組成型抗病性基因(cdr1)及其使用方法

專(zhuān)利名稱(chēng)：組成型抗病性基因(cdr1)及其使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明總的來(lái)講涉及植物中的抗病性，更具體地講，涉及植物抗性因子-組成型抗病性1(CDR1)、編碼CDR1的多核苷酸以及用其產(chǎn)生具有提高的病原體抗性的轉(zhuǎn)基因植物的方法。
背景技術(shù)：
當(dāng)植物可以發(fā)揮其生理功能，諸如細(xì)胞分裂、分化、發(fā)育、光合作用、吸收以及從土壤轉(zhuǎn)運(yùn)水和營(yíng)養(yǎng)物、代謝、繁殖和食物供應(yīng)的貯存，且功能未受破壞時(shí)，認(rèn)為該植物是健康的。當(dāng)植物功能受到病原體破壞時(shí)，所述植物則患病。病害可以定義為由于病原體的連續(xù)刺激引起的植物宿主細(xì)胞和組織的功能失常。病害涉及該植物的生理形式或行為形式的異常變化。
植物病原體通過(guò)從植物細(xì)胞吸收養(yǎng)料、分泌擾亂或殺傷植物細(xì)胞的毒素、酶或生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)、或阻斷植物中的食物營(yíng)養(yǎng)素或水的轉(zhuǎn)運(yùn)，使植物弱化，而引起病害。根、莖、葉、花或果實(shí)都可以被感染。受影響的細(xì)胞和組織被弱化或破壞，不能行使正常的生理功能，導(dǎo)致植物生長(zhǎng)減弱或死亡，并導(dǎo)致作物品質(zhì)降低或減產(chǎn)。植物病害的主要病因是細(xì)菌、支原體、病毒、線(xiàn)蟲(chóng)和真菌。影響植物的真菌來(lái)自各種各樣的屬，包括鐮孢屬(Fusarium)、腐霉屬(Pythium)、疫霉屬(Phytophthora)、輪枝孢屬(Verticillium)、絲核菌屬(Rhizoctonia)、殼球孢屬(Macrophonmina)、根串珠霉屬(Thielaviopsis)、核盤(pán)菌屬(Sclerotinia)和許多其它屬。由真菌引起的植物病害包括出苗前猝倒和出苗后猝倒、下胚軸腐病、根腐病、冠腐病、維管萎蔫病和其它癥狀。對(duì)植物有害的線(xiàn)蟲(chóng)包括來(lái)自根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)屬(Meloidogyne)、異皮線(xiàn)蟲(chóng)屬(Heterodera)、莖線(xiàn)蟲(chóng)屬(Ditylenchus)和短體線(xiàn)蟲(chóng)屬(Pratylencus)的線(xiàn)蟲(chóng)屬。由線(xiàn)蟲(chóng)引起的植物病害包括根癭、根腐病、侵蝕斑、“粗短”根、矮化和其它腐病和萎蔫病。在包括李屬(Prunus)、葡萄、煙草和番茄在內(nèi)的許多植物中，某些線(xiàn)蟲(chóng)(例如毛刺線(xiàn)蟲(chóng)屬(Trichodorus)、Lonoidorus、Xipenema)可以作為病毒病的載體。
植物致病細(xì)菌引起多種植物病癥。約80個(gè)細(xì)菌物種(例如綠黃假單胞菌(Pseudomonas viridiflava)、野油菜黃單胞菌asclepiadas致病變種(Xanthomonas campestris pv.asclepiadas)、苛養(yǎng)木桿菌(Xyellafastidiosa)、Acidovorax albilineans和燕麥?zhǔn)乘峋鞴蟻喎N(Acidovoraxavenae sspl citrulli)引起植物病害，包括果腐病、菌癭、萎蔫病、葉枯病和葉斑病。當(dāng)細(xì)菌快速繁殖時(shí)，在病程早期控制它們是關(guān)鍵性的。銅化合物和鏈霉素化合物是目前可用于防治細(xì)菌病害的僅有的化學(xué)化合物。
植物對(duì)微生物侵襲的反應(yīng)涉及從頭合成一系列用來(lái)限制該病原體生長(zhǎng)的蛋白質(zhì)。這些蛋白質(zhì)包括富含羥脯氨酸的糖蛋白、蛋白酶抑制劑、合成植物抗毒素(phyoalexin)的酶、有助于增強(qiáng)細(xì)胞壁的酶和某些水解酶。
植物防御也可以被衍生自微生物細(xì)胞壁和培養(yǎng)液的激衛(wèi)素激活。在雙子葉植物中，廣泛的研究已經(jīng)表明，微生物侵襲或激衛(wèi)素處理誘導(dǎo)編碼參與防御反應(yīng)的蛋白的一組基因的轉(zhuǎn)錄，作為基因表達(dá)總體模式中的整體開(kāi)關(guān)的一部分。相比之下，對(duì)于單子葉植物中的誘導(dǎo)型防御卻知之甚少。
植物的遺傳工程需要分離和操作例如DNA或RNA的遺傳物質(zhì)，隨后即該物質(zhì)引入植物或植物細(xì)胞中，近幾年來(lái)植物的遺傳工程已經(jīng)大大改變了植物育種和農(nóng)業(yè)。作物營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的提高、產(chǎn)量增加，有飼養(yǎng)價(jià)值的提高、生產(chǎn)成本降低、對(duì)害蟲(chóng)的抗性、逆境耐性、耐旱性、藥物、化學(xué)分子和生物分子的生產(chǎn)以及其它有益性狀，所有這些均可能通過(guò)遺傳工程技術(shù)獲得。提供涉及病原體抗性的基因的遺傳工程技術(shù)具有限制影響作物產(chǎn)生的潛力可能性。
發(fā)明概述本發(fā)明是基于對(duì)賦予植物增強(qiáng)的抗病性的組成型抗病性(CDR1)因子的發(fā)現(xiàn)，所述抗病性包括對(duì)病原體丁香假單胞菌番茄致病變種(Pseudomonas syringe pv.tomato)(Pst)或丁香假單胞菌斑生致病變種(Pseudomonas syringe pv.maculicola)(例如Psm)的抗性。
在一個(gè)實(shí)施方案中，提供基本純化的CDR1多肽。也提供分離的編碼CDR1多肽的多核苷酸，例如SEQ ID NO:1。還提供含CDR1的載體、表達(dá)CDR1的宿主細(xì)胞和結(jié)合于CDR1的抗體。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于產(chǎn)生與未遺傳修飾相比鑒定為抗病性提高的遺傳修飾的植物的方法。所述方法包括使植物細(xì)胞與編碼CDR1多肽、與表達(dá)控制序列有效連接的核酸接觸，獲得轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞；由轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞產(chǎn)生植株；和選擇表現(xiàn)出抗病性提高的植株。也提供一種方法，遺傳修飾植物細(xì)胞，使得與野生型植物相比，由所述細(xì)胞產(chǎn)生的植物被鑒定為抗病性提高。該方法包括將分離的編碼CDR1多肽的多核苷酸引入植物細(xì)胞中，獲得轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞，并且在允許表達(dá)CDR1多核苷酸的條件下培育轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞，由此產(chǎn)生抗病性提高的植物。
在再一實(shí)施方案中，提供通過(guò)使易感性植物與一種因子接觸產(chǎn)生遺傳修飾的植物的方法，其中所述因子的量為將CDR1基因表達(dá)提高至高于未接觸所述因子的植物中CDR1表達(dá)所必需的CDR1啟動(dòng)子誘導(dǎo)量，而且與相應(yīng)的野生型植物相比，所述遺傳修飾的植物被鑒定為抗病性提高。例如，所述因子可以是轉(zhuǎn)錄因子或化學(xué)試劑，諸如地塞米松(DEX)。
也提供一種方法，通過(guò)將具有有效連接至編碼CDR1多肽的多核苷酸的表達(dá)控制序列的核酸序列，引入植物細(xì)胞的基因組中，獲得轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞，產(chǎn)生遺傳轉(zhuǎn)化的抗病性植物。本發(fā)明也提供通過(guò)本發(fā)明方法產(chǎn)生的植物、植物組織和種子。
在再一實(shí)施方案中，提供一種方法，通過(guò)用至少一種編碼CDR1的多核苷酸片段探測(cè)核酸文庫(kù)，并選擇與所述片段雜交的那些克隆，鑒定新的抗病性基因。
附圖簡(jiǎn)述

圖1是激活標(biāo)記雙元載體pSK115的示意圖。
圖2是pCDR1E和pCDR1C1的組構(gòu)圖。
圖3A和3B為CDR1的基因組序列和推導(dǎo)的氨基酸序列(分別為SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2)。
圖4是顯示由CDR1誘導(dǎo)的4.5kDa多肽的1-D銀染凝膠。
優(yōu)選實(shí)施方案的描述必須注意，如本文和所附的權(quán)利要求書(shū)中所用的，單數(shù)形式的“a”、“and”和“the”包括復(fù)數(shù)指示物，除非正文清楚地指明是其它情況。因此，例如提及“a cell”包括多個(gè)這種細(xì)胞，而提及“thereceptor”包括是指一個(gè)或多個(gè)受體以及本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其等同物等等。
除非另有定義，否則本文所用的所有科技術(shù)語(yǔ)均具有本發(fā)明所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員通常理解的相同含義。盡管可以使用與本文所述的相似或等同的任何方法、裝置和材料來(lái)實(shí)施或檢驗(yàn)本發(fā)明，但現(xiàn)在描述優(yōu)選的方法、裝置和材料。
為了描述和公開(kāi)在出版物中描述的、可以結(jié)合本發(fā)明使用的細(xì)胞系、趨化因子和方法，將本文提及的所有出版物均通過(guò)引用全文結(jié)合到本文中。以上討論的和在全文中討論的出版物僅提供在本申請(qǐng)申請(qǐng)日之前的其公開(kāi)內(nèi)容。在這一點(diǎn)上決不能憑借先有的發(fā)明解釋為承認(rèn)本發(fā)明人沒(méi)有權(quán)利說(shuō)早了這些公開(kāi)內(nèi)容的
公開(kāi)日期。
本發(fā)明提供組成型抗病性(CDR1)多肽、多核苷酸和用法。CDR1賦予對(duì)植物病原體的抗性，因此可用于產(chǎn)生遺傳修飾的抗害蟲(chóng)植物。多核苷酸、多肽、載體和宿主細(xì)胞本發(fā)明提供基本純化的CDR1多肽。CDR1最好具有SEQ ID NO:2中提出的氨基酸序列及其保守變異體(參見(jiàn)圖3)。本文所用的術(shù)語(yǔ)“基本純化的”是指基本上不含其它蛋白、脂質(zhì)、糖類(lèi)或與其天然結(jié)合的其它材料的多肽。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以采用蛋白純化的標(biāo)準(zhǔn)方法來(lái)純化CDR1。所述基本純化的CDR1在非還原聚丙烯酰胺凝膠上將產(chǎn)生一條單一的主帶。CDR1多肽的純度可以通過(guò)氨基末端氨基酸序列分析來(lái)測(cè)定。
本發(fā)明包括功能性CDR1多肽及其功能片段。本文所用的術(shù)語(yǔ)“功能性多肽”是指具有通過(guò)限定的功能測(cè)定鑒定的生物功能或活性、且與所述細(xì)胞中特定生物學(xué)、形態(tài)學(xué)或表型的改變相關(guān)的多肽。術(shù)語(yǔ)CDR1多肽的功能片段是指保留CDR1活性的所有CDR1片段。生物功能片段例如可以在大小方面改變，從小至能夠結(jié)合抗體分子的表位的多肽片段至能夠參與特征性誘導(dǎo)或編程細(xì)胞內(nèi)表型改變的大的多肽。一個(gè)具體的非限制性的CDR1功能片段的實(shí)例是編碼能夠提高PR-1、PR-2或RbohA轉(zhuǎn)錄水平的結(jié)構(gòu)域的多肽。另一方面，功能片段可以賦予對(duì)特定病原體的抗病性，或可以結(jié)合DNA并激活轉(zhuǎn)錄或CDR1調(diào)節(jié)的基因。
對(duì)所述CDR1一級(jí)氨基酸序列的小的修飾，可能產(chǎn)生與本文所述的未修飾的對(duì)應(yīng)多肽相比具有基本等同活性的蛋白質(zhì)。這類(lèi)修飾可以是有意的，如通過(guò)定點(diǎn)誘變，或可以是自發(fā)的。本文包括通過(guò)這些修飾產(chǎn)生的所有多肽，只要CDR1的生物活性仍存在。另外，缺失一個(gè)或多個(gè)氨基酸也可能導(dǎo)致所得分子結(jié)構(gòu)的修飾，而不顯著改變其活性。缺失可以導(dǎo)致產(chǎn)生可能具有更廣泛應(yīng)用性的更小的活性分子。例如，應(yīng)該有可能去除CDR1活性所需的氨基末端或羧基末端的氨基酸。顯性失活形式的CDRⅠ也包括在此中。
CDR1多肽包括與SEQ ID NO:2中提出的序列基本相同的氨基酸序列。術(shù)語(yǔ)基本相同是指氨基酸序列保留本文所述的CDR1活性，例如賦予對(duì)植物病原體的抗性。本發(fā)明的CDR1多肽包括所述多肽序列的保守變異。本文所用的術(shù)語(yǔ)“保守變異”是指一個(gè)氨基酸殘基被生物上相似的另一殘基取代。保守變異的實(shí)例包括一個(gè)疏水殘基(例如異亮氨酸、纈氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸)取代另一個(gè)疏水殘基，或一個(gè)極性殘基取代另一個(gè)極性殘基，例如精氨酸取代賴(lài)氨酸，谷氨酸取代天冬氨酸，或谷氨酰胺取代天冬酰胺，等等。術(shù)語(yǔ)“保守變異”也包括用取代的氨基酸替代未取代的母體氨基酸，前提是針對(duì)所述取代的多肽產(chǎn)生的抗體也與未取代的多肽免疫反應(yīng)。
在再一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供基本純化的多肽，所述多肽經(jīng)PAGE鑒定為分子量約4.5kDa；被CDR1多肽誘導(dǎo)；且具有誘導(dǎo)植物抗病性的生物活性。實(shí)施例13提供了CDR1表達(dá)導(dǎo)致特異性誘導(dǎo)4.5kDa蛋白的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。盡管不希望束縛于特定的理論，但認(rèn)為該蛋白可能在植物中負(fù)責(zé)提供抗病性。因此，分離出所述4.5kDa蛋白后，則可以將其獨(dú)立地用來(lái)在植物提供抗病性，抗4.5kDa抗體可以用于在植物中提高對(duì)病害的易感性。
本發(fā)明提供編碼所述CDR1蛋白的多核苷酸。這些多核苷酸包括編碼CDR1的DNA、cDNA和RNA序列。要理解的是，編碼CDR1的所有多核苷酸也都包括在本文中，只要它們編碼具有CDR1活性的多肽或其片段。這類(lèi)多核苷酸包括天然存在的、合成的、和有意操作的多核苷酸。例如，可以對(duì)CDR1多核苷酸進(jìn)行定點(diǎn)誘變。CDR1的多核苷酸序列也包括反義序列和編碼顯性失活形式的CDR1的序列。本發(fā)明的多核苷酸包括由于遺傳密碼簡(jiǎn)并的序列。存在20種天然的氨基酸，其中大多數(shù)由一個(gè)以上的密碼子來(lái)確定。因此，所有簡(jiǎn)并的核苷酸序列均包括在本發(fā)明中，只要由所述核苷酸序列編碼的CDR1多肽的氨基酸序列在功能上未改變。
本文具體公開(kāi)了編碼CDR1多肽的核酸序列(圖3)。在SEQ ID NO:1中提出了典型的CDR1核苷酸序列。術(shù)語(yǔ)多核苷酸序列或核酸序列是指多聚形式的核苷酸，其長(zhǎng)度至少為10個(gè)堿基。所謂分離的多核苷酸是指與在衍生其的生物的天然存在的基因組中與其緊密相鄰的兩個(gè)編碼序列(一個(gè)位于5’端，一個(gè)位于3’端)不緊密相鄰的多核苷酸。因此，該術(shù)語(yǔ)包括例如加入載體中的重組DNA；加入自主復(fù)制型質(zhì)?；虿《局械闹亟MDNA；或加入原核生物或真核生物基因組DNA中的重組DNA，或作為獨(dú)立于其它序列的單獨(dú)的分子(例如cDNA)存在的重組DNA。本發(fā)明的核苷酸可以是核糖核苷酸、脫氧核糖核苷酸或這兩種核苷酸中任一種的修飾形式。該術(shù)語(yǔ)包括單鏈形式和雙鏈形式的DNA。
編碼CDR1的多核苷酸包括SEQ ID NO:1、編碼顯性失活形式的CDR1的多核苷酸和與SEQ ID NO:1互補(bǔ)的核酸序列?；パa(bǔ)序列可以包括反義核苷酸。當(dāng)該序列為RNA時(shí)，SEQ ID NO:1中的脫氧核苷酸A、G、C和T分別由核糖核苷酸A、G、C和U取代。本發(fā)明也包括上述核酸序列的片段，所述片段的長(zhǎng)度至少為15個(gè)堿基，足以允許所述片段選擇性地雜交至在生理?xiàng)l件下編碼SEQ ID NO:2的蛋白或一CDR1的密切相關(guān)家族成員的DNA。也包括SEQ ID NO:1的簡(jiǎn)并變異體、其中T也可以是U的SEQ ID NO:1、以及至少長(zhǎng)15個(gè)堿基的將雜交至編碼CDR1的DNA或RNA的片段。術(shù)語(yǔ)選擇性地雜交是指在排除非相關(guān)核苷酸序列的中等嚴(yán)格或高嚴(yán)格條件下的雜交。
在核酸雜交反應(yīng)中，用來(lái)達(dá)到特定嚴(yán)格水平的條件將根據(jù)待雜交的核酸的性質(zhì)而變化。例如，在選擇雜交條件時(shí)，可以考慮所述核酸雜交區(qū)的長(zhǎng)度、互補(bǔ)性的程度、核苷酸序列的組成(例如GC相對(duì)于AT的含量)和核酸類(lèi)型(例如RNA相對(duì)于DNA)。另一考慮為是否將所述核酸之一固定在例如濾膜上。
漸進(jìn)式較高嚴(yán)格條件的一個(gè)實(shí)例如下2×SSC/0.1SDS，室溫下(雜交條件)；0.2×SSC/0.1SDS，室溫下(低嚴(yán)格條件)；0.2×SSC/0.1SDS，約42℃(中等嚴(yán)格條件)；和0.1×SSC，約68℃(高嚴(yán)格條件)?？梢?xún)H采用這些條件之一進(jìn)行洗滌，例如采用高嚴(yán)格條件，或可以使用每種所述條件，例如以上述所列的順序，每種條件10-15分鐘，重復(fù)所列步驟中的任一步驟或所有步驟。然而，如上所述，最適條件將根據(jù)所涉及的具體雜交反應(yīng)而變化，可以憑經(jīng)驗(yàn)確定。
可以通過(guò)將DNA轉(zhuǎn)移到合適的宿主細(xì)胞中，在體外表達(dá)編碼CDR1的DNA序列?！八拗骷?xì)胞”是載體可以在其中繁殖并表達(dá)載體DNA的細(xì)胞。所述細(xì)胞可以是植物細(xì)胞或原核細(xì)胞或真核細(xì)胞。該術(shù)語(yǔ)也包括所述宿主細(xì)胞的任何后代。人們理解，不可能所有后代均與親代細(xì)胞完全相同，因?yàn)樵趶?fù)制期間可能發(fā)生突變。然而，當(dāng)使用術(shù)語(yǔ)“宿主細(xì)胞”時(shí)，包括這類(lèi)后代。穩(wěn)定轉(zhuǎn)移是指外源DNA在宿主中持續(xù)保留，穩(wěn)定轉(zhuǎn)移的方法是本領(lǐng)域已知的。
在本發(fā)明中，可以將所述CDR1多核苷酸插入表達(dá)載體中。術(shù)語(yǔ)“表達(dá)載體”是指本領(lǐng)域已知的、已經(jīng)通過(guò)插入或加入所述CDR1基因序列進(jìn)行操作的質(zhì)粒、病毒或其它載體。編碼CDR1的多核苷酸序列可以有效地連接至表達(dá)控制序列。有效連接是指一種并列，其中所述組分所處的關(guān)系允許它們以其計(jì)劃的方式起作用。連接有效連接至編碼序列的表達(dá)控制序列，以使在與所述表達(dá)控制序列相容的條件下完成所述編碼序列的表達(dá)。本文所用的術(shù)語(yǔ)表達(dá)控制序列是指調(diào)節(jié)與其有效連接的核酸序列表達(dá)的核酸序列。如果表達(dá)控制序列控制并調(diào)節(jié)核酸序列的轉(zhuǎn)錄以及翻譯(合適時(shí))，則表達(dá)控制序列有效地連接至所述核酸序列。因此，表達(dá)控制序列可以包括合適的啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、轉(zhuǎn)錄終止子、在蛋白編碼基因前面作為起始密碼子(即ATG)、內(nèi)含子的剪接信號(hào)、保持該基因正確讀框以允許正確地翻譯mRNA和終止密碼子。術(shù)語(yǔ)控制序列將最少包括其存在可以影響表達(dá)的組分，也可以包括其存在有利的另外的組分，例如前導(dǎo)序列和融合配偶體(partner)序列。表達(dá)控制序列可以包括啟動(dòng)子。
所謂啟動(dòng)子是指足以指導(dǎo)轉(zhuǎn)錄的最小序列。本發(fā)明也包括足以使依賴(lài)于啟動(dòng)子的基因表達(dá)成為細(xì)胞類(lèi)型特異性、組織特異性控制的或可由外部信號(hào)或因子誘導(dǎo)的那些啟動(dòng)子元件；這類(lèi)元件可以位于該基因的5’或3’區(qū)中。
可以任選地將選擇標(biāo)記與所述CDR1多核苷酸連接。本文所用的術(shù)語(yǔ)“標(biāo)記”是指編碼允許選擇或篩選含所述標(biāo)記的細(xì)胞的性狀或表型的基因。所述標(biāo)記基因最好是抗生素抗性基因，由此可以用合適的抗生素從未轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中選擇轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。適用于植物中的選擇標(biāo)記的實(shí)例包括腺苷脫氨酶、二氫葉酸還原酶、潮霉素-B-磷酸轉(zhuǎn)移酶、胸苷激酶、黃嘌呤-鳥(niǎo)嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶和氨基糖苷3’-O-磷酸轉(zhuǎn)移酶Ⅱ(卡那霉素、新霉素和G418抗性)。其它合適的標(biāo)記是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。
可以利用各種各樣的宿主-表達(dá)系統(tǒng)來(lái)表達(dá)所述CDR1編碼序列。這些系統(tǒng)包括但不限于微生物，諸如用含所述CDR1編碼序列的重組噬菌體核酸、質(zhì)粒核酸或粘粒核酸表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的細(xì)菌；用含所述CDR1編碼序列的重組酵母表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的酵母；用含所述CDR1編碼序列的重組病毒表達(dá)載體(例如花椰菜花葉病毒CaMV；煙草花葉病毒TMV)感染的、或用含所述CDR1編碼序列的重組質(zhì)粒表達(dá)載體(例如Ti質(zhì)粒)轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞系統(tǒng)；用含所述CDR1編碼序列的重組病毒表達(dá)載體(例如桿狀病毒)感染的昆蟲(chóng)細(xì)胞系統(tǒng)；或用含所述CDR1編碼序列的重組病毒表達(dá)載體(例如反轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、痘苗病毒)感染的動(dòng)物細(xì)胞系統(tǒng)、或?yàn)榉€(wěn)定表達(dá)而進(jìn)行工程改造的轉(zhuǎn)化的動(dòng)物細(xì)胞系統(tǒng)。CDR1抗體本發(fā)明的CDR1多肽可以用來(lái)產(chǎn)生對(duì)CDR1多肽的表位具有免疫反應(yīng)性或與其結(jié)合的抗體。提供基本上由具有不同表位特異性的混合單克隆抗體組成的抗體以及不同的單克隆抗體制劑。
多克隆抗體的制備是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。參見(jiàn)例如Green等，Production of Polyclonal Antisera，載于InununochemicalProtoco1s，第1-5頁(yè)，Manson編輯，Humana Press,1992；和Coligan等，Production of Polyclonal Antiserain Rabbits,Rats,Mice and Hamsters，載于Current Protocols in Immunology,2.4.1部分，1992；所述文獻(xiàn)通過(guò)引用結(jié)合到本文中。
單克隆抗體的制備同樣是常規(guī)方法。參見(jiàn)例如Kohler和Milstein，Nature 256:495,1975；Coligan等，2.5.1-2.6.7部分，見(jiàn)上文；和Harlow等，載于Antibodies:a Laboratory Manual，第726頁(yè)，Cold SpringHarbor Pub.,1988；所述文獻(xiàn)通過(guò)引用結(jié)合到本文中。簡(jiǎn)而言之，通過(guò)給小鼠注射包含抗原的組合物，通過(guò)取出血清樣品證實(shí)存在抗體產(chǎn)生，取出脾以獲得B淋巴細(xì)胞，將所述B淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合，以產(chǎn)生雜交瘤，克隆所述雜交瘤，選擇產(chǎn)生針對(duì)所述抗原的抗體的陽(yáng)性克隆，并從雜交瘤培養(yǎng)物中分離所述抗體，可以獲得單克隆抗體?？梢酝ㄟ^(guò)多種很好建立的技術(shù)，從雜交瘤培養(yǎng)物中分離并純化單克隆抗體。這類(lèi)分離技術(shù)包括使用蛋白A Sepharose的親和層析、大小排阻層析和離子交換層析。參見(jiàn)例如Coligan等，2.7.1-2.7.12部分和2.9.1-2.9.3部分，見(jiàn)上文；Bames等，Purification of Immunoglobulin G(IgG)，載于Methods in Molecuar Biology，第10卷，第79-104頁(yè)，Humana Press,1992。
體外和體內(nèi)增殖單克隆抗體的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的?？梢栽诤线m的培養(yǎng)基中進(jìn)行體外增殖，所述培養(yǎng)基例如Dulbecco的改進(jìn)Eagle培養(yǎng)基或RPMⅠ 1640培養(yǎng)基，任選地補(bǔ)充哺乳動(dòng)物血清如胎牛血清、或微量元素和生長(zhǎng)持續(xù)補(bǔ)充物，如正常小鼠腹膜滲出細(xì)胞、脾細(xì)胞、胸腺細(xì)胞或骨髓巨噬細(xì)胞。體外生產(chǎn)提供相對(duì)純的抗體制劑，并允許擴(kuò)大規(guī)模以產(chǎn)生大量的所需抗體?？梢栽跉馍椒磻?yīng)器中通過(guò)同質(zhì)懸浮培養(yǎng)、在連續(xù)攪拌式反應(yīng)器中或在固定化或截留細(xì)胞培養(yǎng)中進(jìn)行大規(guī)模雜交瘤培養(yǎng)。通過(guò)將細(xì)胞克隆注射到與親代細(xì)胞組織相容的哺乳動(dòng)物(例如同源小鼠)中，以使得產(chǎn)生抗體的腫瘤生長(zhǎng)，可以進(jìn)行體內(nèi)增殖。任選地在注射之前，用一種烴、特別是油諸如降植烷(四甲基十五烷)激發(fā)所述動(dòng)物。1-3周后，從該動(dòng)物的體液中回收所需的單克隆抗體。
本發(fā)明所用的術(shù)語(yǔ)“抗體”包括完整的分子及其能夠結(jié)合表位決定簇的片段，諸如Fab、F(ab’)2和Fv。這些抗體片段保留了某些選擇性地與其抗原或受體結(jié)合的能力，其定義如下(1)Fab，可以通過(guò)用木瓜蛋白酶消化完整的抗體，產(chǎn)生一條完整的輕鏈和一條重鏈的一部分，來(lái)產(chǎn)生含有抗體分子的單價(jià)抗原結(jié)合片段的Fab片段；(2)Fab’，通過(guò)用胃蛋白酶處理完整的抗體，然后還原，產(chǎn)生一條完整輕鏈和重鏈的一部分，可以獲得抗體分子的Fab’片段；每個(gè)抗體分子獲得兩個(gè)Fab’片段；(3)(Fab’)2，可以通過(guò)用胃蛋白酶處理完整的抗體、但隨后不還原所獲得的抗體的片段；F(ab’)2是兩個(gè)Fab'片段通過(guò)兩個(gè)二硫鍵保持在一起的二聚體；(4)Fv，定義為含有輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)、作為兩條鏈表達(dá)的基因工程片段；和(5)單鏈抗體(“SCA”)，定義為含有輕鏈可變區(qū)、重鏈可變區(qū)、通過(guò)合適的多肽接頭連接的作為基因融合單鏈分子的基因工程分子。
制備這些片段的方法是本領(lǐng)域已知的。(參見(jiàn)例如HarloW和Lane，Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,NewYork,1988，該文獻(xiàn)通過(guò)引用結(jié)合到本文中)。在本發(fā)明所用的術(shù)語(yǔ)“表位”是指抗體的互補(bǔ)位結(jié)合的抗原上的任何抗原決定簇。表位決定簇通常包含諸如氨基酸或糖側(cè)鏈的分子的化學(xué)活性表面聚集(grouping)，通常具有特定的三維結(jié)構(gòu)特征以及特定的電荷特征。
通過(guò)蛋白水解抗體，或通過(guò)在大腸桿菌中表達(dá)編碼該片段的DNA，可以制備本發(fā)明的抗體片段。可以用常規(guī)方法，通過(guò)胃蛋白酶或木瓜蛋白酶消化完整的抗體，獲得抗體片段。例如，可以通過(guò)用胃蛋白酶酶切抗體產(chǎn)生抗體片段，提供命名為F(ab’)2的5S片段?？梢杂脦€基還原劑進(jìn)一步切割該片段，和任選地用封閉基封閉由二硫鍵切割產(chǎn)生的巰基，產(chǎn)生3.5S Fab'單價(jià)片段。或者，采用胃蛋白酶酶切，直接產(chǎn)生兩個(gè)單價(jià)的Fab’片段和Fc片段。例如Goldenberg的美國(guó)專(zhuān)利第4,036,945號(hào)和第4,331,647號(hào)和其中的參考文獻(xiàn)描述了這些方法。這些專(zhuān)利通過(guò)引用結(jié)合到本文中。也參見(jiàn)Nisonhoff等，Arch.Biochem.Biophys.89:230,1960；Porter,Biochem.J.73:119,1959；Edelman等，Methods in Enzymology，第1卷，第422頁(yè)，Academic Press，1967；和Coligan等，2.8.1-2.8.10部分和2.10.1-2.10.4部分，見(jiàn)上文。
也可以使用其它切割抗體的方法，諸如分離重鏈以形成單價(jià)輕鏈-重鏈片段，進(jìn)一步切割片段，或其它酶技術(shù)、化學(xué)技術(shù)或基因技術(shù)，只要所述片段結(jié)合于所述完整抗體識(shí)別的抗原。
例如，F(xiàn)v片段包含結(jié)合的VH和VL鏈。這種結(jié)合可以是非共價(jià)的，如描述于Inbar等，Proc.Nat’lAcad.Sci.USA 69:2659,1972。或者，可以通過(guò)分子間二硫鍵連接所述可變鏈，或用例如戊二醛的化學(xué)試劑交聯(lián)所述可變鏈。參見(jiàn)例如Sandhu，見(jiàn)上文。Fv片段最好包含用肽接頭連接的VH和VL鏈。通過(guò)構(gòu)建包含編碼通過(guò)寡核苷酸連接的VH和VL結(jié)構(gòu)域的DNA序列的結(jié)構(gòu)基因，制備這些單鏈的抗原結(jié)合蛋白(sFv)。將所述結(jié)構(gòu)基因插入表達(dá)載體中，隨后將該表達(dá)載體引入諸如大腸桿菌的宿主細(xì)胞中。這些重組的宿主細(xì)胞合成具有橋接所述兩個(gè)V結(jié)構(gòu)域的接頭肽的多肽單鏈。例如WhitloW等，Methods:a Companionto Methods in Enzymologv，第2卷，第97頁(yè)，1991；Bird等，Science242:423-426,1988；Ladner等，美國(guó)專(zhuān)利第4,946,778號(hào)；Pack等，Bio/Technology 11:1271-77,1993；和Sandhu，見(jiàn)上文，它們描述了生產(chǎn)sFv的方法。
另一種形式的抗體片段是編碼單一互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)的肽。通過(guò)構(gòu)建編碼目的抗體的CDR的基因，可以獲得CDR肽(“最小識(shí)別單位”)。例如通過(guò)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，從抗體生產(chǎn)細(xì)胞的RNA合成可變區(qū)，制備這種基因。參見(jiàn)例如Larrick等，Methods:a Companion toMethods inEnzymology，第2卷，第106頁(yè)，1991。
用完整的多肽或含目的小肽的片段作為免疫抗原，可以制備結(jié)合于本發(fā)明CDR1多肽的抗體。在一個(gè)說(shuō)明性實(shí)例中，實(shí)施例14(6)中描述的肽DTVSKTVSFKPTDC用于抗體生產(chǎn)。用來(lái)免疫動(dòng)物的多肽或肽可以衍生自翻譯的cDNA或化學(xué)合成，需要時(shí)可以將其綴合于載體蛋白。這類(lèi)常用的化學(xué)偶聯(lián)至所述肽的載體包括匙孔血藍(lán)蛋白(KLH)、甲狀腺球蛋白、牛血清白蛋白(BSA)和破傷風(fēng)類(lèi)毒素。然后用偶聯(lián)的肽免疫動(dòng)物(例如小鼠、大鼠或兔子)。
如果需要，可以例如將抗體所針對(duì)的多肽或肽結(jié)合于基質(zhì)，通過(guò)將多克隆抗體或單克隆抗體結(jié)合于所述基質(zhì)并從中洗脫，可以進(jìn)一步純化多克隆抗體或單克隆抗體。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道免疫學(xué)領(lǐng)域中用于純化和/或濃縮多克隆抗體以及單克隆抗體的常用的各種技術(shù)(參見(jiàn)例如Coligan等，Current Protocols in Immunology，第9單元，WileyInterscience,1991；其通過(guò)引用結(jié)合到本文中)。
也有可能使用抗獨(dú)特型技術(shù)來(lái)生產(chǎn)模擬表位的單克隆抗體。例如，針對(duì)第一單克隆抗體制備的抗獨(dú)特型單克隆抗體將在超變區(qū)中具有一個(gè)結(jié)合結(jié)構(gòu)域，所述結(jié)合結(jié)構(gòu)域是所述第一單克隆抗體結(jié)合的表位的“映象”。遺傳修飾的植物和制備方法在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于產(chǎn)生與未遺傳修飾的植物(例如野生型植物)相比鑒定為抗病性提高的遺傳修飾的植物的方法。術(shù)語(yǔ)抗病性或病原體抗性是指當(dāng)暴露于感染時(shí)相對(duì)于非轉(zhuǎn)基因植物能夠保持所需表型的能力。通過(guò)將本發(fā)明植物的物理特性與已經(jīng)暴露于或尚未暴露于感染的非轉(zhuǎn)基因植物的物理特性相比較，可以確定抗性水平。觀察的典型的物理特性包括能夠經(jīng)受病原體攻擊的植物群體增加、延遲侵蝕斑產(chǎn)生、侵蝕斑大小減小等。術(shù)語(yǔ)“病害”是指病原體攻擊引起的已知引起植物感染癥狀的任何因子，包括但不限于細(xì)菌、線(xiàn)蟲(chóng)、病毒、支原體和真菌。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，病原體為細(xì)菌病原體，包括但不限于假單胞菌屬。典型的生物包括丁香假單胞菌番茄致病變種(Pst)和丁香假單胞菌斑生致病變種(Psm)。術(shù)語(yǔ)“對(duì)病原體的提高的抗性”或“提高的抗病性”是指本發(fā)明轉(zhuǎn)基因植株具有的、高于限定的參考水平(諸如相同物種的非轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)出的抗性水平)的對(duì)植物病原體的抗性水平。因此，相對(duì)于先前存在的相同物種的植株，測(cè)定提高的抗性。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗性大大增加，高于限定的參考水平，抗性的增加大于或等于20％，優(yōu)選大于或等于50％，更優(yōu)選大于或等于75％，最優(yōu)選增加95％或95％以上。短語(yǔ)“相同物種的非轉(zhuǎn)基因植株”是指不含有任何異源轉(zhuǎn)基因或不含有任何含衍生自CDR1的序列的轉(zhuǎn)基因的相同物種的植株。本文所用的術(shù)語(yǔ)“異源核酸序列”是指對(duì)于受體植物宿主為外來(lái)的核酸，或所述宿主自身的核酸，只要所述自身核酸由其原始形式進(jìn)行明顯的修飾。用本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的方法，可以測(cè)定病原體抗性水平。這些方法包括美國(guó)專(zhuān)利第5,530,187中描述的細(xì)菌抗性測(cè)定和真菌感染測(cè)定，該文獻(xiàn)通過(guò)引用結(jié)合到本文中。
本發(fā)明的方法包括以下步驟將至少一種編碼CDR1的核酸序列引入植物細(xì)胞中，以獲得轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞，其中所述核酸序列與啟動(dòng)子有效連接；在允許表達(dá)CDR1多核苷酸產(chǎn)生CDR1多肽的條件下，從轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞產(chǎn)生植株；并且此后選擇表現(xiàn)出病原體抗性提高的植株。該植物或者可以是重要的，或者可以是雙子葉植物。單子葉植物的實(shí)例包括但不限于石刁柏、飼料用玉蜀黍和甜玉米、大麥、小麥、稻(例如Japonica或Indica)、高粱、洋蔥、珍珠粟、黑麥和燕麥。雙子葉植物的實(shí)例包括但不限于番茄、煙草、棉花、rapist、蠶豆、大豆、馬鈴薯、葡萄、草莓、胡椒、萵苣、豆類(lèi)作物、苜蓿、三葉草、甘藍(lán)類(lèi)蔬菜或甘藍(lán)(Brassica oleracea)(例如卷心菜、嫩莖花椰菜、花椰菜、抱子甘藍(lán))、蘿卜、胡蘿卜、甜菜、茄子、菠菜、黃瓜、南瓜、甜瓜、網(wǎng)紋甜瓜、向日葵和各種觀賞植物。木本物種包括楊屬、松屬、紅杉、柏樹(shù)、橡樹(shù)等。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“遺傳修飾”是指將一種或多種異源核酸序列引入一種或多種植物細(xì)胞中，提供有性能力的有活力的植株。本文所用的術(shù)語(yǔ)“遺傳修飾的”是指已經(jīng)通過(guò)上述方法產(chǎn)生的植物。本發(fā)明的遺傳修飾植物能夠自花傳粉或用相同物種的其它植株異花傳粉，以使在生殖系中攜帶的外源基因可以插入或者育種到農(nóng)業(yè)上有用的植物變種中。本文所用的術(shù)語(yǔ)“植物細(xì)胞”是指原生質(zhì)體、產(chǎn)生配子的細(xì)胞和再生為完整植株的細(xì)胞。因此，包括多個(gè)能夠再生為完整植株的細(xì)胞的種子包括在“植物細(xì)胞”的定義內(nèi)。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“植物”是指或者完整植株、植物部分、植物細(xì)胞或一組植物細(xì)胞，例如植物組織。小植株也包括在“植物”的含義中。本發(fā)明包括的植物是適合于轉(zhuǎn)化技術(shù)的任何植物，包括被子植物、裸子植物、單子葉植物和雙子葉植物。
上面已經(jīng)描述了術(shù)語(yǔ)“異源核酸序列”。任何目的核酸序列均可以與本發(fā)明一起使用。例如，該術(shù)語(yǔ)包括起源于宿主物種的核酸，其中這種序列有效連接至不同于天然或野生型啟動(dòng)子的啟動(dòng)子。在廣義的本發(fā)明方法中，至少一種編碼CDR1多肽的核酸序列與合適的啟動(dòng)子連接。最好可以將一個(gè)以上拷貝的CDR1多核苷酸引入植物中，以增強(qiáng)CDR1表達(dá)。例如，多個(gè)拷貝的該基因可能具有增加植物中CDR1多肽生產(chǎn)、提供更大抗病性的效應(yīng)。
通過(guò)將包括至少一種編碼CDR1的核酸序列的載體引入植物細(xì)胞中，產(chǎn)生本發(fā)明的遺傳修飾植物。為了一次有效地引入植物細(xì)胞中，所述CDR1核酸序列必須與在該植物細(xì)胞中有效的啟動(dòng)子有效連接，以引起CDR1轉(zhuǎn)錄。另外，也可以使用也在植物中識(shí)別的聚腺苷酸化序列或轉(zhuǎn)錄控制序列。最好是，如本文所述，帶有待插入核酸序列的載體也含有一種或多種標(biāo)記基因，以便可以從培養(yǎng)物中的非轉(zhuǎn)化細(xì)胞選擇轉(zhuǎn)化細(xì)胞。
本發(fā)明中的CDR1多肽的表達(dá)可以由許多啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)?？梢岳肅DR1的內(nèi)源或天然啟動(dòng)子來(lái)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)該基因，或可以利用作為外源調(diào)節(jié)序列的異源啟動(dòng)子。關(guān)于植物表達(dá)載體，合適的病毒啟動(dòng)子包括CaMV的35S RNA啟動(dòng)子和19S RNA啟動(dòng)子(Brisson等，Nature310:511,1984；Odell等，Nature 313:810,1985)；玄參花葉病毒(FMV)的全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄物啟動(dòng)子(GoWda等，J.Cell Biochem.13D:301,1989)和TMV的外殼蛋白啟動(dòng)子(Takamatsu等，EMBO J.6:307,1987)?；蛘?，可以使用諸如以下的植物啟動(dòng)子核酮糖雙磷酸羧化酶小亞基(ssRUBISCO)的光誘導(dǎo)型啟動(dòng)子(Coruzzi等，EMBO J.3:1671,1984；Broglie等，Sicence 224:838,1984)；甘露氨酸合酶啟動(dòng)子(Velten等，EMBO J.3:2723,1984)、胭脂氨酸合酶啟動(dòng)子(NOS)和章魚(yú)氨酸合酶啟動(dòng)子(OCS)(在根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)的腫瘤誘導(dǎo)質(zhì)粒上攜帶)或熱激啟動(dòng)子例如大豆hsp17.5-E或hsp17.3-B(Gurley等，Mol.Cell.Biol.6:559,1986；Severin等，Plant Mol.Biol.,15:827,1990)。
可用于本發(fā)明的啟動(dòng)子包括天然的組成型啟動(dòng)子和誘導(dǎo)型啟動(dòng)子以及工程啟動(dòng)子。CaMV啟動(dòng)子是組成型啟動(dòng)子的實(shí)例。為了最有效，誘導(dǎo)型啟動(dòng)子應(yīng)該1)在缺乏所述誘導(dǎo)物的情況下提供低表達(dá)；2)在存在所述誘導(dǎo)物的情況下提供高表達(dá)；3)使用不干擾該植物正常生理的誘導(dǎo)方案；和4)對(duì)其它基因的表達(dá)沒(méi)有影響?？捎糜谥参镏械恼T導(dǎo)型啟動(dòng)子的實(shí)例包括用化學(xué)方法誘導(dǎo)的啟動(dòng)子，諸如被銅離子激活的酵母金屬硫蛋白啟動(dòng)子(Mett等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90:4567,1993)；被取代的苯磺酰胺(例如除草劑安全劑)激活的In2-1和In2-2調(diào)節(jié)序列(Hershey等，Plant Mol.Biol.,17:679,1991)；和被糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的GRE調(diào)節(jié)序列(Schena等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.88:10421,1991)(參見(jiàn)實(shí)施例10)。其它組成型和誘導(dǎo)型啟動(dòng)子是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。
選擇的特定啟動(dòng)子應(yīng)該能夠引起有效表達(dá)，導(dǎo)致產(chǎn)生有效量的結(jié)構(gòu)基因產(chǎn)物，例如CDR1多肽，引起抗病性提高，最終導(dǎo)致植物產(chǎn)量提高。需要時(shí)，可以對(duì)用于本發(fā)明載體構(gòu)成物中的啟動(dòng)子進(jìn)行修飾，以影響其控制特性。
組織特異性啟動(dòng)子也可以用于本發(fā)明中。組織特異性啟動(dòng)子的一個(gè)實(shí)例是在莖分生組織(shoot meristems)中有活性的啟動(dòng)子(Atanassova等，Plant J.2:291,1992)。可用于轉(zhuǎn)基因植物中的其它組織特異性啟動(dòng)子例如cdc2a啟動(dòng)子和cyc07啟動(dòng)子是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。(參見(jiàn)例如Ito等，Plant Mol.Biol.,24:863,1994；Martinez等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:7360,1992；Medford等，Plant Cell 3:359,1991；Terada等，Plant Journal,3:241,1993；Wissenbach等，Plant Journal 4:411,1993)。有已知將表達(dá)限于特定植物部分或限制對(duì)特定刺激物應(yīng)答而表達(dá)的啟動(dòng)子(例如patatin啟動(dòng)子或ADP葡糖焦磷酸化酶的大亞基或小亞基的啟動(dòng)子)。這些限制表達(dá)的啟動(dòng)子例如將表達(dá)導(dǎo)向根的啟動(dòng)子，可以與CDR1有效連接，以指導(dǎo)主要在塊莖中表達(dá)。本領(lǐng)域技術(shù)人員將知道許多可用于本發(fā)明中的這類(lèi)植物部分特異性啟動(dòng)子。
需要時(shí)，可以對(duì)用于本發(fā)明核酸構(gòu)成物中的啟動(dòng)子進(jìn)行修飾，以影響其控制特性。例如，可以將CaMV 35S啟動(dòng)子連接至在無(wú)光情況下阻抑ssRUBISCO表達(dá)的ssRUBISCO基因部分，以產(chǎn)生在葉中有活性而在根中無(wú)活性的啟動(dòng)子。所產(chǎn)生的嵌合啟動(dòng)子可以如本文所述使用。為該描述起見(jiàn)，短語(yǔ)“CaMV 35S”啟動(dòng)子因此包括CaMV 35S啟動(dòng)子的變異，例如通過(guò)與操縱基因區(qū)連接、隨機(jī)誘變或控制的誘變等而衍生的啟動(dòng)子。此外，可以改變所述啟動(dòng)子，以含有多個(gè)“增強(qiáng)子序列”以有助于提高基因表達(dá)。
或者，可以選擇所用的啟動(dòng)子，以賦予對(duì)諸如真菌感染的病害應(yīng)答而特異性表達(dá)CDR1。真菌病原體對(duì)植物的感染激活了防御相關(guān)的或致病機(jī)理相關(guān)的(PR)基因，所述基因編碼(1)參與苯基丙酸類(lèi)似物(phenylpropanoid)代謝的酶，諸如苯丙氨酸氨解酶、查耳酮合酶、4-香豆酸coA連接酶和香豆酸4-羥化酶，(2)修飾植物細(xì)胞壁的蛋白質(zhì)，諸如富含羥脯氨酸的糖蛋白、富含甘氨酸的蛋白和過(guò)氧化物酶，(3)降解真菌細(xì)胞壁的酶，諸如殼多糖酶和葡聚糖酶，(4)奇異果甜蛋白樣蛋白，或(5)尚不知功能的蛋白。已經(jīng)從許多植物物種中分離出并鑒定了防御相關(guān)基因或PR基因。可以使用這些基因的啟動(dòng)子，以在轉(zhuǎn)基因植物受病原體攻擊，特別是真菌病原體(諸如Pi)攻擊時(shí)，在這類(lèi)植物中獲得CDR1的表達(dá)。選擇的具體啟動(dòng)子應(yīng)該能夠引起CDR1充分表達(dá)，導(dǎo)致產(chǎn)生有效量的多肽。
可以任選地將選擇標(biāo)記與待插入的核酸序列連接。術(shù)語(yǔ)“標(biāo)記”如以上定義。最好是，所述標(biāo)記基因?yàn)榭股乜剐曰?，由此可以用合適的抗生素從未轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞中選擇轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞。以上描述了合適的選擇標(biāo)記的實(shí)例。所述標(biāo)記基因最好是抗生素抗性基因，由此可以從未轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中選擇轉(zhuǎn)化細(xì)胞。用于植物中的合適的選擇標(biāo)記包括腺苷脫氨酶、二氫葉酸還原酶、潮霉素-B-磷酸轉(zhuǎn)移酶、胸苷激酶、黃嘌呤-鳥(niǎo)嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶和氨基-糖苷3’-O-磷酸轉(zhuǎn)移酶Ⅱ(卡那霉素、新霉素和G418抗性)。其它合適的標(biāo)記是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。
用于本發(fā)明中以轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的載體包括與啟動(dòng)子有效連接的、編碼CDR1多肽的核酸序列。為了實(shí)施按照本發(fā)明的轉(zhuǎn)化方法，首先必須構(gòu)建一種合適的載體，然后將其適當(dāng)?shù)匾胨鲋参锛?xì)胞中。此中所用的載體的構(gòu)建細(xì)節(jié)是植物基因工程領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的。
可以用根癌農(nóng)桿菌的Ti質(zhì)粒、毛根誘導(dǎo)(Ri)質(zhì)粒和植物病毒載體，將用于本發(fā)明的CDR1核酸序列引入植物細(xì)胞中。(關(guān)于這類(lèi)技術(shù)的綜述，參見(jiàn)例如Weissbach和Weissbach,Methodsfor Plant MolecularBiology,Ⅷ部分，第421-463頁(yè)，Academic Press,NY,1988；Grierson和Corey,Plant Molecular Biology，第2版，第7-9章，Blackie,London,1988；和Horsch等，Science,227:1229,1985；每個(gè)文獻(xiàn)均通過(guò)引用結(jié)合到本文中)。除了衍生自農(nóng)桿菌的Ti質(zhì)?；蛎T導(dǎo)(Ri)質(zhì)粒的植物轉(zhuǎn)化載體之外，還可以利用可選擇的轉(zhuǎn)化方法，包括應(yīng)用脂質(zhì)體、電穿孔、提高游離核酸攝入的化學(xué)試劑、采用病毒或花粉的轉(zhuǎn)化和應(yīng)用生物彈道(biolistic)轉(zhuǎn)化。
本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠選擇用于引入相對(duì)完整狀態(tài)的所述CDR1多核苷酸序列的合適載體。因此，產(chǎn)生攜帶所引入核酸序列的植物的任何載體應(yīng)該是足夠的?？梢灶A(yù)期甚至應(yīng)用裸露的核酸，也可提供本發(fā)明的特性，盡管其效力低。選擇的轉(zhuǎn)化方法通常指導(dǎo)載體的選擇或是否使用載體。
按照本發(fā)明的植物轉(zhuǎn)化可以基本上用植物分子生物學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的各種方法中的任一種進(jìn)行。(參見(jiàn)例如Methods ofEnzvmology，第153卷，Wu和Grossman編輯，Academic Press,1987，通過(guò)引用結(jié)合到本文中)。本文所用的術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)化”是指通過(guò)引入CDR1核酸序列引起的宿主植物表型的改變。
例如，可以如上簡(jiǎn)述，利用含Ti質(zhì)粒的根癌農(nóng)桿菌，將CDR1核酸序列引入植物細(xì)胞中。在使用根癌農(nóng)桿菌培養(yǎng)物作為轉(zhuǎn)化載體時(shí)，最好使用農(nóng)桿菌的非致癌性菌株作為載體，以使轉(zhuǎn)化組織可能進(jìn)行正常的非致癌性分化。也優(yōu)選所述農(nóng)桿菌帶有雙元Ti質(zhì)粒系統(tǒng)。這種雙元系統(tǒng)包含1)第一Ti質(zhì)粒，具有將轉(zhuǎn)移核酸(T-DNA)引入植物所必需的侵入性區(qū)，和2)嵌合質(zhì)粒。后者含有鄰接待轉(zhuǎn)移核酸的野生型Ti質(zhì)粒T-DNA區(qū)的至少一個(gè)邊界區(qū)。已經(jīng)表明雙元Ti質(zhì)粒系統(tǒng)有效轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞(De Framond,Biotechnology 1:262,1983；Hoekema等，Nature 303:179,1983)。優(yōu)選這種雙元系統(tǒng)，因?yàn)樗恍枰系睫r(nóng)桿菌的Ti質(zhì)粒中，老方法需要整合。
在按照本發(fā)明的轉(zhuǎn)化中涉及應(yīng)用農(nóng)桿菌的方法包括但不限于1)將農(nóng)桿菌與培養(yǎng)的分離的原生質(zhì)體共培養(yǎng)；2)用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞或組織；或3)用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化種子、頂端或分生組織。
另外，可以如Bechtold等所述(C.R.Acad.Sci.Paris 316:1194,1993)和本文實(shí)施例中所例舉的，用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化植物完成基因轉(zhuǎn)移。這種方法基于農(nóng)桿菌細(xì)胞懸浮液的真空浸潤(rùn)或浸漬。
將CDR1多核苷酸引入植物細(xì)胞的優(yōu)選方法是用轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌感染這種植物細(xì)胞、外植體、分生組織或種子，如上所述或如實(shí)施例中所述。在本領(lǐng)域已知的合適條件下，讓轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞生長(zhǎng)形成苗、根，并進(jìn)一步發(fā)育為植株。
或者，可以用機(jī)械或化學(xué)方法將CDR1多核苷酸引入植物細(xì)胞中。例如，可以用微量移液管(micropipette)，通過(guò)微注射將所述核酸機(jī)械轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞中?；蛘?，可以采用聚乙二醇，聚乙二醇與被細(xì)胞吸收的遺傳物質(zhì)形成沉淀復(fù)合物，將所述核酸轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞中。
可以通過(guò)電穿孔將CDR1多核苷酸引入植物細(xì)胞中(Fromm等，Proc.Nalt.Acad.Sci.U.S.A.82:5824,1985，其通過(guò)引用結(jié)合到本文中)。在該技術(shù)中，在含有相關(guān)核酸序列的載體或核酸存在下，將植物原生質(zhì)體電穿孔。高場(chǎng)強(qiáng)度的電脈沖可逆地透化膜，使得可以引入核酸。電穿孔的植物原生質(zhì)體再形成細(xì)胞壁、分裂并形成植物愈傷組織。如本文所述，用表型標(biāo)記完成對(duì)用轉(zhuǎn)化的基因轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞的選擇。
另一種將CDR1多核苷酸引入植物細(xì)胞的方法是用帶有待引入核酸的小粒子高速?zèng)_擊穿透，所述核酸或者包含在這種粒子基質(zhì)中，或者包含在其表面(Klein等，Nature 327:70,1987)。在Sanford等(Techniques 3:3-16,1991)和Klein等(Bio/Techniques 10:286,1992)中也描述了轟擊轉(zhuǎn)化法。盡管通常僅需要單一引入新核酸序列，但該方法尤其提供多次引入。
花椰菜花葉病毒(CaMV)也可以用作將核酸引入植物細(xì)胞的載體(美國(guó)專(zhuān)利第4,407,956)。CaMV病毒核酸基因組插入親代細(xì)菌質(zhì)粒中，產(chǎn)生可以在細(xì)菌中繁殖的重組核酸分子。克隆后，可以再次克隆所述重組質(zhì)粒，并通過(guò)引入所需核酸序列(例如CDR1序列)進(jìn)行進(jìn)一步修飾。然后從親代細(xì)菌質(zhì)粒上切下所述重組載體的修飾的病毒部分，用來(lái)接種植物細(xì)胞或植株。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“接觸”是指將CDR1引入植物細(xì)胞的任何方法，包括如上所述的化學(xué)方法和物理方法。接觸最好是指通過(guò)用如上所述的CDR1編碼核酸轉(zhuǎn)化的根癌農(nóng)桿菌，將所述核酸或載體引入植物細(xì)胞(包括外植體、分生組織或種子)中。
通常，將轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞再生，以獲得來(lái)自轉(zhuǎn)化方法的整個(gè)植株。轉(zhuǎn)化的直接產(chǎn)物稱(chēng)為“轉(zhuǎn)基因子”。本文所用的術(shù)語(yǔ)“生長(zhǎng)”或“再生”是指從植物細(xì)胞、一組植物細(xì)胞、植物部分(包括種子)或植物段(plant piece)(例如原生質(zhì)體、愈傷組織或組織部分)培育出整株植株。
從原生質(zhì)體再生在種間是不同的，但一般通過(guò)首先提供原生質(zhì)體懸浮液開(kāi)始該過(guò)程。在某些物種中，植株的形成可以從原生質(zhì)體懸浮液誘導(dǎo)，然后成熟并萌發(fā)為天然植株。所述培養(yǎng)基一般含有生長(zhǎng)和再生必需的各種氨基酸和激素。所用的激素的實(shí)例包括植物生長(zhǎng)素和細(xì)胞因子。有時(shí)最好于培養(yǎng)基中加入谷氨酸和脯氨酸，尤其是對(duì)于諸如玉米和苜蓿的植物種。有效的再生將取決于培養(yǎng)基、基因型和培養(yǎng)史。如果控制這些變量，則再生可重現(xiàn)。
也可以從植物愈傷組織、外植體、器官或部分發(fā)育再生?？梢栽谄鞴倩蛑参锊糠衷偕尘跋逻M(jìn)行轉(zhuǎn)化。(參見(jiàn)Methods in Enzymology，第118卷，1987，和Klee等，Annual Review of Plant Physiology,38:467，1987)。利用Horsch等，Science 227:1229,1985的葉圓盤(pán)-轉(zhuǎn)化-再生法，將圓盤(pán)在選擇培養(yǎng)基上培養(yǎng)，然后在約2-4周內(nèi)形成苗。從愈傷組織中切下發(fā)育的苗，并移植到合適的促進(jìn)生根選擇培養(yǎng)基中。在出現(xiàn)根后，將發(fā)根的小植株盡可能快地移植到土壤中。如果需要，可以將小植株再進(jìn)行盆栽直至達(dá)到成熟。
在無(wú)性繁殖的作物中，通過(guò)利用插條或組織培養(yǎng)技術(shù)，產(chǎn)生多個(gè)相同的植株，繁殖成熟的轉(zhuǎn)基因植物。選擇所需的轉(zhuǎn)基因子，獲得新變種，并無(wú)性繁殖用于商業(yè)應(yīng)用。
在種子繁殖的作物中，使成熟的轉(zhuǎn)基因植株自交產(chǎn)生純合近交植株。所得的近交植株產(chǎn)生含新引入的外源基因的種子。種植這些種子，產(chǎn)生將產(chǎn)生所選定表型(例如增產(chǎn))的植株。
從再生植株獲得的部分例如花、種子、葉片、枝條、根、果實(shí)等包括在本發(fā)明內(nèi)，前提是這些部分包含如上轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。所述再生植株的后代和變異體和突變體也包括在本發(fā)明范圍內(nèi)，前提是這些部分包含所引入的核酸序列。
在選擇轉(zhuǎn)化的細(xì)胞后，人們可以證明所需異源基因的表達(dá)。用本領(lǐng)域眾所周知的方法，諸如RNA印跡雜交，可以簡(jiǎn)單地檢測(cè)用所插入DNA編碼的mRNA。所插入的序列也可以通過(guò)DNA印跡雜交來(lái)鑒定。
可以通過(guò)目測(cè)，選擇與野生型植株相比表現(xiàn)出抗病性提高的植株。(也參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利第5,530,187號(hào)，其通過(guò)引用結(jié)合到本文中)。本發(fā)明包括用本發(fā)明方法產(chǎn)生的植物以及植物組織和種子。
在再一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種方法，用于遺傳修飾植物細(xì)胞，以使與野生型植株相比由所述細(xì)胞產(chǎn)生的植株被鑒定為抗病性提高。該方法包括將至少一種編碼CDR1多肽的核酸序列引入植物細(xì)胞中轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞；在允許CDR1多肽表達(dá)的條件下培養(yǎng)所述轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞，由此產(chǎn)生抗病性提高的植株。諸如環(huán)境條件和啟動(dòng)子誘導(dǎo)條件的條件根據(jù)物種的不同而變化，但在一個(gè)種內(nèi)應(yīng)該相同。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供產(chǎn)生被鑒定為抗病性提高的植物的方法，所述方法是將CDR1多核苷酸引入植物細(xì)胞中，以獲得轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，然后在允許表達(dá)CDR1多肽的條件下培養(yǎng)所述轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞，以產(chǎn)生抗病性提高的植株。術(shù)語(yǔ)“表達(dá)”是指增加CDR1 DNA的轉(zhuǎn)錄或CDR1 mRNA的翻譯或提高CDR1多肽的活性。
在再一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供產(chǎn)生與野生型植物相比抗病性提高的植物的方法，即通過(guò)使敏感植物與CDR1啟動(dòng)子誘導(dǎo)量的誘導(dǎo)CDR1基因表達(dá)的因子接觸，其中CDR1基因表達(dá)的誘導(dǎo)導(dǎo)致產(chǎn)生與未接觸所述因子的植株相比抗病性提高的植株。所述因子可以誘導(dǎo)例如內(nèi)源CDR1基因表達(dá)。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述植株是一種轉(zhuǎn)基因植株，它含有有效連接至編碼CDR1的核酸的編碼誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的核酸?？捎糜谥参镏械恼T導(dǎo)型啟動(dòng)子的實(shí)例包括用化學(xué)方法誘導(dǎo)的那些誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，諸如被銅離子激活的酵母金屬硫蛋白啟動(dòng)子(Mett等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90:4567,1993)；被取代的苯磺酰胺(例如除草劑安全劑)激活的In2-1和In2-2調(diào)節(jié)序列(Hershey等，Plant Mol.Biol.,17:679,1991)；和被糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的GRE調(diào)節(jié)序列(Schena等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.88:10421,1991)。術(shù)語(yǔ)啟動(dòng)子誘導(dǎo)量是指將CDR1基因表達(dá)提高至高于未接觸所述因子的植物細(xì)胞中CDR1表達(dá)所必需的因子的量。例如，可以用轉(zhuǎn)錄因子或化學(xué)試劑提高來(lái)自CDR1天然啟動(dòng)子的基因表達(dá)。本發(fā)明的方法設(shè)想了接觸含內(nèi)源CDR1啟動(dòng)子或重組產(chǎn)生的CDR1啟動(dòng)子的細(xì)胞。篩選鑒定新的抗病性基因本發(fā)明提供一種方法，通過(guò)用至少一種編碼CDR1的分離的多核苷酸片段探測(cè)核酸文庫(kù)，并選擇與該片段雜交的那些克隆，鑒定與CDR1相關(guān)的新的抗病性基因。用多種方法中的任一種，鑒定新的抗病性基因諸如CDR1的同系物?？梢园凑毡绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知的多種方法中的任一種，分離出編碼新抗病性基因的核苷酸序列。例如，可以或者從cDNA文庫(kù)，或者從基因組DNA文庫(kù)中分離編碼CDR1同系物的DNA(參見(jiàn)例如Sambrook等，1989,Molecular Cloning:aLaboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press,ColdSpring Harbor,NY)。在一個(gè)實(shí)施方案中，編碼CDR1的多核苷酸片段可以用作雜交探針，來(lái)探測(cè)得自目的靶生物的cDNA文庫(kù)，其中使用低嚴(yán)格條件。所述探針可以是大片段，或是一種或多種短的簡(jiǎn)并引物。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述探針至少長(zhǎng)8個(gè)核苷酸。
通過(guò)在低嚴(yán)格條件下例如50℃和10×SSC(0.9M鹽水/0.09M檸檬酸鈉)雜交，探測(cè)具有序列相似性的核酸，所述核酸當(dāng)于55℃在1×SSC中洗滌時(shí)仍結(jié)合?？梢栽诟鼑?yán)格的條件下，例如于50℃或更高溫度和0.1×SSC(9mM鹽水/0.9mM檸檬酸鈉)下雜交，可以測(cè)定序列同一性。通過(guò)采用探針，特別是標(biāo)記的DNA序列探針，人們可以分離出同源或相關(guān)的基因。同源基因的來(lái)源可以是任何物種，例如植物種、靈長(zhǎng)類(lèi)物種，特別是人；嚙齒動(dòng)物，諸如大鼠和小鼠；犬科動(dòng)物、貓科動(dòng)物、牛、綿羊、馬、酵母和線(xiàn)蟲(chóng)。
另一種方法是，可以例如如Mullis等的美國(guó)專(zhuān)利第4,800,159號(hào)所述方法，或采用本領(lǐng)域眾所周知的表達(dá)克隆法(參見(jiàn)例如Sambrook等，1989,Molecular Cloning:a Laboratory Manual，第2版，Cold SpringHarbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY)，用標(biāo)準(zhǔn)的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增合成的寡核苷酸引物，分離出編碼新抗病性基因的DNA。根據(jù)編碼CDR1多肽的多核苷酸序列，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增的引物。
在植物物種例如單子葉植物、雙子葉植物和木本植物物種之間，同系物通常具有顯著的序列相似性，例如在核苷酸序列之間至少75％序列同一性。根據(jù)參比序列計(jì)算出序列相似性，所述參比序列可以是一組較大的序列，例如保守的基元、編碼區(qū)或側(cè)翼區(qū)。參比序列通常至少長(zhǎng)約18個(gè)核苷酸(nt)，更常見(jiàn)至少長(zhǎng)約30nt，并可以延長(zhǎng)至要比較的全序列。序列分析的算法是本領(lǐng)域已知的，例如BLAST，描述于Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215:403-10。本文提供的序列是在數(shù)據(jù)庫(kù)檢索中識(shí)別CDR1相關(guān)和同源蛋白所必需的。
用抗體、反義或核酶抑制CDR1以提高病害易感性在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供通過(guò)抑制CDR1表達(dá)提高植物對(duì)病害易感性的方法。例如，可能最好如上所述提供CDR1特異性抗體，或在植物中提供反義寡核苷酸，以提供殺傷或減少植物生長(zhǎng)的方法，例如除草。實(shí)施例表明，CDR1是一種胞外蛋白，因此容易被CDR1抗體抑制。反義技術(shù)提供非常特異性且有效的方法，例如通過(guò)降低細(xì)胞中CDR1的表達(dá)量來(lái)抑制CDR1表達(dá)。本發(fā)明內(nèi)容中的反義多核苷酸既包括通常長(zhǎng)10-50個(gè)堿基的稱(chēng)為寡核苷酸的短DNA序列，又包括本身可以超過(guò)所述CDR1基因序列長(zhǎng)度的較長(zhǎng)的DNA序列?？捎糜诒景l(fā)明的反義多核苷酸與相應(yīng)的靶mRNA的特定區(qū)互補(bǔ)。反義多核苷酸與其靶轉(zhuǎn)錄物的雜交因互補(bǔ)堿基配對(duì)，可以為高度特異性的。反義寡核苷酸雜交的能力受諸如轉(zhuǎn)錄物的長(zhǎng)度、化學(xué)修飾和二級(jí)結(jié)構(gòu)的參數(shù)的影響，這些參數(shù)可以影響多核苷酸進(jìn)入靶位點(diǎn)。參見(jiàn)Stein等，Cancer Research 48:2659(1988)。通過(guò)將編碼反義多核苷酸的DNA區(qū)段引入細(xì)胞中，以使所述多核苷酸在所述細(xì)胞中制備，可以將所述多核苷酸引入所述細(xì)胞。通過(guò)將反義多核苷酸加入所述細(xì)胞的環(huán)境中，以使細(xì)胞可以直接吸收所述多核苷酸，也可以將反義多核苷酸引入細(xì)胞。對(duì)于最多長(zhǎng)約20個(gè)堿基的較短的多核苷酸，優(yōu)選后一途徑。
在選擇用于給定多核苷酸的優(yōu)選長(zhǎng)度時(shí)，必須權(quán)衡利弊，以獲得最適特征。例如10-mer至15-mer的較短的多核苷酸雖然提供較高的細(xì)胞滲透，但其基因特異性較低。相反，雖然20-30個(gè)堿基的較長(zhǎng)多核苷酸提供更好的特異性，但它們表現(xiàn)出吸收到細(xì)胞中的動(dòng)力學(xué)降低。參見(jiàn)Stein等，硫代磷酸寡脫氧核苷酸類(lèi)似物，載于“Oligodeoxynucleotides-Antisense Inhibitors of Gene Expression”Cohen編輯，McMillan Press,Lodon(1988)。mRNA靶序列的可及性也很重要，因此，靶mRNA中的回折形成區(qū)提供有前景的靶。
在本說(shuō)明書(shū)中，術(shù)語(yǔ)“多核苷酸”既包括在大自然中發(fā)現(xiàn)的類(lèi)型的寡聚核酸部分，諸如DNA和RNA的脫氧核糖核苷酸和核糖核苷酸結(jié)構(gòu)，也包括能夠結(jié)合于大自然中發(fā)現(xiàn)的核酸的人造類(lèi)似物。本發(fā)明的多核苷酸可以基于通過(guò)磷酸二酯鍵連接的核糖核苷酸或脫氧核糖核苷酸單體，可以基于或通過(guò)甲基磷酸酯、硫代磷酸酯或其它鍵連接的類(lèi)似物。它們也可以包括具有堿基結(jié)構(gòu)改變或其它修飾、但仍保留結(jié)合于天然存在的DNA或RNA結(jié)構(gòu)的能力的單體部分。這類(lèi)多核苷酸可以用本領(lǐng)域熟知的方法制備，所述方法例如采用市售儀器和可得自Perkin-Elmer/Applied Biosystems(Foser City,CA)的試劑。
磷酸二酯連接的多核苷酸對(duì)血清或細(xì)胞內(nèi)的核酸酶作用特別敏感，因此在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的多核苷酸為硫代磷酸酯或甲基磷酸酯連接的類(lèi)似物，已經(jīng)表明它們抗核酸酶。本領(lǐng)域的一般技術(shù)人員將能夠選擇用于本發(fā)明的其它鍵合。這些修飾還可以用來(lái)提高細(xì)胞吸收和所述多核苷酸的穩(wěn)定性。
在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，所述反義多核苷酸是通過(guò)將表達(dá)構(gòu)成物引入靶細(xì)胞中產(chǎn)生的RNA分子。選擇如此產(chǎn)生的RNA分子，以具有雜交至cDR1 mRNA的能力。具有這種能力的這類(lèi)分子可以抑制CDR1 mRNA的翻譯，并因此在含有所述RNA分子的植物細(xì)胞中增強(qiáng)對(duì)病害的易感性。
具有與mRNA靶雜交的能力的多核苷酸可以通過(guò)多種機(jī)制抑制相應(yīng)的基因產(chǎn)物的表達(dá)。在“翻譯停滯”方面，多核苷酸與靶mRNA的相互作用阻斷了核糖體復(fù)合物的作用，因此阻止信使RNA翻譯為蛋白質(zhì)。Haeuptle等，Nucl.Acids.Res.14:1427(1986)。關(guān)于磷酸二酯或硫代磷酸酯DNA多核苷酸，當(dāng)靶RNA序列雜交至所述DNA寡聚物后，可以用胞外RNA酶H消化靶RNA序列。Walder和Walder,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5011(1988)。關(guān)于另外的作用機(jī)制，在“轉(zhuǎn)錄停滯”方面，看來(lái)某些多核苷酸可能形成“三鏈體(triplex)”或三股螺旋結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)具有含目的基因的雙鏈基因組DNA，因此干擾RNA聚合酶的轉(zhuǎn)錄。Giovannangeli等，Proc.Natl.Acad.Sci.90:10013(1993)；Ebbinghaus等，J.Clin.Invest.92:2433(1993)。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，按照標(biāo)準(zhǔn)方法合成CDR1多核苷酸。通常在可得自多個(gè)生產(chǎn)商的自動(dòng)DNA合成儀上，合成硫代磷酸酯修飾的DNA多核苷酸。這些儀器能夠合成納摩爾量的長(zhǎng)至100個(gè)核苷酸的多核苷酸。用現(xiàn)代儀器合成的較短的多核苷酸通常適合不用進(jìn)一步純化而使用。如有必要，可以通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳或反向?qū)游黾兓嗪塑账?。參?jiàn)Sambrook等，MOLECULAR CLONING:A LaboratoryManunal，第2卷，第11章，Cold Spring Harbor Laboratory Press,ColdSpring Harbor(1989)。
或者，根據(jù)反義RNA形式的CDR1多核苷酸在細(xì)胞中表達(dá)，可將其從標(biāo)準(zhǔn)DNA表達(dá)載體引入所述細(xì)胞?？梢詫DR1 DNA反義序列從標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)?？寺〉奖磉_(dá)載體中，該表達(dá)載體具有允許高水平或更有效表達(dá)所述停留(resident)多核苷酸的特征。這些構(gòu)成物至少需要啟動(dòng)所插入DNA序列轉(zhuǎn)錄的原核啟動(dòng)子序列、植物特異性啟動(dòng)子序列或真核啟動(dòng)子序列。一種優(yōu)選的表達(dá)載體是其中可將表達(dá)誘導(dǎo)至高水平的載體。這可以通過(guò)加入在合適的宿主細(xì)胞中提供增加下游序列轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)區(qū)來(lái)完成。參見(jiàn)Sambrook等，第3卷，第16章(1989)。
例如，可以用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)由已經(jīng)摻入CDR1 cDNA的質(zhì)粒的單鏈cDNA擴(kuò)增合適的片段，構(gòu)建CDR1反義表達(dá)載體。Fang等，J.Biol.Chem.267 25889-25897(1992)。多核苷酸合成和純化技術(shù)分別描述于Sambrook等和Ausubel等(編輯)，CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY(Wiley Insterscience 1987)(本文稱(chēng)為“Ausubel”)。通過(guò)眾所周知的方法進(jìn)行PCR程序。參見(jiàn)例如Ausubel和Bangham，“聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)占盡優(yōu)勢(shì)”，載于PROTOCOLS INHUMAN MOLECULAR GENETICS(Humana Press 1991)。此外，PCR試劑盒可以購(gòu)自例如Stratagene Cloning Systems(La Jolla,CA)和Invitrogen(San Diego,CA)公司。
按照本發(fā)明的反義多核苷酸衍生自所述CDR1 cDNA可讀框的任何部分。最好靶向(ⅰ)翻譯起始位點(diǎn)周?chē)膍RNA序列和(ⅱ)形成回折結(jié)構(gòu)的mRNA序列。根據(jù)人基因組的大小，統(tǒng)計(jì)學(xué)研究表明，長(zhǎng)約14-15個(gè)堿基對(duì)的DNA區(qū)段在基因組中將具有一個(gè)特有的序列。因此，為了確保靶向CDR1 RNA的特異性，最好所述反義多核苷酸至少長(zhǎng)15個(gè)核苷酸。因此，本發(fā)明設(shè)想的最短的多核苷酸包括對(duì)應(yīng)于所述CDR1cDNA序列的位置1-14、1-15、1-16、1-17、1-18、1-19、2-16、3-17等的核苷酸。位置1是指所述CDR1編碼區(qū)的第一個(gè)核苷酸。在實(shí)施例9中，用衍生自完整CDR1基因的反義序列抑制CDR1的表達(dá)，由此提高轉(zhuǎn)基因植物對(duì)病害的易感性。
不是每種反義多核苷酸均提供對(duì)CDR1靶足夠的抑制程度或足夠的特異性水平。因此，必需篩選多核苷酸，以確定哪種多核苷酸具有合適的反義特征。一種優(yōu)選的有用反義多核苷酸的測(cè)定方法是如實(shí)施例9中所述用致病生物感染接受反義構(gòu)成物的植物，并測(cè)定所述植物對(duì)病害的易感性。
上述公開(kāi)內(nèi)容一般性地描述了本發(fā)明。通過(guò)參考以下具有實(shí)施例，可以獲得更全面的理解，本文提供所述實(shí)施例僅用于說(shuō)明，并非意在限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例1T-DNA活化標(biāo)記突變體的產(chǎn)生活化標(biāo)記雙元載體pSKI15示于圖1中。該載體衍生自pPCVICEn4HPT(Walden等，1994,Plant Molec.Bio.26:152，其通過(guò)引用結(jié)合到本文中)。該載體具有BAR基因作為植物選擇標(biāo)記，這使得可以在土壤中選擇轉(zhuǎn)化體。衍生自花椰菜花葉病毒35S RNA啟動(dòng)子的4個(gè)拷貝的轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子(4×35S增強(qiáng)子)緊接T-DNA右邊界序列定位，預(yù)期將其插入植物基因組中，引起相鄰植物基因的強(qiáng)異位表達(dá)或過(guò)量表達(dá)。所述T-DNA也含有pBluescript序列，允許通過(guò)質(zhì)粒拯救分離標(biāo)記的植物基因。用帶有pSKI15的農(nóng)桿菌菌株GV3101直接轉(zhuǎn)化擬南芥屬(Arabidopisis)植物(哥倫比亞生態(tài)型)?；旌蠌腡0植株收獲的種子并將其播種在土壤中。用除草劑Basta噴灑幼苗以選擇轉(zhuǎn)化體。轉(zhuǎn)化率平均達(dá)到約1％。將Basta抗性幼苗(T1植株)單個(gè)移植，并在突變體篩選之前培育4周。
實(shí)施例2CDR突變體的鑒定為了篩選表現(xiàn)出抗病性增強(qiáng)的顯性突變體，用3-4×108cfu/ml毒性丁香假單胞菌番茄致病變種(Pst)或丁香假單胞菌斑生致病變種(Psm)噴灑4周大的T1轉(zhuǎn)基因單株。感染后4-7天記錄表型。沒(méi)有表現(xiàn)出病癥或病癥嚴(yán)重程度較低的單株被鑒定為假定的突變體。當(dāng)在T1代進(jìn)行篩選時(shí)，這種鑒定的突變體推測(cè)是顯性的，最可能是由于35S增強(qiáng)子驅(qū)動(dòng)的相應(yīng)基因的激活引起的獲得功能的突變。這些突變體被命名為cdr(組成型抗病性)。
對(duì)約5000個(gè)活化標(biāo)記系篩選cdr突變體，鑒定出12個(gè)推定的cdr突變體。通過(guò)或者用Psm或者用Pst感染，再篩選這些推定的cdr突變體的自交后代(T2植株)。cdr1-D是一個(gè)經(jīng)證實(shí)的突變體，本文中進(jìn)一步描述。
cdr1-D最初因其抗Pst而被鑒定。在噴灑Pst后周?chē)闹仓旮腥緡?yán)重，而該cdr植株幾乎完全無(wú)癥狀。cdr1-D植株矮小，葉片略微卷縮且顏色更深。在苗和花的發(fā)育中沒(méi)有觀察到異常，cdr1-D植株表現(xiàn)出正常結(jié)籽。cdr1-D等位基因的基因分析在241株T2植株中，176株矮小并抗Basta,28株具野生型外觀并抗Basta,37株具野生型外觀且對(duì)Basta易感。沒(méi)有發(fā)現(xiàn)矮小的Basta易感性后代。在迄今測(cè)試的超過(guò)60株矮小的T2植株中，所有植株均表現(xiàn)出抗病性增強(qiáng)，在測(cè)試的20多株野生型外觀的植株中沒(méi)有表現(xiàn)出抗病性增強(qiáng)。因此，在記錄的超過(guò)80株T2后代中，沒(méi)有檢測(cè)到在cdr1-D突變植株矮小和Basta抗性之間的重組。該結(jié)果強(qiáng)有力地表明，cdr1-D突變是由T-DNA插入引起的，植株矮小可能是由cdr1-D突變介導(dǎo)的組成型抗病性表達(dá)機(jī)制的副作用。分離數(shù)據(jù)表明，cdr1-D突變相對(duì)于其野生型等位基因是顯性的。得自野生型哥倫比亞和cdr1-D T1植株回交的后代(雜合后代)，cdr1-D和野生型植株的分離比為1∶1，表明cdr1-D突變是顯性的。另外，F(xiàn)2分離數(shù)據(jù)也表明，cdr1-D T1植株含有兩個(gè)T-DNA插入片段，它們符合39cM的遺傳距離。僅一個(gè)插入片段與cdr1-D突變有關(guān)。DNA分析進(jìn)一步證明，cdr1-D T1植株含有兩個(gè)T-DNA插入片段(參見(jiàn)下文)。
實(shí)施例3cdr1-D同時(shí)抗Pst和Psm通過(guò)采用浸漬感染法(參見(jiàn)下文)測(cè)定細(xì)菌在植物中的生長(zhǎng)，進(jìn)一步監(jiān)測(cè)cdrl-D植株和野生型植株中對(duì)Pst的抗性。在野生型植株中，4天后病原體的生長(zhǎng)超過(guò)接種水平的10,000倍。然而，在cdr1-D突變體中，病原體的生長(zhǎng)增加200倍。也檢查了cdr1-D植株對(duì)Psm的抗性。在用Psm感染后，發(fā)現(xiàn)cdr1-D植株無(wú)癥狀。
實(shí)施例4防御相關(guān)基因在cdr1-D突變體中的激活對(duì)病原體侵襲應(yīng)答，植物在感染部位以及在遠(yuǎn)離感染部位的組織中激活了一組防御相關(guān)基因。這類(lèi)基因包括編碼病理相關(guān)蛋白的PR基因，諸如編碼苯丙氨酸氨解酶的PLA1和編碼谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶的GST。組成型表達(dá)抗病性的其它突變體累積了高水平的防御相關(guān)基因。為了研究所述防御相關(guān)基因是否在cdrl-D突變體中組成型表達(dá)，檢查了PR1、PR2、PAL1、GST1和rbohA轉(zhuǎn)錄物的穩(wěn)態(tài)水平。在cdr1-D突變體中PR1和PR2轉(zhuǎn)錄物的基礎(chǔ)水平相對(duì)于健康的野生型植株高約200倍。cdr1-D突變植株積累的rbohA轉(zhuǎn)錄物也比野生型植株多至少20倍。然而，在突變植株中GST1的轉(zhuǎn)錄物水平僅比野生型植株高2-3倍。另外，在cdr1-D突變植株中基因表達(dá)受到抑制。
在病原體侵襲或施用茉莉酮酸后也激活防衛(wèi)素基因。其激活顯然與水楊酸無(wú)關(guān)。在cdr5和cdr6突變體中，組成型地激活編碼防衛(wèi)素蛋白的擬南芥屬基因PFD1.2。然而，在cdr1-D植株中PFD1.2轉(zhuǎn)錄物水平?jīng)]有升高。
實(shí)施例5cdr1-D表現(xiàn)出水楊酸(SA)水平和水楊酸糖苷(SAG)水平的提高在對(duì)病原體感染的主要抗性應(yīng)答以及系統(tǒng)獲得性抗性誘導(dǎo)中，水楊酸(SA)起重要作用。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，SA和一種糖綴合形式的SA-SA-糖苷(SAG)與先前報(bào)道的某些組成型抗病性突變體有關(guān)。表2顯示了在cdr1-D突變體中SA和SAG的水平比野生型植株中發(fā)現(xiàn)的水平分別高約15倍和35倍。cdr1-D介導(dǎo)的抗病性需要水楊酸為了檢查cdr1-D突變體表型和水楊酸之間的關(guān)系，將cdr1-D植株雜交為表達(dá)細(xì)菌nahG基因的植株。nahG基因編碼水楊酸水解酶，該酶將水楊酸轉(zhuǎn)化為兒茶酚，由此防止水楊酸積累。將nahG植株用作母本，而cdr1-D植株用作父本。選擇Basta抗性F1植株。雖然cdr1-DnahG F1植株更堅(jiān)實(shí)，葉片略有波紋，但cdr1-D矮小株型在F1植株中受到抑制。
在cdr1-D nahG植株中檢查防御基因激活的抑制。與cdr1-D突變體相對(duì)比，cdr1-D nahG植株沒(méi)有表現(xiàn)出PR1和PR2轉(zhuǎn)錄物水平提高。此外，cdr1-D nahG植株不再表現(xiàn)出對(duì)毒性Pst的增強(qiáng)抗性。在人工浸潤(rùn)程序后在植物中的細(xì)菌生長(zhǎng)測(cè)定也證明cdr1-D介導(dǎo)的抗性在cdr1-D nahG F1植株中完全被抑制。
該資料表明，nahG抑制的cdr1-D介導(dǎo)的防御基因的激活，增強(qiáng)了抗病性以及矮小性狀，證明SA在cdr1-D介導(dǎo)的抗病性途徑中是一種必需組分。
實(shí)施例6在擬南芥Landsberg erecta(Ler)生態(tài)型中cdr1-D介導(dǎo)的信號(hào)途徑的顯性抑制cdr1-D產(chǎn)生自發(fā)的微氧化爆發(fā)和微侵蝕斑。高水平的rbohA表達(dá)提示該突變體可能產(chǎn)生高水平的活性氧物質(zhì)。為了檢查這一點(diǎn)，用DAB染色進(jìn)行體內(nèi)和原位檢測(cè)H2O2。當(dāng)DAB一與H2O2接觸后，DAB就立即局部聚合。DAB聚合物表現(xiàn)出紅褐色。有趣的是，在未感染的cdr1-D葉片中，某些細(xì)胞產(chǎn)生高水平的H2O2。
大多數(shù)組成型抗病性突變體產(chǎn)生可見(jiàn)的自發(fā)侵蝕斑。cdr1-D突變體沒(méi)有表現(xiàn)出明顯的侵蝕斑。然而，用錐蟲(chóng)藍(lán)染色技術(shù)，在突變體葉片中觀察到小的侵蝕斑。
實(shí)施例7CDR1基因的克隆和分析與表明T1 cdr1-D植株含有至少兩個(gè)T-DNA插入物的分離數(shù)據(jù)一致，在分離自cdr1-D T1植株的混合自交后代的、EcoRⅠ消化的基因組DNA中，DNA凝膠印跡分析檢測(cè)到兩個(gè)含有35S增強(qiáng)子序列的基因組片段。5kb EcoRⅠ片段存在于Basta抗性野生型后代和cdr1-D植株中，而10kb片段與cdr1-D等位基因共分離。分離出僅含10kb 35S增強(qiáng)子雜交片段的cdr1-D系。采用質(zhì)粒拯救(參見(jiàn)下文)分離出含10kb35S增強(qiáng)子的EcoRⅠ片段。拯救的質(zhì)粒被命名為pCDR1E。PCDR1E的序列分析和限制消化分析表明，它含有約4.5kb的植物序列。
在RNA分析中使用完整的4.5kb植物序列作為探針。在cdr1突變植株中檢測(cè)到1.5-1.6kb轉(zhuǎn)錄物的單一強(qiáng)帶，但在野生型植株中檢測(cè)不到。在或者野生型植株或者cdr1-D植株中沒(méi)有檢測(cè)到其它轉(zhuǎn)錄物。1.6kb轉(zhuǎn)錄物代表候選CDR1基因的編碼序列。
用pCDR1E的所述4.5kb植物序列篩選來(lái)自cDNA文庫(kù)(CD4-7)的約4×105個(gè)噬菌斑和來(lái)自另一大小分離的(1-2kb部分)cDNA文庫(kù)(CD)的1×105噬菌斑。鑒定出來(lái)自后一文庫(kù)的兩個(gè)cDNA克隆(pCDR1C1和pCDR1C2)。序列分析表明，這兩個(gè)cDNA克隆均衍生自同一基因。pCDR1C1的cDNA插入片段長(zhǎng)1485bp，且無(wú)polyA尾，發(fā)現(xiàn)比pCDR1C2的插入片段長(zhǎng)64bp。
對(duì)pCDR1E和pCDR1C1進(jìn)行全測(cè)序，在圖2顯示了其組構(gòu)。所述cDNA衍生自35S增強(qiáng)子下游0.8kb的基因組區(qū)(參見(jiàn)圖3)。不存在內(nèi)含子。
將來(lái)自pCDR1E、包括一個(gè)拷貝的35S增強(qiáng)子和所述候選CDR1基因的XbaⅠ片段，亞克隆到雙元載體pBI101中，產(chǎn)生pBI/CDR1X構(gòu)成物。當(dāng)轉(zhuǎn)化到野生型植株中時(shí)，發(fā)現(xiàn)該片段引起的表型與原始cdr1-D突變體中見(jiàn)到的表型相似，證明所述克隆化序列實(shí)際上是CDR1基因。
實(shí)施例8CDR1蛋白的序列分析CDR1基因含有一個(gè)可讀框，編碼推定分子量為47kDa的437個(gè)氨基酸的多肽(圖3)。通過(guò)PSORT算法(Nakai和Kanehisa,1992)預(yù)測(cè)推導(dǎo)的蛋白質(zhì)為胞外蛋白，具有于位置25切割的信號(hào)肽。
GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)的BLAST(Altschul等，1990,J Mol.Biol 215:403-410)檢索表明，CDR1與天冬氨酸蛋白酶具有顯著的序列同源性。象迄今從多種生物中鑒定出的大多數(shù)天冬氨酸蛋白酶一樣，CDR1包含2個(gè)天冬氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)域。在該數(shù)據(jù)庫(kù)中同源性最強(qiáng)的序列是從擬南芥屬基因組測(cè)序計(jì)劃鑒定出的功能未知的擬南芥基因組序列(GenBank登錄號(hào)AC006193，從序列4600至55982)。該序列與CDR1在氨基酸水平上的序列同一性為71％。數(shù)據(jù)庫(kù)檢索也表明，擬南芥屬基因組含有至少14個(gè)與CDR1具有顯著序列相似性的基因。
實(shí)施例9反義抑制CDR1基因引起病害易感性增強(qiáng)將CDR1基因的全長(zhǎng)cDNA以反義方向與35S啟動(dòng)子融合。將反義構(gòu)成物轉(zhuǎn)移到野生型擬南芥屬植物(哥倫比亞生態(tài)型)中。用無(wú)毒性Psm avrRpml感染12株獨(dú)立的T1轉(zhuǎn)基因植物。其中一個(gè)轉(zhuǎn)基因系(抗-12-1)表現(xiàn)出對(duì)感染的易感性。
實(shí)施例10通過(guò)化學(xué)試劑瞬時(shí)誘導(dǎo)CDR1基因誘導(dǎo)局部和系統(tǒng)抗病性反應(yīng)將CDR1 cDNA亞克隆到糖皮質(zhì)激素介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)系統(tǒng)中，產(chǎn)生pTA-CDR1，其中CDR1表達(dá)在糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的控制之下。為了誘導(dǎo)CDR1基因，用合成激素地塞米松(Dex)噴灑植物。在Dex施用后3小時(shí)內(nèi)檢測(cè)到CDR1基因表達(dá)的誘導(dǎo)，并在2天內(nèi)達(dá)到其最高水平。CDR1基因的誘導(dǎo)在PR2基因和PR1基因的表達(dá)上快速轉(zhuǎn)換。發(fā)現(xiàn)通過(guò)人工Dex浸潤(rùn)局部誘導(dǎo)CDR1，以系統(tǒng)水平(systemicleaves)誘導(dǎo)PR1和PR2表達(dá)。
為了檢查CDR1的瞬時(shí)誘導(dǎo)是否可以增強(qiáng)對(duì)病原體感染的抗性，通過(guò)在用Dex處理植物后兩天噴灑PSt懸浮液，感染TA-CDR轉(zhuǎn)基因植株和對(duì)照植株(僅具有pTA載體序列)。所述TA-CDR1轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)出對(duì)感染的抗性增強(qiáng)。局部誘導(dǎo)CDR1基因也使得整個(gè)植株對(duì)感染的抗性更強(qiáng)。
實(shí)施例11CDR1為胞外蛋白針對(duì)衍生自推導(dǎo)的CDR1蛋白的近C末端的合成肽，產(chǎn)生抗CDR1多克隆抗體。然后用在大腸桿菌中表達(dá)的重組CDR1蛋白，親和純化粗制抗體。在包括cdr1-D植侏和Dex誘導(dǎo)的TA-CDR1植株在內(nèi)的CDR1過(guò)量表達(dá)植株中，純化的抗體檢測(cè)到大小約58kDa的單一多肽。推測(cè)在野生型植株中CDR1蛋白的豐度太低，以致用所述抗體檢測(cè)不到。檢測(cè)到的CDR1蛋白的大小大于完整的CDR1蛋白的預(yù)測(cè)大小(47kDa)，表明成熟的CDR1蛋白被修飾。
預(yù)測(cè)所述CDR1蛋白是胞外蛋白。為了測(cè)試這一點(diǎn)，從CDR1過(guò)量表達(dá)的植株中和對(duì)照植株中分離胞間液(IF)。在IF中用所述抗體檢測(cè)到的CDR1蛋白的豐度比全粗制提取物中的豐度至少高10-15倍，表明CDR1蛋白位于胞間隙。
實(shí)施例12得自CDR1過(guò)量表達(dá)的擬南芥的胞間液局部和系統(tǒng)誘導(dǎo)PR基因表達(dá)當(dāng)將IF人工浸潤(rùn)到野生型葉片中時(shí)，發(fā)現(xiàn)分離自cdr1-D植株和Dex誘導(dǎo)的TA-CDR1植株的IF強(qiáng)烈誘導(dǎo)PR1和PR2基因表達(dá)。為了進(jìn)一步確定誘導(dǎo)PR蛋白的激衛(wèi)素活性的分子特征，用10kDa分子量截留濾膜將所述IF進(jìn)行大小分離。發(fā)現(xiàn)較高(＞10kDa)分子量部分(HMWF)負(fù)責(zé)粗制IF中見(jiàn)到的主要激衛(wèi)素活性。HMFW也在次生葉中誘導(dǎo)PR基因表達(dá)。發(fā)現(xiàn)較低分子量部分(LMWF)在初生葉中弱誘導(dǎo)PR基因表達(dá)。有趣的是，LMWF能夠在次生葉中與HMWF同樣有效地誘導(dǎo)PR基因表達(dá)。用3kDa分子量截留濾膜進(jìn)一步進(jìn)行大小分離，證明LMWF中的激衛(wèi)素活性的大小為3-10kDa。
實(shí)施例13CDR1在胞間液中釋放4.5kDa多肽用3kDa分子量截留濾膜濃縮所述IF。在1D PAGE凝膠上分離濃縮的IF，并銀染。在分離自CDR1誘導(dǎo)的植株的IF中僅積累約4.5kDa多肽(圖4)。這種CDR1釋放的多肽可能具有誘導(dǎo)局部和系統(tǒng)抗病性反應(yīng)的激衛(wèi)素活性。
實(shí)施例14材料和方法1．植物材料在短日光周期(9小時(shí)光和15小時(shí)黑暗)下于23℃培育用于轉(zhuǎn)化的擬南芥哥倫比亞生態(tài)型(Arabidopsis thaliana ecotype Columbia)30天，然后在長(zhǎng)日條件下培育直至成熟。
如前所述用攜帶激活標(biāo)記載體pSKⅠ15(圖1)的農(nóng)桿菌菌株GV3101 pMP90RK轉(zhuǎn)化擬南芥植株，pSKⅠ15具有用Basta選擇的BAR基因。將T1種子種植在土壤中，用Basta噴灑幼苗以選擇轉(zhuǎn)化體。將Basta抗性幼苗移植到短日條件下并在此條件下培育約4周，然后篩選抗病性增強(qiáng)的突變體。2．病原體和突變體篩選如所述獲得并培養(yǎng)丁香假單胞菌番茄致病變種(Pst)和丁香假單胞菌斑生致病變種。從過(guò)夜培養(yǎng)物中沉淀細(xì)菌，并再懸浮于水中至濃度為2-4×108cfu/ml。加入洗滌劑Silwet-L177至終濃度為0.02％。采用人工噴灑瓶，用所述細(xì)菌懸浮液噴灑植株，然后覆蓋24小時(shí)以保持高濕度。記錄感染后4-7天的癥狀。將推定的突變體移植到長(zhǎng)日條件下并培育至成熟。3．?dāng)M南芥核酸的分離和分析用修改的十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)法(Saghai-Maroff等，1984)分離擬南芥基因組DNA。從尚未開(kāi)始抽苔的4-5周大的植株的地上部分分離總RNA。用磷-32標(biāo)記DNA片段，按照標(biāo)準(zhǔn)方法(Sambrook,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratory Press)，進(jìn)行電穿孔、核酸印跡和雜交。4．T-DNA側(cè)翼植物序列的克隆為了克隆鄰接T-DNA邊界的植物序列，進(jìn)行質(zhì)粒拯救法。簡(jiǎn)而言之，用KpnⅠ或EcoRⅠ消化約2μg的基因組DNA，然后通過(guò)用1∶1苯酚∶氯仿抽提1次，然后乙醇沉淀進(jìn)行純化。在200μl總反應(yīng)體積中將純化的DNA片段連接過(guò)夜。用苯酚∶氯仿(1∶1)將連接反應(yīng)物抽提1次，用乙醇沉淀，將其再懸浮于10μl蒸餾水中。采用如前所述的電穿孔法(Sambrook等，1989，見(jiàn)上文)，用1μl純化的連接反應(yīng)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌。5．基因組克隆和cDNA克隆的克隆按照標(biāo)準(zhǔn)方法(Sambrook等，1989，見(jiàn)上文)，篩選出1個(gè)衍生自Ler生態(tài)型的擬南芥基因組文庫(kù)(Voytas等，1990)和兩個(gè)衍生自哥倫比亞生態(tài)型的cDNA文庫(kù)。6．抗體產(chǎn)生和純化以及免疫印跡分析合成14個(gè)氨基酸的肽DTVSKTVSFKPTDC，將其注射到兔子中，以產(chǎn)生多克隆抗體。如所述(Sambrook等，1989)，用固定于硝化纖維素濾膜上的CDR1融合蛋白親和純化所產(chǎn)生的抗血清。
按照標(biāo)準(zhǔn)方法(Sambrook等，1989)進(jìn)行蛋白分離和免疫印跡法。7．胞間液的分離將葉片切為0.2-0.5cm寬的切片，并用水沖洗。將葉切片浸入水中，真空浸潤(rùn)5-10分鐘，將其吸干，置于20ml或30ml注射器針筒中。將注射器置于合適大小的離心管中，以800g離心10分鐘。收集管底部的胞間液。
應(yīng)該理解，雖然已經(jīng)結(jié)合詳細(xì)的描述描述了本發(fā)明，但前述說(shuō)明意在說(shuō)明本發(fā)明，而不是限制本發(fā)明，本發(fā)明由所附的權(quán)利要求書(shū)的范圍限定。其它方面、優(yōu)點(diǎn)和修改在以下權(quán)利要求書(shū)的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1．基本純化的組成型抗病性1(CDR1)多肽。
2．權(quán)利要求1的多肽及其保守變異體，其中所述蛋白的氨基酸序列基本上與SEQ ID NO:2中提出的氨基酸序列相同，
3．權(quán)利要求1的多肽，其中所述蛋白的氨基酸序列在SEQ ID NO:2中提出。
4．編碼權(quán)利要求1的組成型抗病性1(CDR1)多肽的分離的多核苷酸。
5．編碼SEQ ID NO:2中提出的氨基酸序列的分離的多核苷酸。
6．分離的多核苷酸，選自a)SEQ ID NO:1；b)SEQ ID NO:1，其中T也可以是U；c)與SEQ ID NO:1互補(bǔ)的核酸；d)a)、b)或c)的至少長(zhǎng)15個(gè)堿基的片段，所述片段將與編碼SEQ ID NO:2中提出的組成型抗病性1(CDR1)多肽的DNA雜交；和a)、b)、c)或d)的簡(jiǎn)并變異體。
7．權(quán)利要求4的多核苷酸，其中所述多核苷酸分離自植物細(xì)胞。
8．權(quán)利要求5的多核苷酸，其中所述多核苷酸有效連接至表達(dá)控制序列。
9．權(quán)利要求8的多核苷酸，其中所述表達(dá)控制序列為啟動(dòng)子。
10．權(quán)利要求9的多核苷酸，其中所述啟動(dòng)子為組織特異性啟動(dòng)子。
11．含有權(quán)利要求5的多核苷酸的表達(dá)載體。
12．權(quán)利要求11的表達(dá)載體，還包含一種選擇標(biāo)記。
13．權(quán)利要求12的表達(dá)載體，其中所述選擇標(biāo)記賦予抗生素抗性。
14．權(quán)利要求11的表達(dá)載體，其中所述載體為病毒載體。
15．權(quán)利要求11的表達(dá)載體，其中所述載體為質(zhì)粒。
16．權(quán)利要求15的表達(dá)載體，其中所述質(zhì)粒為根癌農(nóng)桿菌的Ti質(zhì)粒。
17．權(quán)利要求15的表達(dá)載體，其中所述質(zhì)粒為根癌農(nóng)桿菌的Ri質(zhì)粒。
18．含有權(quán)利要求11的表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。
19．結(jié)合于權(quán)利要求1的多肽或結(jié)合于所述多肽抗原性片段的抗體。
20．產(chǎn)生與相應(yīng)的野生型植物相比被鑒定為抗病性提高的遺傳修飾植物的方法，所述方法包括a)使植物細(xì)胞與編碼組成型抗病性1(CDR1)多肽的核酸接觸，其中所述核酸與表達(dá)控制序列有效連接，獲得轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞；b)在允許表達(dá)組成型抗病性1(CDR1)的條件下由所述轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞產(chǎn)生植株；和c)選擇表現(xiàn)出所述抗病性的植株。
21．權(quán)利要求20的方法，其中所述抗病性提高是對(duì)細(xì)菌病原體的抗性提高。
22．權(quán)利要求21的方法，其中所述細(xì)菌病原體選自丁香假單胞菌番茄致病變種(Pst)和丁香假單胞菌斑生致病變種(Psm)。
23．權(quán)利要求20的方法，其中所述表達(dá)控制序列為啟動(dòng)子。
24．權(quán)利要求20的方法，其中所述接觸通過(guò)物理方法進(jìn)行。
25．權(quán)利要求20的方法，其中所述接觸通過(guò)化學(xué)方法進(jìn)行。
26．權(quán)利要求20的方法，其中所述植物細(xì)胞選自原生質(zhì)體、產(chǎn)生配子的細(xì)胞和再生為完整植株的細(xì)胞。
27．權(quán)利要求20的方法，其中所述核酸包含于T-DNA衍生載體中。
28．通過(guò)權(quán)利要求20的方法產(chǎn)生的植物。
29．得自權(quán)利要求28的植物的植物組織。
30．得自權(quán)利要求28的植物的種子。
31．產(chǎn)生遺傳修飾植物細(xì)胞和方法，使得由所述細(xì)胞產(chǎn)生的植物與野生型植物相比被鑒定為抗病性提高，所述方法包括a)將權(quán)利要求5的組成型抗病性1(CDR1)多核苷酸引入植物細(xì)胞中，獲得轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞；并且b)在允許表達(dá)組成型抗病性1(CDR1)多肽的條件下培育所述轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞，由此產(chǎn)生抗病性提高的植物。
32．權(quán)利要求31的方法，其中所述抗病性提高是對(duì)細(xì)菌病原體的抗性提高。
33．權(quán)利要求32的方法，其中所述細(xì)菌病原體選自丁香假單胞菌番茄致病變種(Pst)和丁香假單胞菌斑生致病變種(Psm)。
34．產(chǎn)生與野生型植物相比被鑒定為抗病性提高的植物的方法，所述方法包括使易感性植物與一種因子接觸，其中所述因子的量為將組成型抗病性1(CDR1)基因表達(dá)提高至高于未接觸所述因子的植物中組成型抗病性1(CDR1)表達(dá)所必需的組成型抗病性1(CDR1)啟動(dòng)子誘導(dǎo)量。
35．權(quán)利要求34的方法，其中所述因子為轉(zhuǎn)錄因子。
36．權(quán)利要求34的方法，其中所述因子為化學(xué)試劑。
37．權(quán)利要求34的方法，其中所述抗病性提高是對(duì)細(xì)菌病原體的抗性提高。
38．權(quán)利要求37的方法，其中所述細(xì)菌病原體選自丁香假單胞菌番茄致病變種(Pst)和丁香假單胞菌斑生致病變種(Psm)。
39．產(chǎn)生遺傳轉(zhuǎn)化的抗病性植物的方法，所述方法包括將包含有效連接至編碼組成型抗病性1(CDR1)多肽的多核苷酸的表達(dá)控制序列的核酸序列，引入植物細(xì)胞的基因組中，獲得轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞。
40．權(quán)利要求39的方法，其中所述表達(dá)控制序列將表達(dá)靶向選自葉片、根、苗和莖的植物組織。
41．權(quán)利要求39的方法，其中所述多核苷酸為權(quán)利要求5的多核苷酸。
42．權(quán)利要求39的方法，其中所述抗病性是對(duì)細(xì)菌病原體的抗性。
43．權(quán)利要求42的方法，其中所述細(xì)菌病原體選自丁香假單胞菌番茄致病變種(Pst)和丁香假單胞菌斑生致病變種(Psm)。
44．通過(guò)權(quán)利要求39的方法產(chǎn)生的植物。
45．衍生自用權(quán)利要求39的方法產(chǎn)生的植物的植物組織。
46．衍生自用權(quán)利要求39的方法產(chǎn)生的植物的種子。
47．鑒定新的抗病性基因的方法，所述方法包括e)用至少一種權(quán)利要求5的多核苷酸片段探測(cè)核酸文庫(kù)；并f)選擇所述文庫(kù)中與所述片段雜交的那些克隆。
48．經(jīng)PAGE鑒定為分子量約4.5kDa的基本純化的多肽；所述多肽由CDR1多肽誘導(dǎo)，并具有在植物中誘導(dǎo)抗病性的生物活性。
49．在植物中提高病害易感性的方法，所述方法包括使所述植物與CDR1抑制量的因子接觸，以使所述植物對(duì)病害的易感性高于未接觸所述因子的野生型植物。
50．權(quán)利要求49的方法，其中所述因子為抗體。
51．權(quán)利要求49的方法，其中所述因子為反義寡核苷酸。
全文摘要
本發(fā)明提供所有以下物質(zhì)基本純化的CDR1多肽、編碼CDR1多肽的分離的多核苷酸、包含CDR1的載體、表達(dá)CDR1的宿主細(xì)胞和結(jié)合CDR1的抗體。本發(fā)明還提供生產(chǎn)與野生型植物相比被鑒定為抗病性提高的遺傳修飾植物。還提供一種方法，通過(guò)用至少一種編碼CDR1的多核苷酸片段探測(cè)核酸文庫(kù)，并選擇與所述片段雜交的那些克隆，鑒定新的抗病性基因。
文檔編號(hào)C12N15/29GK1317054SQ99810840
公開(kāi)日2001年10月10日 申請(qǐng)日期1999年7月14日 優(yōu)先權(quán)日1998年7月14日
發(fā)明者R·A·迪科松, 夏亦薺, C·拉姆 申請(qǐng)人:索爾克生物學(xué)研究院