酶原性核酸的檢測方法,以及相關分子和試劑盒的制作方法

專利名稱：：酶原性核酸的檢測方法,以及相關分子和試劑盒的制作方法
技術領域：
：本發明涉及通過核酸擴增來檢測和定量樣品中的目標核酸分子的方法。在本方法中，產生一條含有催化性核酸和目標序列的單擴增子。催化性核酸僅在目標存在時從它的反義的酶原性的前體中合成。
背景技術：
：體外核酸擴增的方法在遺傳學、疾病診斷和法醫學中有廣泛應用。在過去的十年中，許多擴增已知核酸序列(“目標序列”)的技術已被描述。這些包括多聚酶鏈式反應(“PCR’)(1-7,41)，鏈置換擴增法(“SDA”)(8)和轉錄調節擴增(“TMA’)(9,10)(也作為自動維持序列復制(“SSR”)為人所知)。PCR和SDA產生的擴增產物(“擴增子”)為DNA，而RNA擴增子由TMA產生。這些方法產生的DNA或RNA擴增子可被用作和遺傳疾病有關的核酸序列的標記物。幾個方法都可在封閉系統中，亦即，在單一的同源反應系統中同時擴增和檢測核酸序列。這些方法包括SunriseTM引物(11)，分子標記(12)和TaqmanTM系統(13)。使用同源封閉試管形式比在擴增反應后，分別分析擴增子有幾個優點。由于需要更少的操縱步驟，封閉系統方法更快、更簡便。封閉系統減少了和從其它反應得到的擴增子的污染有關的假陽性的可能性。同源反應可以實時監控，而0時的信號可測量系統的背景信號。因此不需要另外的減少背景信號的對照反應。信號強度的改變指示在樣品中存在特異性的核酸序列的擴增。替換策略包括擴增報道基因的信號，而不是擴增目標核酸。分枝DNA測定法(14)通過使用二級報道分子(例如，堿性磷酸酶)擴增信號，而熒光相關光譜學(FCS)使用信號的電放大(15)。采用其它的擴增技術，催化性核酸已在近年來被深入研究。作為治療劑，用催化性核酸抑制基因功能的可能性在文獻中被廣泛討論(16-22)。催化性RNA分子(“核酶”)已被顯示能催化磷酸二酯鍵的形成和切開(16,23)。用體外進化技術已發現其它能催化范圍廣泛得多的反應的核酸，包括核酸的切開(21,22,24)和連接(25)，卟啉金屬化(26)，和碳-碳(27)、酯(28)和胺(29)鍵的形成。核酶已顯示能切開RNA(16)和DNA(21)的分子。相似的，催化性DNA分子(“DNA酶”)也顯示能切開RNA(17,24)和DNA(22,30)分子。催化性核酸能切開目標核酸底物，使該底物符合嚴緊序列要求。目標底物要和催化性核酸的雜交區域互補，并在切割位點含有特異性的序列。切割位點的序列要求的例子包括對一類DNA酶的嘌呤嘧啶序列要求(“10-23”模型或“10-23DNA酶”)(24)，和對錘頭核酶的U:X序列要求，其中X可以是A,C或U，但不能是G(16)。除了有治療潛力外，催化性核酸分子還能用作基因診斷方法中的分子工具。例如，核酶已在二階段方法中用于促進信號放大(31-33)。在第一階段中，測試樣品和非活性的寡聚核苷酸接觸。接觸導致在樣品含有目標序列時，“觸發”RNA寡聚核苷酸的產生。在第二階段中，觸發RNA寡聚核苷酸誘導放大級聯。該級聯導致大量催化活性的報道核酶的產生，當它們被檢測到時，指示在測試樣品中存在目標序列。在過程中，目標序列本身不被擴增。更確切的，僅報道信號被擴增。總之，目標核酸擴增和允許的反應條件都是已知的。催化性核酸分子，和它們的活性的允許反應條件也是已知的。然而，允許核酸擴增的同時過程和在單一反應內部環境中的催化性核酸活性的方法不存在。而且，目標擴增方法，其中擴增產物是含有目標和催化性核酸分子序列的單核酸分子，不曾被施行過。最后，沒有目標擴增方法曾使用催化性核酸分子的反義酶原性序列，它僅在目標序列存在時，才以它的“有義”，催化性形式擴增。發明簡介本發明提供了檢測樣品中目標核酸序列存在的方法，其中包括(a)在允許引物起始的核酸擴增和催化性核酸活性的條件下，和樣品接觸，使用(ⅰ)適合起始目標擴增的DNA引物，和(ⅱ)編碼催化性核酸分子，但本身是反義序列的DNA酶原，其中引物和酶原相互關聯定位，從而在目標存在時，產生含有目標和催化性核酸分子序列的單擴增核酸分子；以及(b)測定催化性核酸活性，從而測定樣品中的目標核酸序列的存在。本發明還提供同時檢測樣品中多種目標核酸序列存在與否的方法，其中包括(a)在允許引物起始的核酸擴增和催化性核酸活性的條件下，和樣品接觸，使用(ⅰ)多個引物，其中對于每個要檢測的目標，存在至少一個適合起始該目標擴增的引物，和(ⅱ)多個酶原基因，其中對于每個要檢測的目標，存在至少一個編碼具有明顯的可測定的活性的催化性核酸分子，但本身是反義序列的酶原基因，引物和酶原基因相互關聯定位，從而當相應目標存在時，產生含有目標和相應的催化性核酸分子序列的單擴增核酸分子；以及(b)同時測定每個催化性核酸活性的存在與否，從而測定樣品中的每個相應的目標核酸序列的存在。本發明還提供含有引物和酶原基因，其中引物位于酶原基因的3′端的DNA分子。本發明還進一步提供在測定樣品中目標核酸序列存在中使用的試劑盒，其中包括(a)適合起始目標擴增的引物；(b)編碼催化性核酸序列，但本身是反義序列的酶原基因，其中引物和酶原基因相互關聯定位，從而當目標存在時，產生含有目標和催化性核酸分子序列的單擴增核酸分子；以及(c)允許引物起始核酸擴增和催化性核酸活性的試劑。最后，本發明提供在測定樣品中多種目標核酸序列存在與否中使用的試劑盒，其中包括(a)多個引物，其中對于每一個被檢測的目標，至少存在一個適合起始該目標擴增的引物；(b)多個酶原基因，其中對于每個要檢測的目標，存在至少一個編碼具有明顯的可測定的活性的催化性核酸分子，但本身是反義序列的酶原基因，其中引物和酶原基因相互關聯定位，從而當相應目標存在時，產生含有目標和相應的催化性核酸分子序列的單擴增核酸分子；以及(c)允許引物起始核酸擴增和催化性核酸活性的試劑。附圖簡述圖1表示上述方法的流程。在此，含有引物和酶原基因的核酸分子和含有目標序列的基因組DNA片段接觸。這引起含有催化性核酸和目標的第二核酸分子產生。催化性核酸依次切開可檢測的底物。發明詳述定義在本發明中，某些術語被頻繁使用，因此有必要先如下定義。“催化性核酸分子”、“催化性核酸”和“催化性核酸序列”是相同的，每個都表示DNA分子或含DNA的分子(也以“DNA酶”在領域中公知)，或RNA或含RNA的分子(也以“核酶”在領域中公知)，特異性識別不同底物和催化該底物的化學變化。DNA酶和核酶中的核酸堿基可能是A,C,G,T和U，也可能是它們的衍生物。這些堿基的衍生物在領域內熟知，并在參考文獻40中列舉。目標核酸序列的“擴增”表示它的指數擴增(相對于線性擴增)，其中每個擴增循環使目標擴增子存在數比前一循環的增加一倍。指數擴增的方法包括，但不限于，PCR,SDA和TMA。指數擴增和線性擴增不同，在線性擴增中，每個擴增循環以固定的數量相對于前一循環存在的目標擴增子的數目增長。“報道底物”、“化學底物”和“底物”是相同的，每個都表示任何可被催化性核酸分子識別并改造的任何分子。“目標”和“目標核酸序列”是相同的，每個都表示需要注意的被本發明檢測或測定的核酸序列，其中包括在本方法中當與之接觸時和引物雜交的序列，可以是它的整個分子或它的部分。“引物”表示一段DNA或含DNA的核酸分子的短片斷，它(ⅰ)在擴增條件下和要擴增的DNA或RNA序列退火，而(ⅱ)通過多聚酶調節合成起始并自身物理延伸。最后，“酶原基因”可表示核酸序列，其包括有可被檢測活性的催化性核酸分子的反義(亦即，互補)序列，而它的轉錄產物是催化性核酸分子。本發明實施例本發明提供了在樣品中檢測和定量所需的目標核酸序列迅速的和程序可變的方法。本方法的特別之處在于它同時進行在單一反應容器中的目標擴增和催化性核酸活性檢測。而且，其獨特之處在于擴增產物是含有目標和催化性核酸分子的序列的單核酸分子。最后，本方法是首次使用催化性核酸分子的反義、酶原性序列，其僅在目標序列存在的情況下，擴增它的“有義”、催化性形式。更特別的是，本發明提供檢測樣品中目標核酸序列存在的方法，其中包括(a)在允許引物起始的核酸擴增和催化性核酸活性的條件下，和樣品接觸，使用(ⅰ)適合起始目標擴增的DNA引物，和(ⅱ)編碼催化性核酸分子，但本身是反義序列的DNA酶原基因，其中引物和酶原基因相互關聯定位，從而在目標存在時，產生含有目標和催化性核酸分子序列的單擴增核酸分子；以及(b)測定催化性核酸活性，從而測定樣品中的目標核酸序列的存在。在一實施例中，本方法還包括步驟定量測定從步驟(a)得到的樣品中催化性核酸活性，并將由此得到的活性量和已知標準比較，從而對目標核酸序列進行定量。已知標準可以是任何用來定量的標準或對照。這些標準的例子包括(ⅰ)，已知反應動力學信息，以及(ⅱ)用不含催化活性的樣品獲得的信號測量值，或預先測定的催化劑活性量。在一實施例中，引物和酶原基因在不同的DNA分子上，而引物起始的核酸擴增是滾環擴增(已知的擴增方法)。在另一實施例中，至少兩個DNA分子同時含引物和酶原基因。在另一實施例中，樣品和兩個DNA分子接觸，每個分子都含有引物，至少一個分子含有酶原基因，其中引物在酶原基因的3′端。在該實施例的一個形式中，該酶原基因編碼的DNA酶識別并切開確實位于擴增核酸分子本身上的序列(亦即，順式切開，相對于DNA酶切開在不同分子上的底物的反式切開)。更特別的是，單擴增核酸分子還含有一核苷酸序列，該核苷酸序列被共同位于擴增分子上的酶原基因編碼的催化性核酸DNA酶識別并順式切開。在本方法的使用順式DNA酶催化的切開的優選例中，酶原基因編碼的DNA酶是10-23DNA酶，而在本方法步驟(a)(ⅰ)中使用的DNA引物(亦即，“嵌合”引物)含有至少一個嘌呤核糖核苷酸殘基，該殘基作為在10-23DNA酶識別并順式切開的位點的5′端。在嵌合引物中的該嘌呤核糖核苷酸殘基是10-23DNA酶切開所需的。因此，用該嵌合引物使10-23DNA酶切割位點在PCR反應中產生。嵌合引物也包括，例如，作為10-23DNA酶識別并順式切開的位點的3′端的核糖核苷酸殘基。在本發明中，包括引物和/或酶原基因的核酸分子也可包括另外的序列，例如和目標互補的序列。在本發明中檢測或定量的目標序列可以是任何核酸序列。在一實施例中，目標核酸序列是DNA分子。在另一實施例中，目標核酸序列是RNA分子，而步驟(a)進一步包括在用引物和酶原基因接觸樣品前，將目標RNA序列首先反轉錄成DNA的必須的步驟。酶原基因編碼的催化性核酸分子可以是核酶或DNA酶。在一實施例中，催化性核酸分子是核酶。在另一實施例中，催化性核酸分子是DNA酶。在本方法中測量的催化性核酸活性可以是任何能同時(而且，可任選的，被測量的)，并在相同的核酸擴增反應環境中發生的活性。催化性核酸活性可包括，例如，可檢測的化學底物的修飾，該修飾包括磷酸二酯鍵的形成和切開，核酸連接和切開，卟啉金屬化，和碳-碳、酯和胺鍵的形成。在一實施例中，可檢測的化學底物修飾是熒光標記的核酸分子的切開，尤其是DNA/RNA嵌合體。在優選例中，報道底物被切開，測量該切開是測量催化活性的手段。例如，切開底物的存在可在報道底物放射性標記的情況下，通過凝膠電泳后的磷光顯像監控。切開底物的存在也可通過在底物中摻入切割位點的相對側的熒光/淬滅染色分子的分離導致的熒光的變化來監控。這些系統提供了可被實時監控的同類方法的機會。監控熒光變化的方法在本領域中是公知的。這些方法包括，例如，目視觀察和用光譜熒光計監控。目標核酸序列可來自任何有機體，樣品可以是任何含有，或希望含有核酸分子的組合物。在一實施例中，目標來自植物，或來自動物，例如，小鼠、鼠、狗、豚鼠、鼬、兔和靈長類。在另一實施例中，目標在從例如水或土的來源得到的樣品中。在另一個實施例中，目標來自含有細菌、病毒或支原體的樣品。在優選例中，目標來自人類。本方法可用于各種目的，包括診斷，公共衛生和法醫學。在一實施例中，本方法用于診斷目的。特別是，本發明能夠用于診斷在一個體內的疾病，其特征是至少一條當沒有疾病時不存在的目標核酸序列的存在。這樣的疾病在本領域中公知，例如，癌癥、囊性纖維變性，以及各種血紅蛋白病。本發明也可用于診斷和感染因子有關的疾病，這樣的疾病包括，例如，AIDS、丙型肝炎和結核病。在優選例中，被診斷的個體是人類，疾病是癌癥。在另一實施例中，測試目標核酸分子存在或數量的樣品是為公共衛生目的取得的樣品。這樣的樣品的例子包括水、食物和土壤，可能含有有害的病原體，例如細菌、病毒和支原體。在進一步的實施例中，測試目標核酸分子存在或數量的樣品是法醫學樣品。這樣的樣品包括體液、組織和細胞，它們可從任何例如犯罪現場的任何來源獲得。本發明還提供同時檢測樣品中多種目標核酸序列的存在的方法，其中包括(a)在允許引物起始的核酸擴增和催化性核酸活性的條件下，和樣品接觸，使用(ⅰ)多個引物，其中對于每個要檢測的目標，存在至少一個適合起始該目標擴增的引物，和(ⅱ)多個酶原基因，其中對于每個要檢測的目標，存在至少一個編碼具有明顯的可測定的活性的催化性核酸分子，但本身是反義序列的酶原基因，引物和酶原基因相互關聯定位，從而當相應目標存在時，產生含有目標和相應的催化性核酸分子序列的單擴增核酸分子；以及(b)同時測定每個催化性核酸活性的存在與否，從而測定樣品中的每個相應的目標核酸序列的存在。在一實施例中，同時檢測多種目標的存在與否的方法還進一步包括定量測定從步驟(a)得到的樣品中每個催化性核酸活性，并將由此得到的每個活性量和已知標準比較，從而對每個目標核酸序列進行定量。可用本方法同時檢測的多重目標的例子包括在參考文獻39中。本發明進一步提供含有引物和酶原基因的DNA分子，其中引物位于酶原基因的3′端。該分子可依照本方法使用。本發明還進一步提供在測定樣品中目標核酸序列存在中使用的試劑盒，其中包括(a)適合起始目標擴增的引物；(b)編碼催化性核酸序列，但本身是反義序列的酶原基因，其中引物和酶原基因相互關聯定位，從而當目標存在時，產生含有目標和催化性核酸分子序列的單擴增核酸分子；以及(c)允許引物起始核酸擴增和催化性核酸活性的試劑。最后，本發明提供在測定樣品中多種目標核酸序列存在與否中使用的試劑盒，其中包括(a)多個引物，其中對于每一個被檢測的目標，至少存在一個適合起始該目標擴增的引物；(b)多個酶原基因，其中對于每個要檢測的目標，存在至少一個編碼具有明顯的可測定的活性的催化性核酸分子，但本身是反義序列的酶原基因，其中引物和酶原基因相互關聯定位，從而當相應目標存在時，產生含有目標和相應的催化性核酸分子序列的單擴增核酸分子；以及(c)允許引物起始核酸擴增和催化性核酸活性的試劑。在一實施例中，本試劑盒進一步含有對分離從個體或樣品得到的核酸分子樣品有用的試劑。在本試劑盒中的組分可以從商業獲得或參照本領域中公知的方法制備，如在下面的實驗細節部分中例證的。另外，本試劑盒的組分可以是溶液的或適當冷凍干燥。在一實施例中，組分在一個盒，而在另一個實施例中，組分在不同的盒中。在優選例中，試劑盒進一步包括使用說明。在本方法和試劑盒中，核酸擴增可通過本領域所知的任何適合的方法進行，尤其是從PCR,SDA，和TMA中選擇。許多和本發明相關的方法是本領域的常規技術。這些包括分離核酸分子的技術，包括例如，苯酚氯仿抽提、柱上的快裂解和捕獲(34-38)；核酸分子檢測和定量的方法；催化性核酸活性的檢測和定量的方法；擴增核酸序列的方法；包括例如，PCR,SDA和TMA(也稱為(SSR))(1-10,41)；為擴增特定目標序列設計和制造引物的方法；以及測定是否催化性核酸分子切開擴增的核酸片斷的方法，包括例如，聚丙烯酰胺凝膠電泳和熒光共振能量轉移(FRET)(25,31)。本發明可通過參考下面的實驗詳述更好的理解，但那些本領域的熟練人員可容易的理解，特別詳述的實驗只是在其后的權利要求中更全面的敘述的本發明的例證。實驗詳述實施例1腫瘤細胞DNA中K-ras的檢測A．PCR引物三種PCR引物(5KID,3K2Dz3和3K2)由OligosEtc.,Inc.(Wilsonville,OR,USA)合成。5′PCR引物(5KID)和人類K-ras基因互補。3′引物3K2Dz3是酶原基因PCR引物，其含有(a)含有和活性的DNA酶互補的催化性的無活性反義序列的5′區域，以及(b)和人類K-ras基因互補的3′區域。在用5KID和3K2Dz3進行PCR擴增時，通過5KID延伸產生的擴增子含有摻入它們的3′區域的K-ras序列和DNA酶的催化活性的有義拷貝。活性的DNA酶被設計用來切開RNA/DNA報道底物(Sub1)。引物3K2是含有相同的摻入3K2Dz3的K-ras-特異性序列的對照引物。然而該引物不含酶原基因序列。PCR引物的序列列于下文。下劃線的序列和人類K-ras互補，而斜體的序列是和活性DNA酶互補的非活性(反義)的序列。5KID(5′K-ras引物)GGCCTGCTGAAAATGACTGAATA3K2Dz3(3′K-ras酶原基因引物)GAGAACTGCAATTCGTTGTAGCTAGCCTTTCAGGACCCACGTCCACAAAATGATTCTGA3K2(3′K-ras引物用于對照反應)CGTCCACAAAATGATTCTGAB．報道底物報道底物(Sub1)由OligosEtc.,Inc.(Wilsonville,OR,USA)合成。Sub1是含有RNA(粗體，下劃線)和DNA堿基的嵌合分子。它具有3′磷酸基團，防止在PCR中被DNA多聚酶延伸。Sub1通過標準技術(34)用32P在5′末端標記。Sub1的序列在下列出。Sub1GAGAACTGCAAUGUUTCAGGACCCAC．對照切開反應的DNA酶DNA酶Dz3a由OligosEtc.,Inc.(Wilsonville,OR,USA)合成。該DNA酶被設計用來在用酶原基因引物3K2Dz3進行PCR擴增時，在與產生的活性的DNA酶切開的相同序列處切開Sub1。Dz3a的序列在下列出。Dz3aTCCTGAAAGGCTAGCTACAACGAATTGCAGTD．腫瘤細胞株的基因組DNA的制備人類細胞株K562從美國典型培養物保藏中心(Rockville,MD)獲得。K562是含有野生型K-ras序列的白血病細胞株。基因組DNA通過陽離子聚合物抽提制備(38)。E．K-ras基因的PCR擴增從K562分離到的基因組DNA用PCR擴增。反應(A1和A2)含有基因組DNA(500納克)、50pmole的5KID、1pmole的3K2Dz3、50fmole的32P標記的Sub1、每種dNTP(dATP,dCTP,dTTP,dGTP)以100μM溶于100mM的NaCl,50mM的Tris(pH8.3,25℃)和8mM的MgCl2。將6單位的TaqDNA多聚酶(5單位/微升；AmpliTaq,PerkinElmer)和溶于1.8微升抗體稀釋緩沖液(Clontech)的2微升TaqStartTM抗體(1.1mg/ml,Clontech)混合。將TaqDNA多聚酶TaqStartTM抗體混合物室溫培養15分鐘，然后加到PCR混合物中。總反應體積是50微升。負對照反應(B)含有所有的除基因組DNA以外的反應組分。第二個負對照反應(C)含有除3K2Dz3，(用1pmole的3K2代替)以外的所有組分。正對照切開反應(D)含有30pmole的Dz3a加上所有的在反應C中存在的反應組分。反應被放在GeneAmpPCR系統9600(PerkinElmer)中，94℃變性2分鐘，然后進行92℃20秒和58℃30秒的20個循環，再進行92℃20秒，74℃1秒和40℃20秒的20個循環。F．切開的報道底物Sub1的檢測每個反應的3微升份量不經后隨操縱步驟，在16％的變性聚丙烯酰胺凝膠上進行電泳分析。凝膠在磷光顯像儀445S1(MolecularDynamics)上通過磷光顯像觀測。放射性標記的25堿基的Sub1報道底物被切開，從而在正對照切開反應D中產生一13堿基的放射性標記的片段。存在于PCR反應A1和A2的13-堿基的片段含有基因組DNA和酶原基因引物3K2Dz3，表示用PCR對K-ras基因的成功擴增。在負對照反應B(不含基因組DNA)中，只有25堿基片段是明顯的，表示在不存在目標DNA時未發生底物的切開。最后，在負對照反應C中，其中酶原基因引物被只含K-ras序列的引物所代替，由于在該反應中未產生活性DNA酶，底物不被切開。實施例2熒光報道底物的切開A．報道底物報道底物，SubCz2，由OligosEtc.,Inc.(Wilsonville,OR,USA)合成。SubCz2的序列在下列出。SubCz2是含有RNA(在下用小寫表示)和DNA核苷酸的嵌合分子。它具有3′磷酸基團，防止在PCR中被DNA多聚酶延伸。SubCz2用一個和5′核苷酸(粗體，下劃線)結合的6-羧基氫化熒光素(“6-FAM”)部分以及一個和RNA堿基的3′端的第一個“T”脫氧核糖核苷酸(粗體，下劃線)N,N,N′,N′-四甲基-6-羧基羅丹明(“TAMRA”)部分合成。報道底物的切開可用485納米(FAM激發波長)激發，在530納米(FAM放射波長)監控。SubCz25′CCACTCguATTAGCTGTATCGTCAAGCCACTC3′B．PCR引物兩種PCR引物由BresatecPty.Ltd.(Adelaide,SA,Australia)或PacificOligosPty.Ltd.(Lismore,NSW,Australia)合成。5′PCR引物(5K49)和人類K-ras基因互補。3′引物(3K45Zc2)是含有(a)含有和活性的DNA酶互補的催化性的無活性反義序列的5′區域，以及(b)和人類K-ras基因互補的3′區域。在用5K49和3K45Zc2進行PCR擴增時，通過5K49延伸產生的擴增子含有摻入它們的3′區域的K-ras序列和DNA酶的催化活性的有義拷貝。活性的DNA酶被設計用來切開RNA/DNA報道底物SubCz2。PCR引物的序列在下列出。下劃線的部分和人類K-ras基因互補，而粗體所示的序列是和活性DNA酶互補的非活性(反義)序列。5K49(5′K-ras引物)5′CCTGCTGAAAATGACTGAATATAAA3′3K45Zc2(3′K-ras酶原基因引物)5′CCACTCTCGTTGTAGCTAGCCTATTAGCTGTATCGTCAAGCCACTCTTGC3′C．腫瘤細胞株的基因組DNA的制備人類細胞株K562從美國典型培養物保藏中心(Rockville,MD)獲得。K562是含有野生型K-ras序列的白血病細胞株。基因組DNA通過陽離子聚合物抽提制備(38)。D．K-ras基因的PCR擴增從K562分離到的基因組DNA用PCR擴增。反應含有20pmole的5K49、3pmole的3K45Zc2、10pmole的SubCz2、8mM的MgCl2，每種100μM的dATP,dCTP,dTTP和dGTP，以及1x緩沖液(75mM含10mMTrispH8.3,25℃的KCl)。所有PCR用的溶液用DEPC處理的水配制。3單位的TaqDNA多聚酶(5單位/微升AmpliTaq,PerkinElmer)和TaqStartTM抗體(Clontech)混合，得到最終的TaqDNA多聚酶TaqStartTM抗體的摩爾比率為1∶10。TaqDNA多聚酶TaqStartTM抗體混合物室溫下培養15分鐘，然后加入PCR混合物到。使總反應體積是50微升。建立復制反應，其中含500納克的K562基因組DNA。對照反應含有除基因組DNA以外的反應組分。反應被放在ABIPrism7700序列檢測系統，并在40℃培養1分鐘(提供閱讀的基線)，94℃變性3分鐘，然后進行70℃1分鐘，每循環降低1℃，再在94℃培養5秒的20個循環。然后再進行40℃1分鐘，94℃培養5秒鐘的50個循環。熒光通過ABIPrism7700序列檢測系統在PCR退火/延伸階段測量。有基因組DNA的反應顯示530納米處的FAM熒光比在對照反應中觀察到的熒光增加。該熒光增加用于監控PCR中K-ras擴增子的聚集。這些結果肯定了酶原基因PCR可被用來促進同類擴增和簡單熒光形式的實時檢測。實施例3使用酶原基因來辨別變異等位基因K-ras密碼子12上的變異的檢測A．策略PCR用的酶原基因引物也可用來分析點突變。在本實施例中，酶原基因引物在PCR中促進活性DNA酶的合成。這些DNA酶被設計成僅在它們的雜交臂和K-ras中的密碼子12的位點1完全互補的適合才順式切開PCR擴增子。Walder，等(41)已指出TaqDNA多聚酶能延伸含有一或二個3′末端核糖殘基的DNA/RNA嵌合引物。這些嵌合引物在此用于產生作為10-23DNA酶的底物的PCR擴增子。PCR用5′DNA/RNA嵌合引物(5K42r)和3′酶原基因引物(3K42Dz2)擴增一段K-ras區域。5K42r和與密碼子12相鄰的K-ras序列雜交，并含有形成DNA酶切開區域的嘌呤嘧啶殘基。酶原基因引物3K42Dz2有和K-ras互補的3′區域，以及含有DNA酶反義的5′區域。酶原基因引物本身無固有的催化活性，但當和5K42r一起使用時，它促進含有(a)靠近它們的5′末端的DNA酶切開位點和(b)3′末端的活性(有義)DNA酶的擴增子的產生。該DNA酶被設計成順式切開擴增子的5′末端。DNA酶的5′臂和密碼子12的野生型序列完全互補。K-ras密碼子12的突變，導致5′DNA酶臂的錯配。該突變可用DNA酶切開的效率的顯著減少來預測。B．引物序列5′嵌合引物5K42r(大寫-脫氧核糖核苷酸殘基；小寫-核糖核苷酸殘基)5′TATAAACTTGTGGTAGTTGGAgcT3′3′酶原基因引物3K42Dz2(粗體部分和10∶23催化核心互補)5′ACTTGTGGTAGTTGGATCGTTGTAGCTAGCCCTGGTGGCAGCTGTATCGTCAAGGCACTC3′引物由PacificOligosPty.Ltd.(Lismore,NSW,Australia)或OligosEtc.,Inc.(Wilsonville,OR,USA)合成。5′引物，5K42r，用g-32P在5′末端標記，通過將25微升的20μM引物和2.5微升多核苷酸激酶(10x103U/ml，無3′磷酸酶，BoehringMannheim),2.5μl的rRNasin(40U/μl重組rRNasin，核糖核酸酶抑制子，Promega),5μl多核苷酸激酶緩沖液(BoehringMannheim),10μlg-32P5′-三磷酸腺苷(2.5μM,StableLableGoldTM,Bresatec)和5微升DEPC水一起在37℃培養30分鐘。C．K-rasDNA模板含有K-ras外顯子1序列的pUC18質粒載體，可以是野生型(GGT)或密碼子12突變(CGT或AGT)，用作PCR的DNA模板。D．酶原基因PCR擴增和反應合成的DNA酶切開PCR混合物含有0.2pg/μl的K-ras質粒DNA,10pmole的g-32P-標記的5K42r,2pmole的3K42Dz2,1mMDTT,8mM的MgCl2,100μM的每種dNTP(dATP,dCTP,dTTP,dGTP),0.4U/μlrRNasin，和1x緩沖液(100mMNaCl和50mMTrispH8.3,25℃)。為每個DNA模板建立復制反應。將6個單位的TaqDNA多聚酶(5單位/μlAmpliTaq,Perkin-Elmer)和TaqStartTM抗體(Clontech)混合，以得到TaqDNA多聚酶TaqStartTM抗體最終摩爾比率1∶5。將TaqDNA多聚酶TaqStartTM抗體混合物室溫培養15分鐘，加入到PCR混合物中。總反應體積是50微升。反應置于GeneAmpPCR9600(Perkin-Elmer)中，96℃變性2分鐘，然后進行60℃1分鐘，94℃處理20秒的30個循環。然后反應進一步進行50℃1分鐘，94℃處理20秒的10個循環。將每個反應的2.5微升份和2.5微升的加樣染料(97.5％甲酰胺，0.1％二甲苯苯胺，0.1％溴酚藍和0.01MEDTA)混合。75℃培養2分鐘，然后立刻加入預溫的16％變性(尿素)丙烯酰胺凝膠中。凝膠電泳大約1小時。PCR產物和切開的片段用分子動態熒光顯像儀445S1掃描凝膠顯像。在凝膠上可見數條條帶(數據未顯示)。片段從遷移最慢到最快(亦即，從膠起始端到底部)依次為(a)PCR擴增子(成雙移動)，(b)未結合的引物和(c)切開的PCR擴增子。由在5′引物中的核糖核苷酸殘基的背景水解產生的少量的兩種片段，也在引物和切開的擴增子間可見，和切開的擴增子平行移動。在所有的反應中，PCR產物和未結合的引物都可見。含有密碼子12野生型(亦即，那些和DNA酶完全互補者)的模板DNA的反應含有切開的擴增子。含有密碼子12突變的模板DNA(亦即，那些和DNA酶錯配者)的反應不含切開的擴增子。在這些反應的凝膠中只有該位置的低水平的背景水解產物可見。下列的序列是密碼子12位點1(下劃線)的野生型擴增子的一個構型的顯示，其中DNA酶(粗體)順式雜交。5′TATAAACTTGTGGTAGTTGGAgcTGGTGGCGTAGGCAAGAGTGCC3′TGAACACCATCAACCTGACCACCGTCGACATAGCAGTTAGGGCCATAACGATC以本發明為基礎，使用引物設計的常規方法，導致DNA酶的產生的酶原基因引物可容易的被設計，用于特異性的切開突變的K-ras序列。參考文獻1．美國專利號4,683,202。2．美國專利號4,683,195。3．美國專利號4,000,159。4．美國專利號4,965,188。5．美國專利號5,176,995。6．F.F.Chehab,等。(1987)自然科學雜志329:293-294。7．R.K.Saiki,等。(1985)科學雜志230:1350-1354。8．Walker,G.T.等。(1992)鏈置換擴增--等溫體外DNA擴增技術。核酸研究20:1691。9．Jonas,V.，等。(1993)通過rRNA擴增直接從痰液沉淀物檢測和識別結核(分枝)桿菌。臨床微生物學雜志31:2410-2416。10．Fahy,E.，等。(1991)自動維持序列復制(3SR):PCR替代的等溫、轉錄基礎的擴增。PCR方法應用1:25-33。11．Nazarenko,I.A.，等。(1997)能量傳遞為基礎的擴增和檢測DNA的密封試管形式。核酸研究25:2516-2521。12．Tyagi,S.和Kramer,F.R.(1996)分子標記雜交熒光探針自然科學雜志生物技術14:303-308。13．Lee,L.G.,Connell,C.R.和Bloch,W.(1993)用熒光探針通過切口平移PCR進行等位基因識別。核酸研究21:3761-3766。14．Urdea,M.(1993)用于直接和定量檢測CMV,HBV,HCV和HIV的分枝DNA(bDNA)的合成和鑒定。臨床化學39:725-726。15．Eigen,M.和Rigler,R.(1994)單分子分類診斷和進化生物技術的應用。PNAS91:5740-5747。16．Perriman,R.和Gerlach,W.L.(1992)對錘頭核酶的延伸目標位點的特異性。基因雜志113:157-163。17．Breaker,R.R.和Joyce,G.(1994)切開RNA的DNA酶。化學和生物學1:223-229。18．Koizumi,M.，等.(1989)識別RNA中單一堿基突變的RNA酶的設計。核酸研究17:7059-7069。19．E.Otsuka和M.Koizumi，日本專利號4,235,919。20．Kashani-Sabet,M，等(1992)通過抗-ras核酶逆轉惡性腫瘤反義研究和進展2:3-15。21．Raillard,S.A.和Joyce,G.F.(1996)用DNA切開核酶定位HIV-1cDNA中的目標位點。生物化學35:11693-11701.22．Carmi,N.，等.(1996)自切開的DNA的體外篩選。化學和生物學3:1039-1049。23．Komatsu,Y.,Koizumi,M.,Sekiguchi,A.和Ohtsuka,E.(1993)由發夾核酶催化的交叉連接和交換反應。核酸研究21:185-190。24．Santoro,S.W.和Joyce,G.(1997)通用的目的RNA-切開DNA酶。PNAS94:4262-4266。25．Cuenoud,B.和Szostak,J.W.(1995)具有DNA連接酶活性的DNA金屬酶。自然科學雜志375:611-614.26．Li,Y.和Sen,D.A.(1996)卟啉金屬化的催化DNA。怕tureStruct.Biol.3:734-747.27．Tarasow,T.M.,Tarasow,S.L.和Eaton,B.E.(1997)RNA-催化的碳-碳鍵形成。自然科學雜志389:54-57。28．Illangasekare,M.,Sanchez,Nickles,T.，和Yarus,M.(1995)RNA催化的胺酰基-RNA合成。科學雜志267:643-647。29．Lohse,P.A.和Szostak,J.W.(1996)核酶催化的氨基酸轉移反應。自然科學雜志381:442-444。30．Breaker,R.R.DNA酶(1997)自然科學雜志生物技術15:427431。31．PCT國際出版號WO94/29481。32．PCT國際出版號WO96/17087。33．PCT國際出版號WO96/27026。34．Promega流程和應用指南。Titus,D.E.(Ed)Promega公司(1991)。35．Kramvis,A.,Bukofzer,S.和Kew(1996)用QIAamp血液試劑盒，Genereleaser，和酚-氯仿方法從血清中得到的乙型肝炎病毒DNA抽提物的比較。臨床微生物學雜志34:2731-2733。36．Yong,S.L.,Thomas,R.J.S.和Phillips,W.A.(1995)從固體組織中單步驟直接PCR擴增。核酸研究23:1640。37．Sambrook,J.,Fritsch,E.F.和Maniatis,T.(1989)分子克隆實驗室手冊。第二版，NewYork:ColdSpringHarbourLaboratoryPress38．美國專利號5,582,988。39．PCT國際出版號WO96/32500。40．PCR系統，試劑和耗材。PerkinElmer目錄1996-1997。RocheMolecularSystems,Inc.,Branchburg,NewJersey,USA。41.Walder,R.Y.,Hayes,J.R.和WalderJ.A.(1993)使用含有3′-末端核糖殘基的PCR引物防止擴增序列的交叉污染。核酸研究21(18):4339-4343。權利要求1．一種檢測樣品中目標核酸序列存在的方法，其特征在于，包括(a)在允許引物起始的核酸擴增和催化性核酸活性的條件下，和樣品接觸，使用(ⅰ)適合起始目標擴增的DNA引物，和(ⅱ)編碼催化性核酸分子，但本身是反義序列的DNA酶原，其中引物和酶原相互關聯定位，從而在目標存在時，產生含有目標和催化性核酸分子序列的單擴增核酸分子；以及(b)測定催化性核酸活性，從而測定樣品中的目標核酸序列的存在。2．如權利要求1所述的方法，其特征在于，還包括步驟定量測定從步驟(a)得到的樣品中催化性核酸活性量，并將由此得到的活性量和已知標準比較，從而對目標核酸序列進行定量。3．如權利要求1所述的方法，其特征在于，引物和酶原基因在不同的DNA分子上，而引物起始的核酸擴增是滾環擴增。4．如權利要求1所述的方法，其特征在于，樣品和兩個DNA分子接觸，每個分子都含有引物，至少一個分子含有酶原基因，其中引物在酶原基因的3′端。5．如權利要求4所述的方法，其特征在于，在步驟(a)(ⅱ)產生的單擴增核酸分子進一步含有被共同位于擴增分子上的酶原基因編碼的催化性核酸識別并順式切開的核苷酸序列。6．如權利要求5所述的方法，其特征在于，酶原基因編碼的催化性核酸是10-23DNA酶，而在步驟(a)(ⅰ)中使用的DNA引物含有至少一個嘌呤核糖核苷酸殘基，該殘基作為被10-23DNA酶識別并順式切開的位點的5′端。7．如權利要求4所述的方法，其特征在于，至少有兩個DNA分子同時含有引物和酶原基因。8．如權利要求1所述的方法，其特征在于，目標核酸序列是DNA分子。9．如權利要求1所述的方法，其特征在于，目標核酸序列是RNA分子，而步驟(a)進一步包括在用引物和酶原基因接觸樣品前，將目標核酸序列，若存在，反轉錄成DNA的步驟。10．如權利要求1所述的方法，其特征在于，催化性核酸分子是核酶。11．如權利要求1所述的方法，其特征在于，催化性核酸分子是DNA酶。12．如權利要求1所述的方法，其特征在于，催化性核酸活性包括可檢測的化學底物的修飾，該修飾選自磷酸二酯鍵的形成和切開，核酸連接和切開，卟啉金屬化，和碳-碳、酯和胺鍵的形成。13．如權利要求12所述的方法，其特征在于，可檢測的化學底物修飾是熒光標記的核酸分子的切開。14．如權利要求13所述的方法，其特征在于，熒光標記的核酸分子是DNA/RNA嵌合體。15．如權利要求1所述的方法，其特征在于，目標核酸序列來自選自人類、細菌、支原體和病毒的有機體。16．如權利要求15所述的方法，其特征在于，目標核酸序列來自人類。17．如權利要求16所述的方法，其特征在于，樣品中的目標核酸序列的存在是遺傳疾病。18．如權利要求1所述的方法，其特征在于，樣品是法醫學樣品。19．一種同時檢測樣品中多種目標核酸序列存在與否的方法，其特征在于，包括(a)在允許引物起始的核酸擴增和催化性核酸活性的條件下，和樣品接觸，使用(ⅰ)多個引物，其中對于每個要檢測的目標，存在至少一個適合起始該目標擴增的引物，和(ⅱ)多個酶原基因，其中對于每個要檢測的目標，存在至少一個編碼具有明顯的可測定的活性的催化性核酸分子，但本身是反義序列的酶原基因，引物和酶原基因相互關聯定位，從而當相應目標存在時，產生含有目標和相應的催化性核酸分子序列的單擴增核酸分子；以及(b)同時測定每個催化性核酸活性的存在與否，從而測定樣品中的每個相應的目標核酸序列的存在。20．如權利要求19所述的方法，其特征在于，進一步包括步驟定量測定從步驟(a)得到的樣品中每個催化性核酸活性，并將由此得到的每個活性量和已知標準比較，從而對每個目標核酸序列進行定量。21．一種DNA分子，其特征在于，含有引物和酶原基因，其中引物位于酶原基因的3′端。22．如權利要求1或19所述的方法，其特征在于，核酸擴增可通過選自PCR,SDA，和TMA的方法進行。23．一種測定樣品中目標核酸序列存在中使用的試劑盒，其特征在于，包括(a)適合起始目標擴增的引物；(b)編碼催化性核酸序列，但本身是反義序列的酶原基因，其中引物和酶原基因相互關聯定位，從而當目標存在時，產生含有目標和催化性核酸分子序列的單擴增核酸分子；以及(c)允許引物起始核酸擴增和催化性核酸活性的試劑。24．一種在測定樣品中多種目標核酸序列存在與否中使用的試劑盒，其特征在于，包括(a)多個引物，其中對于每一個被檢測的目標，至少存在一個適合起始該目標擴增的引物；(b)多個酶原基因，其中對于每個要檢測的目標，存在至少一個編碼具有明顯的可測定的活性的催化性核酸分子，但本身是反義序列的酶原基因，其中引物和酶原基因相互關聯定位，從而當相應目標存在時，產生含有目標和相應的催化性核酸分子序列的單擴增核酸分子；以及(c)允許引物起始核酸擴增和催化性核酸活性的試劑。25．如權利要求23或24所述的試劑盒，其特征在于，核酸擴增可通過選自PCR,SDA，和TMA的方法進行。全文摘要本申請提供了對樣品中的目標核酸序列的檢測和定量的方法,包括用引物和編碼的,但本身是一催化性核酸序列的反義序列的酶原基因和樣品接觸,從而當目標存在時,產生單一擴增的核酸分子,其含有目標和催化分子的序列。本發明進一步提供了同時檢測在樣品中的多種目標核酸序列的存在與否的方法。最后,本發明還提供了實現上述方法的分子和試劑盒。文檔編號C12N15/09GK1319142SQ99811114公開日2001年10月24日申請日期1999年2月22日優先權日1998年3月5日發明者A·托德,C·J·富爾里,M·凱恩斯申請人:約翰遜及約翰遜研究有限公司