的表達和/或用于制備根據本發明的異源多肽的優選宿主有機體是一種曲霉屬的有機體，有利地是黑曲霉。關于根據本發明的一種轉基因曲霉能通過以下教導制備Rambosek,J和Leach,J 1987(絲狀真菌中的重組DNA進展與展望。CRC Crit.生物技術綜述6:357-393),Dauis RW 1994(在曲霉中異源基因表達和蛋白分泌，在Marfinelli S.D.Kinghorn J.R.(編者)曲霉50年工業微生物進展29卷。Elsevier Amsterdam 1994 525-560頁)，Ball ance D.J.1991(絲狀真菌的轉化系統和真菌基因結構概述。在Leong,S.A.,Berka R.M.(編者)分子工業真菌學。絲狀真菌的系統和應用。Marcel Deklar lnc紐約1991 1-29頁)和Turner,G.1994(基因操作載體，在Martinelli.S.D.,Kinghorn J.R.(編者)曲霉50年工業微生物進展29卷，Elsevier Amsterdam 1994 641-666頁)。下面評述提供一個制備發明轉基因曲霉的教導的摘要。
為了制備轉基因曲霉，通過插入異源核酸序列(如編碼一種淀粉酶的核酸序列)至設計用于絲狀真菌中表達的構建體制備表達構建體。
已經發展了異源表達使用的幾種類型的構建體。這種構建體含有在真菌中有作用的根據本發明的啟動子。異源核苷酸序列能與一種信號序列融合，該信號序列指導異源核苷酸序列編碼的蛋白的分泌。通常使用一種真菌來源的信號序列。也可使用在真菌中有活性的終止子。
在真菌中已經發展了另一種類型的表達系統，其中異源核酸序列被融合至編碼一種穩定蛋白的真菌基因中。這樣能穩定編碼一種目的多肽的異源核酸序列編碼的蛋白。在這樣一種系統中，被一種特殊的蛋白酶識別的切割位點能被引入到真菌蛋白和由異源核苷酸序列編碼的蛋白之間，使得產生的融合蛋白在該位點能被該特殊蛋白切開，這樣釋放出由異源核酸序列編碼的蛋白。作為例子，可以引入至少在某些曲霉中發現的KEX-2樣肽酶識別的位點(Broekhuijsen等1993生物技術雜志31:135-145)。這種融合造成體內切割，導致表達產物的保護，和不出現大的融合蛋白。
已報導了編碼細菌，真菌，脊椎動物和植物蛋白的幾個基因在曲霉中的異源表達。關于產物穩定性和宿主菌株的修飾，一些異源蛋白當它們分泌至真菌培養液時不是十分穩定。大多數真菌產生幾種降解異源蛋白的胞外蛋白酶。為避免這一問題，降低了蛋白酶產生的特殊真菌菌株已被用作宿主以進行異源生產。
為轉化絲狀真菌，對于許多絲狀真菌來說幾種轉化方法已被建立起來了(Balance 1991，同前)。它們中的許多方法是基于原生質體的制備和用PEG和Ca+2離子引入DNA至該原生質體。這種轉化的原生質體然后再生，并用不同的選擇標記篩選轉化真菌。轉化使用的標記是一些營養缺陷標記如argB,trpC,niaD和pyrG，抗生素抗性標記如苯菌靈抗性，潮霉素抗性和腐草霉素抗性。一種常用的轉化標記是構巢曲霉的amds基因，該基因的高拷貝數量允許該真菌以丙烯酰胺為唯一N源生長。
通過插入一個增強子序列至載體也可增加真菌有機體編碼肽基脯氨酰基順反異構酶的DNA的轉錄。增強子相對方向和位置獨立。
表達載體包括任何能表達肽基脯氨酰基順反異構酶編碼核酸的載體，該核酸被有效的與調控序列如能表達這樣的DNA的啟動子區域連接。這樣一種表達載體是指重組DNA或RNA構建體，如質粒，噬菌體，重組病毒或其它載體，將其引入一種適合的宿主細胞導致克隆DNA的表達。適合的表達載體對于本領域普通技術人員來說是熟知的，包括在真核和/或原核細胞中能復制的載體，和仍為附加體或整合進宿主細胞基因組的載體。
根據本發明載體的構建使用傳統的連接技術。分離的質粒或DNA片段被切割，處理并以期望的形式連接形成需要的質粒。假如需要的話，以已知的方式進行構建質粒的分析以證實正確的序列。構建表達載體適合的方法，體外轉錄物的制備，導入DNA進入宿主細胞和進行肽基脯氨酰基順反異構酶表達和作用的評價分析對于本領域技術人員來說是熟知的。基因存在，擴增和/或表達也可在一種樣品中直接被測定，例如通過傳統的DNA印跡，RNA印跡進行mRNA轉錄的定量，斑點印跡(DNA或RNA分析)，或原位雜交，用一個適合的標記探針，該探針可基于在此提供的一種序列。必要時，本領域技術人員很容易知道如何調整這些方法。
相同的或相似的考慮將應用于編碼目的多肽的載體的設計。盡管不是必須的，PPI和目的多肽被編碼在同一載體上是可能的，無論是處于游離狀態還是整合狀態，并從此而被表達。優選目的多肽是由不來源于宿主有機體的異源核苷酸序列編碼的多肽。
編碼目的多肽的核苷酸序列的典型例子包括編碼蛋白和酶的序列，該蛋白和酶改變代謝和分解過程。異源核苷酸序列可以編碼一種試劑用以引入或增加病原體抗性。異源核苷酸序列可以編碼一種絲狀真菌，優選曲霉屬的非天然蛋白，或對動物或人體有益的化合物。根據本發明的核苷酸序列的例子包括果膠酶，果膠解聚酶，多聚半乳糖醛酸酶，果膠酸裂解酶，果膠裂解酶，己糖氧化酶，氧化還原酶，酯酶，葡聚糖裂解酶，鼠李糖-半乳糖醛酸酶，半纖維素酶，內-β-葡聚糖酶，阿拉伯糖酶，或乙酰酯酶或其組合及其反義序列。目的多肽也可是一種提高一種食品或谷物營養價值的蛋白。典型的例子包括能抑制抗-營養因子形式的植物蛋白和有更理想的氨基酸組成(如比非轉基因植物賴氨酸含量高)的植物蛋白。
目的多肽可以是一種酶，該酶能被用于食品加工，如凝乳酶，奇甜蛋白和α-半乳糖酶。此外目的多肽可以是任何一種害蟲毒素，ADP-葡萄糖焦磷酸化酶(例如，見EP-A-0455316)，一種葡聚糖酶或基因組B-1,4-內葡聚糖酶。
異源核苷酸序列可以編碼一種特定核苷酸序列的內含子，其中該內含子可以是有義或反義方向。
該異源核苷酸序列是能編碼阿拉伯呋喃糖苷酶的核苷酸序列，該酶是PCT專利申請PCT/EP96/01009的主題(在此引入作為參考)。該異源核苷酸序列可以是能編碼ADP-葡萄糖焦磷酸化酶的任何核苷酸序列，該酶是PCT專利申請PCT/EP94/01082的主題(在此引入作為參考)。該異源核苷酸序列可以是能編碼α-葡聚糖裂解酶的任何核苷酸序列，該酶在PCT專利申請PCT/EP94/03397中被描述(在此引入作為參考)。該異源核苷酸序列可以是能編碼T.languinosus淀粉酶的任何核苷酸序列，如在PCT專利申請PCT/EP95/02607中被描述的，該專利申請在此引入作為參考。該異源核苷酸序列可以是能編碼葡聚糖酶的任何核苷酸序列，該酶在PCT專利申請PCT/EP96/01008中被描述(在此引入作為參考)。
在本發明的一個優選方面，編碼PPI的核酸將包括有效連接于其上的一種內質網保留信號。優選內質網保留信號是一種四肽，該四肽是HDEL,HEEL或KDEL是有利的。該內質網保留信號是讓該多肽運向內質網并使其停留于此。
根據本發明的第二方面，提供了一種多肽，該多肽擁有折疊酶活性，并且具有在多肽中催化脯氨酸殘基N端肽鍵順反異構化作用能力的特點，在N端有一種信號序列，且在C端有內質網保留信號，其分子量為20.7kDa，推測的等電點為6.27。有利的是，根據本發明這一方面的新的PPI從一種真菌有機體如絲狀真菌中獲得，例如那些用于生物技術工業的真菌；優選曲霉，木霉或青霉；優選黑曲霉。
根據本發明的PPI的一個例子于SEQ.ID.No.2示出。經鑒定具有這一序列的分子可從黑曲霉中獲得，并且在此稱為CYPB。滿足上述標準的PPI酶在此一般稱為“CYPB”酶。因此，在優選方面，本發明提供SEQ.ID.No.2所示CYPB或其生物同配體(bioisostere)。
當用于此時，術語“生物同配體”根據本領域的普通用法被使用，意即一種有相似(但不相同)或不同結構、具有相同生物功能效果的化合物。
本發明的生物同配體從真菌有機體如絲狀真菌中獲得是有利的，例如用于生物技術工業的絲狀真菌，優選曲霉，木霉或青霉；優選黑曲霉。
根據本發明的更進一步的方面，提供一種編碼本發明酶的核酸。除了被用于生產重組PPI蛋白外，這些核酸也可用于作為探針，這樣使得本領域技術人員容易鑒定和/或分離編碼PPIs或其同源物的核酸。該核酸也可不標記或用一種可查明的部分標記。而且，本發明的核酸可用于確定PPI特異性核酸存在的檢測方法中，所說的方法包括使編碼(或互補于)PPI的DNA(或RNA)和一種試驗樣品核酸雜交并確定PPI的存在。在另一方面，本發明提供與編碼PPI的核酸序列互或在嚴格條件下與所述核酸序列雜交的核酸序列。
PPI編碼核酸片段的長度在10-200核苷酸之間是有利的，優選在15-50核苷酸之間，并且更優選為約20個核苷酸。
本發明也提供一種擴增試驗樣品核酸的一種方法，包括用編碼(或互補于)PPI的核酸(DNA或RNA)起始核酸聚合酶(鏈)反應。
在本發明的另一方面，該核酸是DNA，且還包括一種可復制的載體，該載體含有有效連接于控制序列的編碼PPI的核酸，該控制序列可被載體轉化的宿主細胞識別。而且本發明提供用這種載體轉化的宿主細胞和用一種編碼PPI的核酸去實現PPI生產的方法，該方法包括在轉化宿主細胞培養物中表達PPI編碼核酸，并且需要時，可從宿主細胞培養物中回收PPI。
此外，本發明涉及分離的PPI蛋白和由上述核酸編碼的其生物同配體。
分離的PPI核酸包括除去了至少一種污染核酸的核酸，該污染核酸通常與天然來源的PPI核酸或在粗提核酸制品如DNA文庫等中伴隨存在。這樣的核酸除了以這種形式存在外，在自然界也有發現。但是，分離的PPI編碼核酸包括在通常的PPI表達細胞中的PPI核酸，在表達細胞中，該核酸在染色體上的位置不同于天然細胞或其旁側有一個與自然界中發現的DNA序列不同的DNA序列。
根據本發明，提供編碼具有示于SEQ.ID.No.2序列的CYPB的分離核酸(如DNAs或RNAs)或其片段。尤其是本發明提供一種編碼如SEQ.ID.No.2所示CYPB的DNA分子或其片段。依據定義，這樣一種DNA包括一種編碼的單鏈DNA，上述的編碼DNA和其互補DNA的雙鏈DNA或這種互補(單鏈)DNA本身。
編碼CYPB的優選序列是具有基本上與SEQ.ID.No.2編碼序列相同的核苷酸序列的序列，最優選具有與SEQ.ID.No.2編碼序列相同序列的核酸。當用于此時，基本上相同的核酸序列至少要有約90％的同一性。
本發明的核酸，不管是用于探針還是其它方面，優選與顯示于SEQ.ID.No.2的CYPB序列基本上同源。“基本上同源”中的同源指序列的同一性，當通過直接序列對比和比較判斷時，序列同一性超過40％，優選超過45％，最優選序列同一性為50％或更多。
基本上同源的氨基酸和核苷酸序列應具有大于75％的同源性(如至少80％的同源性，或至少85％的同源性，如至少90％的同源性或甚至至少95％的同源性，例如至少97％的同源性)。核苷酸序列同源性可使用Myers和Miller的“Align”程序(線性空間的最佳序列對比，CABIOS4,11-17,1988，在此引入作為參考)并獲自NCBI。或者，關于核苷酸或氨基酸序列的術語“同源性”可表明兩個序列之間的同源性定量測定。序列同源性百分比能用(Nref-Ndif)*100/Nref進行計算，其中Ndif是指當進行序列對比時，在兩序列中不相同的殘基的總數，其中Nref是指在一個序列中的殘基數目。因此，DNA序列AGTCAGTC與序列AATCAATC將有75％的序列相似性(Nref=8；Ndif=2)。或者，序列的“同源性”可以指用相同核苷酸或氨基酸的數量除以在兩序列中較短序列的核苷酸或氨基酸的數量，其中兩序列的對比能根據Wilbur和Lipman算法確定(Wibur and Lipma 1983 PNAS USA 8:7267，在此引入作為參考)，例如用20個核苷酸大小為一個窗口，四個核苷酸為一個詞的長度，且間隙為4，計算機輔助分析和序列數據包括序列對比的翻譯可用商用程序方便地進行(如IntelligeneticsTMSuit IntelligeneticsInc.CA)。當提及RNA序列與DNA序列相似或有一定程度的同一性或同源性時，在DNA序列中的胸腺嘧啶(T)被認為等同于RNA序列中的尿嘧啶(U)。
將DNA序列中的T視為等同于RNA序列中的U，本發明范圍中的RNA序列可從DNA序列衍生。
或者，氨基酸序列的相似性或同一性或同源性能用BlastP程序進行測定(Altschul等核酸研究25,3389-3402，在此引入作為參考)，并獲自NCBI，使用默認參數是有利的。下面的文獻(在此引入作為參考)提供了比較兩種蛋白的氨基酸殘基的相對同一性或同源性的算法，或者，關于上述的這些文獻中的教導能被用于測定同源性或同一性百分比Needleman SB和Wunsch CD，“可用于在兩種蛋白的氨基酸序列中尋找相似性的一般方法”，分子生物學雜志，48:444-453(1970)；Smith TH和Waterman MS，“生物序列的比較”，應用數學進展2:482-489(1981)；Smith TH,Waterman MS，和SadlerJR，“核酸序列功能域的統計特征”，核酸研究，11:2205-2220(1983)；Feng DF和Dolittle RF，“漸進的序列對比作為修改系統發生樹的先決條件”，分子進化雜志，25:351-360(1987)；Higgins DG和Sharp PM，“在一微型計算機上快速而靈敏的多重序列對比”，CABIOS,5:151-153(1989)；Thompson JD,Higgins DG和Gibson TJ,“ClusterW通過序列權重、位置特異性缺口補償和權重基質選擇提高漸進多重序列對比的敏感性”核酸研究，22:4673-480(1994)；和，Devereux J,Haeberlie P和Smithies O，“用于VAX的全面序列分析程序”，核酸研究，12:387-395(1984)。
根據本發明的核酸優選是CYPB基因編碼序列的片段。作為探針，長度為較少核苷酸，優選5至150個核苷酸的核酸序列片段是特別有用的。
或者范例性核酸的特征是編碼CYPB蛋白并能與SEQ.ID.NO.2所示DNA序列或所說DNA序列的選定片段雜交。優選的是在嚴格條件下與SEQ.ID.NO.2序列或上述定義的此序列的一個片段雜交、編碼CYPB基因的序列。
雜交的嚴格性指的是在此條件下核酸雜合體是穩定的。這些條件對于本領域普通技術人員來說是顯而易見的。如對本領域技術人員所知，雜合體的穩定性體現于雜合體的融解溫度(Tm)，此融解溫度隨序列同源性每降低1％而大約降低1至1.5℃。一般來說，雜合體的穩定性與Na+的濃度及溫度密切相關。典型地，雜交反應在高嚴格條件下進行，然后在不同嚴格條件下漂洗。
在本文中，高嚴格性是指僅有在1M Na+或者相等鹽濃度、65-68℃下能形成穩定雜合體的核酸可以雜交的條件。高嚴格條件可以是，例如在含有6×SSC,5×Denhardt’s,1％SDS(十二烷基硫酸鈉)、0.1焦磷酸鈉和0.1mg/ml變性鮭精DNA作為非特異性競爭劑的水溶液中進行雜交。雜交后，高嚴格條件的漂洗可以分幾步進行，最后的漂洗(大約30分鐘)，在0.2-0.1×SSC,0.1％SDS及雜交溫度下進行。
中等嚴格條件指在上面所述相同溶液中，但在約60-62℃的條件下進行雜交。在此條件下，最后的漂洗在1×SSC,0.1％SDS及雜交溫度下進行。
低嚴格條件指在上面所述相同溶液中，但在約52-56℃的條件下進行雜交。在此條件下，最后的漂洗在4×SSC,0.1％SDS及雜交溫度下進行。
顯然，這些條件是可以改變的且用不同的緩沖液和溫度也能被重復，例如，基于甲酰胺的緩沖液。Denhardt溶液和SSC就象其它適用于雜交的緩沖液一樣對本領域技術人員來說是熟知的(見，例如，Sambrook，等編著(1989)分子克隆實驗室手冊，冷泉港實驗室出版，紐約或者Ausubel，等編著(1990)最新分子生物學指南，JohnWiley&Sons,Inc)。最佳的雜交條件只能由經驗來決定，例如探針的長度和GC含量同樣也很重要。
本發明的CYPB蛋白包括一個ER保留信號。因此，在本發明的一個優選方面，提供了一種具有折疊酶活性的多肽，此多肽的特征是能催化多肽中脯氨酸殘基N端一側肽鍵的順反異構化，由一個能夠在低嚴格、中等嚴格或高嚴格條件下與由SEQ ID N0.1衍生而成的一個17個堿基的寡核苷酸雜交的核酸編碼。優選使用低嚴格條件。
SEQ.ID.NO.1代表編碼一種ER保留信號的簡并序列。因為此信號很可能位于任何位于ER中的CYPB蛋白中，所以此序列的存在可有利地用于鑒定和分離根據本發明的CYPB多肽。
根據本發明提供的指導，本發明的核酸可根據本領域中熟知的一些方法獲得。例如，本發明的一種DNA可通過PCR方法化學合成，或通過篩選基因組文庫或合適的cDNA文庫來獲得，這些文庫由確信含有CYPB并以可檢測水平表達CYPB的來源而制得。
化學合成目的核苷酸的方法在本領域是熟知的，包括三酯法，亞磷酸法，亞磷酰胺法和H-膦酸脂法，PCR及其它自動引物方法及固相寡核苷酸合成。如果核酸的全核酸序列已知或者可獲得與編碼鏈互補的核酸序列，可以使用這些方法。另外，如靶氨基酸序列是已知的，可以應用每個氨基酸已知的和優選的編碼推斷可能的核酸序列。
根據本發明，分離編碼PPI的基因的另一方法就是如Sambrook等1989年的書中14章所述利用PCR技術。該方法需要利用能和PPI核酸雜交的寡核苷酸探針。選擇寡核苷酸的策略如下描述。
利用設計用來鑒定目的基因或目的基因所編碼蛋白的探針或分析工具篩選文庫。對于cDNA表達文庫合適的方法包括，識別并特異結合CYPB的單克隆或多克隆抗體；長度大約在20至80個堿基的編碼同種或不同種已知或可疑CYPB cDNA的寡核苷酸；和/或互補或同源的cNDA或者其片段，它們編碼同一基因或能與其雜交的基因。篩選基因組DNA文庫的合適探針包括，但不限于寡核苷酸，cDNA或者其片段，它們能編碼同一DNA或編碼能與其雜交的DNA；和/或同源的基因組DNAs或其片段。
編碼CYPB的核酸可以通過在適合的雜交條件下，用一個探針來篩選合適的cDNA文庫或基因組文庫而被分離，所述探針即此處公開的包括來自于SEQ.ID.NO.2所示序列的寡核苷酸的核酸。
在本文中，一個探針是例如單鏈DNA或RNA，此單鏈DNA或RNA含有一個核苷酸序列，包括10-50，優選15-30，最優選大約20個連續堿基，這些連續的堿基與示于SEQ.ID.NO.2的相同數量或更多的連續堿基是相同(或互補)的。被選作探針的核酸序列應有足夠的長度及非常確切，以使假陽性結果降至最小。該核苷酸序列通常基于保守的或高度同源的核苷酸序列或CYPB區域。用作探針的核酸可以在一個或多個位點是簡并的。在從其密碼子使用偏嗜不清楚的種中篩選文庫時，簡并寡核苷酸的利用尤其重要。
用來構建探針的優選區域包括5′和/或3′編碼序列、預測編碼配體結合位點的序列等。例如，不管是本發明公開的全長cDNA克隆還是其片段都能用作探針。優選，本發明的核酸探針用適合的標記方法標記，以通過雜交進行快速檢測。例如，一種適合的標記方法是放射性標記。該優選的標記一個DNA片段的方法是在隨機引發反應中用DNA聚合酶的Klenow片段摻入α32P dAIP的方法，此方法在本領域是熟知的。寡核苷酸通常是用γ32P標記的ATP和多核苷酸激酶來進行末端標記。然而，其它方法(如非放射性)也同樣可以被用來標記片段或寡核苷酸，包括如酶標記、利用適合熒光基團的熒光標記及生物素化。
篩選文庫以后，例如，利用包括基本上整個CYPB編碼序列的DNA一部分或者基于所述DNA的一部分的一個適合寡核苷酸，陽性克隆通過檢測雜交信號被鑒定；所鑒定的克隆通過限制性作圖和/或cDNA序列分析來定性，并且通過與本發明所列序列比較來檢查，以確定是否它們含有編碼完整CYPB的DNA(即，它們是否包括翻譯起始和終止密碼子)。如果所選克隆是不完全的，它們可以被用來重新篩選相同或不同的文庫以獲得重疊克隆。如果文庫是基因組，那么這些重疊克隆可能包含外顯子和內含子。如果文庫是cDNA文庫，那么這些重疊克隆將包含一個開放閱讀框架。以上兩種情況下，完整的克隆可以通過與本發明提供的DNAs和推測的氨基酸序列的比較來鑒定。
為了檢測內源性CYPB的任何異常，遺傳學的篩選可以通過運用本發明的核苷酸序列作雜交探針來進行。同樣，如果需要的話，根據此處提供的核酸序列，可以設計反義型試劑用于降低CYPB的表達。
可以設想，本發明的核酸能通過核苷酸替代，核苷酸缺失，核苷酸插入或核苷酸片段的倒轉及它們的任何組合來方便地修飾。這些突變體能夠用來，例如，產生具有與自然界中發現的CYPB序列不同的氨基酸序列的CYPB突變體。誘變可以被預先確定(定點)或是隨機的。不是沉默突變的突變必須位于閱讀框之內并且最好不會產生能產生象環狀或發夾的二級mRNA結構的互補區。
以下通過實施例描述本發明，其目的僅僅為了說明本發明。
實施例1黑曲霉(Aspergillus niger)cDNA文庫的構建λZAP-黑曲霉N402 cDNA文庫通過應用Stratagene公司的ZAP-cDNA合成試劑盒及根據制造商提供的指導從黑曲霉cDNA構建而來。
實施例2黑曲霉cDNA文庫的篩選大約2×50.000 pfu被涂布于大的(22×22cm)NZY平板上，平板含有以下培養基(每升)5g NaCl,2g MgSO4·7H2O,5g酵母浸提物，10g酪蛋白水解物，15g瓊脂，用NaOH調節pH值至7.5。培養基滅菌、冷卻到約65℃后倒平板。每個平板用240ml培養基。
接種后的NZY平板于37℃下培養過夜，并且制作平板的噬菌斑的印膜。在Hyboud N(Amersham)膜上，每個平板做兩個印膜。DNA用紫外射線固定4分鐘，并且如下面所描述的，濾膜用32P-dCTP標記的簡并寡核苷酸作探針進行雜交，探針的標記用Terminal Transferase(Boehringer Uannherm)試劑盒，根據以下程序進行。
用500pmol的簡并寡核苷酸，在末端轉移酶(TerminalTransferase)反應緩沖液(Boehinger Mannheim)中，94℃溫育3分鐘后，混合液置冰上冷卻并加入4ul32P-dCTP。標記反應通過加入10個單位的末端轉移酶(Boehringer Mannheim)來起動。37℃溫育30分鐘后，70℃溫育5分鐘，熱失活末端轉移酶。放射性標記的寡核苷酸用NAP5柱子(Pharmaeia-含Sephader G-25介質)純化。
濾膜在50ml預雜交緩沖液中，56℃預雜交4小時，預雜交緩沖液含有12.5ml 20×SSC(0.3M檸檬酸鈉，3M NaCl),2.5ml 100×Denhardt溶液，2.5ml 10％SDS及32.5ml水。在使用之前向預雜交緩沖液中加入300ul 10mg/ml變性的鮭魚精DNA。預雜交后，加入放射性標記的寡核苷酸，濾膜在56℃下雜交過夜。第二天，濾膜用4×SSC+0.1％SDS在56℃下漂洗兩次，每次30分鐘。
濾膜進行放射自顯影16小時，陽性克隆得到分離。只有當NZY平板的兩個印膜都有雜交信號時，此克隆才被認為是陽性。
基本上按如上所述進行第二次篩選，六個推斷的克隆得到分離，并通過在小的Petri氏培養皿上涂板得以純化。最終篩選了4個克隆，用Rapid Excision Kit (Stratagene)將其轉入質粒。
所得質粒的測序用反向及通用序列引物進行。含有cypB基因的質粒被定名為pPD23，此cypB基因編碼親環蛋白樣肽基脯氨酰基順反異構酶B。
實施例3含有cypB基因的質粒pPD23的鑒定作了此克隆的限制性圖譜。片段被克隆于pBluescript SK+的EcoRⅠ和XhoⅠ位點間。顯示op pPD23結構的限制性圖譜在圖1(圖1)中表示。此基因用循環測序法測序。全序列如SEQ.ID.NO.2所示。對全部構建體的兩條鏈測序。
推導的氨基酸序列用Clustal W程序與3個親環蛋白樣肽基脯氨酰基順反異構酶B作了序列對比。序列對比如圖2(圖2)所示。以上的序列對比表明，此CYPB與其它已知的CYPB序列是同源的。
在SWISS-PROT數據庫中進行了檢索，沒有發現任何比上述序列對比中(圖2)有更高同源性的序列。具有最高同源性的序列是來自Orpinomyces屬種的親環蛋白樣肽基脯氨酰基順反異構酶的一個前體，此處的同一性為63％(圖3)。
1-23位殘基被確認為信號序列，余下的是一推測分子量為20,7kDa，推測的等電點(pI)為6.27的186個氨基酸的成熟蛋白。此CYPB蛋白含有一個推測的ER保留信號，在其C-端的最末端(位點209-212)。一個推測的N-糖基化的位點在CYPB蛋白的139-142位被發現。一個親環蛋白型的肽基-脯氨酰基順反異構酶的保守基序存在于79-76位。
實施例4cypB在大腸桿菌中的表達含有編碼成熟的CYPB蛋白基因部分的一個片段用以下引物通過PCR獲得。
上游引物5′ccc ara tgg aag atg ctc agc ccc ggg gcc cca aga3′(SEQ.ID.NO.3)下游引物5′cga agc tta gtg gtg gtg gtg gtg gtg gct gct acc ttt ttct3′(SEQ.ID.NO.4)PCR用pfu聚合酶于52℃下進行。ER靶序列從此構建體中去除。而且，此蛋白的C-末端部分用一個HIS-標志延伸。隨后，此片段被克隆入pET-24a(+)(Novagen)，能使此基因在大腸桿菌中表達。此構建被轉化到大腸桿菌菌株BL21(DE3)pLysS中。cypB的表達通過向OD600=1時的培養物中加1mM IPTG來誘導。
大腸桿菌中表達的蛋白用固定化金屬疏水相互作用色譜(Ni-NTA樹脂，Qiagen)和凝膠過濾(Superdex 75,Pharmacia)純化。純化的CYPB的表現分子量用SDS-PAGE凝膠電泳確定大約為21kDa。準確的分子量用MALDI-TOF分析來確定，顯示分子量為21100.6Da,N-末端的測序顯示了成熟序列的前10個氨基酸(EDAQPRGPK-SEQ.ID.NO.2序列中24到32位殘基)。
一種基于α-chemotrypsin(Boehringer Mannheim)立體特異性降解底物suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA(Sigma)的分析法已被建立用于確定CYPB的活性。此底物的反式異構體被chemotrypsin快速降解。在水中，88％的此底物是以反式形式存在，而12％以順式形式存在。順式異構體向反式異構體的轉變是限速的并且被肽基脯氨酰基順反異構酶催化。
CYPB在含有50uM底物及25umα-chemotrysin的50mM HEPESpH7.8的緩沖液中，25℃下被測定。0.5nM CYPB蛋白被加入到以上混合體系并且每隔0.5秒鐘測一次380nm處的吸光值。CYPB蛋白的加入明顯導致了底物的更快的降解，證明了其折疊酶的活性。
實施例5CYPB與三酰甘油脂酶的共表達脂酶表達和CypB質粒質粒pLIP4(圖4)包括lipA基因的整個基因組的序列。此序列示于SEQ.ID.NO.4。CYPB表達自ppd23d14或ppd23d13，分別如圖5或圖6所示。ppd23d14包括受啟動子glaA控制的CypB序列(通常可得到，見，例如，Ward等，(1995)。生物技術13:498-503),glaA啟動子是可誘導的。ppd23d13包括受構巢曲霉gpdA啟動子控制的CypB序列(Punt等，(1991)生物技術雜志17:19:34)，此gpdA啟動子是有組成型活性的。以上兩種情況中，CypB基因后都接著構巢曲霉的trpC終止子。
通過插入一個受gpdA啟動子控制的潮霉素抗性基因(從吸水鏈霉菌和大腸桿菌分離)，抗生素抗性被摻入到質粒中。
脂酶基因轉化塔賓曲霉菌株3M pyrA。
塔賓曲霉菌株3M pyrA的孢子在含有2％葡萄糖和10mM尿嘧啶核苷的基本培養基的搖瓶中，34℃培養過夜。收集菌絲并用加有裂解酶的裂解緩沖液重懸浮。所產生的原生質體與pLIP4和ppd23d14或ppd23d13一起混合，通過共轉化，用pyrG和抗生素基因標記去選擇目的重組體。
在轉化的曲霉菌株中脂酶產物的原位檢測一種用于超薄層等電聚焦后使真菌脂酶可見的篩選程序被應用于篩選生長于瓊脂平板上的Aspergillas轉化子。此程序對于表達和非表達的轉化曲霉菌株的早期分析是非常方便的。在瓊脂平板上脂酶產生菌的篩選是通過用2％橄欖油作為酶(脂酶)的底物及脂酶啟動子的誘導物來進行的。另外，平板中含有一種熒光染料羅丹明B(RhodamineB)(N-9-(2-carboxylphenyl)-6-(diethylamino)-3H-xanthen-3-ylidene-N-ethylethanaminium chloride)。在橄欖油的存在下，轉化子受誘導分泌脂酶。脂酶分泌在瓊脂平板中水解橄欖油，在UV照射(350nm)下，引起可見的橙色熒光克隆的形成，取決于轉化子，熒光克隆的檢測在培養24小時后觀察。生長幾天后，脂酶產生菌能通過肉眼可見的橙色熒光來確定。在這些平板篩選的條件下，沒有轉化的菌株沒有熒光背景，而且顯現不透明的粉紅色菌落。然而，研究者應小心能在含有橄欖油的平板上快速生長的真菌及細菌的可能污染。通過加入抗生素-氨芐青霉素來防止污染。
脂酶分泌轉化子的鑒定顯現橙色熒光環的16個轉化子在加有1％橄欖油，0.5％酵母浸提物，0.2％酪蛋白氨基酸的100ml基本培養基中搖瓶培養8天。所分泌脂酶量的定量測定，通過向打在橄欖油-羅丹明B瓊脂平板上的孔中加入10ul無細胞的培養液上清，將此平板于37℃溫育過夜來進行。利用此技術，能生產最強熒光的來自5個轉化子的無細胞培養液上清用色譜進行進一步的分析。
疏水相互作用色譜純化重組脂酶通過平板篩選法發現的五個不同的脂酶分泌轉化子的培養液上清，用NAP5柱子(Pharmacia，含Sephadex G-25介質)脫鹽并用含1m(NH4)2SO4的50mM Na2AC pH5.5平衡。脫鹽的培養液上清用一個Biogel Phenyl-5 PW柱子(Biorad)進行疏水相互作用色譜分離各組分。洗脫用含1M至0M(NH4)2SO4的20mM Na2Ac pH5.5逐漸降低鹽濃度的梯度洗脫。分離后觀察到一個單個的蛋白峰。對不同轉化子中的此蛋白峰的面積進行計算并與非轉化菌株作比較。下面的表格總結了這5個轉化子所分泌的脂酶的水平。最好的轉化子疏水相互作用色譜分離后的純化脂酶的量增加了62倍。表格也顯示了在非最佳小規模搖瓶條件下生長6天后不同轉化子產生的不同脂酶量。
b．重組脂酶的鑒定1．氨基酸分析和蛋白的確定HIC分離的分立蛋白峰，通過冷凍干燥并重新溶解于水。純化脂酶的氨基酸組成和蛋白濃度被確定，以獲得280nm下紫外吸收和蛋白濃度的相關系數。這使得同源制備物的脂酶濃度的估計可以進行。
脂酶蛋白被羧甲基化并通過N-末端氨基酸測序確定頭15個氨基酸的序列。重組脂酶的頭15個氨基酸的序列與表現正確信號序列切割的天然脂酶完全相同。
2．SDS-PAGE電泳疏水相互作用色譜分離后收集的不同蛋白組分用12％ Tris-甘氨酸SDS膠分離。銀染表現為一條帶，確證此蛋白峰的同一性。另外，粗提液表現為一條主要的帶，它是當此真菌在含有橄欖油的培養基中培養時，以極大量在培養液上清中積累的唯一蛋白帶。
3．重組脂酶中共價連接的N-聯寡糖存在的檢測。
N-聯寡糖的檢測通過來自鏈霉菌的內切N-乙酰葡萄糖胺酶H(Sigma)消化脂酶來實現。內切酶H處理分泌到生長培養基中的重組脂酶，改變了SDS-PAGE所顯條帶的遷移率并且以大約30kDa分子量的單一分子種類移動。這說明了N-聯糖基化的程度。
4．重組脂酶的基質輔助激光解吸附質譜將已純化的脂酶與由70％乙腈、0.1％三氟乙酸中的芥子酸(3,5-二甲氧基-4-羥基肉桂酸)組成的基質溶液混合，進行MALDT-TOF質譜分析。脫鹽重組脂酶的分子量確定為32,237道爾頓(Daltons)。
脫糖基化的脂酶通過用內切糖苷酶H消化產生，并直接用Maldi-MS分析，給出一個多肽骨架分子量的估計值為29.325Da。
通過這些分析，N-聯寡糖在糖蛋白上的存在及其大約數量可以被確定。總之，N-聯寡糖占重組脂酶分子量的大約10％。脂酶的質譜分析
實施例6cypB基因在黑曲霉(Aspergillas niger)中的過量表達曲霉N592(cspAl,pyrA5)已經轉化入一個質粒，此質粒能表達受組成型強啟動子gpdA控制的CypB。推測的轉化子通過PCR篩選以確認此質粒的存在。菌株(N592::ppD23d13)中CypB整合的拷貝數及表達水平分別通過Southern和Northern分析被確定。
Southern分析清楚地表明，菌株N592::pPD23d13含有整合質粒pPD23d13的多個拷貝。在此菌株中cypB的表達水平大約比野生型的表達水平高約15倍。
為了確定是否此菌株有分泌更多蛋白的能力，設立了一個生長實驗，在此生長實驗中，野生型菌株(N402)和菌株N592::pPD23d13在含有2％(w/v)淀粉的條件下生長。淀粉被認為是葡糖淀粉酶表達的特異誘導物。因而，分析上清樣品酶的活性及分泌蛋白的量。
葡糖淀粉酶被認為是一個很好的分泌蛋白并通常作為融合蛋白用來幫助難分泌靶蛋白的分泌。
cypB的過量表達明顯導致了葡糖淀粉酶的高產水平，72小時誘導后，幾乎兩倍的葡糖淀粉酶活性被檢測出。此時不再有葡糖淀粉酶從頭產生，最大的可能是因為誘導碳源的耗盡。
實施例7CYPB的定位真核細胞的蛋白分泌是一個復雜的過程。最新合成的分泌蛋白及膜蛋白以一種非折疊狀態進入內質網(ER)，并且在它們能在分泌路徑中進一步運輸之前需要一種特異的構型。許多蛋白已經被發現在ER的腔中。這些包括BiP(結合蛋白，70kDa熱激蛋白的一種同源物)，蛋白二硫鍵異構酶(PDI)及肽基脯氨酰基順反異構酶(PPI)。這些折疊酶與催化蛋白從非折疊狀態到天然狀態的折疊有關。為了保留在ER中，因此也為了被從大量的分泌蛋白流中轉移出，折疊酶有特異的保留及回復信號。一個普通的羧基末端四肽HDEL已經被鑒定為能保留蛋白在ER腔中的一個信號。去除此四肽導致蛋白的分泌(Pelham(1990)Trends Biochem Sci.15,483-486)。
CYPB蛋白含有一個信號序列及一個推測的ER保留信號，說明此蛋白是被定位及保留在ER中的。然而，此蛋白中的保留信號與已知保留信號有細微的差別。在-3位上(從最后一個氨基酸殘基開始數)，此CYPB蛋白含有一個谷氨酸殘基。此HEEL序列還沒有被鑒定為是一個ER保留信號。為了評價是否能保留CYPB于ER的腔中，構建了含有CYPB信號序列及CYPB ER保留信號的GFP構建體。此基因的表達受組成型強啟動子gpdA的驅動(質粒pPD38d3；圖7)。
通過PCR篩選黑曲霉D15(prtT；pyrG；phmA)轉化子中GFP表達質粒的插入。含表達構建體的菌株被用來分析GFP的表達。
菌株D15::pPD38d3#5在液體培養基中生長過夜，并顯示GFP被定位于細胞中的一個管狀網絡。在構巢曲霉中同樣的構建體已經被證實使GFP靶向ER，顯示了一個類似于我們發現的網絡(Fernandez-Abalos，等(1998)Mol.Microbiol.27,121-130)。用ER-Tracker DPX(分子探針)染菌絲顯示了同型的管狀網絡。
最后，DIOC6顯示如DPX和GFP中所見的同樣的管狀網絡，這種物質低濃度時是線粒體的染料，但較高濃度時對ER染色也有效。然而，DIOC6染色為ER染料向外擴散所阻礙，只會染色線粒體。
我們的結果清楚地表明，HEEL對GFP保留在ER中是必需和充分的。因此，CYPB蛋白是靶向并保留在ER中也是很清楚了。
序列表<110>Danisco A\S<120>酶<130>p4837gb<140><141><160>4<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>17<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述ER保留信號<400>1ggyyavagyt crtcrtg17<210>2<211>987<212>DNA<213>黑曲霉<220><221>CDS<222>(42)..(677)<400>2ggcacgagaa ttctcctaca ttggagacat cctgagcaat c atg aac ttc aag aac 56Met Asn Phe Lys Asn1 5att ttt cta tct ttc ttc ttc gtc ctg gcg gtt gga ctt gct ctt gtc 104Ile Phe Leu Ser Phe Phe Phe Val Leu Ala Val Gly Leu Ala Leu Val10 15 20cac gcc gaa gat gct cag ccc cgg ggc ccc aag atc acc agt aag gtg 152His Ala Glu Asp Ala Gln Pro Arg Gly Pro Lys Ile Thr Ser Lys Val25 30 35ttc ttt gat ata gag cac gga gac aag cct ctg ggc aga gtc gtg ctt 200Phe Phe Asp Ile Glu His Gly Asp Lys Pro Leu Gly Arg Val Val Leu40 45 50ggc ttg tat ggc aag act gtt cct aag acc gct gag aac ttc cgg gct 248Gly Leu Tyr Gly Lys Thr Val Pro Lys Thr Ala Glu Asn Phe Arg Ala55 60 65ctc gct act ggt gag aag ggc ttt ggc tat gaa gga tct acc ttc cac 296Leu Ala Thr GIy Glu Lys Gly phe Gly Tyr Glu Gly Ser Thr Phe His70 75 80 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1．在一種宿主細胞中生產一種分泌多肽的方法，包括在該宿主細胞中過量表達一種肽基脯氨酰基順反異構酶，因此提高分泌多肽的產量。
2．根據權利要求1的方法，包括用編碼該多肽的第一編碼序列和編碼肽基脯氨酰基順反異構酶的第二編碼序列共轉染該細胞。
3．根據權利要求2的方法，其中該多肽和肽基脯氨酰基順反異構酶被編碼于不同的載體。
4．根據前述任何權利要求的方法，其中編碼肽基脯氨酰基順反異構酶的編碼序列被整合到該宿主細胞的基因組中。
5．根據前述任何權利要求的方法，其中該細胞為真菌細胞。
6．根據前述任何權利要求的方法，其中該親環蛋白肽基脯氨酰基順反異構酶是真菌來源的。
7．根據前述任何權利要求的方法，其中該多肽包括一個ER保留信號。
8．根據權利要求7的方法，其中此ER保留信號是HDEL,HEEL或KDEL。
9．一種具有折疊酶活性的多肽，此多肽有以下特征能夠催化多肽鏈中脯氨酸殘基N端一側肽鍵的順反異構化，在N末端有一個信號序列，在C末端有一個內質網保留信號，分子量為20.7kDa，推測的等電點為6.27。
10．根據權利要求9的多肽，該多肽是真菌來源的。
11．根據權利要求10的多肽，該多肽來自曲霉屬。
12．根據權利要求11的多肽，該多肽來自黑曲霉。
13．一種具有折疊酶活性的多肽，其特征在于能夠催化多肽鏈中脯氨酸殘基N端一側肽鍵的順反異構化，由能夠在低嚴格條件下與來自SEQ.ID.N0.2的20個堿基的寡核苷酸雜交的核酸編碼。
14．一種具有折疊酶活性的多肽，其特征在于能夠催化多肽鏈中脯氨酸殘基N端一側肽鍵的順反異構化，由能夠在低嚴格條件下與來自SEQ.ID.NO.1的17個堿基的寡核苷酸雜交的核酸編碼。
15．一種具有折疊酶活性的多肽，其特征在于能夠催化多肽鏈中脯氨酸殘基N端一側肽鍵的順反異構化，其與SEQ.ID.NO.2至少40％同源。
16．根據權利要求1至8任一項的方法，其中該親環蛋白肽基脯氨酰基順反異構酶是根據權利要求9至15任一項的多肽。
17．編碼根據權利要求9至15任一項的多肽的核酸載體。
18．用權利要求17的載體轉化的宿主細胞。
19．根據權利要求18的宿主細胞，其為真菌宿主細胞。
20．根據權利要求19的宿主細胞，其為曲霉宿主細胞。
21．一種生產具有折疊酶活性的多肽的方法，該多肽的特征在于能夠催化多肽鏈中脯氨酸殘基N端一側肽鍵的順反異構化，該方法包括用權利要求17的載體轉化宿主細胞。
全文摘要
本發明提供在宿主細胞中制備分泌多肽的方法,包括在該宿主細胞中過量表達一種肽基脯氨酰基順反異構酶,從而提高分泌多肽的產量,本發明也提供了用于該方法的來自黑曲霉的肽基脯氨酰基順反異構酶。
文檔編號C12N9/90GK1321195SQ99811597
公開日2001年11月7日 申請日期1999年9月30日 優先權日1998年9月30日
發明者P·M·F·德爾克斯, S·M·馬德里 申請人:丹尼斯科有限公司