含有兩拷貝以不同方向轉錄之基因的原核細胞的制作方法

專利名稱：含有兩拷貝以不同方向轉錄之基因的原核細胞的制作方法
技術領域：
表達所需基因，且染色體上含有至少兩拷貝所述基因的原核細胞。
背景技術：
原核多拷貝生產細胞，即含有1拷貝以上所需基因的細胞已被用于在工業規模上生產所需蛋白質。
優選的多拷貝生產細胞是在發酵過程中能穩定維持各個所需基因拷貝的細胞。
另外，由于環境的關系，迫切需要生產細胞染色體上不含任何整合的抗生素抗性基因，也即生產細胞在不合抗生素的發酵培養基中能穩定維持所需基因拷貝。
EP 284126描述了解決上述穩定性問題的方案，即提供了構建原核細胞的方法，所述細胞的染色體上含有至少兩拷貝被內源性DNA分開的所需基因，該內源性DNA對宿主細胞而言是至關重要的(必需的)(見EP 284126的權利要求1)。
由于必需DNA的存在，使得發酵的細胞群體能穩定維持所需基因的各個拷貝。如果細胞通過兩拷貝所需基因之間的同源重組除去此必需DNA，細胞失去必需DNA，此特異性細胞將會死亡。
籍此可以維持含有所需基因拷貝的穩定細胞群體。
此方法需要知道哪個DNA區域對細胞而言是必需的。或者，基因整合于染色體上很遠的位置，所以必需DNA很可能位于拷貝之間(見EP 284126的圖2)。這是相對費力和不可靠的方法。
發明簡述本發明解決的問題是提供了表達所需基因，且染色體上含有至少兩拷貝所述基因的原核細胞。
另外，所述原核細胞應該a)是穩定的，也即在發酵過程中，其染色體上可維持兩拷貝基因；和b)能穩定維持兩拷貝基因，這兩拷貝基因之間不具有細胞生長所必需的DNA區段(如EP 284126所述)。
解決方案的基礎是本發明人鑒定出發酵過程中，細胞染色體上可以穩定維持兩個反平行轉錄的基因拷貝(見

圖1)，這兩個反平行轉錄基因可以被穩定維持，甚至這兩拷貝基因之間不具有細胞生長所必需的DNA區段。
因此，本發明的第一方面涉及表達所需基因的原核細胞，其特征在于i)細胞染色體上含有兩個反平行轉錄的所需基因拷貝；和ii)位于i)中所述的兩個反平行轉錄的所需基因拷貝之間的任何DNA區段僅含有細胞生長非必需的DNA序列。
本發明的第二方面涉及構建表達所需基因的原核細胞的方法，所述方法包括構建細胞，其中i)細胞染色體上含有兩個反平行轉錄的所需基因拷貝；和ii)位于i)中所述的兩個反平行轉錄的所需基因拷貝之間的任何DNA區段僅含有細胞生長非必需的DNA序列。
本發明的第三方面涉及生產和分離所需多肽的方法，所述方法包括i)在允許表達由所需基因編碼之所需多肽的適當條件下培養根據本發明的第一方面的原核細胞；和ii)分離所需多肽。
如本文所述，原核細胞的一個優點是所述兩拷貝基因是反平行轉錄的(即趨同或趨異轉錄)，與平行轉錄基因時相比，它將因同源重組而使細胞丟失1拷貝所述基因的風險降至最低(見圖1)。
這暗示了所述原核細胞的另一個優點，因為它可以穩定整合所述兩拷貝基因，而這兩拷貝基因之間不具有細胞生長所必需的DNA區段。
因此，無需按EP 284126所述，將各個所需基因拷貝整合至染色體上很遠的位置(見EP 284126圖2)。這使得構建本文所述的原核細胞比構建EP284126中的細胞相對簡單一些。下文將進一步詳細描述構建本文所述原核細胞的優選方法。
另外，在本領域中，所述細胞生長必需的DNA區段是抗生素抗性標記基因，該基因被用于構建含有1拷貝以上所需基因的原核細胞(見EP 166 628和WO 94/14968)。
因此，本文所述構建原核細胞的方法的另一個優點是提供了產生原核細胞的簡單方法，該細胞可表達兩拷貝所述基因中的基因，且不含導入的抗生素抗性基因。
定義在詳細描述本發明之前，先定義本發明獨立方面的術語。
術語“基因”在本文中表示能在所述細胞中表達成多肽的基因(DNA序列)。因此，所述基因序列被定義為從起始密碼子(通常為“ATG”，“GTG”或“TTG”)開始至終止密碼子(通常為“TAA”，“TAG”或“TGA”)結束的開放閱讀框。
為了表達所述基因，本領域技術人員已知應該將基因與在細胞中表達基因所必需的元件相連。這種標準的元件包括啟動子，核糖體結合位點，終止序列，也可以是本領域已知的其它元件。
術語“兩個反平行轉錄的所述基因拷貝”在本文中表示基因被趨同或趨異轉錄，即以彼此相反的方向存在，見圖1的圖解說明。
對本發明的原核細胞而言，術語“細胞染色體上含有兩個反平行轉錄的所述所需基因拷貝”表示所述原核細胞含有至少兩拷貝按本發明的第一方面所述進行定位的所需基因。除了這兩拷貝所需基因外，所述原核細胞染色體上還可含有更多的所述基因拷貝。
所述更多拷貝可以是根據本發明位于染色體上獨特位置的另外兩個所述基因拷貝，或者是位于染色體另一部分的單個/多個所述基因拷貝。
術語“僅含有細胞生長非必需的DNA序列的DNA區段”表示與上述DNA區段被缺失前相比，該DNA區段如果從所述細胞染色體上刪除(缺失)，在類似的生長條件下，細胞仍能以基本上相同的生長速率生長。
與之相反，被稱為“細胞生長必需的”DNA區段表示與上述DNA區段被缺失前相比，如果所述DNA區段從細胞中缺失，那么在類似的生長條件下，所述細胞不能以基本上相同的生長速率生長。
這種必需的DNA區段可以是親代(野生型)染色體序列(如EP 284126所述)的一部分，或者可以是選擇性標記基因，如抗生素抗性標記基因，其中所述選擇性標記被導入染色體中(例見EP 166628；WO9414968)。
下文通過實施例描述本發明的實施方案。
1A部分表示位于細胞染色體上平行轉錄的兩個基因。如交叉線所示，通過相同DNA序列的同源重組可從細胞中丟失1拷貝所述基因。
B部分表示位于細胞染色體上趨異轉錄的兩個基因。在這種情況下，兩個基因沒有同向相同(direct identical)的序列，因此，兩個基因之間導致1個基因拷貝丟失的同源重組風險顯然最低。
C部分表示位于細胞染色體上趨同轉錄的兩個基因。與B部分相同，兩個所述基因之間沒有同源重組。
圖2此圖表示構建本文所述原核細胞的優選策略。
A部分DNA區段“ABC”和“DEF”位于細胞染色體上。
DNA區段“ABC”，“123”，“456”，“XXX”(所需基因)和“DEF”被導入細胞，優選位于溫度敏感型質粒上被導入細胞。
B部分DNA區段“ABC”和“DEF”之間同源重組之后，染色體現含有“ABC”，“123”，“456”，“XXX”和“DEF”。
含有區段“123”，“XXX”和“456”的新質粒被轉化至細胞中，其中基因“XXX”被轉錄的方向與A部分中相反。
C部分DNA區段“123”和“456”之間同源重組之后，染色體現含有“ABC”，“123”，“XXX”，“456”，“XXX”和“DEF”，其中所需基因“ XXX”是反平行轉錄的。在本文所示的具體實施例中，它們是趨異轉錄的。
圖3-14這些圖表示工作實施例1至3中通過本發明構建原核細胞的方法制備本發明原核細胞所用的質粒。
因此，可參照實施例1至3進一步描述所述質粒。
圖15-29這些圖描述了工作實施例4中通過本發明構建原核細胞的方法制備本發明原核細胞所用的策略和質粒。
因此，可參照實施例4進一步描述這些圖。
發明詳述在本發明的一個實施方案中，本發明的所需基因是能表達多肽的基因，所述多肽可從細胞中分泌出來。
優選該基因編碼含有信號肽和分泌的成熟多肽的融合多肽，這種信號肽是本領域眾所周知的。
在本發明的另一個實施方案中，所述基因編碼酶，該酶可以是蛋白酶，淀粉酶，纖維素酶，脂肪酶，木聚糖酶，植酸酶和其它本領域已知的酶。
在本發明的另一個實施方案中，所述原核細胞是革蘭氏陽性原核細胞，如芽孢桿菌屬細胞或鏈霉菌屬細胞。
優選芽孢桿菌屬細胞是枯草芽孢桿菌，地衣芽孢桿菌，緩慢芽孢桿菌，嗜堿芽孢桿菌，解淀粉芽孢桿菌，Bacillus clausii，環狀芽孢桿菌和蘇云金芽孢桿菌細胞。
另外，本發明的一個實施方案涉及位于兩拷貝所述基因之間的所述DNA區段，該區段至少為10bp長，更優選為10bp-6000bp，甚至更優選為75bp-4500bp長。
本發明的另一個實施方案涉及位于兩拷貝所述基因之間的所述DNA區段，該區段也不含編碼可篩選蛋白質，如綠色熒光蛋白(GFP)的基因。可使用這種可篩選的蛋白質構建含有1拷貝以上所需基因的原核細胞(有關可篩選蛋白質的詳細描述可參見DK 0792/97；和WO 99/01562)。
本發明的另一個實施方案涉及本發明第一方面的原核細胞或本發明第二方面的方法，其中所述的位于兩拷貝所述基因之間的DNA區段不含抗生素抗性標記基因，如氨芐青霉素抗性基因；紅霉素抗性基因；卡那霉素抗性基因；新霉素抗性基因；或氯霉素抗性基因。
工作實施例3和4中例舉了不含抗生素抗性標記基因的本發明的細胞。
可根據本領域已知的將DNA區段/片段導入原核細胞染色體的任何技術，尤其是通過同源重組將所述DNA區段導入染色體的任何已知技術實施根據本發明第二方面的方法以及本文所述的其實施方案。優選的策略是用含有所需DNA區段和溫度敏感型復制起點的質粒轉化細胞，然后在不允許所述質粒復制的溫度下培養細胞，質粒通過同源重組與細胞染色體重組。
有關此方法的進一步描述可參見EP 0284126；EP 166628；WO94/14968；Maniatis，T.，Fritsch，E.F.，Sambrook，J.“分子克隆，實驗室手冊”，冷泉港實驗室，1982；Ausubel，F.M.等(編)，“分子生物學最新方法”，John Wiley和Sons，1995；Harwood，C.R和Cutting，S.M(編)，“芽孢桿菌的分子生物學方法”。
本文的工作實施例(見實施例3和4)中公開了實施根據本發明第二方面的方法以及本文所述的其實施方案的一般策略。
本文圖2中顯示了基于同源重組的優選策略，工作實施例4中描述了此策略的操作實施例。
本文工作實施例和圖2中所述方法的優點在于通過精確的機理將兩拷貝所需基因插入宿主染色體的相同基因座。如果已知該基因特別適合的基因座，那么該方法是優選的。
因此，本發明構建表達基因之原核細胞的方法實施方案中，通過精確的機理將兩拷貝所需基因插入宿主染色體的相同基因座。
可根據本領域技術人員已知的任何標準方法實施根據本發明第三方面生產和分離所需多肽的方法中步驟i)的具體培養條件和步驟ii)中分離所需多肽的具體方法。
如上所述，本文所述的原核細胞的優點在于它是穩定的，也即在發酵過程中能在染色體上維持兩拷貝所述基因。
因此，它特別適于大規模的工業發酵。
這種大規模工業發酵的特征在于a)產生相對高產的所需多肽或b)使用了大規模發酵法。
因此，發明第三方面生產和分離所需多肽的方法實施方案中，在所需多肽的表達量為至少2g多肽(干重)/kg培養基；優選為至少3g多肽(干重)/kg培養基；最優選為至少5g多肽(干重)/kg培養基的條件下培養i)中所述的原核細胞。
另外，發明第三方面生產和分離所需多肽的方法實施方案中，在體積規模＞10m3；優選＞25m3；更優選＞50m3；最優選＞100m3的發酵方法中培養i)中所述的原核細胞。
材料和方法使用分子生物學標準方法進行體外DNA操作，轉化細菌菌株等(Maniatis，T.，Fritsch，E.F.，Sambrook，J.“分子克隆，實驗室手冊”，冷泉港實驗室，1982；Ausubel，E.M.等(編)，“分子生物學最新方法”，John Wiley和Sons，1995；Harwood，C.R和Cutting，S.M(編)，“芽孢桿菌的分子生物學方法”，John Wiley和Sons，1990)。
除非特別說明，根據廠商說明使用DNA操作所用的酶。
所用培養基(TY，BPX和LB瓊脂)描述于EP 0506780。LBPSG瓊脂是添加有磷酸鹽(0.01M磷酸鉀)，葡萄糖(0.4％)和淀粉(0.5％)的LB瓊脂。
實施例1.從地衣芽孢桿菌染色體上缺失α-淀粉酶(amyL)啟動子1A.構建質粒如Jorgensen等，1990所述，將地衣芽孢桿菌的α-淀粉酶(amyL)基因克隆至2.4kb的SphI-HindIII片段上，產生質粒pDN1981(圖3)。“kan”表示衍生自pUB110的卡那霉素抗性基因，“PamyL”表示α-淀粉酶啟動子區域。
(Jorgensen，P.L.，Hansen，C.K.，Poulsen，G.B.，Diderichsen，B.(1990)，體內基因工程以同源重組作為質粒構建的工具，基因96，37-41)。
pSJ2433(圖4)含有被克隆至pUC19的此序列的前450個堿基對(以UPS_PamyL表示)(Yanish-Perron等，1985(Yanish-Perron，C.，Vieira，J.，Messing，J.(1985)，改良的M13嗜菌體克隆載體和宿主菌株M13 mp18和pUC19載體的核苷酸序列，基因33，103-119))，按下述構建該質粒將pDN1981 DNA用作模板以使用引物LWN4739+LWN 4740進行PCR擴增，用EcoRI和HindIII消化所得的0.5kb片段，與經EcoRI和HindIII消化的pUC19連接，通過電穿孔轉化大腸桿菌SJ2(Diderichsen等，1990(Diderichsen，B.，Wedsted，U.，Hedegaard，L.，Jensen，B.R.，Sjoholm，C.(1990)，編碼短芽孢桿菌胞外酶α-乙酰乳酸脫羧酶的aldB的克隆))，選擇氨芐青霉素抗性(AmpR)，200μg/ml。“bla”表示pUC19氨芐青霉素抗性基因。
兩個轉化子被稱為SJ2433和SJ2434，通過末端DNA測序證實插入物的同一性，但未測定整個插入物的序列。LWN4739HindIII KpnI PstI NheI SphI<----amyLV2 464-437-5′-TGAGTAAGCTTGGTACCCTGCAGGCTAGCGCATGCGCTGAGATACAGTTACCAATT------->GATAGCC-3′LWN4740EcoRI XbaI<----amyLV2 18-43------>5′-TGAGTGAATTCTCTAGACCTTCTTTGTGCTTGGAAGCAGAGCC-3′通過將pDN1981上α-淀粉酶(amyL)基因的0.5kb PstI-KpnI片段與經PstI+KpnI消化的pSJ2433連接，并通過電穿孔轉化大腸桿菌SJ2(Diderichsen等，1990)，選擇AmpR(200μg/ml)，從而由pSJ2433衍生得到pSJ2454(圖5)。
pSJ1327(圖6)含有衍生自pC194(Horinouchi和Weisblum，1982(Horinouchi，S和Weisblum，B.(1982).專門為氯霉素抗性的質粒pC194的核苷酸序列和功能圖譜，細菌學雜志，173，559-567))的cat基因，該基因被插入pUC19衍生物的多接頭中。從pDN1600上切下1.0kb BamHI-BglII片段，其為專門為氯霉素抗性的cat基因，將此片段與經BamHI消化的pDN3000(Diderichsen等，1990)連接，轉化大腸桿菌SJ2，選擇AmpR(200μg/ml)。
pSJ2643(圖7)含有在pSJ2454中兩個amyL衍生區段之間插入的cat基因。從pSJ1327上切下1.1kb NheI-XbaI片段，將此片段與經NheI消化的pSJ2454連接，通過電穿孔轉化大腸桿菌SJ6，選擇氯霉素抗性(CamR，6μg/ml)，以產生pSJ2643。“Plac”表示衍生自pUC19的β-半乳糖苷酶啟動子。
pSJ2650(圖8)含有位于溫度敏感型芽孢桿菌質粒上的UPS_PamyL-cat-amyL區段。用XbaI+HindIII消化pSJ2643，分離2.0kb的片段，與pSJ980(圖9；美國專利5698415)的5.1kb NheI-HindIII片段連接，轉化枯草芽孢桿菌DN1885(Diderichsen等，1990)感受態細胞，分別在LBPSG平板上選擇CamR和卡那霉素抗性(KanR)，6μg/ml和10μg/ml，得到pSJ2650。“repF”表示衍生自pE194的復制蛋白基因，“+ori pE194”表示pE194復制起點，“erm”表示pE194的紅霉素抗性基因，也稱其為“ermC”。
1B.地衣芽孢桿菌轉化將美國專利5698415的實施例6中所述的地衣芽孢桿菌菌株用作宿主菌株，該菌株含有1染色體拷貝α-淀粉酶(amyL)基因，該基因由突變的amyL啟動子表達。通過原生質體轉化(Akamatzu和Sekiguchi，1984(Akamatsu，T.，Sekiguchi，J.(1984)，芽孢桿菌原生質體再生的改良方法及其在原生質體融合和轉化中的應用，農業生物化學，48，651-655))將pSJ2645導入此菌株，于30℃選擇紅霉素抗性(ErmR，2μg/ml)。保溫2周后分離再生菌株，得到3個菌株，稱之為SJ3034，SJ3035和SJ3036。
1C.染色體整合和切除在含6μg/ml氯霉素和5μg/ml紅霉素的平板上劃線菌株SJ3035和SJ3036，50℃下保溫。使用引物LWN4726+LWN3825進行PCR擴增，從每個菌株中挑選出8個淀粉酶-陰性菌落，全都具有正確大小的擴增片段。擴增片段從cat基因內的NcoI位點延伸至KpnI位點下游157bp處的amyL基因中的位置，共1007個堿基對。僅當pSJ2650經由amyL同源性整合時才會產生此片段。
LWN3825<-amyLV2 1341-1322->
5′-CTGCTGCGACATCAGGATGG-3′LWN4726<-pDN3060 548-528-->
5′-CATGGACTTCATTTACTGGG-3′
于30℃，在10ml不含抗生素的TY培養基(WO 91/09129)中連續2天過夜保溫，取出各個菌落鋪于含6μg/ml氯霉素的平板上，于30℃保溫過夜后，影印鋪板于含6μg/ml氯霉素+/-5μg/ml紅霉素的平板上，再在相同類型的平板上劃線推定的紅霉素敏感型菌落。
分離出3個氯霉素抗性，紅霉素敏感型菌株由SJ3035得到SJ3047，菌落1由SJ3035得到SJ3048，菌落2由SJ3036得到SJ3049，菌落3通過Southern分析證實cat基因整合至amyL啟動子區域。
以前已構建出amyL基因區域的限制性圖譜，該圖譜揭示出amyL啟動子位于3.35kb HindIII片段和1.9kb ClaI片段上。
用cat基因取代amyL啟動子應凈插入835個堿基對，cat基因未插入另外的HindIII或ClaI位點。因此，從分別被HindIII和ClaI消化的SJ3047-49中提取染色體DNA，在瓊脂糖凝膠上分離，通過真空印跡轉移到Immobilon-N膜上，通過切口平移用經32P標記的pSJ1325(含有cat基因的pUC19質粒)探測。
正如所預期的，與SJ3047和SJ3048中的4.2kb HindIII片段雜交，但與SJ3049中的較大片段有某種程度的雜交，并如所預期的，與SJ3047和SJ3048中的2.7kb ClaI片段雜交。
因此，淀粉酶陰性的SJ3047和SJ3048菌株的amyL啟動子按需要被cat基因取代。
實施例2.分離改良的α-淀粉酶(amyL)啟動子2A.構建質粒美國專利5698415中要求了衍生自地衣芽孢桿菌amyL啟動子的突變型啟動子，參照該專利的權利要求1，所述突變型啟動子是該權利要求中給出的序列片段，其中N2-N9具有序列ATGTATCA。通過將所需突變摻入覆蓋amyL啟動子區域的長PCR引物(#28902)即可構建這種突變型啟動子。另一個PCR引物LWN3216從跨越AmyL信號肽編碼區之PstI位點的位置往上游讀碼。這兩個引物合在一起可PCR擴增突變的amyL啟動子片段。
#28902XbaI SphI←----序列片段5′-GCTCTAGAGCATGCTGGAAGAAAATATAGGGAAAATGGTA-美國專利5,698,415之權利要求1中給出CTTGTTAAAAATTCGGAATATTTATACAATATCATATGTATCAC--------→ATTGAAAGGGGAGGAGAATCATG-3′LWN32165 ′-GCTGCTGCAGAATGAGGCAG-3 ′按下述構建可轉移的溫度敏感型質粒，該質粒含有側翼于amyL DNA的突變型啟動子，所述amyL DNA為適于整合至地衣芽孢桿菌菌株SJ3047染色體的形式PCR擴增的底物是經BglII消化的pDN1981，將引物#28902和引物LWN3216一起使用，退火溫度為45℃，得到正確大小的PCR產物，用SphI+PstI消化，與pSJ2643 3.6kb SphI-PstI片段連接，用EcoRI+HindIII消化連接混合物，將1.1kb的片段(分離自片段混合物)與pSJ2739 4.4kbEcoRI-HindIII片段連接(圖10；描述于WO 96/23073中的“通過轉座整合DNA”)。用連接混合物轉化感受態枯草芽孢桿菌DN1885，于30℃選擇紅霉素抗性(5μg/ml)。通過限制性圖譜的繪制分析重組質粒，使用引物LWN3207對pSJ4199質粒(圖11)上的amyL啟動子區域進行DNA測序，發現它具有所需的序列。“oriT(pUB110)”表示pUB110上質粒接合轉移所必需的順式作用序列，見WO96/23073。“PamyL 4199”表示突變的amyL啟動子。
使用突變的amyL啟動子取代質粒pDN1981上的amyL啟動子，從pSJ4199上切下0.2kb SphI-PstI片段，即突變的amyL啟動子，與pDN1981的5.0kb SphI-PstI片段連接，用連接混合物轉化枯草芽孢桿菌DN1885，選擇紅霉素抗性(10μg/ml)。兩個轉化子為SJ4277(DN1885/pSJ4277；圖12)和SJ4278(DN1885/pSJ4278)。“rep”表示pUB110復制蛋白基因。
2B.轉移至地衣芽孢桿菌和染色體整合將質粒pSJ4199轉化至枯草芽孢桿菌PP289-5(dal-，pLS20，pBC16；WO96/23073，實施例4)的感受態細胞中，于30℃，在D-丙氨酸(100μg/ml)平板上選擇紅霉素(5μg/ml)和四環素(5μg/ml)抗性。兩個轉化子為SJ4237和SJ4238。
基本上按WO 96/23073之實施例11所述，通過接合，使用這兩個供體菌株將其質粒轉移至地衣芽孢桿菌中。轉接合子幾乎都是四環素敏感型。
從兩個供體菌株中各衍生得到1個轉接合子SJ4258(得自SJ4237)和SJ4259(得自SJ4238)，它們都含有pSJ4199。
在添加有氯霉素(6μg/ml)和紅霉素(5μg/ml)的LBPSG平板上劃線這些菌株，50℃培養過夜。從各個菌株中得到淀粉酶陽性菌落，30℃下，將每個菌株的4個這種菌落接種于不含抗生素的TY培養基中，隨后轉移3-4次，使質粒復制，切除和缺失。從各個轉接合子菌株中得到淀粉酶陽性，紅霉素敏感型菌落，為SJ4270(得自SJ4258)和SJ4271(得自SJ4259)。
2C.檢測突變的啟動子菌株在搖瓶實驗中檢測突變啟動子的效力，其中將各個整合體菌株產生的α-淀粉酶與對照菌株(通過缺失啟動子衍生得到SJ3047的菌株)產生的α-淀粉酶相比較。37℃下，在BPX培養基(EP0506780)中將雙份實驗保溫7天，在第2，5和7天測定α-淀粉酶活性。
相對于由對照菌株所測定的最高活性給出活性。
相對于對照菌株的啟動子而言，菌株SJ4270和SJ4271中存在的突變啟動子顯然在α-淀粉酶的生產方面有所改良。
實施例3構建含有兩個趨異轉錄的表達盒的菌株3A.構建質粒設計質粒，其中將amyL基因的全部拷貝插入pSJ4199上UPS_PamyL區段和PamyL_4199啟動子之間，以使所得質粒上的兩個amyL啟動子可在相反方向上讀碼。
構建質粒pSJ4338(圖13)和pSJ4339，構建方法與整合質粒pSJ4199的幾乎相同，不同之處是在UPS_PamyL和PamyL_4199區段之間導入了幾個額外的限制性位點。將質粒pSJ4278用作PCR擴增的模板，所述PCR的引物為#113123和LWN3216。
#113123SphI ClaI BglII5′-GTCAGCATGCATCGATAGATCTTGGAAGAAAATATAGGG-3′LWN32165′-GCTGCTGCAGAATGAGGCAG-3′得到0.19kb的擴增片段，純化之，并用SphI+PstI消化，將其與pSJ26433.5kb的SphI-PstI片段連接，用EcoRI+HindIII消化連接混合物，純化1.13kb的片段，與經EcoRI+HindIII消化的pSJ2739連接，然后用連接混合物轉化感受態的DN1885，30℃下選擇紅霉素抗性(5μg/ml)。得到3個轉化子，菌株SJ4338(DN1885/pSJ4338)含有質粒，通過限制性分析發現該質粒是正確的，通過DNA測序發現amyL啟動子區域是正確的。
然后通過將整個amyL基因插入上述整合質粒來構建質粒pSJ4372和pSJ4373(圖14)。因此，用BclI+BglII(+NcoI以進一步消化不需要的片段)消化pSJ4277，純化2.8kb的片段，將其與經BglII消化的pSJ4338連接，用連接混合物轉化感受態的DN1885，30℃下選擇紅霉素抗性(5μg/ml)。通過限制性分析證實為正確的淀粉酶陽性轉化子是SJ4372(DN1885/pSJ4372)和SJ4373(DN1885/pSJ4373)。
3B.轉移至地衣芽孢桿菌和染色體整合
隨后，用這些質粒轉化接合供體菌株宿主PP289-5，產生菌株SJ4378和SJ4379(皆為PP289-5/pSJ4373；ErmRTetRDal-)。
按上文所述將質粒pSJ4373轉移至地衣芽孢桿菌SJ3047中。
2天后出現轉接合子(使用SJ4378供體的為4個，使用SJ4379供體的為9個)。
保存4個菌株得自SJ4378供體的SJ4395和SJ4396，得自SJ4379供體的SJ4397和SJ4398。
50℃，在含紅霉素(5μg/ml)的LBPSG平板上將菌株劃線，然后將各個菌株的10個單菌落接種于10ml TY培養基中，30℃培養過夜。在LBPSG平板上將培養物鋪成單菌落，30℃下將這些平板保溫過夜，影印鋪板于含紅霉素(5μg/ml)的LBPSG平板上，過夜培養后評價紅霉素抗性和淀粉酶表型的評分。大多數菌落為紅霉素敏感型，但淀粉酶為陰性。然而，從一個培養物中分離到紅霉素敏感型，淀粉酶陽性菌株，將該菌株稱為SJ4414。
3C.檢測兩-拷貝菌株在兩個獨立的實驗中，將兩拷貝菌株SJ4414在BPX搖瓶中的性能與SJ4270(相應的1-拷貝菌株)的相比較。
37℃下，將BPX搖瓶保溫7天，未加入抗生素，測定α-淀粉酶的活性。每個實驗中所得的活性是相對于1拷貝菌株所得活性的活性。
實驗A
實驗B
實驗A和B清楚地闡明兩拷貝菌株SJ4414的產量比相應的1拷貝菌株SJ4270的要高。
另外，將SJ4414樣品鋪于LBPSG上，所有單菌落(從包括含低pH肉湯之燒瓶的各個燒瓶中得到約30個)都是淀粉酶陽性，說明穩定維持了兩個整合的拷貝。
實施例4以兩個連續的步驟的染色體基因插入作為上述(實施例3)構建途徑的可替代方法，設計并構建溫度敏感型的可轉移載體對以易于克隆和整合任何表達盒。第一個載體含有兩個與宿主細胞染色體的相鄰區段具有同源性的區域。在這兩個區域之間含有多接頭位點和大的(如5kb)“中性”DNA區段。第二個載體僅含有大的“中性”DNA區段，但在此區段的中間插入多接頭位點，插入方向與第一個載體中的相反。圖15的圖示中闡明了載體及其使用策略。除了上述說明外，“區段A”表示大的“中性”DNA區段的一半，“區段B”表示此區段的另一半，“GFP”表示表達綠色熒光蛋白的基因。
作為適于整合至生產菌株的“中性”DNA，可選擇由枯草芽孢桿菌168pps基因區域(GenBank/EMBL登記號為Z34883)的兩個區段組成，這兩個區段取自用于國際基因組測序計劃的枯草芽孢桿菌菌株SJ2692。一個區段全部位于基因pps2的內部，另一個區段全部位于pps4的內部。之所以選擇它們是因為它們含有很少的限制性酶位點，并且克隆時不會編碼任何基因產物。
4A.構建載體以整合第一個表達盒拷貝按下述構建質粒pSJ4459(圖16)以#119882和#119883為引物，PCR擴增SJ2692的染色體DNA。
#119882EcoRI SphI←z34883 9964-9987----→5′-CAGTGAATTCGCATGCAGCAGGTAGTTCTATCAAACCG-3′#119883HindIII NheI←z34883 12565-12540--→5′-GACTAAGCTTGCTAGCCGCTGGATGTTAATGGCATCTGGC-3′
用EcoRI和HindIII消化擴增的2.6kb片段，與經EcoRI和HindIII消化的pUC19連接，通過電穿孔將連接混合物轉化至大腸桿菌SJ2中，在IPTGX-gal平板上選擇氨芐青霉素抗性(200μg/ml)。挑選4個白色菌落以制備質粒，所有質粒都是正確的，用EcoRI，HindIII，SphI和NheI消化質粒，一個菌株為SJ4459(SJ2/pSJ4459)。“z34883 10-12.5”表示由pps2擴增的片段。
按下述構建質粒pSJ4461(圖17)以#119884和#119885為引物，PCR擴增SJ2692的染色體DNA。
#119884XbaI←z34883 25234-25260----→5′-CAGTTCTAGACTTTTACAATAGAAGGAAAAGTCACCC-5′#119885HindIII BglII SalI SacII NotI MluI NheI NcoI5′-GACTAAGCTTAGATCTGAGCTCCGCGGCGGCCGCACGCGTGCTAGCCATGG<-z34883 28038-28015→-CCTCTAACAGATTTCGAGGGGCAG-3′用EcoRI和HindIII消化擴增的2.8kb片段，與經EcoRI和HindIII消化的pUC19連接，通過電穿孔將連接混合物轉化至大腸桿菌SJ2中，在IPTGX-gal平板上選擇氨芐青霉素抗性(200μg/ml)。挑選4個白色菌落以制備質粒，3個質粒是正確的，且可用HindIII，XbaI，BglII，SalI，SacII，NotI，MluI，NheI，NcoI消化質粒，一個轉化子為SJ4461(SJ2/pSJ4461)。“z34883 25.2-28.0”表示由pps4擴增的片段。
按下述構建質粒pSJ4498(圖18)用EcoRI和NheI(+BsaI以進一步消化不需要的部分)消化質粒pSJ4459，從瓊脂糖凝膠中純化2.6kb的EcoRI-NheI片段，與經EcoRI和XbaI消化的pSJ4461連接，通過電穿孔將連接混合物轉化至大腸桿菌SJ6中，選擇氨芐青霉素抗性(6μg/ml)。一個菌株為SJ4498(SJ6/pSJ4498)。
按下述構建質粒pSJ4505(圖19)用SphI和HindIII消化質粒pSJ4498，凝膠純化5.4kb的片段，與純化自pSJ2643(上文圖7)的3.2kb SphI-HindIII片段連接，通過電穿孔將連接混合物轉化至大腸桿菌SJ6中，選擇氨芐青霉素抗性(6μg/ml)。一個轉化子為SJ4505(SJ6/pSJ4505)。
為了能可見地篩選第二個基因拷貝的插入，將編碼綠色熒光蛋白的基因插入第一個整合載體中的兩個pps基因區段之間。使用此系統第一次插入所需基因可使細胞變為GFP陽性，而第二拷貝所需基因的正確插入再次使細胞變為GFP陰性。表達綠色熒光蛋白的質粒是專利申請DK 0792/97的實施例1和圖3中和WO 99/01562中所述的pSJ4574(圖20)。“bioST”表示GFP基因，“PamyQ”表示解淀粉芽孢桿菌α-淀粉酶基因的啟動子。
按下述構建質粒pSJ4581(圖21)用PstI消化pSJ4574，凝膠純化0.95kb的片段，與經NsiI消化的pSJ4505連接，通過電穿孔將連接混合物轉化至大腸桿菌SJ2中，選擇氨芐青霉素抗性(200μg/ml)。一個轉化子為SJ4581(SJ2/pSJ4581)。
按下述構建質粒pSJ4587(圖22)用EcoRI+BglII消化pSJ4581，凝膠純化6.9kb的片段，與5.0kb經EcoRI+BglII消化的pSJ2739(上文圖10)片段連接，將連接混合物轉化至枯草芽孢桿菌DN1885感受態細胞中，30℃下選擇紅霉素抗性(5μg/ml)。一個轉化子為SJ4587(DN1885/pSJ4587)。
4B.構建載體以整合第二個表達盒拷貝按下述構建質粒pSJ4465(圖23)質粒pSJ4459被用作引物為#119882和#119886的PCR反應中的模板，退火溫度為60℃，PCR反應僅有10個擴增循環。
#119882見上文#119886HindIII NheISacII SalI BglII←z34883 12565-12540---→5′-GACTAAGCTTGCTAGCCGCGGAGCTCAGATCTGCCGCTGGATGTTAATGGCATCTGGC-3′用EcoRI和HindIII消化擴增的2.6kb片段，與經EcoRI和HindIII消化的pUC19連接，通過電穿孔將連接混合物轉化至大腸桿菌SJ2中，在IPTGX-gal平板上選擇氨芐青霉素抗性(200μg/ml)。挑選6個白色菌落以制備質粒，3個質粒是正確的，并可用酶EcoRI，HindIII，SphI，NheI，SacII，SalI和BglII消化質粒，一個轉化子為SJ4465(SJ2/pSJ4465)。
按下述構建質粒pSJ4471(圖24)質粒pSJ4461被用作引物為#119887和#119888的PCR反應中的底物，退火溫度為60℃，PCR反應僅有10個擴增循環。#119887XbaI NotI MluI NheI NcoI←z34883 25234-25260----→5′-CAGTTCTAGAGCGGCCGCACGCGTGCTAGCCATGGCTTTTACAATAGAAGGAAAAGTCACCC-3′#119888HindIII<-z34883 28038-28015→5 ′-GACTAAGCTTCCTCTAACAGATTTCGAGGGGCAG-3′用XbaI和HindIII消化擴增的2.8kb片段，與經XbaI和HindIII消化的pUC19連接，通過電穿孔將連接混合物轉化至大腸桿菌SJ2中，在IPTGX-gal平板上選擇氨芐青霉素抗性(200μg/ml)。挑選12個白色菌落以制備質粒，1個質粒是正確的，并可用酶XbaI，HindIII，NotI，MluI，NheI和NcoI消化質粒，一個菌株為SJ4471(SJ2/pSJ4471)。
按下述構建質粒pSJ4499(圖25)用EcoRI和NheI(+BsaI進一步消化不需要的部分)消化質粒pSJ4465，從瓊脂糖凝膠中純化2.6kb的EcoRI-NheI片段，與經EcoRI和XbaI消化的pSJ4471連接，通過電穿孔將連接混合物轉化至大腸桿菌SJ6中，選擇氨芐青霉素抗性(200μg/ml)。一個正確的轉化子為SJ4499(SJ6/pSJ4499)。
按下述構建質粒pSJ4507(圖26)用EcoRI和HindIII消化質粒pSJ4499，純化5.4kb的片段，與4.3kb經EcoRI和HindIII消化的pSJ2739片段連接，將連接混合物轉化至枯草芽孢桿菌DN1885的感受態細胞中，30℃下選擇紅霉素抗性(5μg/ml)。一個轉化子為SJ4507(DN1885/pSJ4507)。
4C.將編碼地衣芽孢桿菌α淀粉酶的基因amyL插入第一個和第二個整合載體構建質粒pSJ4457(圖27)，構建方法與上述pSJ4277(圖12)幾乎相同，不同的是在突變的amyL啟動子上游插入了幾個額外的限制性位點。其構建過程如下從pSJ4338(上文實施例3A，圖13)中純化0.2kb的SphI-PstI片段，將此片段與pDN1981之5kb的PstI-SphI片段連接，將連接混合物轉化至DN1885中，選擇卡那霉素(10μg/ml)抗性，一個轉化子為SJ4457(DN1885/pSJ4457)。
質粒pSJ4608(圖28)含有amyL基因，該基因被插入第一拷貝整合載體中，其構建過程如下用BglII和HindIII消化質粒pSJ4457，凝膠純化1.9kb的片段，與11.2kb經BglII和HindIII消化的pSJ4587片段連接，將連接混合物轉化至枯草芽孢桿菌DN1885的感受態細胞中，30℃下選擇紅霉素抗性(5μg/ml)。一個淀粉酶陽性，GFP陽性的轉化子為SJ4608(DN1885/pSJ4608)。
質粒pSJ4606(圖29)含有amyL基因，該基因被插入第二拷貝整合載體中，其構建過程如下用BglII和BclI消化pSJ4457，凝膠純化1.9kb的片段，與經BglII消化的pSJ4507片段連接，將連接混合物轉化至枯草芽孢桿菌DN1885的感受態細胞中，30℃下選擇紅霉素抗性(5μg/ml)。一個含有以所需方向插入的amyL基因的轉化子為SJ4606(DN1885/pSJ4606)。
4D.轉移至地衣芽孢桿菌和第一個整合載體的染色體整合將質粒pSJ4608轉化至接合供體宿主菌株PP289-5的感受態細胞中，在添加有D-丙氨酸(100μg/ml)的LBPSG平板上選擇紅霉素(5μg/ml)和四環素(5μg/ml)抗性，轉化子為SJ4611(PP289-5/pSJ4608)。
按上文所述通過接合將質粒pSJ4608轉移至地衣芽孢桿菌SJ3047(實施例1)中。在含紅霉素(5μg/ml)的LBPSG平板上劃線淀粉酶陽性，GFP陽性的轉接合子，50℃保溫過夜。將6個淀粉酶陽性，GFP陽性的菌落接種于各為10ml的TY培養基中，30℃搖瓶培養。于30℃在LBPSG平板上將培養物鋪成單菌落，影印鋪板于含紅霉素(5μg/ml)的LBPSG平板上。重新分離推定的紅霉素敏感型，淀粉酶陽性菌落。在平板上培養約1周后可清楚地看見GFP陽性表型。兩個淀粉酶陽性，GFP陽性和紅霉素敏感型菌株為SJ4629和SJ4630。
4E.轉移至地衣芽孢桿菌和第二個整合載體整合至染色體上將質粒pSJ4606轉化至接合供體宿主菌株PP289-5的感受態細胞中，在添加有D-丙氨酸(100μg/ml)的LBPSG平板上選擇紅霉素(5μg/ml)和四環素(5μg/ml)抗性，轉化子為SJ4609。
通過接合將SJ4609中的質粒pSJ4606轉移至地衣芽孢桿菌菌株SJ4629和SJ4630中。在紅霉素(5μg/ml)平板上劃線由各個受體得到的兩個轉接合子，50℃保溫過夜。將12個在50℃時由各個受體產生的菌落接種于各為10ml的TY培養基中，30℃搖瓶培養。重復增殖1次，于30℃在LBPSG平板上將培養物鋪成單菌落，影印鋪板于含紅霉素(5μg/ml)的LBPSG平板上。從24個培養物的12個中得到紅霉素敏感型，GFP陰性菌落。一些菌株為SJ4669，SJ4670和SJ4671(從分開的TY培養物中得到，得自SJ4629受體)，和SJ4672，SJ4673和SJ4674(從分開的TY培養物中得到，得自SJ4630受體)。
4F.檢測兩拷貝菌株于37℃，在BPX搖瓶中保溫1周后，檢測菌株SJ4270(單拷貝菌株)，SJ4629和SJ4630(也表達GFP的單拷貝菌株，其中含有插入的pps基因區段)，和兩拷貝菌株SJ4669-SJ4674，并測定α淀粉酶活性。產量表示為用對照1拷貝菌株SJ4270所得產量的百分比。
用菌株SJ4630得到令人驚奇的低產量可能是由于此菌株較后被檢測的污染所致。
通過Southern分析(見下文)證實菌株SJ4671含有兩拷貝按需要以相反方向插入的amyL基因，選擇該菌株通過在實驗室發酵罐中發酵以進一步分析之。在發酵的第4天，將SJ4671培養物的樣品鋪于含染料支鏈淀粉的LBPG平板上以檢查淀粉酶表型。出現的800個菌落都是同等程度的淀粉酶陽性，反映出該菌株的穩定性。
將其中10個菌落接種于BPX搖瓶中，將來自冷凍儲液的SJ4671鋪平板作為對照，結果如下(7天，37℃)。<
<p>此實驗中SJ4671的產量為第一個實驗中SJ4671產量的102％，因此，發酵后挑選的單菌落得到的產量全部與原始的SJ4671菌株產量相同，反映出該菌株的穩定性。
4G.Southern分析提取菌株SJ3047，SJ4270，SJ4629和兩拷貝菌株，包括SJ4671的染色體DNA，通過Southern印跡雜交進行分析。用HindIII或用HindIII+KpnI消化DNA制品，通過瓊脂糖凝膠電泳分離DNA片段，通過真空印跡轉移至Immobilon-N(Millipore)膜上。使用New England Biolabs的NE-BlotPhotope試劑盒和Photope檢測試劑盒，用生物素化的質粒pDN1981 DNA探測膜。
用作探針的質粒pDN1981含有整個Termamyl基因(位于2.4kb的SphI-HindIII片段上)，pUB110的起點和rep基因，以及卡那霉素抗性基因。
所得印跡表明菌株SJ3047中有一個所期望的4.2kb HindIII片段。
菌株SJ4270中有一個3.3kb的HindIII片段。
菌株SJ4629中有一個9.6kb的HindIII片段。
菌株SJ4671中有一個10.6kb的HindIII片段。
最后，用HindIII和KpnI消化菌株SJ4671 DNA，顯示出5.2kb，4.2kb和1.3kb的片段。
此雜交模式按預期得自所需的兩拷貝菌株，證實了菌株SJ4671的正確。
權利要求
1.表達所需基因的原核細胞，其特征在于i)細胞染色體上含有兩個反平行轉錄的所需基因拷貝；和ii)位于i)中所述的兩個所需基因拷貝之間的任何DNA區段僅含有細胞生長非必需的DNA序列。
2.構建表達所需基因的原核細胞的方法，所述方法包括構建細胞，其中i)細胞染色體上含有兩個反平行轉錄的所需基因拷貝；和ii)位于i)中所述的兩個反平行轉錄的所需基因拷貝之間的任何DNA區段僅含有細胞生長非必需的DNA序列。
3.根據權利要求1的原核細胞，或根據權利要求2的方法，其中所述基因是能表達由細胞分泌之多肽的基因。
4.根據權利要求1或3的原核細胞，或根據權利要求2或3的方法，其中所述基因編碼酶。
5.根據權利要求1或3-4中任一項的原核細胞，或根據權利要求2或3-4中任一項的方法，其中所述原核細胞是芽孢桿菌屬細胞。
6.根據權利要求1或3-5中任一項的原核細胞，或根據權利要求2或3-5中任一項的方法，其中所述位于兩拷貝所述基因之間的所述DNA區段為至少10bp長，更優選為10bp-6000bp長，甚至更優選為75bp-4500bp長。
7.根據權利要求1或3-6中任一項的原核細胞，或根據權利要求2或3-6中任一項的方法，其中所述位于兩拷貝所述基因之間的所述DNA區段不含有抗生素抗性標記基因。
8.生產和分離所需多肽的方法，所述方法包括i)在允許表達由所需基因編碼之所需多肽的適當條件下培養根據權利要求1或3-7中任一項的原核細胞；和ii)分離所需多肽。
9.生產和分離權利要求8之所需多肽的方法，其中在所需多肽的表達量為至少2g多肽(干重)/kg培養基的條件下培養i)中所述的原核細胞。
10.生產和分離權利要求8之所需多肽的方法，其中在體積規模＞10m3的發酵方法中培養i)中所述的原核細胞。
全文摘要
表達所需基因,且染色體上含有至少兩拷貝所述基因的原核細胞。拷貝在不同的方向上被轉錄,從而避免了同源刪除,兩拷貝之間的DNA區段不含有細胞生長所必需的任何信息,如抗生素抗性基因。
文檔編號C12P21/00GK1272135SQ9980075
公開日2000年11月1日 申請日期1999年2月10日 優先權日1998年2月12日
發明者斯蒂恩·T·喬根森 申請人:諾沃挪第克公司