酶的制作方法

專利名稱：酶的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種新的參與控制植物生長的酶，編碼該酶的DNA序列，以及編碼該酶的核苷酸序列在生產(chǎn)生長特征有所改進或改變的轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。
赤霉素(GA)是一大類存在于所有高等植物和一些真菌中的二萜類羧酸。這類物質(zhì)中的某些成分發(fā)揮植物激素的功能，參與某些發(fā)育過程，包括種子萌發(fā)、莖伸長、葉擴展、花的發(fā)生和發(fā)展、以及種子和果實的生長。生物活性GA通常是19碳化合物，含有一個19-10內(nèi)酯、一個C-7羧酸和一個3β-羥基。其生物合成的后一階段涉及C-20的氧化去除和C-3的羥基化。2β位的羥基化產(chǎn)生無生物活性的產(chǎn)物。該反應(yīng)是植物中GA代謝的最重要途徑，它確?；钚约に夭辉谥参锝M織中累積。GA的生物合成酶7-氧化酶、20-氧化酶、3β-羥化酶和2β-羥化酶均是2-酮戊二酸-依賴性雙加氧酶。它們是一大類以2-酮戊二酸作為共底物的酶，反應(yīng)的一部分是所述底物被脫羧化成為琥珀酸(參見Hedden,P.和Kamiya,Y.,的綜述，“植物生理和植物分子生物學年度綜述(Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.)”48 431-460(1997))。
植物生長的化學調(diào)節(jié)劑應(yīng)用于園藝和農(nóng)業(yè)已有很多年。這些化合物中的一些功能在于改變植物組織中的GA濃度。例如，生長延緩劑抑制參與GA生物合成的酶的活性，由此降低GA濃度。這些化學物質(zhì)應(yīng)用很普遍，例如，防止谷類倒伏，控制觀賞植物和園藝植物生長。相反地，GA可以應(yīng)用于植物，例如GA3應(yīng)用于無子葡萄，以改善果實的大小和形狀。GA4和GA7的混合物應(yīng)用于蘋果改進果實的質(zhì)量，應(yīng)用于某些松類植物刺激松果形成。應(yīng)用生長調(diào)節(jié)劑存在幾個問題。一些生長延緩劑在土壤中高度殘留，使這樣的土壤在被處理作物之后很難生長其它作物。其它生長調(diào)節(jié)劑需要反復應(yīng)用，以維持所需的作用。很難將應(yīng)用限制到目標植物器官，而不擴散到其它器官或植物，和不產(chǎn)生不期望的作用。生長調(diào)節(jié)劑應(yīng)用的精確靶向需要花費大量勞動。因此，非常期望一種非化學物質(zhì)來控制植物形態(tài)。
發(fā)育中的種子通常含有GA，以及相對較大量的GA-生物合成酶。紅花菜豆(多花菜豆，Phaseolus coccineus)的成熟種子含有極高濃度的2β-羥基GA,GA8，作為其糖甙，說明一定存在高水平的2β-羥化酶活性。這在相關(guān)品種的菜豆(Phaseolus vulgaris)中得到確證，其中在種子完全成熟之前不久，GA2β-羥化酶活性迅速增加(Albone等，Planta 177 108-115(1989))。2β-羥化酶已經(jīng)從豌豆(Pisumsativum)(Smith,V.A.和MacMillan,J.,Planta 167 9-18(1983))和菜豆(Griggs等，植物化學(Phytochemistry)30 2507-2512(1991)和Smith,V.A.和MacMillan,J.,植物生長調(diào)節(jié)雜志(J.Plant GrowthRegul.)2251-264(1984))的子葉中部分純化出來。這些研究表明，對于這兩種來源都顯然存在至少兩種不同底物特異性的酶。通過陽離子交換色譜和凝膠過濾從吸液膨脹的菜豆的子葉中分離出兩種活性物質(zhì)。主要活性物質(zhì)，是一種相當于通過尺寸排阻HPLC測得分子量為26,000的酶，優(yōu)選底物是羥化的GA1和GA4,GA9和GA20不太優(yōu)選，而GA9是第二種酶(Mr 42,000)的優(yōu)選底物。然而，試圖純化酶活性物質(zhì)以獲得用于氨基酸測序的N-末端構(gòu)型已經(jīng)證明是不可能的，因為該酶在植物組織中相對于其它蛋白質(zhì)豐度很低，而且一種污染物，植物凝集素與酶活性物質(zhì)共同純化出來，使N-端氨基酸測序是不可能的。
Ross等報道，利用sln(纖細(slender))突變在豌豆(Pisumsativum，也稱garden pea)中檢查了赤霉素失活的調(diào)控(植物雜志(The Plant Journal)7(3)513-523(1995))。sln突變阻斷了GA20(生物活性GA1的前體)的失活。這些研究結(jié)果表明sin基因可能是控制參與GA失活的兩種獨立結(jié)構(gòu)基因表達的調(diào)控基因，所述的GA失活也就是GA20經(jīng)C-2位的2β-羥化，氧化為GA29，然后羥基進一步氧化為酮(GA29到GA29-分解代謝物(catabolite))。在豌豆子中GA29到GA29-代謝物的轉(zhuǎn)化被前己二酮鈣(prohexadione-calcium)抑制，前己二酮鈣是2-酮戊二酸-依賴性雙加氧酶的一種抑制劑(Nakayama等，植物細胞生理學(Plant Cell Physiol.)31 1183-1190(1990))，表明該反應(yīng)被這種類型的酶催化。雖然發(fā)現(xiàn)豌豆中的纖細(sln)突變可以阻斷種子中GA20轉(zhuǎn)化為GA29以及GA29轉(zhuǎn)化為GA29-分解代謝物，但未標記的GA20不能抑制放射性標記的GA29的氧化，反之亦然，表明上述步驟由不同的酶催化。而且，在芽組織中，纖細突變抑制GA20的2β-羥化，但不抑制形成GA29-分解代謝物。這些觀察形成了這樣的理論，即存在兩種不同的酶參與控制植物中GA失活的代謝途徑(Hedden,P.和Kamiya,Y.,植物生理和植物分子生物學年度綜述(Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.)48 431-460(1997))。
然而，現(xiàn)在令人驚奇地發(fā)現(xiàn)，事實上一種酶即可分解代謝這些不同的反應(yīng)。本發(fā)明公開了編碼GA 2β-羥化酶的cDNA的首次被報道的克隆，所述GA 2β-羥化酶作用于C19-GA，并且2β-羥化作用是其唯一羥化酶活性。來自南瓜子(pumpkin seed)的cDNA克隆編碼一種具有2β-和3β-羥化酶活性的酶(Lange等，植物細胞(Plant Cell)91459-1467(1997))，但它的主要活性是3β-羥化作用，僅當?shù)孜锸侨人?C20)時，它才作為2β-羥化酶；它不對C19-GA進行2β-羥化。因為本發(fā)明的新酶催化β-羥化，并催化C-2位取代的羥基進一步氧化為酮基，因此該酶被稱為“GA2-氧化酶”。
按照本發(fā)明的第一方面，提供了一種編碼赤霉素2-氧化酶的，分離、純化或重組的核酸序列，它包括如

圖1所示的核酸序列或其功能衍生物，或其互補鏈或其同源序列。
GA-生物合成基因的命名系統(tǒng)目前已有介紹(Coles等，植物雜志，17(5)547-556(1999))。在本申請中有關(guān)多花菜豆的赤霉素2-氧化酶基因的引用應(yīng)當理解為也指PcGA2ox1。本申請中有關(guān)鼠耳芥(Arabidopsis thaliana)的at-2bt3、at-2bt24、和T31E10.11的赤霉素2-氧化酶基因的引用應(yīng)當理解為也分別指AtGA2ox1、AtGA2ox2、和AtGA2ox3。
本發(fā)明的編碼赤霉素2-氧化酶(GA 2-氧化酶)的核酸序列是將GA，特別是C19-GA，包括生物活性GA例如GA1和GA4的C-2β位引入羥基的2-酮戊二酸-依賴性雙加氧酶。它們也可以將2β-羥化GA進一步氧化為GA-代謝物，其在C-2具有酮基。這些代謝物的內(nèi)酯橋也可以打開，產(chǎn)生一個C-19羧酸和一個C-10雙鍵。2-氧化酶的活性導致生物活性GA的失活，或活性GA的生物合成前體轉(zhuǎn)化為不能被轉(zhuǎn)化成生物活性形式的產(chǎn)物。因此本發(fā)明的優(yōu)選核酸序列編碼能夠通過在C-2β位引入一個羥基而氧化C19-赤霉素化合物的赤霉素2-氧化酶。該酶還可以將2β-羥基氧化為酮基。本發(fā)明的赤霉素2-氧化酶的優(yōu)選底物是GA9、GA4、GA20和GA1。
在本發(fā)明中的上下文，氨基酸序列之間的同一性程度可以至少為40％、合適地為50％或更高，例如55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、或95％。在核苷酸水平上，同一性程度可以至少為50％，合適地為60％或更高，例如65％、70％、75％、80％、85％、90％、或95％。按照本發(fā)明，一種同源序列因此可以具有上述序列同一性?？梢杂萌魏纬Ｒ?guī)提供的方案確定序列同源性，例如利用來自Strasbourg大學的Clustal XTM和利用GenedocTM(Karl B.Nicholas)產(chǎn)生的同一性表。
與按照本發(fā)明第一方面的序列在嚴緊條件下雜交的核酸序列，或者若非遺傳密碼的簡并性將與所述序列同源或在嚴緊條件下與其雜交的核酸序列，或者特異于任何所述序列的寡核苷酸序列，也包括在本雜交的嚴緊條件可以具有如下特征，即低鹽濃度或高溫度條件。例如，高度嚴緊條件可以定義為在0.5M NaHPO4、7％十二烷基硫酸鈉(SDS)、1mM EDTA中在65℃與結(jié)合到固體支持物上的DNA雜交，在0.1xSSC/0.1％SDS中在68℃洗滌(Ausubel等，“分子生物學當前方案(Current Protocols in Molecular Biology)”1，頁2.10.3,GreenPublishing Associates,Inc.和John Wiley & Sons,Inc.，出版，New york,(1989))。在某些情況下，可能需要低嚴緊度條件。如本申請中使用的，中度嚴緊條件可以定義為包括在0.2xSSC/0.1％SDS中在42℃洗滌(Ausubel等，(1989)，同上)。還可以加增加量的甲酰胺使雜交體的核酸雙鏈不穩(wěn)定，而使雜交更嚴緊。因此，特定的雜交條件能夠容易地操作，通常將按照所需的結(jié)果選擇。通常，在存在50％甲酰胺的情況下，對于與目的DNA具有95％-100％同源性的探針而言，適宜的雜交溫度為42℃，對于90-95％的同源性為37℃，對于70-90％的同源性為32℃。
本發(fā)明的優(yōu)選核酸序列的一個例子是編碼具有多花菜豆赤霉素2-氧化酶活性的酶(例如，PcGA2ox1)，或蝶形花科(Fabaceae family)家族的另一成員的等效蛋白質(zhì)。本發(fā)明的核酸序列還可以編碼一種來自菜豆或來自鼠耳芥的赤霉素2-氧化酶(例如AtGA2ox1、AtGA2ox2、或AtGAox3)。
按照本發(fā)明這方面的其它核酸序列還可以包括，如前面定義的核酸序列，其中編碼序列有效地連接于啟動子。啟動子可以是結(jié)構(gòu)型的和/或在特定植物細胞或組織中特異性表達的，例如在根中應(yīng)用煙草RB7(Yamamoto等，植物細胞，3 371-382(1991))；在綠色組織中應(yīng)用番茄rbcS-3A(Ueda等，植物細胞，1 217-227(1989))；在分化細胞中應(yīng)用玉米組蛋白H3(Brignon等，植物分子生物學，22 1007-1015(1993))或鼠耳芥屬(Arabidopsis)CYC07(Ito等，植物分子生物學，24 863-878(1994)；在蔬菜分生組織中應(yīng)用鼠耳芥屬KNAT1(Lincoln等，植物細胞6 1859-1876(1994))；在導管組織中應(yīng)用豆GRPl.8(Keller,B.,& Heierli,D.,植物分子生物學，26 747-756(1994))；在花中應(yīng)用鼠耳芥屬ACT11(Huang等，植物分子生物學33125-139(1997)或矮牽牛查耳酮合成酶(Bandermeer等，植物分子生物學，15 95-109(1990)；在雌蕊中應(yīng)用土豆SK2(Ficker等，植物分子生物學，35 425-431(1997))；在花粉囊中應(yīng)用蕓苔TA29(Deblock,M.,& Debrouwer,D.,Planta 189 218-225(1993))；在果實中應(yīng)用番茄聚半乳糖醛酸酶(Bird等，植物分子生物學11651-662(1988))?；蛘邌幼涌梢詠碓从谥参锝M織，例如，花椰菜花葉病毒35S啟動子(CaMV)。適當?shù)膯幼有蛄锌梢园▉碜灾参锲贩N的啟動子序列，例如來自十字花科(Brassicaceae)的啟動子序列。
因此本發(fā)明還擴展到一種分離、純化或重組的核酸序列，其包括天然驅(qū)動赤霉素2-氧化酶的編碼基因表達的啟動子，包括圖1所示的核酸序列或其功能衍生物，或其互補鏈，或其序列同源物。該赤霉素2-氧化酶可以是多花菜豆的(例如PcGA2ox1)或豆科植物家族另一成員的等效蛋白質(zhì)。該核酸序列還可以編碼來自菜豆或鼠耳芥的赤霉素2-氧化酶(例如AtGA2ox1、AtGA2ox2、或AtGA2ox3)。優(yōu)選地，核酸序列包括一種驅(qū)動來自多花菜豆、菜豆或鼠耳芥的赤霉素2-氧化酶表達的啟動子。該啟動子序列包括圖1所示序列的編碼序列5’端天然存在的啟動子。啟動子還可以被選擇用來組成性超量表達編碼赤霉素2-氧化酶基因的核酸?？梢允褂糜蓛?nèi)部或外部因素，例如化學物質(zhì)、植物激素、光或應(yīng)力誘導的啟動子。例如可由水楊酸誘導的與致病機理有關(guān)的基因，銅-操縱的基因表達(Mett等，美國國家科學院科學進展(Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA)90 4567-4571(1993))和四環(huán)素-調(diào)控的基因表達(Gatz等，植物雜志，2 397-404(1992))。可由赤霉素誘導的基因的例子是γ-TIP(Phillips,A.L.,& Huttly,A.K.,植物分子生物學24 603-615(1994))和GAST(Jacobsen,S.E.,&Olszewshi,N.E.,Planta 198 78-86(1996))。GA下調(diào)赤霉素20-氧化酶基因(Phillips等，植物生理學108 1049-1057(1995))，它們的連接于GA 2-氧化酶ORF的啟動子也可以應(yīng)用于本發(fā)明的這一方面。
由本發(fā)明的核酸序列編碼的赤霉素2-氧化酶可以適當?shù)卮呋疌19-赤霉素分子的2β-氧化，在C-2位引入羥基，隨后進一步氧化產(chǎn)生酮衍生物。
本發(fā)明的核酸序列還可以編碼與植物細胞中正常存在的RNA反義的RNA，或者可以編碼能夠剪切植物細胞中正常存在的RNA的RNA。因此，本發(fā)明還提供了一種編碼核酶的核酸序列，所述核酶能夠特異地剪切由赤霉素2-氧化酶基因編碼的RNA。該編碼核酶的DNA通常將用于抑制赤霉素，尤其是C19-GA的失活。
按照本發(fā)明的核酸序列還可以進一步含有5’信號序列，以指導表達的蛋白質(zhì)產(chǎn)物的表達。該信號序列還可以包括蛋白質(zhì)導向序列，其能夠指導表達的蛋白質(zhì)到達表達該核酸序列的宿主細胞內(nèi)部或外部的特定位置?；蛘撸怂嵝蛄羞€可以包括3’信號，例如聚腺苷酸化信號或其它調(diào)控信號。
因此本發(fā)明為農(nóng)業(yè)提供了意義重大的便利，即提供核酸序列調(diào)控赤霉素植物激素的代謝。該調(diào)控可以是通過促進赤霉素2-氧化酶的作用抑制植物生長，還可以是通過赤霉素2-氧化酶防止赤霉素失活而促進植物生長。例如，1997年，英國約15％小麥倒伏，約30％大麥倒伏，估計損失達到￡100m栽培物。由于降低GA含量產(chǎn)生的矮壯莖抗-倒伏谷類的應(yīng)用具有相當大的經(jīng)濟價值。
按照本發(fā)明的另一方面，提供了一種反義核酸序列，其包括一種與編碼赤霉素2-氧化酶，例如來自多花菜豆、菜豆或鼠耳芥的赤霉素2-氧化酶，的基因中被天然轉(zhuǎn)錄的至少部分DNA鏈互補的DNA的可轉(zhuǎn)錄鏈。按照本發(fā)明優(yōu)選的基因包括PcGA2ox1、AtGA2ox1、AtGA2ox2和AtGA2ox3。
一種更一般性原理的例子是上述反義核酸和核酶-編碼的核酸按照本發(fā)明的進一步方面，提供了導致(例如通過其表達)選擇性破壞赤霉素2-氧化酶基因的適當表達的DNA，或在優(yōu)選實施方式中，多花菜豆基因PcGA2ox1。
按照本發(fā)明的另一方面，提供了一種分離的、純化的或重組的多肽，包括赤霉素2-氧化酶，具有圖2所示氨基酸序列。
按照本發(fā)明的重組DNA在形式上可以是一種載體。該載體可以是例如一種質(zhì)粒、粘粒、噬菌體或人工染色體。載體將通常包括一種或多種可選擇性標記，使可以選擇含有它們的被轉(zhuǎn)染的細胞(或被轉(zhuǎn)化的這些術(shù)語在本說明書中可以互換使用)，優(yōu)選地，能夠選擇攜帶整合異源DNA的載體的細胞。通常存在適當?shù)摹捌鹗肌被颉敖K止”信號。另外，如果載體是用于表達的，則將存在足夠的調(diào)控序列以促使表達；然而，本發(fā)明的DNA將通常在植物細胞中表達，因此微生物宿主表達將不屬于本發(fā)明的主要目標，當然也不排除(例如在細菌或酵母菌宿主細胞)。不包括調(diào)控序列的載體可以用作克隆載體。
可以將克隆載體導入大腸桿菌(E.coli)或另一種有利于它們操作的適當宿主中。因此按照本發(fā)明的另一方面，提供了一種用上述核酸序列轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化的宿主細胞。本發(fā)明的進一步實施方式提供了一種通過GA 2-氧化酶cDNA在異源宿主例如大腸桿菌，酵母包括釀酒酵母，或用含重組DNA的桿狀病毒感染的昆蟲細胞中表達得到的酶。該酶可以用于生產(chǎn)2β-羥化GA和GA-分解代謝物或用于制備針對GA 2-氧化酶的抗體。宿主細胞還可以適當?shù)貫橹参锛毎囵B(yǎng)中的植物細胞或愈傷組織的一部分。
可以通過任何常規(guī)方法制備本發(fā)明的核酸序列，包括連續(xù)核苷酸連接到一起，和/或寡-和/或多-核苷酸的連接，包括在無細胞的體外過程中，但重組DNA技術(shù)構(gòu)成精選方法。
最后，本發(fā)明的核酸序列將通過任何適當方法導入植物細胞。按照本發(fā)明的再一方面，提供了一種包括本發(fā)明上述核酸序列的植物細胞。
優(yōu)選地，本發(fā)明的核酸序列通過用二元載體pLARS120，pGPTV-Kan的改進形式(Becker等，植物分子生物學，20 1195-1197(1992)),其中β-葡糖醛酸酶報告基因被來自pBI220的花椰菜花葉病毒35s啟動子取代(Jefferson,R.A.,植物分子生物學報告(Plant Mol.Biol.Rep.)5 387-405(1987))，轉(zhuǎn)化導入植物細胞。然后通過電融合將該質(zhì)粒導入根瘤農(nóng)桿菌，然后可以經(jīng)一個真空過濾程序轉(zhuǎn)移到宿主細胞中?；蛘?，可以通過本領(lǐng)域已知的方法，例如EP-A-0116718和EP-A-0270822中描述的方法，利用解除的(disarmed)Ti-質(zhì)粒載體實現(xiàn)轉(zhuǎn)化，和通過農(nóng)桿菌進行轉(zhuǎn)化。當農(nóng)桿菌屬無效時，可以用單獨的放電裝置將外源DNA直接導入植物細胞，例如轉(zhuǎn)化單子葉植物。能夠穩(wěn)定地將核酸序列引入任何植物細胞的細胞核DNA或線粒體DNA中的任何其它方法也是適用的。包括那些還不能進行遺傳轉(zhuǎn)化的植物品種。
優(yōu)選地，用于導入宿主細胞的本發(fā)明的核酸序列還含有第二嵌合基因(或“標記”基因)，其能夠使含有外源DNA的轉(zhuǎn)化植物容易地從不含外源DNA的其它植物中分辨出來。該標記基因的例子包括抗生素抗性(Herrera-Estrella等，EMBO J.2 987-995(1983))，除草劑抗性(EP-A-0242246)和葡糖醛酸酶(GUS)表達(EP-A-0344029)，標記基因的表達優(yōu)選被第二啟動子控制，其允許在所有發(fā)育期的細胞中表達，從而能夠在植物再生的所有階段確定標記基因的存在。
可以從一個轉(zhuǎn)化植物細胞再生完整植物，因此本發(fā)明提供了含有上述本發(fā)明核酸序列的轉(zhuǎn)基因植物(或其部分，例如繁殖材料，例如，原生質(zhì)體、細胞、愈傷組織、組織、器官、種子、胚、胚珠、合子、塊莖、根等)。在本發(fā)明中，應(yīng)當注意術(shù)語“轉(zhuǎn)基因”不應(yīng)當限于指其種系中含有一個或多個來自另一物種基因的上述生物體，雖然一些這類生物體將含有該基因。而是該術(shù)語更廣泛地指其種系已經(jīng)作為重組DNA技術(shù)的技術(shù)介入主題的任何生物體。因此，例如，其胚系中一種內(nèi)源基因被刪除、復制、激活、或修飾的生物體與其種系中附加了一種外源DNA序列的生物體一樣，也是作為本發(fā)明目標的轉(zhuǎn)基因生物體。
植物的優(yōu)選品種包括但不限于單子葉植物包括種子和其后代或繁殖體，例如黑麥草屬、玉蜀黍?qū)?、小麥屬、蜀黍?qū)佟riticale、甘蔗屬、雀麥屬、燕麥屬、大麥屬、黑麥屬、和狗尾草屬。尤其有用的轉(zhuǎn)基因植物是玉米、小麥、大麥植物和其種子。雙子葉植物也在本發(fā)明范圍內(nèi)，優(yōu)選的轉(zhuǎn)基因植物包括但不限于蝶形花科(Fabaceae)、茄屬、十字花科(Brassicaceae)，尤其是土豆、菜豆、卷心菜、森林樹(foresttree)、玫瑰、鐵線蓮、油子蕓苔、向日葵、菊花、猩猩木和金魚草((snapdragon))。
可以通過如Sambrook等(分子克隆實驗室手冊，第二斑(1989))描述的Southern分析篩選存在特定DNA序列的植物細胞、組織和植物。還可以通過本領(lǐng)域已知技術(shù)——聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)進行該篩選。
植物細胞的轉(zhuǎn)化包括從沒有被轉(zhuǎn)化的細胞中分離轉(zhuǎn)化細胞。這種分離或篩選的—種方便方法為將一種篩選標記基因引入到待插入轉(zhuǎn)化細胞的材料中。結(jié)果是，僅那些成功轉(zhuǎn)化的細胞才含有標記基因。然后標記基因的翻譯產(chǎn)物賦于能夠篩選的表型性狀。通常，表型性狀是在存在某些化學試劑、例如卡那霉素、G418、巴龍霉素等抗生素(它們被置于篩選培養(yǎng)基中)的情況下，能夠生存的能力。賦于具備抗生素抗性的一些基因的例子包括例如，編碼新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶卡那霉素抗性(Belten等，EMBO J.3 2723-2730(1984))、潮霉素抗性(vanden Elzen等，植物分子生物學，5 299-392(1985))、來源于Tn5的卡那霉素抗性(NPT Ⅱ)基因(Bevan等，自然，304 184-187(1983)；Mcbride等，植物分子生物學，14(1990))和氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶的基因。Thompson等中描述的PAT基因(EMBO J.6 2519-2523(1987))可以用于賦予除草劑抗性。
主要用作組織培養(yǎng)中鑒定含遺傳工程載體的植物細胞的可篩選標記基因的例子是編碼形成產(chǎn)色產(chǎn)物的酶。一個例子是編碼產(chǎn)生β-葡糖醛酸酶(GUS)的基因。該酶被廣泛應(yīng)用，其制備和應(yīng)用在Jefferson中被描述(植物分子生物學報告，5 387-405(1987))。
當在篩選培養(yǎng)基上培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的植物細胞后，存活的細胞被篩選出來用于進一步研究和操作。篩選方法和材料是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，可以篩選具有高度可預(yù)言性的存活細胞，被篩選出的細胞將是已經(jīng)成功地被外源DNA轉(zhuǎn)化的細胞。
當植物細胞或植物用例如，農(nóng)桿菌屬Ti-質(zhì)粒轉(zhuǎn)化后，Ti-質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的、從而能夠表達酶的植物細胞或植物能夠通過適當?shù)谋硇蜆擞浐Y選出來。這些表型標記包括但不限于抗生素抗性。其它的表型標記是本領(lǐng)域已知的，可以用于本發(fā)明。
按照本領(lǐng)域已知的程序再生陽性克隆。隨后評價轉(zhuǎn)化植物是否存在所述特性和/或所需特性被表達的程度。第一種評價可以包括，例如，轉(zhuǎn)化植物的細菌/真菌抗性水平，所需特性的穩(wěn)定的遺傳率，田間實驗等。
下面方案通過說明和概述的方式闡述了一種典型方法，通過該方法可以制備轉(zhuǎn)基因植物材料，包括完整植物?？梢哉J為該方法涉及下面五個步驟
(1)首先從適當來源分離或通過已知方法合成一種編碼表現(xiàn)GA2-氧化酶活性的蛋白質(zhì)的DNA序列；(2)將所述DNA序列以5’到3’的方向有效地連接于本文前面描述的植物表達序列；(3)將步驟(2)的構(gòu)建物通過已知方法轉(zhuǎn)化到植物材料中，并在其中表達；(4)篩選按照步驟(3)處理的植物材料是否存在編碼表現(xiàn)赤霉素2-氧化酶活性的蛋白質(zhì)的DNA序列；和(5)任選地將步驟(3)的轉(zhuǎn)化的植物材料再生成為一個完整植株。
因此本發(fā)明還包括轉(zhuǎn)基因植物和其有性和/或無性后代，它們已經(jīng)用本發(fā)明的重組DNA序列轉(zhuǎn)化?？梢酝ㄟ^任何已知常規(guī)方法從適當?shù)那笆龇椒ㄖ苽涞?，或者從這些材料來源的繁殖材料進行植物的再生。
“轉(zhuǎn)基因植物的無性或有性后代”的表達包括本發(fā)明定義的所有通過已知方法得到的突變體和變異體，例如細胞融合或突變體篩選，其仍然表現(xiàn)起始轉(zhuǎn)化植物的特性，以及轉(zhuǎn)化植物材料的所有雜交和融合產(chǎn)物。
本發(fā)明的另一個目的涉及轉(zhuǎn)基因植物的繁殖材料。轉(zhuǎn)基因植物的繁殖材料相對于本發(fā)明，定義為可以在體內(nèi)或在體外有性繁殖的任何植物材料。在本發(fā)明范圍內(nèi)特別優(yōu)選的是原生質(zhì)體、細胞、愈傷組織、組織、器官、種子、胚、卵細胞、合子、以及從轉(zhuǎn)基因植物得到的任何其它繁殖材料。
本發(fā)明的另一方面在于提供針對至少部分赤霉素2-氧化酶氨基酸序列的抗體。該抗體在篩選適當載體中的來源于植物組織RNA的cDNA文庫方面是有用。
按照本發(fā)明赤霉素2-氧化酶基因用于轉(zhuǎn)基因植物生長和發(fā)育過程的修飾。因此，本發(fā)明的另一個重要方面是其在制備轉(zhuǎn)基因植物或種子中的應(yīng)用，在所述轉(zhuǎn)基因植物或種子中，赤霉素2-氧化酶組成性超量表達，以減少植物或種子中的生物活性赤霉素(GA)的濃度。優(yōu)選的赤霉素2-氧化酶基因包括PcGA2ox1、AtGA2ox1、AtGA2ox2和AtGA2ox3。該超量表達GA2-氧化酶的轉(zhuǎn)基因植物類似用生長遲緩劑處理的植物。因此本發(fā)明用于降低植物生長，例如，預(yù)防谷類植物包括稻倒伏，提高谷類產(chǎn)量，預(yù)防油子蕓苔(oilseed rape)倒伏，改善株冠結(jié)構(gòu)，改善移植的幼苗質(zhì)量，減緩草坪草的生長，降低果園中和觀賞樹木芽的生長，使觀賞植物形成更緊密的生長習慣，改善對低溫、干旱、和感染的耐受力，通過同化物從營養(yǎng)器官轉(zhuǎn)移到生殖器官而提高產(chǎn)量，防止蓮座狀植物例如甜菜、萵苣、brassicas、和菠菜的抽苔。本發(fā)明還通過花器官中表達用于誘導雄性和/或雌性不孕，防止谷類在收獲前發(fā)芽，降低綠籬植物芽的生長，可逆地抑制種子的發(fā)育和萌發(fā)，降低商業(yè)樹木品種芽的生長。
可以利用含組成性啟動子和核酸編碼序列的DNA構(gòu)建體在通過重組DNA技術(shù)制備的轉(zhuǎn)基因植物中實現(xiàn)編碼赤霉素2-氧化酶的核酸序列的超量表達。或者，可以利用同源重組技術(shù)將一種組成性啟動子插入細胞核中本發(fā)明核酸序列的正常沉默拷貝的上游，實現(xiàn)超量表達。
本發(fā)明還提供了另一方面，即上述核酸序列在制備轉(zhuǎn)基因植物和/或種子中的用途，在所述轉(zhuǎn)基因植物和/或種子中，通過例如，內(nèi)源性GA 2-氧化酶DNA序列的反義拷貝的表達，內(nèi)源性基因的截短的有義拷貝的表達(共-抑制)，或者針對內(nèi)源性轉(zhuǎn)錄物的合成核酶的應(yīng)用，使轉(zhuǎn)基因植物中內(nèi)源性GA 2-氧化酶基因的表達減少(即，沉默)。按照本發(fā)明這一方面的優(yōu)選的赤霉素2-氧化酶基因包括PcGA2ox1、AtGA2ox1、AtGA2ox2、和ATGA2ox3。這將導致生物活性GA的周轉(zhuǎn)降低，因此濃度增加的植物。在這一方面，本發(fā)明可以用于，例如，改善無子葡萄、柑桔和梨的果實形成和生長，改善蘋果皮質(zhì)地和果實形狀，增加甘蔗莖的長度由此提高產(chǎn)量，提高芹菜和大黃的產(chǎn)量和早熟，改善谷類，尤其是大麥麥芽的產(chǎn)量和質(zhì)量。它還可以用于促進木本品種的生長。
本發(fā)明第二方面和后續(xù)方面的優(yōu)選特征如同第一方面，同時在細節(jié)上加以必要的變更。
下面將參考實施例和附圖進一步描述本發(fā)明，提供它們的目的僅在于解釋，不應(yīng)該構(gòu)成對本發(fā)明的限制。在實施例中，參考對照下列附圖編號，其中圖1顯示了多花菜豆2-氧化酶cDNA克隆pc-2boh.dna(PcGA2ox1)的核苷酸序列，其中編碼區(qū)在殘基68-1063nt(332個氨基酸)。
圖2顯示了圖1所示的多花菜豆核苷酸序列(PcGA2ox1)的推測的氨基酸序列。
圖3顯示了鼠耳芥探針T3(圖3a)和探針T24(圖3b)的DNA探針序列。
圖4顯示了赤霉素(GA)生物合成的兩個主要途徑。
圖5顯示了鼠耳芥克隆at-2bt3(AtGA2ox1)的部分核苷酸序列，其中編碼區(qū)在殘基41-1027nt(329個氨基酸)。
圖6顯示了鼠耳芥克隆at-2bt3(AtGAox1)的推測的氨基酸序列。
圖7顯示了鼠耳芥克隆at-2bt24(AtGA2ox2)的部分核苷酸序列，其中編碼區(qū)在殘基109-1131nt(341個氨基酸)。
圖8顯示了鼠耳芥克隆at-2bt24(AtGAox2)的推測的氨基酸序列。
圖9顯示了鼠耳芥基因組克隆T31E10.11(AtGA2ox3)的核苷酸序列。
圖10顯示了基因組克隆T31E10.11(AtGA2ox3)的推測的氨基酸序列。
圖11顯示了在CaMV35S啟動子的控制下，表達多花菜豆GA 2-氧化酶cDNA的轉(zhuǎn)化的鼠耳芥植物(哥倫比亞生態(tài)型)的照片，包括一種未顯示表型的轉(zhuǎn)化植物(最右端的圖)。
實施例1．來自多花菜豆的編碼GA 2β-羥化酶的cDNA克隆的分離如下述從多花菜豆胚中，通過在cDNA文庫中篩選功能型酶的表達，而分離編碼GA 2β-羥化酶的cDNA克隆。按照Dekker等(1989)，從成熟多花菜豆種子的子葉中提取RNA。通過oligo(dT)纖維素層析純化Poly(A)+mRNA。用定向cDNA合成試劑盒(λ-ZAP Ⅱ cDNA合成試劑盒，Stratagene)從5μg多聚(A)+mRNA合成cDNA。將cDNA連接到λ-ZAP Ⅱ臂中，利用Gigapack Gold Ⅲ(Stratagene)包裝和按照生產(chǎn)商的說明書擴增1 x 106重組克隆。
按照生產(chǎn)商的體外切除方案(Stratagene)從多花菜豆cDNA文庫(1×109pfu)制備噬菌粒貯備液。為了初步篩選，按照生產(chǎn)商的說明(Stratagene)，用噬菌粒貯備液感染大腸桿菌SOLR，得到約11000菌落形成單位(cfu)。將它們再分到微滴板的48個孔(6×8陣列)中(孔體積=3.5ml)，在0.5ml添加50μg/ml卡那霉素和100μg/ml羧芐青霉素的2×YT肉湯中，在37℃下振搖過夜生長擴增。從每行六個孔和每列八個孔中取20μl等分液混合，得到14個匯集液，分別加入10ml 2 YT肉湯，添加50μg/ml卡那霉素和100μg/ml羧芐青霉素，在37℃下振搖生長，直到OD 600nm值為0.2-0.5。然后將該培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到30℃的振蕩培養(yǎng)箱中，添加1mM的IPTG，誘導重組融合蛋白質(zhì)產(chǎn)生。誘導培養(yǎng)物16小時。離心(3000g×10分鐘)沉淀細菌，重懸浮于750μl溶胞緩沖液(100mM Tris HCl pH 7.5,5 mM DTT)。超聲溶解細菌(3×10秒)，在微量離心管中離心10分鐘沉淀細胞碎片。如下述分析上清液中GA 2β-羥化酶的活性。從第6行(R6)和第1列(C1)的收集到的細菌的細胞溶解液能夠催化[1.2-3H2]GA4和[2.3-3H2]GA9釋放3H2O。對于第二次篩選，將孔R6C1的細菌在添加100μg/ml羧芐青霉素和50μg/ml卡那霉素的2YT瓊脂板上鋪板，在37℃下生長16小時。隨機挑取一百個單菌落，轉(zhuǎn)移到5ml含100mg/ml羧芐青霉素和50mg/ml卡那霉素的2xYT肉湯中，于37℃振搖生長16小時。將培養(yǎng)物分布到10×10格柵中，來自每行和每列的匯集物用于如上述誘導和測試GA 2β-羥化酶的活性。第2和9行和第7和10列能夠催化從[1,2-3H2]GA4和[2,3-3H2]GA9釋放3H2O。表明培養(yǎng)物27和90表現(xiàn)該活性。推測的GA 2β-羥化酶克隆被命名為2B27。
利用Promega SV miniprep試劑盒從克隆2B27分離出的質(zhì)粒DNA，應(yīng)用Amersham’s Taq循環(huán)測序試劑盒，M13通用(-20)和反向測序引物，測序。用Applied Biosystems 373A自動測序儀分析從測序反應(yīng)得到的鏈終止產(chǎn)物。用來自基因密碼公司(Gene Codes Corporation)的程序性測序儀3.0進行序列分析。用Wisconsin大學遺傳計算機組的一套程序進行進一步核苷酸和蛋白質(zhì)序列分析。實施例2．GA 2-氧化酶活性的分析如Smith和MacMillan所述(Smith,V.A.,和MacMillan,J.“植物生長調(diào)節(jié)雜志(J.Plant Growth Regulation)”2 251-264(1984))，通過測定2β-氚標記的GA底物中3H2O的釋放，確定GA 2β-羥化酶活性。將細菌裂解液(90μl)與[1,2-3H2]GA4或[2,3-3H2]GA9(約50000dpm)，在存在4mM 2-氧化戊二酸、0.5mM Fe(Ⅱ)SO4、4mM抗壞血酸、4mM DTT、1mg/ml過氧化氫酶、2mg/ml BSA的情況下一同保溫，終反應(yīng)體積為100μl?；旌弦涸?0℃培養(yǎng)60分鐘。添加1ml活性炭(5％w/v)，隨后在微量離心管中離心5分鐘除去氚代GA。0.5ml上清等份液與2ml閃爍液體混合，通過閃爍記數(shù)確定放射活性。
為了確定cDNA表達產(chǎn)物的功能，將細菌裂解液與[17-14C]GA在存在輔助因子的情況下如上述共同保溫。保溫后，加入pH為3的乙酸(10μl)和水，混合液在3,000rpm離心10分鐘。通過HPLC在在線放射性監(jiān)測儀上分析上清液，通過GC-MS鑒定產(chǎn)物，如以前的描述(MacMillan等，植物生理學，113 1369-1377(1977))。實施例3．編碼來自鼠耳芥的GA 2-氧化酶的cDNA的克隆應(yīng)用TblastN程序，用預(yù)測的克隆2B27的蛋白質(zhì)序列，在國家生物信息中心(the National Centre for Biological Information,ncbi.nlm.nih.gov)的基因組概括序列數(shù)據(jù)庫(the Genomic SurveySequences database)中檢索。兩種鼠耳芥屬的基因組序列，T3M9-Sp6和T24E24TF，證明與2B27序列具有高度氨基酸序列等同性?；赥3M-Sp6基因組序列設(shè)計寡核苷酸引物為5’-TAATCACTATCCACCATGTC-3’(有義)5’-TGGAGAGAGTCACCCACGTT-3’(反義)，和基于T24E24TF序列設(shè)計寡核苷酸引物為5’-GGTTATGACTAACGGGAGGT-3’(有義)，5’-CTTGTAAGCAGAAGATTTGT-3’(反義)，將它們應(yīng)用于以鼠耳芥屬基因組DNA作為模版的PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)由200ng基因組DNA、1xPCR緩沖液、1.5mM MgCl2、200μM脫氧核苷酸三磷酸、1μM各種引物、和2單位Taq DNA聚合酶(Promega)組成。將該反應(yīng)加熱到94℃3分鐘，然后進行擴增循環(huán)35次(94℃30秒，55℃30秒和72℃30秒)，最后在72℃保溫10分鐘。應(yīng)用TA克隆試劑盒(Invitrogen)將得到的PCR產(chǎn)物直接克隆到pCR2.1載體中，然后如上述測序?？寺”幻麨锳tT3和AtT24。采集哥倫比亞生態(tài)型(columbia ecotype)的長角果、花、頂端莖(莖頂端2cm)、下端莖、葉(莖生的和蓮坐葉叢)、和根，在液氮中冷凍。如上述提取Poly(A)+mRNA。使5μg Poly(A)+mRNA樣品通過含甲醛的瓊脂糖凝膠電泳，制備Northern印跡，然后轉(zhuǎn)移到硝基纖維素上(Sambrook等，分子克隆實驗室指南，Cold Spring Harbor Laboratory Press,Plainview,New York(1989))。應(yīng)用即用標記小珠(Ready to go labelling beads)(Pharmacia)制備AtT3和AtT24的隨機-引導的32P-標記的探針。圖3顯示了鼠耳芥探針T3(圖3a)和探針T24(圖3b)的DNA探針序列。在存在50％甲酰胺的情況下，在42℃進行雜交16小時(雜交緩沖液5xSSPE,2xDenhardts、0.5％(w/v)SDS、100μg/ml變性超聲的鮭魚精DNA,10％葡聚糖硫酸酯)。印跡在20℃1×SSC/0.5％SDS中清洗10分鐘，共兩次。在60℃0.1×SSC/0.5％SDS中進一步清洗10分鐘，兩次。在-80℃使印跡與具有MS強化濾光片的kodakMS膠片接觸在花序中檢測到兩種基因的最高表達。如上述用5μg花序poly(A)+mRNA構(gòu)建cDNA文庫。總共5x105在大腸桿菌XL1-Blue MRF’中的重組噬菌體在五個24cm×24cm方型平板上鋪板。噬斑生長直到鋪滿(8-10小時)，然后在20×22cm支持的硝基纖維素濾膜(Nitropure,MSI)進行影印，然后如Sambrook等(分子克隆實驗室指南。ColdSpring Harbor Laboratory press,Plainview,New York(1989))所述處理。如上述進行32P-標記的AtT3和AtT24探針的雜交。通過放射自顯影鑒定陽性噬斑，挖取噬斑中心，置于750μl SM緩沖液(50mMTris HCl pH7.5,100mM NaCl,10mM MgSO4,0.5％明膠)，重新篩選直到分離出噬斑-純克隆。應(yīng)用Stratagene’s Rapid Excision試劑盒進行質(zhì)粒拯救。對cDNA克隆進行測序，如上述進行重組蛋白質(zhì)在大腸桿菌中表達，GA 2-氧化酶活性的實驗。所述克隆的部分核苷酸和推測的氨基酸序列在圖5、6、7和8中顯示。
也在GenBank數(shù)據(jù)庫中檢測了與多花菜豆GA 2-氧化酶(PcGA2ox1)具有高度氨基酸等同性的第三種鼠耳芥屬基因組序列T31E10.11(AtGA2ox3)。其衍生的氨基酸序列分別與多花菜豆GA 2-氧化酶(PcGA2ox)、T3(AtGA2ox1)、和T24(AtGA2ox2)具有53％、49％和67％的等同性(67％、67％和84％的相似性)。T31的核苷酸序列在圖9中顯示，推測的氨基酸序列在圖10中顯示。實施例4．用有義和反義GA 2-氧化酶cDNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化鼠耳芥屬應(yīng)用下述寡核苷酸引物通過PCR擴增預(yù)測的2B27的編碼區(qū)5’-TGAGCTCAACCATGGTTGTTCTGTCTCAGC-3’(有義)，和5’-TGAGCTCTTAATCAGCAGCAGATTTCTGG-3’(反義)，它們各有一個插入其5’末端的SacI限制性位點。將PCR產(chǎn)物亞克隆到pCR2.1中，以便有利于如前述的DNA測序。用SacⅠ消化2B27編碼區(qū)，然后亞克隆到二元載體pLARS120的SacⅠ位點上，所述二元載體pLARS120是一種pGPTV-Kan的改進型(Becker等，植物分子生物學20 1195-1197(1992))，其中β-葡糖醛酸酶報告基因被來自pBI220的花椰菜花葉病毒35S啟動子取代(Jefferson,R.A.,植物分子生物學報告(Plant Mol Biol Rep)5 387-405(1987))。將DNA在35S啟動子的控制下插入有義方向。通過電穿孔將質(zhì)粒導入根瘤農(nóng)桿菌，然后通過真空滲入法轉(zhuǎn)化進鼠耳芥哥倫比亞栽培品種(ArabidopsisCV.Columbia)(Bechtold等，Compt.Rend.Acad.Sci.SerieⅢ-Sciences de la Vie-Life Science 316 1194-1199(1993))。同樣地，也將AtT3和AtT24的SacⅠ片段亞克隆到pLARS120中，除了在這兩種情況下，將DNA在35S啟動子的控制下插入反義方向。用這兩種反義構(gòu)建體如上述轉(zhuǎn)化鼠耳芥。實施例5(a)．GA 2-氧化酶在轉(zhuǎn)基因植物中改變的表達將有義方向的多花菜豆2-氧化酶cDNA(PcGA2ox1)和反義方向的鼠耳芥2-氧化酶cDNA插入載體pLARS120的CaMV 35S啟動子和nos終止子之間。載體pLARS120是一種用于由農(nóng)桿菌介導的植物轉(zhuǎn)化的二元載體除了CaMV 35S啟動子和nos終止子之外，T-DNA還含有nos啟動子之下的nptⅡ可選擇標記。載體來源于pGPTV-Kan(Becker等，植物分子生物學20 1195-1197(1992)),pGPTV-Kan中的uidA報告基因由35S啟動子替代。通過電穿孔將二元表達構(gòu)建體導入攜帶pAD1289質(zhì)粒的根瘤農(nóng)桿菌菌株GV3101，所述pAD1289質(zhì)粒使VirG超量表達。通過真空滲入法將它們導入鼠耳芥(Bechtold等，Compt.Rend.Acad.Sci.Serie iii-Sciences de la Vie-Life Science 3161194-1199(1993))。為了鑒定轉(zhuǎn)基因植物，將來自滲入的植物的種子在添加卡那霉素(50μg/ml)的MS平板中生長約14天，將抗性植物轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)料中。同時通過用轉(zhuǎn)化的根瘤農(nóng)桿菌感染葉盤，將含多花菜豆2-氧化酶構(gòu)建體的T-DNA導入Nicotiana sylvestris。
在CaMV 35S啟動子的控制下用多花菜豆GA 2-氧化酶cDNA轉(zhuǎn)化鼠耳芥屬植物產(chǎn)生下列結(jié)果。所有被檢查的轉(zhuǎn)化體半數(shù)以上表現(xiàn)某種程度的矮小，許多嚴重矮小，一些不能抽苔。圖11顯示矮小轉(zhuǎn)化植物與未表現(xiàn)表型(哥倫比亞生態(tài)型)的轉(zhuǎn)化植物相比的篩選照片。轉(zhuǎn)化體對GA3處理有應(yīng)答，導致增加的莖伸長和正常花形成，從而它可能夠獲得種子。多花菜豆GA 2-氧化酶cDNA在Nicotiana sylvestris中的超量表達導致植物莖高減少。一種轉(zhuǎn)化體不能抽苔或形成花，而同一年齡的未轉(zhuǎn)化植物已經(jīng)開花。實施例5(b)．GA 2-氧化酶在轉(zhuǎn)基因植物中的改變的表達得到五種35S-PcGA2ox1轉(zhuǎn)基因為純合的鼠耳芥品系。一種在野生型(哥倫比亞(Columbia))植物抽苔的同一時間抽苔，但莖高度較短，而其它四種在長(16小時)或短(10小時)光期下生長時，保留蓮座，不抽苔。一種嚴重矮小系不能產(chǎn)生純合子植物，甚至當存在GA3下種子發(fā)芽時，表明當存在兩拷貝所述基因時，該系的種子發(fā)育被損傷。嚴重矮小系擁有接近盤卷水平的小、暗色葉。當在長光期下它們形成花蕾，然而不能正常形成花，并且不結(jié)果。當植物在短光期下生長時，得不到花蕾。用10μM GA3處理轉(zhuǎn)基因系能夠使它們抽苔，產(chǎn)生結(jié)出能發(fā)芽的種子的正?；ā?br> 比較了嚴重矮小35A-PcGA2ox1系與野生型植物中C19-Gas的代謝。基于HPLC分析發(fā)現(xiàn)，矮小系比野生型更大程度地將GA1、GA4、GA9、和GA20轉(zhuǎn)化成2-氧化產(chǎn)物。矮小系不代謝GA3，確證了重組酶的結(jié)果，表明GA3不是GA 2-氧化酶的底物。因此，該GA可以用于，當需要時，逆轉(zhuǎn)由于GA 2-氧化酶基因超量表達產(chǎn)生的GA-缺陷。
35S-PcGA2ox1系的Northern印跡分析確證轉(zhuǎn)基因高水平表達。與野生型植物相比，35S-PcGA2ox1系的蓮座型葉叢中GA 20-氧化酶基因(AtGA2ox1)和3β-羥化酶(AtGA3ox1)基因的轉(zhuǎn)錄豐度提高，而天然GA 2-氧化酶(AtGA2ox2)的轉(zhuǎn)錄水平降低，這是GA穩(wěn)態(tài)的控制機制的結(jié)果。實施例6．鼠耳芥屬GA 2-氧化酶基因T3和T24(分別為AtGA2ox1和AtGA2ox2)的表達模式通過對從具有全長cDNA的不同組織中提取到的RNA進行探針Northern印跡分析，檢查了鼠耳芥GA 2-氧化酶基因T3和T24的表達模式。這些基因表現(xiàn)相似的表達模式，這兩種基因均在葉、下端莖、上端莖、花、和長角果中轉(zhuǎn)錄。花、長角果和上端莖中有高水平表達，它們的轉(zhuǎn)錄豐度以降序排列。T24，而不是T3，還在根中表達。GA3處理后，在GA-缺陷型鼠耳芥突變體，gal-2的未成熟花蕾和花梗中T3和T24的轉(zhuǎn)錄豐度增加，表明這些2-氧化酶基因的表達被GA上調(diào)。這與GA 20-氧化酶和3β-羥化酶基因的表達被GA下調(diào)形成對照。在所有組織中，T31的轉(zhuǎn)錄豐度比T3或T24低得多。通過RT-PCR檢測到花、上端莖和葉中有T31轉(zhuǎn)錄，而根或長角果中沒有。實施例7．來自多花菜豆和鼠耳芥的重組GA2-氧化酶的功能在存在雙加氧酶輔助因子的情況下，將重組蛋白質(zhì)與由C19-GA GA1、GA4、GA9和GA20，以及C20-GA GA12和GA15構(gòu)成的一系列14C-標記的GA底物一同保溫，檢查了重組蛋白質(zhì)的催化性質(zhì)，所述重組蛋白質(zhì)是通過將來自多花菜豆(PcGA2ox1)和鼠耳芥(AtGA2ox1、AtGA2ox2、和AtGA2ox3)的cDNA在大腸桿菌中表達得到的。這種最終化合物以其封閉內(nèi)酯形式和開放內(nèi)酯形式保溫。所有酶都沒有轉(zhuǎn)化GA12，而PcGA2ox1和AtGA2ox2將GA15轉(zhuǎn)化成單一產(chǎn)物。開放內(nèi)酯形式的GA15(20-羥基GA12)被AtGAox2轉(zhuǎn)化成同一產(chǎn)物，但比內(nèi)酯形式的效率低，而PcGA2ox1不轉(zhuǎn)化GA15開放內(nèi)酯。GA15的產(chǎn)物的質(zhì)譜與2β-羥基GA15的一致，盡管，因為得不到用于比較的真正化合物，對該產(chǎn)物的鑒定是暫行的。
C19-GA的重組酶的底物特異性比較(表1)表明GA9是PcGA2ox1、AtGA2ox1和AtGA2ox2的優(yōu)選底物。重組酶在其底物特異性上存在某些不同，PcGA2ox1和AtGA2ox3可以將GA4如GA9一樣有效地轉(zhuǎn)化，但對于AtGA2ox1和AtGA2ox2來說GA4是相對較差的底物。雖然AtGA2ox1和AtGA2ox2能夠使GA20比使GA4更有效地2β-羥基化，但與GA20保溫后，沒有檢測到GA29分解代謝物(catabolite)，而當GA4與PcGA2ox1、AtGA2ox2、和AtGA2ox3保溫后，得到低產(chǎn)量的GA34分解代謝物。重組PcGA2ox1、AtGA2ox2、和AtGA2ox3對GA9的2β-羥基化活性在pH6.5-8之間改變很小，而AtGA2ox1的該活性在pH7時達峰值，在pH≤5.9和≥8.1時未檢測到活性。
結(jié)果表明，作為生物活性化合物的即時前體的非3β-羥基C19-GA比活性GA本身是GA 2-氧化酶的更好底物。因此，GA 2-氧化酶基因的超量表達將導致產(chǎn)生非常低活性的GA。
表1重組GA 2-氧化酶對C19-GA底物的特異性
數(shù)值是將表達cDNA的大腸桿菌的細胞裂解物與14C-標記的GA底物和輔助因子共同保溫2.5小時后，對產(chǎn)物進行HPLC-放射性監(jiān)測得到的％產(chǎn)率。產(chǎn)物和底物通過HPLC分離，產(chǎn)物通過GC-MS鑒定。產(chǎn)物的合并產(chǎn)率＜100％，其余的是未轉(zhuǎn)化的底物。赤霉素(GA)的生物合成圖4顯示了赤霉素(GA)生物合成的兩個主要途徑，從GA12到GA4和從GA53到GA1。GA1和GA4是生物活性GA。GA12到GA9以及GA53到GA20的轉(zhuǎn)化被GA 20-氧化酶催化。GA9到GA4以及GA20到GA1的轉(zhuǎn)化由GA3β-羥化酶催化。GA9、GA4、GA20、和GA1均是GA 2-氧化酶的2β-羥化酶活性的底物，它們分別被轉(zhuǎn)化為GA51、GA34、GA29、和GA8。這些2β-羥化的GA可以被進一步氧化成相應(yīng)的分解代謝物。本發(fā)明表明來自多花菜豆的酶和來自鼠耳芥的兩種酶催化每一種底物2β-羥化。另外，本發(fā)明還表明當將多花菜豆酶和鼠耳芥酶的一種分別與GA9和GA4保溫后，形成GA51分解代謝物和GA34分解代謝物。
權(quán)利要求
1．一種編碼赤霉素2-氧化酶的分離的、純化的或重組的核酸序列，其包括圖1所示的核酸序列或其功能衍生物，或其互補鏈，或其同源序列。
2．如權(quán)利要求1的核酸序列，其編碼一種具有多花菜豆赤霉素2-氧化酶活性的酶。
3．如權(quán)利要求1的核酸序列，其編碼一種來自多花菜豆或鼠耳芥的赤霉素2-氧化酶。
4．如權(quán)利要求1-3任一的核酸序列，其中編碼序列有效地連接于啟動子。
5．如權(quán)利要求4的核酸序列，其中啟動子是一種組成型啟動子。
6．如權(quán)利要求4的核酸序列，其中啟動子在特定植物細胞中表達特異性的。
7．一種含有一種啟動子的分離的、純化的或重組的核酸序列，所述啟動子天然驅(qū)動編碼赤霉素2-氧化酶的基因表達，含有圖1所示的核酸序列或其功能衍生物，或其互補鏈，或其同源序列。
8．如權(quán)利要求7的核酸序列，其中赤霉素2-氧化酶是來自多花菜豆的赤霉素2-氧化酶(PcGA2ox1)。
9．如權(quán)利要求1-8任一的核酸序列，其中赤霉素2-氧化酶催化C19-赤霉素分子2β-氧化，在C-2引入羥基。
10．如權(quán)利要求9的核酸序列，其中赤霉素2-氧化酶進一步催化C-2位引入的羥基氧化，產(chǎn)生酮衍生物。
11．一種編碼核酶的核酸序列，所述核酶能夠特異性地剪切由赤霉素2-氧化酶基因編碼的RNA。
12．一種反義核酸序列，包括一種互補于至少部分的在編碼赤霉素2-氧化酶基因中被天然轉(zhuǎn)錄的DNA鏈的DNA的可轉(zhuǎn)錄鏈。
13．一種分離的、純化的、或重組的多肽，包括赤霉素2-氧化酶，具有如圖2所示氨基酸序列。
14．一種包含權(quán)利要求1-12任一的核酸序列的載體。
15．一種用權(quán)利要求1-12任一的核酸序列轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的宿主細胞。
16．一種含有權(quán)利要求1-12任一的核酸序列的植物細胞。
17．一種至少其某些細胞是權(quán)利要求16的細胞的植物或植物的一部分。
18．來自權(quán)利要求17的植物的繁殖材料。
19．權(quán)利要求1-12任一的核酸序列在制備植物中的用途。
20．權(quán)利要求19的用途，其中赤霉素2-氧化酶在植物中組成型地超量表達，從而降低了植物中生物活性赤霉素(GA)的濃度。
21．權(quán)利要求19的用途，其中在轉(zhuǎn)基因植物中內(nèi)源性GA 2-氧化酶基因的表達降低
全文摘要
提供了一種編碼赤霉素2－氧化酶基因的核酸序列,所述赤霉素2－氧化酶催化赤霉素分子2β－氧化,在C－2位引入羥基,并進一步催化C－2位引入的羥基氧化,產(chǎn)生酮衍生物。該序列可以應(yīng)用于制備赤霉素2－氧化酶水平改變的轉(zhuǎn)基因植物。
文檔編號C12N1/21GK1310761SQ99808839
公開日2001年8月29日 申請日期1999年6月11日 優(yōu)先權(quán)日1998年6月12日
發(fā)明者S·G·托馬斯, P·赫登, A·L·菲利普斯 申請人:布里斯托爾大學