酶混合物的制作方法

專利名稱：酶混合物的制作方法
技術領域：
本發明涉及新的微生物，新的酶和新的酶混合物。此外，本發明還涉及酶混合物的組合物，其制備及其在飼料、食品和造紙及紡織等其它產業中的用途。發明背景酶早已在工業上被用于不同的用途。例如食物發酵、制酒和果汁行業(酶在此用于降解果膠和β-葡聚糖)，紡織行業(在此，用纖維素酶獲取柔軟而光滑的纖維素纖維)，以及動物飼料。在此，酶提高植物源食物的消化率。
這最后一種用途使得家畜對飼料的消化更有效。飼料的價值可用FCR(飼料轉化率)衡量，這是一個飼料消耗量比動物體重增量的營養學比值。如果某飼料的FCR降低，說明相對于給定量的飼料，動物可增加更多的重量；即，動物的飼料利用效率更高。
飼料成分(淀粉、脂肪、蛋白質/氨基酸)難以消化被認為是谷類飼料，尤其是大麥或小麥含量高的飼料的特點。這時，必需配制包含由其它來源和其它補充成分(例如氨基酸)提供更高能量的飼料。這些酶可提高飼料中谷類的表觀可代謝能。
解決這一問題的另一方法是在谷類飼料中添加補充酶纖維素酶，內-1，3(4)-β-葡聚糖酶(β-葡聚糖酶)，內-1，4-β-木聚糖酶(木聚糖酶)等，或活性混合酶。酶添加劑可能具有水解谷類飼料(尤其是大麥和小麥)中β-葡聚糖或阿糖木聚糖的特殊作用。加酶有不同的目的。明確證明飼料酶添加劑作用的一個優點是降低了動物接受含合適酶添加劑飼料后腸內物的粘度。粘度高在一定程度上是因為大麥和小麥中的β-葡聚糖或阿糖基木聚糖。粘度因酶作用而降低使得營養成分更容易在腸中被吸收。另一個優點是釋放出了包裹在谷類細胞壁內的營養素，減少了對其它昂貴的飼料添加劑的需要。整體效果是在保持或提高FCR的同時，顯著降低了飼料成本。
現已用來自不同微生物的酶制劑提高飼料的消化率。
就與酶在動物飼料中的應用有關的現有技術而言，有歐洲專利0.699.762，它說明許旺酵母分泌植酸酶的用途。這種植酸酶來自經基因修飾而包含了某種克隆基因的微生物，這種克隆基因正是本發明所要避免的。
在專利申請WO95/26398中，將外源DNA序列引入宿主細胞，改變原菌株的特性，獲得一種修飾纖維素酶，所述的原菌株選自芽孢桿菌，鏈霉菌，酵母菌，裂殖酵母菌，曲霉菌。在本發明中，我們的主要目的是避免在生產酶的微生物中引入外源基因。
在專利申請WO96/05739中，從不同微生物獲得一種酶混合物(木聚糖酶、蛋白酶，和可選的β-葡聚糖酶)。作者例舉了木聚糖酶與β-葡聚糖酶活性之比為1∶5的酶混合物。已發現，當木聚糖酶在谷類飼料中的含量是或接近其最佳劑量時，共存的具有β-葡聚糖酶活性的酶提高飼料的FCR，這當然是不利的。所以，作者主張減少β-葡聚糖酶，推薦木聚糖活性與β-葡聚糖酶活性最大比為1∶0-0.25。
有時，為了保證與飼料用途相關的所有酶活性都存在，由不同的微生物制備酶制劑。許多情況下，酶制劑是由經重組DNA技術基因修飾過的微生物制備的。
我們發現并開發了一種新的索狀青霉菌類微生物，它含有新的酶和活性混合酶，主要可成功提高谷類動物飼料的消化率。發明概述所以，本發明涉及一種衍生自索狀青霉菌的新的微生物，和培養這種微生物并回收由其產生的酶的方法。
此外，本發明還提供由這種微生物分泌的新的酶，它們的核酸序列和含有這些酶的新的組合物。
本發明還提供提高谷類飼料和氨基酸的氨基酸消化率的方法。
本發明的另一主題是減少來自飼養動物的倉房的磷排放和氨排放。本發明的詳細說明A.新的索狀青霉菌菌株新的索狀青霉菌真菌菌株保藏于布達佩斯條約(1977)認可的國際保藏單位International Mycological Institute(IMI)，Bakeham Lane，Englefield Green，EghamSurrey，TW20 9TY，UK，保藏號為IMI378536。起源新的菌株來自IMI134756，經對孢子連續UV和β輻照后獲得，包括在選擇培養基上進行篩選。沒有用引入外源DNA或RNA的重組DNA技術造成任何基因修飾。鑒定和分類通過在Czapek Dox瓊脂上，25℃的生長來描述索狀青霉菌IMI378536。它具有索狀青霉菌典型的菌落特征和微生物形態。是索狀青霉菌的微生物鑒定已經得到了International Mycological Institute，Bakeham Lane，Englefield Green，Egham，Surrey，TW20 9TY，UK的確認。生長情況為根部堅硬，氣生部分呈繩狀或菌絲索，菌絲呈白色，基質內略泛紅色，邊緣蒼白，但是向中心變紅，可變為深紅色。這是典型的青霉菌，具有主要來自菌絲索，二輪生針狀產分生孢子細胞的短分生孢子梗，分生孢子呈橢圓形，外表光滑。
用于制備本發明酶制劑的微生物培養于有氧條件下，含纖維素、玉米浸泡液、碳酸鈣和硫酸銨的培養基中。B.發酵過程這種新真菌是通過首先在種子培養基中進行保藏株的發酵來生產的，所述的種子培養基宜包含(按重量計)玉米浸泡液 1％至4％消泡劑 足以避免發泡即可水 加至100％NaOH足以在培養基滅菌前將pH調節至約3.0至6.0培養溫度為27℃至36℃。
生產培養基的組成宜為(按重量計)玉米浸泡液 0％至4.0％分批加入的纖維素0.8％至14％鈣鹽0至0.8％硫酸銨 0至1.0％消泡劑 足以避免發泡即可水 補足至100％NaOH足以在培養基滅菌前將pH調節至3.0至6.0H2SO4足以將pH維持在約3.0至6.0液態或氣態氨足以將pH維持在約3.0至6.0培養溫度為27℃至36℃。
為了進行發酵，在發酵罐中加入足量的水，在適當攪拌的容器中，將各成分加入水中，攪拌至成分完全溶解。密封發酵罐，將內含物升溫至121℃，進行滅菌。用種子罐給發酵罐接種。
發酵過程中加入的主要碳源是纖維素；在各種不同的纖維素來源中，我們優選不同級別的ARBOCEL，SOLKAFLOC，CLAROCEL，ALPHACEL，FIBRACEL。
發酵的pH宜用硫酸或其它酸，和氣態或液態氨或其它堿來調節。
在發酵結束時，通過過濾或離心等固液分離來去除固體，收集液相，通過例如有機或金屬膜上的超濾來濃縮。
這些酶還可以用重組DNA技術來制造，由重組的同源或異源微生物產生。用編碼酶的基因轉化的宿主細胞可選自真菌、細菌或植物細胞。可用各種常規技術將編碼感興趣的酶的基因插入宿主細胞，例如用質粒(整合或非整合質粒)、噬菌體載體和病毒載體。含有異源基因插入，或因同源基因的插入、缺失或修飾而致基因組被修飾的索狀青霉菌也屬于本發明的內容。
根據本發明，提供的酶可以是分離后的純酶制劑，也可以是作為培養索狀青霉菌的培養基的粗制劑。
含酶組合物中還可以包含一種其它酶，其類型取決于組合物的用途。所加的酶選自例如糖酶、脂酶和蛋白酶。C.混合酶活性組合物1.液體組合物就液體組合物而言，在加入抗生素后，測定酶濃度，并將稀釋度校正到產物強度(product strength)。
按重量計，液體組合物較好的組成是作為總有機固體的微生物產物4％-10％抗生素0.005％-0.35％，以0.01％-0.25％為佳山梨醇20％-50％防凍劑0-40％，15％-40％更好濃縮的過濾后發酵液15％-40％加緩沖液，調節至pH3至5抗生素選自山梨酸和鹽，苯甲酸和鹽，4-羥基苯甲酸甲酯和4-羥基苯甲酸正丙酯，富馬酸、鹽和酯。也可使用氯化鈉或氯化鉀等鹽。
最好的防凍劑是1，2-丙二醇，乙二醇，甘油。2.粉末組合物要得到粉末制劑，可在填料存在下干燥濃縮液。無填料存在下干燥濃縮液所得的粉末可進一步與合適的填料混合。
較好的粉末形式的組成是作為總有機固體的微生物產物16％-40％運載體59％-83％其它干燥的發酵液成分 1％較好的填料選自小麥粉，淀粉，生石膏，麥芽糊精，玉米漿，和玉米渣、粗麥粒、麥麩、黑麥渣等谷類加工副產物。
我們得到一種由索狀青霉菌產生的新的酶混合物。這種酶混合物含有例如纖維素酶，β-葡聚糖酶，木聚糖酶，呋喃阿糖苷酶和阿魏酰基酯酶等木聚糖酶輔酶等新酶。1.過程用試驗來描述酶制劑的特征，這包括測試纖維素酶、纖維二糖水解酶(cellobiohydrolase)、β-葡糖苷酶、內-1，3(4)-β-葡聚糖酶、昆布糖酶、內-1，4-β-木聚糖酶(利用不同的底物)、β-木糖苷酶、呋喃阿糖苷酶和阿魏酰基酯酶(利用不同的底物)活性。1.1.用DNS CMC測定纖維素酶根據羧甲基纖維素(CMC)(β-1，4-葡聚糖)內糖苷鍵的酶水解檢測纖維素酶活性。根據反應后還原值(成為葡萄糖)的升高檢定反應產物β-1，4-葡聚糖寡糖。
含1ml 1％(v/v)CMC的0.1M乙酸鈉緩沖液pH5.0(或其它pH值)溶液；1ml適當稀釋的酶溶液50℃孵育10分鐘。加2ml DNS溶液(1％(w/v)3，5-二硝基水楊酸，1.6％(w/v)氫氧化鈉，30％(w/v)酒石酸鉀鈉溶于蒸餾水)終止酶反應。攪拌溶液，置于至少95℃的沸水浴中，5分鐘后冷卻至25℃。溶液中加10ml蒸餾水，用路徑長度2cm的玻璃比色杯測定540nm處的吸光度。
與以同樣方式用DNS溶液處理的2ml 0.00-0.04％(w/v)葡萄糖溶液的標準曲線比較，轉換成μmole還原糖(例如葡萄糖)。
對測得的酶反應液吸光度進行非特異性吸光度校正，為此，反應時DNS溶液在酶溶液之前加入。1單位纖維素酶活性定義為在試驗條件下(50℃，pH5.0或其它pH)，每分鐘產生1μmole葡萄糖或其它還原糖的酶量。1.2.用對硝基苯基β-D-吡喃纖維二糖苷法測定纖維二糖水解酶根據對硝基苯基β-D-吡喃纖維二糖苷的酶水解檢測纖維二糖水解酶。用比色法測定反應產物，對硝基苯酚。
含1ml 0.1％(w/v)對硝基苯基β-D-吡喃纖維二糖苷的蒸餾水溶液；1ml蒸餾水；1ml 0.2M乙酸鈉緩沖液，pH5.0；1ml適當稀釋的酶溶液在50℃孵育30分鐘。加4ml 0.4M甘油溶液終止酶反應。攪拌溶液并冷卻至20℃。用路徑長度1cm的玻璃比色杯測定400nm處的吸光度。
通過與上述條件下對硝基苯酚的摩爾濃度延伸系數比較，將結果轉換成μmole對硝基苯酚。
對測得的酶反應液吸光度進行非特異性吸光度校正，為此，反應時甘油溶液在酶溶液之前加入。1單位纖維二糖水解酶酶活性定義為在試驗條件下(50℃，pH5.0)，每分鐘由對硝基苯基β-D-吡喃纖維二糖苷產生1μmole對硝基苯酚所需的酶量。1.3.用對硝基苯基β-吡喃葡萄糖苷法測定β-葡萄糖苷酶根據對硝基苯基β-吡喃葡萄糖苷的酶水解測定β-葡萄糖苷酶活性。用比色法檢定反應產物對硝基苯酚。
含1ml 0.1％(w/v)對硝基苯基β-吡喃葡萄糖苷蒸餾水溶液；1ml蒸餾水；1ml0.2M乙酸鈉緩沖液，pH5.0；1ml適當稀釋的酶溶液在50℃孵育30分鐘。加4ml0.4M甘油溶液終止酶反應。攪拌溶液并冷卻至20℃。用路徑長度1cm的玻璃比色杯測定400nm處的吸光度。
通過與上述條件下對硝基苯酚的摩爾濃度延伸系數比較，將結果轉換成μmole對硝基苯酚。
對測得的酶反應液吸光度進行非特異性吸光度校正，為此，反應時甘油溶液在酶溶液之前加入。1單位β-葡萄糖苷酶活性定義為在試驗條件下(50℃，pH5.0)，每分鐘由對硝基苯基β-D-吡喃葡萄糖苷產生1μmole對硝基苯酚的酶量。1.4.用DNS大麥β-葡聚糖法測定內-1，3(4)-β-葡聚糖酶根據大麥β-葡聚糖(一種β-1，3(4)-葡聚糖)內糖苷鍵的酶水解測定內-1，3(4)-β-葡聚糖酶活性。根據反應后還原值(葡萄糖)的升高檢定反應產物β-1，3(4)-葡聚糖寡糖。
含1ml 0.1％(w/v)大麥β-葡聚糖的0.1M乙酸鈉緩沖液，pH5.0(或其它pH值)溶液；1ml適當稀釋的酶溶液在50℃孵育10分鐘。加2ml DNS溶液(1％(w/v)3，5-二硝基水楊酸，1.6％(w/v)氫氧化鈉，30％(w/v)酒石酸鉀鈉溶于蒸餾水)終止酶反應。攪拌溶液，置于至少95℃的沸水浴中，5分鐘后冷卻至25℃。溶液中加10ml蒸餾水，用路徑長度2cm的玻璃比色杯測定540nm處的吸光度。
與以同樣方式用DNS溶液處理的2ml 0.00-0.04％(w/v)葡萄糖溶液的標準曲線比較，將結果轉換成μmole還原糖(例如葡萄糖)。
對測得的酶反應液吸光度進行非特異性吸光度校正，為此，反應時DNS溶液在酶溶液之前加入。1單位內-1，3(4)-β-葡聚糖酶活定義為在試驗條件下(50℃，pH5.0或其它pH)，每分鐘產生1μmole葡萄糖或其它還原糖的酶量。1.5.用偶氮大麥β-葡聚糖法測定內-1，3(4)-β-葡聚糖酶根據大麥β-葡聚糖的酶水解測定內-1，3(4)-β-葡聚糖酶活性，這種大麥葡聚糖含有一個生色基團(偶氮大麥β-葡聚糖)。根據反應后590nm處吸光度的升高檢定反應產物，這是一種在乙醇沉淀后可溶的寡聚物。
含0.5ml偶氮大麥β-葡聚糖底物(即用型)和0.2ml酶稀釋液(在0.01M乙酸鈉緩沖液，pH4.6中含0.15至0.60單位/ml)的溶液在30℃孵育20分鐘。加2.5ml沉淀溶液(18.1g乙酸鈉和3.0g鋅混合于300ml蒸餾水，用鹽酸將pH調至5.0，轉移到燒杯中，用96％的乙醇定容)終止酶反應。攪拌溶液，并在室溫下靜置10分鐘。將溶液轉移到離心管中，在臺式離心機上以1000g離心10分鐘。用路徑長度1cm的玻璃比色杯測定上清液在590nm處的吸光度。
對測得的酶反應液吸光度進行非特異性吸光度校正，為此，反應時沉淀溶液在酶溶液之前加入。1單位內-1，3(4)-β-葡聚糖酶活定義為在試驗條件下(30℃，pH4.6)，用標準底物，底物水解使得590nm吸光度為0.820單位所需的酶量。1.6.用DNS昆布糖法測定昆布糖酶(內-1，3-β-葡聚糖酶)根據昆布糖(一種β-1，3-葡聚糖)內糖苷鍵的酶水解檢測昆布糖酶(內-1，3-β-葡聚糖酶)活性。根據反應后還原值(葡萄糖)的升高檢定反應產物β-1，3-葡聚糖寡糖。
含1ml 1％(w/v)昆布糖的0.1M乙酸鈉緩沖液，pH5.0溶液；1ml適當稀釋的酶溶液在50℃孵育10分鐘。加2ml DNS溶液(1％(w/v)3，5-二硝基水楊酸，1.6％(w/v)氫氧化鈉，30％(w/v)酒石酸鉀鈉溶于蒸餾水)終止酶反應。攪拌溶液，置于至少95℃的沸水浴中，5分鐘后冷卻至25℃。溶液中加10ml蒸餾水，用路徑長度2cm的玻璃比色杯測定540nm處的吸光度。
與以同樣方式用DNS溶液處理的2ml 0.00-0.04％(w/v)葡萄糖溶液的標準曲線比較，將結果轉換成μmole還原糖(例如葡萄糖)。
對測得的酶反應液吸光度進行非特異性吸光度校正，為此，反應時DNS溶液在酶溶液之前加入。1單位昆布糖酶活定義為在試驗條件下(50℃，pH5.0)，每分鐘產生1μmole葡萄糖或其它還原糖的酶量。1.7.用DNS樺木木聚糖法測定內-1，4-β-木聚糖酶根據樺木木聚糖即β-1，4-木聚糖內木聚糖苷鍵的酶水解檢測內-1，4-β-木聚糖酶活性。根據反應后還原值(例如木聚糖)的升高檢定反應產物β-1，4-木聚糖寡糖。
含1ml 1％(w/v)樺木木聚糖0.1M乙酸鈉緩沖液，pH5.0(或其它pH)溶液；1ml適當稀釋的酶溶液在50℃孵育10分鐘。加2ml DNS溶液(1％(w/v)3，5-二硝基水楊酸，1.6％(w/v)氫氧化鈉，30％(w/v)酒石酸鉀鈉溶于蒸餾水)終止酶反應。攪拌溶液，置于至少95℃的沸水浴中，5分鐘后冷卻至25℃。溶液中加10ml蒸餾水，用路徑長度2cm的玻璃比色杯測定540nm處的吸光度。
與以同樣方式用DNS溶液處理的2ml 0.00-0.03％(w/v)木聚糖溶液的標準曲線比較，將結果轉換成μmole還原糖(木聚糖)。
對測得的酶反應液吸光度進行非特異性吸光度校正，為此，反應時DNS溶液在酶溶液之前加入。1單位內-1，4-β-木聚糖酶活定義為在試驗條件下(50℃，pH5.0或其它pH)，每分鐘產生1μmole木聚糖或其它還原糖的酶量。1.8.用DNS小麥阿糖木聚糖法測定內-1，4-β-木聚糖酶根據小麥阿糖木聚糖即阿糖取代的β-1，4-木聚糖內木聚糖苷鍵的酶水解檢測內-1，4-β-木聚糖酶活性。根據反應后還原值(例如木聚糖)的升高檢定反應產物阿糖-β-1，4-木聚糖寡糖。
含1ml 1％(w/v)小麥阿糖木聚糖0.1M乙酸鈉緩沖液，pH5.0(或其它pH)溶液；1ml適當稀釋的酶溶液在50℃孵育10分鐘。加2ml DNS溶液(1％(w/v)3，5-二硝基水楊酸，1.6％(w/v)氫氧化鈉，30％(w/v)酒石酸鉀鈉溶于蒸餾水)終止酶反應。攪拌溶液，置于至少95℃的沸水浴中，5分鐘后冷卻至25℃。溶液中加10ml蒸餾水，用路徑長度2cm的玻璃比色杯測定540nm處的吸光度。
與以同樣方式用DNS溶液處理的2ml 0.00-0.03％(w/v)木聚糖溶液的標準曲線比較，將結果轉換成μmole還原糖(木聚糖)。
對測得的酶反應液吸光度進行非特異性吸光度校正，為此，反應時DNS溶液在酶溶液之前加入。1單位內-1，4-β-木聚糖酶活定義為在試驗條件下(50℃，pH5.0或其它pH)，每分鐘產生1μmole木聚糖或其它還原糖的酶量。1.9.用DNS小麥阿糖木聚糖粘度法測定內-1，4-β-木聚糖酶根據標準小麥阿糖木聚糖溶液的酶水解檢測內-1，4-β-木聚糖酶活性。根據相對粘度隨時間降低檢定所述活性。
將含1ml，1％(w/v)小麥阿糖木聚糖的0.1M乙酸鈉緩沖液，pH5.5(或其它pH)溶液；3ml蒸餾水和1ml適當稀釋的酶溶液注入Haake微量粘度計中(使用標定到0.1-2.0mPa.s的金球)，在30℃，在15至20分鐘的時間內，每隔30秒測定一次球的落下時間(T測試)。分別測定水(5m蒸餾水)和底物(1ml，1％(w/v)小麥阿糖木聚糖的0.1M乙酸鈉緩沖液，pH5.5(或其它pH)溶液；4ml蒸餾水)的平均落球時間，即T水和T底物。用同樣的方式測定對照。如下計算相對流度(Fr)
計算Fr對時間(每次測定T測試時已經過的時間)圖中的斜率，即每分鐘的相對流度改變(ΔFr.min-1)，它與酶濃度成正比。一單位內-1，4-β-木聚糖酶活性定義為在試驗條件下(30℃，pH5.5或其它pH)每分鐘通過水解底物使得溶液的相對流度改變1(無量綱單位)的酶量。1.10.用對硝基苯基β-D-吡喃木糖苷法測定β-木糖苷酶根據對硝基苯基β-D-吡喃木糖苷的酶水解測定β-木糖苷酶。用比色法檢定反應產物對硝基苯酚。
含1ml 1％(w/v)對硝基苯基β-D-吡喃木糖苷蒸餾水溶液；1ml蒸餾水；1ml0.2M乙酸鈉緩沖液，pH5.0；1ml適當稀釋的酶溶液在50℃孵育30分鐘。加4ml0.4M甘油溶液終止酶反應。攪拌溶液，并冷卻至20℃。用1cm路徑長度的玻璃比色杯測定400nm處的吸光度。
與相同條件下對硝基苯酚的摩爾濃度延伸系數比較，將結果轉化為μmole對硝基苯酚。
對測得的酶反應液吸光度進行非特異性吸光度校正，為此，反應時甘油在酶溶液之前加入。一單位木糖苷酶活性定義為在試驗條件下(50℃，pH5.0)每分鐘由對硝基苯基β-D-吡喃木糖苷產生1μmole對硝基苯酚的酶量。1.11.用對硝基苯基α-L-呋喃阿糖苷法測定α-N-呋喃阿糖苷酶根據對硝基苯基α-L-呋喃阿糖苷的酶水解測定α-N-呋喃阿糖苷酶(呋喃阿糖苷)。用比色法檢定反應產物對硝基苯酚。
含1ml 1％(w/v)對硝基苯基α-L-呋喃阿糖苷蒸餾水溶液；1ml蒸餾水；1ml0.2M乙酸鈉緩沖液，pH5.0；1ml適當稀釋的酶溶液在50℃孵育30分鐘。加4ml0.4M的甘油溶液終止酶反應。攪拌溶液，并冷卻至20℃。用1cm路徑長度的玻璃比色杯測定400nm處的吸光度。
與相同條件下對硝基苯酚的摩爾濃度延伸系數比較，將結果轉化為μmole對硝基苯酚。
對測得的酶反應液吸光度進行非特異性吸光度校正，為此，反應時甘油溶液在酶溶液之前加入。一單位呋喃阿糖苷酶活性定義為在試驗條件下(50℃，pH5.0)每分鐘由硝基苯基α-L-呋喃阿糖苷產生1μmole對硝基苯酚的酶量。1.12.FAXX法測定阿魏酰基酯酶根據O-[5-O-(反-阿魏酰基)-α-L-呋喃阿糖基]-(1→3)-O-β-D-吡喃木糖基-(1→4)-D-吡喃木糖(FAXX)的酶水解測定阿魏酰基酯酶(阿魏酸酯酶)。FAXX由小麥麩皮水解制得，用NMR純化并描述其特征。用分光光度法測定FAXX的水解。
在325nm處跟蹤酶反應，用路徑1cm的測定比色杯，含0.050mM FAXX的0.1M MOPS緩沖液，pH6.0溶液，37℃。
FAXX的一個單位阿魏酰基酯酶活性定義為在試驗條件下(37℃，pH65.0)每分鐘將1μmole底物轉化成產物所需的酶量。1.13.Ara2F法測定阿魏酰基酯酶根據Ara2F(在1，2位與阿拉伯糖連接的阿魏酸)的酶水解測定阿魏酰基酯酶(阿魏酸酯酶)。由甜菜瓤酶水解制備Ara2F，NMR純化并描述特征。用分光光度法測定Ara2F的水解。
在325nm處跟蹤酶反應，用路徑1cm的比色杯，含0.050mM Ara2F的0.1MMOPS緩沖液，pH6.0溶液，37℃。
一單位阿魏酰基酯酶活性定義為在試驗條件下(37℃，pH6.0)每分鐘將1μmole底物轉化為產物的酶量。1.14.根據以下甲酯的水解測定阿魏酰基酯酶阿魏酸甲酯(MFA)；血凝酸甲酯(MCA)；芥子酸甲酯(MSA)；對香豆酸甲酯(MpCA)根據阿魏酸甲酯(MFA)，血凝酸甲酯(MCA)，芥子酸甲酯(MSA)，對香豆酸甲酯(MpCA)的酶水解測定阿魏酰基酯酶(阿魏酸酯酶)。在0.1M MOPS緩沖液中，pH6.0，37℃測定甲酯的水解。試驗以兩種不同的技術為基礎。
在分光光度法中，甲酯底物的濃度是0.10mM，用路徑1cm的比色杯在325nm處跟蹤酯水解。該方法中底物的初始濃度是限定的。
在HPLC中，甲酯底物的濃度是1.0mM，用HPLC以10-30分鐘的間隔測定游離酸的釋放來跟蹤酯水解。該方法對底物濃度沒有限定，所以，測得的活性比分光光度法測得的高。
一單位阿魏酰基酯酶活性定義為在試驗條件下(37℃，pH6.0)每分鐘將1μmole底物轉化為產物的酶量。1.15.用改良Bradford考馬斯藍結合蛋白試驗測定蛋白質濃度根據改良Bradford考馬斯藍結合蛋白試驗測定蛋白質濃度，用Brilliant藍G(考馬斯藍)，用路徑1cm的玻璃比色杯在分光光度計中測定595處的吸光度。用牛血清白蛋白(Sigma P 0914)將該方法(Sigma B 6916)標準化。1.16.用等電點聚焦法測定等電點在NOVEXXCell IITMMini-Cell中，使用NOVEXpH3-10(pI3.5-8.5)或pH3-7(pI3.0-6.5)的預制5％垂直聚丙烯酰胺凝膠用標準法測定蛋白質的等電點。使用NOVEX陽極和陰極，pH3-10或pH3-7的IEF樣品緩沖液。使用NOVEX的等電點聚焦、固定、考馬斯R-250藍染色和脫色標準方法。1.17.SDS-PAGE(十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳)用SDS-PAGE標準法進行蛋白質的分析分離和分子量測定。在NOVEXXCell IITMMini-Cell中使用預制NOVEXNuPAGETM凝膠(NuPAGETM雙Tris凝膠或NuPAGETMTris乙酸凝膠，并使用NOVEX推薦的電泳緩沖液)。使用的是NOVEX的樣品制備和電泳緩沖液，以及分子量標準物。使用NOVEX的SDS-PAGE、固定、考馬斯R-250藍染色和脫色標準方法。2.有關酶混合物的結果2.1.最適pH2.1.1.內-1，3(4)-β-葡聚糖酶的活性用DNS大麥β-葡聚糖法，在50℃的標準條件下進行索狀青霉菌內-1，3(4)-β-葡聚糖酶試驗。測定pH3.0至pH7.0之間的酶活性。酶活性的最適pH在pH4.0-5.0。<
2.1.2.內-1，4-β-木聚糖酶活性用DNS樺木木聚糖法，在50℃的標準條件下進行索狀青霉菌內-1，4-β-木聚糖酶試驗。
2.2.最適溫度2.2.1.內-1，3(4)-β-葡聚糖酶的活性用DNS大麥β-葡聚糖法，在pH5.0(該酶的最適pH)的標準條件下進行索狀青霉菌內-1，3(4)-β-葡聚糖酶試驗。測定30℃至70℃之間的酶活性。酶活性的最適溫度在50至60℃之間，60℃時的酶活性最高。以下溫度與活性表給出了詳細的結果。
2.1.2.內-1，4-β-木聚糖酶活性用DNS樺木木聚糖法，在pH5.5和pH3.5的標準條件下進行索狀青霉菌內-1，4-β-木聚糖酶試驗。測定30℃至70℃之間的酶活性。酶活性的最適溫度在50℃至60℃之間，pH5.5時50℃的酶活性最高，pH3.5時，60℃的酶活性最高。以下溫度與活性表給出了詳細的結果
活性。此外，它們還具有高水平的內-1，4-β-木聚糖酶和木聚糖酶輔酶活性。半纖維素水解酶(hemicellulolytic)的廣譜性是該微生物的酶制劑的特征之一。
被測的每種酶活性都可以表示為與制劑主活性的比例。表A是所得結果的一實例。這些比例可能隨不同的發酵批次而不同。
表A對不同底物的相對活
3-酶混合物中各組分的特性3.1.純化方法疏水層析將發酵培養基過濾濃縮，得到蛋白質濃度為112.6mg/ml的制劑，用疏水層析(HIC)緩沖液(50mM磷酸緩沖液，pH7.0/1.7M(NH4)2SO4/0.04％疊氮鈉)進行1/1稀釋，交換到HIC緩沖液中(PD-10柱；Pharmacia)。每份10ml上樣在PhenylSepharoseTM高效HIC凝膠柱(10×5cm直徑，200ml)(Pharmacia)上，用還原性硫酸銨((NH4)2SO4)濃度梯度(1.7-0.0M)分離，速度為10ml/min。收集流份(10ml)，測定木聚糖酶活性。
HIC產生2個木聚糖酶活性峰。第一個稱A峰，當(NH4)2SO4濃度減低到0.6M時從柱上洗脫，第二個稱B峰，約在(NH4)2SO4濃度為0.25M時洗脫。分別合并各次注入樣品后含A峰和B峰的流份。按總計，流份A相當于總木聚糖活性的2.8％，流份B相當于97.2％。得率為77％。離子交換層析沉淀HIC中A峰和B峰的合并流份將(NH4)2SO4濃度提高到100％飽和，然后離心(10,000×g，30分鐘)。沉淀重溶于20mM Tris-HCl緩沖液，pH8.0/0.04％疊氮鈉中，用PD-10柱脫鹽到同一緩沖液中。MonoQTMHR10/10陰離子交換柱(Pharmacia)事先以20mM Tris-HCl緩沖液，pH8.0/0.04％疊氮鈉平衡，上樣5ml，在同一緩沖液中逐步升高氯化鈉濃度(NaCl(0-1M))以2ml/min的速度洗脫。收集流份(2ml)，測定木聚糖活性。
A峰陰離子交換層析分離的A峰產生木聚糖酶活性單峰，在0.3M NaCl時洗脫。合并活性最高的流份，進行SDS-PAGE分析(十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳)。產生一條分子量48kDa的主帶。IEF(等電點聚焦)后回收木聚糖酶活性證實這一被考馬斯藍染色的主帶是木聚糖酶。
B峰陰離子交換層析分離的B峰產生2個木聚糖酶活性主峰，一個在純水中洗脫(不結合的物質；B-I峰)，另一個在0.1M NaCl時洗脫(B-II峰)。在0.13M和0.19MNaCl時還洗出2個副峰。合并對應于各峰的活性流份，進行SDS-PAGE分析，這些樣品都不純。
凝膠過濾層析將含B-I和B-II的合并流份冷凍干燥，重溶于水，脫鹽(用PD-10柱)。將樣品(0.2ml)上樣在SuperdexTM75HR柱(Pharmacia)上，用20mM Bis-Tris緩沖液，pH6.0/0.2M NaCl/0.04％疊氮鈉洗脫。收集流份(0.4ml)，分析木聚糖酶活性。3.2.木聚糖酶的性質3.2.1.用等電點聚焦法測定等電點用標準方法，使用pH3-10和pH3-7的NOVEX預制5％垂直聚丙烯酰胺凝膠板測定蛋白質的等電點。使用NOVEX陽極、陰極和IEF樣品緩沖液，等電點聚焦、固定、考馬斯R-250藍染色和脫色的標準方法。
就木聚糖酶A而言，在MonoQ之后使用一份樣品。就木聚糖酶B-I和B-II而言，在HIC和木聚糖B之后使用一份樣品。就A和B分別而言，將一小份樣品(10μl)加入一格中，將一大份(50μl)樣品加入3格。樣品聚焦后，凝膠對半切開，使得其中一半包含兩個小份樣品(A+B)和分子量標記(這一半用考馬斯藍染色)，另一半包含兩個大份樣品。切割含大份樣品的那一半凝膠將兩樣品泳道分開，然后分別將兩泳道分成2mm的片。分別將2mm的片在100mM MOPS緩沖液、pH6.0/0.04％疊氮鈉中浸泡過夜。測試各小片的木聚糖酶活性。
就木聚糖酶A樣品而言，染色后的IEF凝膠展示對應pI3.55標記物的一條主帶和一些含量甚微的條帶。只有對應于主帶的部分測得了木聚糖酶活性，證明這是木聚糖酶主帶。
就木聚糖酶B樣品而言，染色后的IEF凝膠展示一定pl范圍內的數條條帶。未染色的凝膠上的兩份部分凝膠中測到了木聚糖酶活性，這兩部分對應于pI4.2和4.8。3.2.2.SDS-PAGE測定分子量為了確認HIC B峰中木聚糖酶的分子量，將從IEF凝膠上洗脫的具有木聚糖酶活性的部分脫鹽、冷凍干燥和SDS-PAGE分離。用10％Tris-甘油凝膠(NOVEX)進行變性PAGE，在樣品緩沖液中加入二硫蘇糖醇(DTT50mM)作為還原劑。
染色后的凝膠顯示，分子量36kDa和15kDa的木聚糖酶B-I和木聚糖酶B-II都是純的。
對純化后的以下三種木聚糖酶進行SDS-PAGE分析陰離子交換層析后的木聚糖酶A，凝膠過濾層析后的木聚糖酶B-I和木聚糖酶B-II。木聚糖酶A呈現一條分子量48kDa的條帶。考馬斯染色后，木聚糖酶B-I呈現1條主帶和4條副帶。經確認，主帶是木聚糖酶，因為它的分子量為36kDa。據估計，純度為90％。木聚糖酶B-II呈現1條分子量15kDa的主帶和2-3條副帶。這種木聚糖酶的純度約為95％。
3.2.3.酶活性酶活性的測試已在先前說明過了。
3.2.3.1.木聚糖酶A的測試[蛋白質]0.4(mg/ml)
nd未測定n/a不適用木聚糖酶對樺木木聚糖的活性與pH
es>3.2.3.2.木聚糖酶B-I的分析[蛋白質]0.096(mg/ml)<
>nd未測定n/a不適用木聚糖酶對樺木木聚糖的活性與pH<
>3.2.3.3.木聚糖酶B-II的分析[蛋白質]0.165(mg/ml
nd未測定n/a不適用木聚糖酶對樺木木聚糖的活性與pH
3.2.4.序列本發明的實施例之一是關于上述蛋白質及其變異體的氨基酸和核酸序列。
為此，根據純化蛋白(木聚糖酶A，木聚糖酶B-I和木聚糖酶B-II)的氨基酸序列和與已知真菌木聚糖酶氨基酸序列及核苷酸序列的比較來確定各木聚糖酶的序列。
在本發明中，變異體應理解成指，具有相同于天然蛋白或多肽的生物活性的各種蛋白類似物、蛋白質片段、天然蛋白或多肽的衍生或突變蛋白。不同的變異體可以不同的自然狀態存在。所述的變體可能是等位變體，特征在于編碼所述蛋白的基因序列內的差異，或者來自差異剪接或轉導后修飾。變體可通過取代、缺失、添加和/或修飾一個或多個氨基酸得到。所述的修飾都是本領域技術人員熟知并可根據標準方法予以實施的。
變體即具有(例如)更高的底物親合性或新的生物特性的分子。
本發明的另一目的是在單細胞或多細胞生物宿主細胞內用序列表達在此揭示的蛋白質或多肽。為此，可將所述序列結合到載體的基因組內。所述載體可以是質粒、噬菌體或病毒。因此，本發明的另一實施例是分離自單細胞或多細胞生物，并用所述載體轉染或感染的宿主細胞。在優選實施例中，宿主細胞是細菌。
用含所述蛋白質的核酸序列的所述載體在各種宿主細胞內表達所述蛋白是本發明的另一實施例。3.2.4.1.木聚糖酶C的序列探針的制備是根據已知真菌木聚糖酶氨基酸序列及核苷酸序列的比較。檢定出保守區域，用于設計PCR引物，產物被用來篩選索狀青霉菌的基因組文庫。
制備了兩對簡并引物。第一對被設計成由B型(或2型)木聚糖酶基因擴增200bp(大約)的產物。第二對設計用來由A型(或1型)木聚糖酶基因擴增250bp的產物。
引物3和4產生一條258bp的條帶。克隆到pGEMT內并測序后發現，該條帶與A/1型真菌木聚糖酶具有顯著的序列相似性。含有該克隆產物的質粒命名為pPFXYLA。
圖1和SEQ IN NO1顯示了木聚糖酶C的完整序列。3.2.4.2.木聚糖酶BI的序列用內部氨基酸序列，并與其他真菌纖維二糖水解酶進行序列排列對比來設計簡并PCR引物(SEQ ID NO.2和3)。擴增得到290bp的產物(SEQ ID NO.4)，克隆到pGEMT(Promega)內產生pGEMTCB2，然后測序。如圖2所示，引物序列加了下劃線。該PCR產物目前被用作探針篩選索狀青霉菌IMI134756基因組文庫。3.2.4.3.木聚糖酶BII的序列木聚糖酶BII基因的完整序列包括1.3kb的5’非翻譯上游區和0.85kb的3’非翻譯區，一個54bp內含子和編碼一個223氨基酸蛋白質的669bp。
用逆轉錄PCR(RT-PCR)證明54bp內含子的存在。由索狀青霉菌IMI-134756的菌絲體分離總RNA，菌體是在1％(w/v)燕麥木聚糖上生長4天后收獲的。引物設計成用來由信使RNA擴增多至195bp片段(基因組DNA的249bp)和433bp片段(基因組DNA的487bp)。
測定質粒(pPFXYNC2，3’末端的3kb序列揭示了一個基因(稱為perA)，其中含有兩個推定內含子，編碼一個約570氨基酸的多肽。該多肽與真菌氨基酸透酶具有顯著的序列相似性。3.2.4.4.木聚糖酶A的序列測得木聚糖酶A的內序列，其氨基酸序列為AEAINYNQDY3.3.阿魏酰基酯酶的特征3.3.1.純化實施過程與木聚糖酶的相同。
酶混合物包含至少兩種不同的阿魏酰酯酶。其中一種(FaeB)質譜測定的分子量為38,945-41,051Da(根據一級氨基酸序列為35,450Da，SDS-PAGE測得的是37Da)。FaeB的pI為4.2，它是一種B型阿魏酰酯酶，對MpCA和Ara2F底物具有特異性(對MpCA、MCA、MFA和Ara2F有活性；但對MSA和FAXX沒有活性)。
另一阿魏酰酯酶(FaeA)的分子量為29kDa(由SDS-PAGE測得)。FaeA的pI為4.65，它是一種A型阿魏酰酯酶，對FAXX和MSA底物具有特異性(對MSA、MCA、MFA和FAXX具有活性，但對MpCA和Ara2F沒有活性)。
3.3.2.等電點聚焦法測定等電點用標準方法測定蛋白質的等電點。將酶混合物上樣在IEF凝膠上成一寬帶(約20mm)，低溫(5℃)電泳。在聚焦和條帶清晰化后，在樣品泳道的中部切下凝膠。用標準方法將樣品泳道的一半和IEF標準物固定，染色，脫色。將另一半泳道切成2mm的切片，都在1ml 100mM MOPS緩沖液，pH6.0中浸泡過夜。用MFA、MpCA和MSA底物測定各凝膠切片的阿魏酰酯酶活性。
染色后的IEF凝膠顯示有許多纖維素酶蛋白，它們的pI從強酸性(pI2.4)到大約pI7。蛋白中大多數是酸性的(pI為2.4-5)。在切自凝膠的各份中測得兩個阿魏酰酯酶活性峰。一個對應于FaeB，pI4.2，只對MFA和MpAC(不是MSA)具有活性。另一個對應于FaeA，pI4.65，對三種測試底物都有活性。3.3.3.SDS-PAGE測定分子量用SDS-PAGE，使用10％Tris-甘油凝膠測定分子量。采用標準方法，進行SDS-PAGE凝膠電泳，固定，考馬斯染料染色和脫色。
酶混合物含至少2種不同的阿魏酰酯酶。一種對應于FaeB(pI4.2)，分子量37kDa。另一種對應于FaeA(pI4.65)，分子量29kDa。
3.3.4.阿魏酰酯酶的活性用分光光度法，以酶混合物測定阿魏酰酯酶活性。
酶混合物對所有測試底物都有活性。在甲酯中，對MpCA的活性最高，對MSA的活性最低。對Ara2F和FAXX的活性高于對甲酯的活性，說明酯酶活性來自真正的阿魏酰酯酶而不是籠統的酯酶或其它細胞壁降解性酯酶(例如乙酰木聚糖酯酶，果膠酯酶)的副活性。3.3.5.序列3.3.5.1.FEA-A的序列根據純化蛋白的胰蛋白酶消化，得到內氨基酸序列序列1QYTLTLPSNYNPNK序列2AVAVMSGANL序列3TEYSG(C/A)DSEHPVWWIAFDGP序列4DTFVKDDHCTPTNPPAPAAGSGTHIKYV根據由純化蛋白得到的氨基酸序列設計了一些簡并PCR引物。將產物克隆到pGEMT(Promega)中，然后測序。
PCR發現，質粒pGEMTD19(180bp)(圖3)含有上述肽序列4。圖3中，引物序列加雙下劃線，已知序列加單下劃線。
SEQ ID NO.5是FAE-A的核酸序列和氨基酸序列。3.3.5.2.FEA-B的序列將根據FAE-B的肽序列設計的引物用作擴增探針，然后用于篩選索狀青霉菌基因組文庫。分離到一段2291bp的克隆并測定了序列(SEQ ID NO.6)。該基因編碼一個304氨基酸的多肽，并具有一個推定內含子。圖4顯示推定氨基酸序列，其中成熟蛋白(成熟蛋白長338氨基酸)以粗體表示。該蛋白包含2個不同的結構域，由一個高度糖基化的接頭隔開。在圖4中，催化區是粗體，結合區具有粗雙下劃線，接頭以粗虛線表示。
該蛋白的特征還在于具有推定的活性位點基序(絲氨酸＝親核)，見圖4中的下劃線部分，具有以下推定的催化三聯體(1)S136/D174/H216(2)S136/D220/H276FAE-B蛋白還有一段分泌序列(353)和10個半胱氨酸。3.4.葡聚糖酶的特性對酶混合物進行2D凝膠電泳。在NOVEXXCell IITMMini-Cell中，用pH3-7(pI3.0-6.5)的NOVEX預制5％垂直聚丙烯酰胺凝膠進行IEF。使用NOVEX陽極、陰極和pH3-7的IEF樣品緩沖液和等電點聚焦的標準方法。切下一條泳道，用10％Laemmli SDS-PAGE凝膠進行第二維度的電泳。從凝膠中分離出第二泳道，切成35份，將凝膠條浸在緩沖液中，分析各份的酶活性。將第三泳道留在凝膠上，用NOVEX標準方法固定，考馬斯R-250藍染料染色，脫色。
在pI4.2，分子量36kDa和pI5.4，分子量27kDa的部分中發現了顯著的內-1，3(4)-β-葡聚糖酶活性(DNS大麥β-葡聚糖法)和纖維素酶活性(CMC法)。為了去除各等份之一中的木聚糖酶B-I，用DNS樺木木聚糖法測定各等份的活性。在β-葡聚糖酶或纖維素酶等份中沒有測到木聚糖酶活性。


圖1索狀青霉菌木聚糖酶C蛋白的氨基酸序列；圖2木聚糖酶BI(XynBI)PCR產物的核苷酸序列和氨基酸序列；圖3阿魏酰酯酶A(faeA)PCR產物的核苷酸和氨基酸序列；圖4索狀青霉菌阿魏酰酯酶B(faeB)蛋白(FAE-V或FAE-1)的氨基酸序列。E.用酶混合物來飼養動物實施例1在仔雞內評價索狀青霉菌產酶制劑對于小麥-大麥混合飼料能值(AMEN)的效用。
該實施例的目的是證明酶(β-葡聚糖酶活性100U.kg-1；木聚糖酶活性1100U.kg-1)對50％小麥22％大麥飼料的氮平衡校正表觀可代謝能的效用。
用歐洲參考方法(Bourdillon等，1990)，放養，對對照和酶制劑(β-葡聚糖酶活性100U.kg-1；木聚糖酶活性1100U.kg-1)進行常規處理，收集18日至21日齡的排泄物。a.材料和方法禽品種和飼養條件1日齡的Ross雄仔雞在養雞棚中喂養至12日齡。它們被飼以標準起始飲食。在第12日，稱量仔雞的體重，分到單獨的籠子中，每種處理均為10籠，然后在適應期(最少5天)飼以實驗飲食。
使用標準溫度和濕度。光照條件保持為23小時光照，1小時無光，直至實驗結束。
飼料仔雞從第一天至第12天接受的是起始飲食，然后飼以實驗飲食。實驗飼料含50％小麥和22％大麥的飼料(表1.1)。將酶制劑噴在20kg碎飼料上。
用測粘度法測定飼料中的酶回收率(in-feed enzyme recovery)(Sabatier &amp; Fish，1996)。測定可代謝能按以下過程，第18日起進行結算D17仔雞被通宵禁食；D18稱重，清潔收集盤；D19收集雞糞，冷凍；D20收集雞糞，冷凍，通宵禁食；D21收集雞糞，冷凍，稱量仔雞重量，恢復喂食。
然后，將排泄物冷凍干燥，研磨得如同飼料一般(1mm，Retsch研磨機)。在一臺IKA C5000絕熱熱量計上測定飼料和排泄物的粗能。還測定蛋白質(N*6.25，Kjeldahi法Z130)和脂肪(Z160法)含量。以蛋白質占重量增加的18％進行氮平衡校正。b.結果與討論氮平衡校正的表觀可代謝能(AMEN)表1.2是動物工藝學表現和代謝能。不同的處理沒有動物工學表現差異。
在成長期的仔雞中，酶制劑將主要為50％小麥和22％大麥的飲食的AMEN提高了6.2％(+204kcal/kg DM(干物質))。
而且，能量的消化率變化從80kcal/kg DM降低到62kcal/kg DM。
這一大幅改善證明索狀青霉菌產生的兩種酶活性(木聚糖酶和β-葡聚糖酶)都能水解小麥和大麥的水溶性非淀粉多糖。
表1.1實驗飲食的主要成分和被測特征

表1.2索狀青霉菌產酶制劑對飼以50％小麥22％大麥飲食的仔雞生長和表觀可代謝能的作用。

實施例2索狀青霉菌產酶制劑在小麥飼養的仔雞中對飼料消化率的作用進行該實驗是為了測定在飼以含54％小麥的飲食的仔雞中，索狀青霉菌產酶制劑(β-葡聚糖酶活性100U.kg-1；木聚糖酶活性1100U.kg-1)對表觀可代謝能(AMEN)、蛋白質和脂類消化率的作用。對研磨的作用也進行了測定。
(1)對照1(54％研磨的小麥)(2)對照1+酶制劑(β-葡聚糖酶活性100U.kg-1；木聚糖酶活性1100U.kg-1)(3)對照2(30全小麥，24％研磨后的小麥)(4)對照2+酶制劑(β-葡聚糖酶活性100U.kg-1；木聚糖酶活性1100U.kg-1)根據歐洲參考方法(放養，收集18至21日齡的全部排泄物)(Bourdillon等，1990)。a.材料和方法禽品種和飼養條件1日齡的Ross雄仔雞在養雞棚中喂養至12日齡。然后轉移到單獨的籠子中進行消化平衡結算。
使用標準溫度和濕度。保持光照條件為23小時光照，1小時無光，直至第8日。然后因同一棚中進行的另一蛋雞實驗改為15小時30分鐘光照，8小時30分鐘無光。
飼料仔雞從第一天至第12天接受的是標準起始飲食，然后飼以實驗飲食。實驗飼料含54％小麥。特征見表2.1。飲食的組成見表2.2。測定表觀可代謝能按照以下過程，第17日起進行結算D17仔雞被通宵禁食；D18稱重，清潔收集盤；D19收集雞糞，冷凍；D20收集雞糞，冷凍，通宵禁食；D21收集雞糞，冷凍，稱量仔雞重量，恢復喂食。
然后，將排泄物冷凍干燥，進行如同飼料的研磨(1mm，Retsch研磨機)。在一臺IKA C5000絕熱熱量計上測定飼料和排泄物的粗能。還測定蛋白質(N*6.25，對飼料使用Kjeldahi Z130法，對糞便使用Z135法)和脂類(Z160法)含量。
用HPLC(對飼料使用Z100法，對糞便使用Z080法)測定氨基酸總體特征。用AFNOR法(NFV18-106)測定飼料和糞便的磷含量。b.結果與討論表觀可代謝能(AMEN)表2.3中是成長表現和可代謝能數據。不同的處理之間，表現(體重增加，飼料攝入)在3天的測定中沒有區別。含54％研磨小麥的對照飲食的AMEN是3173kcal/kg。小麥總含量相同但其中30％是全谷的飲食的可代謝能比理論值提高了100kcal/kg。而且，全麥還降低了測得的以不同標準的標準偏差表示的不一致性。
如果小麥都是研磨的，索狀青霉菌產生的酶(β-葡聚糖酶活性100U.kg-1；木聚糖酶活性1100U.kg-1)將54％小麥飲食的可代謝能值提高3.4％(122kcal/kgDM)，如果30％的小麥是全谷顆粒，提高2.7％(101kcal/kg DM)。營養物質(脂類、蛋白質和氨基酸)的表觀消化率如果小麥全部是研磨的，脂類和蛋白質的表觀消化率分別被索狀青霉菌產生的酶制劑提高7％和2.7％。如果部分小麥是全谷，提高較小分別為3％和0.6％，因為營養物質的消化率被全面提高。實際上，含全麥的對照飲食的營養物質消化率與只含研磨小麥但補充了酶制劑的實驗飲食的相似。
酶制劑對表觀氨基酸消化率的作用見表2.4。酶制劑對全部為研磨小麥的飼料的提高平均為2.9％，對全麥飼料的提高為1.1％，由此證明了對表觀蛋白質消化率的作用。表觀磷滯留和磷排泄表2.5是酶制劑對表觀磷滯留的作用。添加酶制劑顯著提高了表觀磷滯留+8.0％。這一提高高于其他營養物質的提高(根據不同的標準(AME，蛋白質，脂類，氨基酸)在2.9％至3.5％)。所以，這樣的提高可能來自營養物質消化率的改善(木聚糖酶和β-葡聚糖酶的直接作用)，也可能還來自小麥植酸酶作用的改善。在水解非淀粉多糖時，木聚糖酶和β-葡聚糖酶使得內源性小麥植酸酶更容易接近植酸。
可消化磷利用的改善降低了磷的排泄如果以“g磷/kg體重增加”表示，降低8％。
表2.1小麥的特征(％)

表2.2實驗飲食的組成與特征

表2.3酶制劑(β-葡聚糖酶活性100U.kg-1；木聚糖酶活性1100U.kg-1)在成長期的仔雞中對以小麥為主的飲食(54％研磨小麥或24％研磨小麥+30％全麥)的AME的作用。

1飲食效果的單向偏差分析，n＝47；a，b時，上標相同的數值p都小于0.05。
2偏差的雙向分析n＝47(小麥54％研磨或24％研磨+30％全麥；酶沒有或加0.2l/t木聚糖)。
3FCR飼料轉化率(g飼料∶g體重增加)表2.4在成長期的仔雞中，酶制劑對54％小麥飲食的氨基酸表觀消化率(％)的作用(每種處理取一份混合排泄物樣品)

<

2.5在成長期的仔雞(n＝12)中，酶制劑對以小麥為主的飲食(54％研磨小麥)的磷(P)排泄和表觀磷滯留的作用

kg-1)；使用歐洲參考方法(Bourdillon等，1990)，放養，收集33日齡至37日齡的全部排泄物。a.材料和方法禽品種和飼養條件1日齡的BUT9雄火雞在養雞棚中飼養到20日齡。將它們轉移到單獨的籠子中，適應至少7天后進行消化率結算。
使用標準溫度與濕度。將光照條件保持為前2周，光照23小時，無光1小時；然后減少至光照15小時，無光9小時，直至實驗結束。
飼料從第一天至第21天，火雞接受的是標準完全起始飲食，然后給以實驗飼料。實驗飲食飼料含47％小麥和33％大豆粉(表3.1)。在20kg對照飲食的顆粒上噴以酶。可代謝能的測定在第21天，稱量火雞體重，均勻地分入單獨的籠子，每種處理各10籠，然后飼以實驗飲食。
按照以下程序，從第31天起開始結算第32天，火雞通宵禁食；第33天，稱重，清潔收集盤；第34天和第35天，收集糞便，冷凍；第36天，收集糞便，冷凍，通宵禁食；第37天，收集糞便，冷凍，稱重，恢復喂食。
然后，將糞便冷凍干燥，象飼料一樣磨碎(1mm，Retsch研磨機)。在IKA C5000絕熱熱量計上測定飼料和排泄物的粗能。
對AME進行N平衡校正，即將體重增加(g)和氮含量(21％粗蛋白)考慮在內。
然后，將糞便冷凍干燥，象飼料一樣磨碎(1mm，Retsch研磨機)。在IKA C5000絕熱熱量計上測定飼料和排泄物的粗能。還測定了蛋白質(N*6.25，對飼料使用Kjeldahl法Z130，對糞便使用Z135法)，并用HPLC測定了氨基酸總體特征(對飼料使用Z100法，對糞便使用Z080法)。b.結果與討論表觀可代謝能(AME)表3.2中是動物工藝學表現和可代謝能。不同的處理在結算期間，在成長表現上沒有顯著區別。
在成長的火雞中，酶制劑將小麥飲食EP1和EP2的AMEN分別提高了2.2％和5.4％。
這一大幅改善證明酶制劑中的兩種活性(木聚糖酶和β-葡聚糖酶)都能夠水解小麥的非淀粉多糖，從而在成長的火雞中提高谷類的能值。
表3.1實驗飲食的主要成分和測試特征

>表3.2在成長的火雞(32至37天)中，酶制劑對小麥飲食經氮平衡校正的表觀可代謝能(AMEN)的作用(平均值±SD)<

>1偏差的單向分析酶效n＝60，a，b所跟字母不同的平均值在p＜0.05時顯著不同；量效0，0.2，0.3l/t。
2平均值±SEM實施例4在成長期豬中評價索狀青霉菌所產酶制劑對以小麥為主的完全飼料的作用。
該實施例的目的是表明在以小麥為主的飼料中添加酶對成長期豬的小腸內能量消化的作用。酶制劑的標準活性水平是木聚糖酶1100U.kg-1，β-葡聚糖酶100U.kg-1。a.材料和方法動物根據Latin方形設計對每種處理進行測試，用了3種飲食，3段時間，每段飲食2頭豬。在整個測試期間，根據豬的體重，飼以恒定的飲食。實驗飲食給6頭成長期的豬喂以以低質量的小麥為主以其它常用飼料成分補足的飲食(參見表4.1)。取以下方式之一飼以飲食1.不添加酶(基本)2.添加(1)添加1倍水平的酶制劑(β-葡聚糖酶活性100U.kg-1；木聚糖酶活性1100U.kg-1)；3.添加充(2)添加2倍水平的酶制劑(β-葡聚糖酶活性200U.kg-1；木聚糖酶活性2200U.kg-1)；先用玉米淀粉將酶制劑稀釋成預混合物，然后加入適量的飲食中，由此精確控制飲食量。樣品的收集根據RPNA實驗室的標準方法，每周收集48小時的回腸液。用Sanders彈式量熱計測定回腸液樣品和被測飲食的能量，測定可消化能。保存分成等份的樣品，以備以后的測試。統計學分析根據彈式量熱計測得的回腸液、飼料的能量和飼料攝入量計算粗能量的消化率。對消化率計算進行偏差分析。
表4.1基本飲食的組分和營養素說明


b.結果與討論在豬的飲食中添加木聚糖酶提高能量的消化率至少6％。這表明，酶加強了原料細胞壁(特別是小麥)的破壞，增加了小腸中能量的釋放。
表4.2以小麥為主飼料添加酶制劑對給予成長期豬的飼料的能量消化率的作用。

實施例5在反芻動物中，索狀青霉菌產酶制劑對稿草、谷草、干草和禾草飲食的作用HFT測試(Hohenheimer Futterwertesten，Menke等，1979，1988)是一種體外孵育試驗，能夠通過飼料在緩沖胃液中發酵產生的氣體量測定原料的降解。a.材料和方法在溫控(39℃)培養箱內，在試管內，將200mg干燥并磨碎的底物與10ml胃液加20ml緩沖液一起孵育，旋轉攪拌。第24小時時，記錄產生的氣體量。用空白(無底物)、標準干草對照和標準濃縮物對照(已知產生的氣體凈體積)來校正結果，計算24小時內產生的氣體凈體積。用24小時內產生的氣體凈體積和Menke等(1988)提出的預計方程式計算底物的能值和OMD(有機物消化率)。
收集2頭牛的胃液，插胃管，在8a.m.和7pm喂以6kg干草和2kg濃縮物(75/25)。在上午喂食之前收集胃液。過濾胃液，不要讓消化道內的顆粒物通過，將濾液保存在嚴格無氧條件下。
該實驗的目的是測試HFT孵育前15小時酶制劑對飼料的作用。
酶制劑預處理在堆積在地的稿草、谷草、干草和禾草上噴以酶制劑。每2kg干飼料噴以1ml酶制劑。為了提高樣品的一致性，棄去邊緣(約10cm)的草料。處理后，手工拌和草料，噴灑后室溫靜置15小時。在同一系列中，與酶制劑接觸的15小時后進行HFT孵育，每種處理重復6次。b.結果與討論表5.1給出了稿草、谷草、干草和禾草第24小時的產氣凈體積。
在預處理時給稿草使用纖維素酶使凈產氣體積比對照增加了18％。谷草的這一增加是8％，干草是9.5％，禾草是9％。
表5.2中是預處理前后不同草料的OMD。與對照相比，稿草、谷草、干草和禾草的OM消化率都分別有所提高稿草8.5％，谷草5％，干草5.4％，禾草5％。
酶制劑對草料(稿草、谷草、干草和禾草)15小時的預處理提高了胃內底物孵育的強度和底物的OM消化率。
表5.1第24小時的產氣凈體積<

<p>表5.2OMD

實施例6索狀青霉菌產酶制劑對小麥或大麥喂養的蛋雞的行為的作用該實驗的目的是評價添加酶制劑對喂以小麥或大麥飼料的蛋雞的生產力的作用。a.材料與方法實驗方案4種處理×8份重復×5籠×3只母雞處理1.對照160％小麥2.對照1+酶制劑3.對照260％大麥4.對照2+酶制劑動物，飼養和管理對480只Hy-line種棕色母雞進行實驗。每次重復實驗有共用同一食槽的5個籠子組成，也就是說，總共32次實驗，每次15只母雞。
重復實驗分別在兩個相同的房間內進行，光照和通風條件都相同。開始時，每天光照14小時，當17周齡時，每隔2周，光照延長30分鐘，直到最多每天17小時光照。
母雞在實驗開始時為22周齡，持續至下蛋期的前5個月。飲食和喂養有2種實驗飲食，分別以60％小麥為主(飲食1)和60％大麥為主(飲食2)，并加有10％向日葵籽份。它們的組成見表6.1。谷物的特性見表6.2。對照化學分析飼料樣品通過對干物質、粗蛋白、粗脂肪和灰份的分析對實驗飼料進行質量控制。
測定混合飼料的木聚糖酶活性(T-1，T-2)和β-葡聚糖酶活性(T-3，T-4)。測定每4周記錄一次飼料消耗和飼料效率。在實驗開始和結束時稱量母雞的體重。在每4周的五個時段內，每天記錄產蛋數，雞蛋重量，臟蛋和壞蛋的百分比。每天核對和記錄死亡率，并記錄死亡原因。b.結果與討論表現實驗表6.3至6.5列出了實驗期間獲得的生產參數。在前2段時間(22周至30周)，和在整個實驗過程中，從統計學上看，臟蛋的百分比受處理方式的影響(p＞0.005)。喂以無酶小麥飼料的母雞生產的臟蛋較多。從第二時段至實驗結束，不同的處理在產蛋百分比和蛋重方面有統計學上的顯著差異，P分別大于0.05和0.005。與飼以小麥的母雞相比，飼以大麥的母雞產蛋百分比更高，所產雞蛋更重。酶制劑似乎能改善這些參數，但是并不明顯，幾率為0.05。
在整個實驗期間，T-3和T-4處理(大麥飲食)的動物的飼料攝入量高于飼以小麥的動物，這是因為兩種飼料的能量水平(大麥飲食的能量被配制成2600kcal/kg，小麥飲食配制成2800kcal/kg)。考慮到兩種飲食的能值和動物飼料消耗率的差異，全過程中，所有動物具有相同的日能耗。
第一時段中，實驗飲食的飼料效率(表示為g飼料/g蛋)很高，因為這段時間內母雞的產蛋率低。在前兩個時段內，小麥飼養的飼料效率優于大麥；但在產蛋率最高的第三時段，兩種飼料的效率相近。從第34周至實驗結束，大麥的飼料效率優于小麥。酶能夠改善飼料效率(P＞0.05)。全過程中，β-葡聚糖酶改善大麥飲食的飼料效率(P＝0.066)。
表6.4顯示，與無添加酶的相比，添加了酶制劑的小麥喂養蛋雞產蛋率更高(1.5絕對百分點)，蛋更重(+0.37g)，飼料轉化率更低(-2.7％)。
表6.5顯示，與對照大麥飼料相比，給大麥喂養的蛋雞增加酶制劑改善了產蛋率(+4％)，平均蛋重量(+0.7％)和飼料轉化率(-5.7％)。
表6.1實驗蛋雞飲食的組成


(*)1kg飼料包含維生素A8000UI；維生素D31600UI；維生素E5mg；維生素K32mg；維生素B11.5mg；維生素B23mg；維生素B1211.8μg；葉酸0.35mg；生物素150μg；泛酸鈣10mg；煙酸20mg；Mn30mg；Zn50mg；I0.3mg；Fe50mg；Cu6mg；Se0.1mg；etoxiquin125mg。
表6.2谷類的分析組成

表6.322周到24周的生產參數(完全實驗方案)

1.與一只遺傳性狀優良的母雞進行了比較。(數值由母雞提供者提供)數值是每次15只母雞的8次重復實驗的平均值。各欄中，不同上標的平均值具有顯著差異(p＜0.05)。
表6.4木聚糖對小麥喂養的蛋雞的產蛋表現的影響(表示為與對照相比的絕對值1和百分比2)

3. 22-42周期間表6.5酶制劑對大麥喂養的蛋雞產蛋表現的作用(表示為與對照相比的絕對值1和百分比2)

3. 22-42周期間著錄Bourdillon A.，Carre B.，Conan L.，Duperray J.，Franscesch M.，Fuentes M.，Huyghebaert G.，Jansen W.M.M.A.，Leclercq B.，Lessire M.，McNab J.，Rigoni M.，Wiseman J.，1990.
用成年公雞體內測定可代謝能的歐洲參考方法重復性，年齡的作用，與預計值的比較。British Poultry Science 31，567-576.
Sabatier A.M.，Fish N.M.，1996.飼料酶的分析方法方法學問題？Journal ofApplied Poultry Research 5，408-413。
Barrier-Guillot B.，Metayer J.P.，Bouvarel I.，Castaing J.，Picard M.，Zwick J.L.1997.Proceedings of the Xith European Symposium on Poultry Nutrition，WPSA，Faaborg，Denmark，237-239，Aug 24-28th，Svihus B.，Herstad O.，Newman C.W.，Newman R.K.，1997.British Poultry Science 38，524-529。
權利要求
1.新的索狀青霉菌，根據布達佩斯條約保藏，保藏號為IMI378536。
2.新的酶混合物，它是由根據布達佩斯條約保藏于國際微生物研究所，保藏號IMI378536的索狀青霉菌產生的。
3.新的酶混合物，它由索狀青霉菌IMI378536產生，木聚糖酶活性的最適pH介于pH3.0至5.0之間。
4.新的β-葡聚糖酶，由索狀青霉菌IMI378536獲得。
5.新的阿魏酰酯酶，由索狀青霉菌IMI378536獲得。
6.新的酶混合物，由索狀青霉菌IMI378536獲得，至少含木聚糖酶，β-葡聚糖酶和阿魏酰酯酶。
7.根據權利要求6所述的酶混合物，其中用DNS小麥阿糖木聚糖法在pH3.5測得的木聚糖酶與用DNS CMC法在pH5.0測得的β-葡聚糖酶/纖維素酶之比為10/1和1/4。
8.新的液體組合物，由索狀青霉菌IMI378536獲得，包含作為全部有機固體物質的微生物產物 4％-10％抗微生物劑 0.005-0.35％山梨醇 20％-50％抗凍劑 0-40％發酵液過濾后的濃縮液 0.3％-76％用緩沖液調節至pH3-5。
9.根據權利要求8所述的新的液體組合物，其中的抗真菌劑和/或抗細菌劑選自山梨酸及其鹽，苯甲酸及其鹽，4-羥基苯甲酸甲酯，4-羥基苯甲酸正丙酯，糠酸、鹽和酯，氯化鈉或氯化鉀。
10.根據權利要求8或9所述的新的液體組合物，其中的抗凍劑選自1，2-丙二醇，乙二醇，甘油。
11.新的粉末組合物，由索狀青霉菌IMI378536獲得，其組成如下作為全部有機固體物質的微生物產物16％-40％載體 59％-83％干燥的其它發酵液組分1％
12.根據權利要求11所述的新的粉末組合物，其中的載體選自小麥面粉，淀粉，生石膏，麥芽糊精，玉米漿，諸如玉米渣、小麥渣，小麥麩皮，黑麥渣的谷類加工副產物。
13.前述權利要求中任一項所述產品的用途，用來飼養禽、豬、反芻動物等家禽或家畜。
14.根據權利要求13所述的產品的用途，用來提高以下物質的消化率谷類，例如小麥、大麥、黑麥、黑小麥、燕麥、稻米；產油種子，例如大豆、向日葵籽、油菜籽；和谷類副產物，例如小麥麩皮。
15.權利要求6至12中任一項所述產品的用途，用于減低磷排泄。
16.權利要求6至12中任一項所述產品的用途，用于提高磷的消化利用率。
17.權利要求1所述產品的新用途，用于提高氨基酸的消化率。
18.前述權利要求中任一項所述產品的用途，用于降低飼養棚空氣中的氨氣含量。
19.一種索狀青霉菌，它插入有異源基因。
20.一種索狀青霉菌，它的基因組因同源基因插入、缺失或修飾而被改變。
21.一種新的多肽，具有SEQ ID NO.1和圖1所示的氨基酸序列。
22.一種新的多肽或其變體，具有SEQ ID NO.1所示的核酸序列。
23.一種新的多肽，具有SEQ ID NO.4和圖2所示的氨基酸序列。
24.一種新的多肽或其變體，具有SEQ ID NO.4所示的核酸序列。
25.一種新的多肽，具有SEQ ID NO.5和圖3所示的氨基酸序列。
26.一種新的多肽或其變體，具有SEQ ID NO.5所示的核酸序列。
27.一種新的多肽，具有SEQ ID NO.6和圖4所示的氨基酸序列。
28.一種新的多肽或其變體，具有SEQ ID NO.6所示的核酸序列。
29.一種新的多肽，具有以下氨基酸序列AEAINYNQDY。
30.一段核酸序列，編碼木聚糖酶C多肽或其變體。
31.一段核酸序列，編碼木聚糖酶BI多肽或其變體。
32.一段核酸序列，編碼阿魏酰酯酶A多肽或其變體。
33.一段核酸序列，編碼阿魏酰酯酶B多肽或其變體。
34.載體，含有權利要求22、24、26和28或權利要求30至33所述的核酸序列。
35.根據權利要求34所述的載體，是質粒、噬菌體或病毒。
36.權利要求34所述載體的用途，用于在宿主細胞內表達權利要求21至29所述的新多肽。
37.一種宿主細胞，被權利要求34所述載體轉染或感染。
38.根據權利要求37所述的宿主細胞，由單細胞或多細胞生物分離得到。
39.權利要求37所述宿主細胞的用途，用于生產權利要求21至29所述的新的多肽或權利要求2、6和7所述的酶混合物。
全文摘要
本發明涉及新的微生物,索狀青霉菌,涉及由其獲得的新的酶混合物,還涉及這些酶的核酸序列。
文檔編號C12R1/80GK1273601SQ99801034
公開日2000年11月15日 申請日期1999年5月6日 優先權日1998年5月6日
發明者A·薩巴捷, N·M·菲什, N·P·黑格 申請人:羅納-普朗克動物營養素公司, 羅迪亞化學公司