專利名稱：功能性組合物的制作方法
技術領域：
本發明涉及包含混有酵母的乳酸菌的未處理或處理的培養物的組合物，還涉及含所述組合物的功能性食品。
背景技術：
人們一直期望含乳酸菌的發酵食品能預防成人疾病和促進健康。這樣的食品以了發酵乳(酸牛奶)為代表。另外，乳酸菌飲料和酸牛奶已相當普及。
有關乳酸菌和發酵食品的生理活性報告已有許多，因此，預計這類食品可作為保健食品使用。
在大多數釀造的食品中，包括清酒、豆瓣醬(味噌)和醬油，已知通過在培養基中共培養的一些微生物之間的共生或拮抗作用可以產生獨特的風味和味道以及一些組分。但是，通過所謂共培養僅有少數幾種乳酸菌或其發酵食品產生，且人們對乳酸菌的生理活性也一直不了解。
本
發明內容
本發明的目的在于提供包含混有酵母的乳酸菌的未處理或處理的培養物的組合物，還涉及含所述組合物的功能性食品。
本發明的發明人為解決上面提到的問題進行了巨大的努力，并且發現混有酵母的乳酸菌的培養物或經處理的該培養物能顯示各種功能。由此，完成了本發明。
本發明提供一種含至少三種乳酸菌的未處理或處理的培養物組合物，所述乳酸菌選自德氏乳桿菌(Lactobacillus delbrueckii)、嗜酸乳桿菌(Lactococcus acidophilus)、植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)、發酵乳桿菌(Lactobacillus fermentium)、干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei)、鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)和嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermaphilus)，它們與啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)混合。用于本發明中的混合微生物包括德氏乳桿菌、干酪乳桿菌、乳酸乳球菌和啤酒酵母；嗜酸乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、乳酸乳球菌和啤酒酵母；植物乳桿菌、干酪乳桿菌、嗜熱鏈球菌和啤酒酵母；以及發酵乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、嗜熱鏈球菌和啤酒酵母。
另外，本發明還提供含所述組合物的功能性食品。
本說明書包括如日本專利申請JP 98/24892的說明書和/或附圖中公開的部分或全部內容，該專利申請為本申請的優先權書面證明。
下面對本發明予以更詳細的說明。
本發明的組合物包括通過培養(共培養)含乳酸菌和酵母的混合微生物得到的培養物，或經處理的該培養物。
乳酸菌包括屬于乳酸桿菌屬、乳球菌屬或鏈球菌屬的那些，如德氏乳桿菌、嗜酸乳桿菌、植物乳桿菌、發酵乳桿菌、干酪乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、乳酸乳球菌和嗜熱鏈球菌。
酵母包括啤酒酵母。
使用的所述微生物通常可從市場上買到；它們不限于所述微生物的特殊菌株，只要這些微生物的未處理或處理的共培養物能作為功能性食品使用就行。例如，屬于乳酸桿菌屬的乳酸菌包括德氏乳桿菌菌株ALAL007、嗜酸乳桿菌菌株ALAL005、植物乳桿菌菌株ALAL006、發酵乳桿菌菌株ALAL001和JCM1173、干酪乳桿菌菌株ALAL002、ALAL003和JCM1053，以及鼠李糖乳桿菌菌株ALAL004、ALAL010和JCM1136；屬于乳球菌屬的乳酸菌包括乳酸乳球菌霍氏亞種(Lactococcus lactis subsp hordinae)菌株ALAL008和ALAL009；屬于鏈球菌屬的乳酸菌包括嗜熱鏈球菌菌株ALAL011和ALAL012；以及酵母包括(例如)啤酒酵母菌株JCM1499、ALAY001、ALAY002、ALAY003和ALAY004。
啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株ALAY001、發酵乳桿菌(Lactobacillus fermentum)菌株ALAL001、干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei)菌株ALAL003和鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus)菌株ALAL004已在1997年11月28日按布達佩斯條約保藏在日本國立生命科學與人體技術研究所(National Institute of Bioscience and Human-Technology，Agency of Industrial Science and Technology)(1-3 Higashi1-chome，Tsukubashi，Ibaraki，305-0046，Japan)，保藏號分別為FERMBP-6626、6627、6628和6629。
按照本發明，混合微生物由至少三種任選的乳酸菌和一種酵母組成。例如，按表1列出的微生物的組合可以是A到D組的任意一組。
表1
可以單獨使用A組到D組中的任一組(4種微生物菌株)，或將其兩組或更多組組合起來。若在有待組合和使用的兩組或更多組中包含了同一種類的微生物(例如，當組A和C有待組合時，干酪乳桿菌和啤酒酵母重疊)，應使用同一種類的不同菌株。
本發明的組合物可通過在含大豆的熱水提取物的培養基中培養含乳酸菌和酵母的混合微生物來獲得。
培養基含大豆的熱水提取物。在把每毫升1×105-1×106的各乳酸菌與每毫升1×104-1×106酵母混合后，將混合微生物在所述培養基中接種并于20-37℃下培養4-10天。
當來自不同組的許多微生物有待組合時，將待組合的各組先在上述條件下培養再彼此混合，接著在上述條件下再培養。
培養后，將培養物在80℃下煮沸以滅菌和回收。
本發明的組合物可通過冷凍或噴霧干燥培養物而得到。用另一種方法是，培養物用過濾或離心或用其他方法進行處理以使上清液與細胞分離。在這種情況下，上清液和細胞可同樣被冷凍或噴霧干燥，以分別制備本發明的組合物。
本發明的組合物可以以任何形式存在并可處理成液體、固體、顆粒或諸如此類。顆粒狀是優選的，因為顆粒便于操作。
當處理成顆粒時，可將其包含在多糖如環糊精中。
用上述方法獲得的本發明組合物具有多種活性，因此可以用作具有某些功能的保健食品(功能性食品)。所述活性包括(例如)改進肝和腎功能的活性，抗致突變活性，抑制腫瘤細胞生長活性和改進腸道細菌菌叢活性。
當通常以顆粒狀存在時，本發明的組合物可通過吃顆粒狀的組合物本身或將適當的量顆粒狀組合物加到食品中作為功能性食品來使用。
食品包括(但不限于)例如餅狀物如果凍和糖果、飲料如果汁、茶和營養飲料以及米飯。
可對加到食品中的本發明組合物的數量和比例適當加以調節，一般每種食品為0.1-1％(按重量計)。
附圖簡述
圖1表明根據本發明的組合物改善肝功能的活性。
圖2表明根據本發明的組合物改善腎功能的活性。
圖3表明根據本發明的組合物改善腎功能的活性。
圖4表明根據本發明的組合物改善腎功能的活性。
圖5表明根據本發明的組合物改善肝功能的活性。
圖6表明試驗鼠體重的變化。
圖7表明根據本發明的組合物抑制致癌作用的活性。
圖8表明根據本發明的組合物抗致突變作用的活性。
完成本發明的最好方式通過下面的實施例對本發明進行更詳細地說明。但是，本發明的范圍不限于這些實施例。實施例1組合物的制備將八(8)種、12個乳酸菌菌株和一種、4個酵母菌株分成4組(組A-D)，如表2所示。
表2
對于各組，將分別含有4個菌株的預培養物接種到大豆的熱水提取物中(各菌株分別為乳酸菌--1×105～1×106/ml；酵母--1×104～1×105/ml)并在20～37℃下培養5-10天。
將各培養物和新鮮培養基混合并在20～37℃下繼續培養2～5天。培養后，將培養物加熱消毒并凍干，每升產生90克的干產物。另一方面，將培養物過濾并將清液凍干，每升得到40克干產物。
在如此獲得的組合物中，將從培養物本身得到的那些和從清液中得到的那些組合物分別命名為RS-II和RS-I。實施例2改善肝功能活性試驗(對施用了膽汁酸的患肝病鼠的作用)脫氧膽酸(下文稱之為DCA)是一種由腸細菌從膽酸產生的有代表性的次級膽汁酸。DCA是高度有毒的，并且已知它是引起試驗動物患膽汁郁積性肝病的原因。此外，據報道DCA還可能是導致急性胰腺炎和結腸癌的因素。
膽汁酸在血液和膽汁中的含量和組成可能隨個體的飲食習慣和生理狀態的不同而不同，例如，已知糖尿病患者和糖尿病試驗動物模型的膽汁中的DCA量明顯增高。此種效應對于活體而言是極其重要的。
因此，為了研究本發明組合物的對肝病的作用效果，用DCA來誘發肝病。(1)方法從Charles River購進5周齡Wistar雄鼠，在空調良好的飼養室預飼養1周，室內溫度控制在23±1℃，濕度為50±5％，光周期循環為12小時光照/12小時暗。6周齡時，將鼠分成兩組，每組6只鼠，使各組體重平均值和偏差彼此基本相同，一組給藥本發明組合物，而另一組為對照組。給給藥組飼喂含0.5％DCA和5％RS-I的MF粉狀飼料(東方酵母有限公司)，而給對照組飼喂僅含0.5％DCA的MF粉狀飼料。這些飼料與自來水一起由兩組鼠自由采食6周。
從開始給藥的第0、2、4和6周時，從尾部靜脈取血并分離出血清。測量谷草轉氨酶(GOT)、谷丙轉氨酶(GPT)、血脲氮(BUN)、尿酸(UA)和膽甾醇(CHL)的值。給藥5周時，用代謝籠測尿量和尿中的電解質濃度。給藥后，殺死小鼠并進行解剖。稱量器官重量并從采集的血液中分離出血清，分析該血清的生化性能。(2)結果當輸入DCA時，鼠的血清GOT活性迅速增加。在對照組中，第2周時該活性升至1366±467(Karmen)和如圖1A所示的5122±1848(Karmen)。相反，在RS-I給藥組中，第2周時為406±88(Karmen)。由此，GOT活性的升高被顯著地抑制(P＜0.05)。即使在第4周時，也僅有1636±630(Karmen)，這表明GOT活性的升高趨于被抑制(圖1A)。另一方面，還可觀察到血清GPT活性的升高如同GOT活性一樣被抑制(圖1B)。
對于BUN值來說，RS-I給藥組在第4和6周時與對照組比較明顯表現出較低的值(P＜0.01)(圖2)。觀察到RS-I給藥對UA和CHL沒有影響。
RS-I給藥組在第5周時傾向表現排泄出大量的尿(圖3A)并且對喝入的水量排泄的比例也較大(圖3B)。
RS-I給藥組與對照組之間在尿中電解度濃度上沒有區別。在對照組中，尿量更多些，因此排泄的電解質量也多些(圖4)。
根據給藥DCA后的血清生化分析，對于總蛋白質(TP)、堿性磷酸酶(ALP)、r-谷氨酰基肽基轉移酶(r-GPT)、亮氨酸氨肽酶(LAP)、葡萄糖(GLU)、總膽甾醇(T-CHL)、類脂過氧化物(LPO)、β-脂蛋白(β-LP)和膽紅素的數值沒有觀察到因給藥RS-I而有變化。但是血清中總膽汁酸的濃度在對照組中為81±36(nmol/ml)而在RS-I給藥組中為46±34(nmol/ml)。因此，與對照組比較，RS-I給藥組血清中的總膽汁酸趨于顯示低濃度。
顯示出RS-I給藥抑制由DCA的輸入引起的血清GOT和GPT活性提高，因此證明RS-I對改善肝功能損傷是有用的。
此外，RS-I給藥降低了血清BUN值和增大了排泄的尿量。因此，發現RS-I具有改善腎功能損傷的活性。實施例3對半乳糖胺肝病大鼠的作用在本實施例中，研究RS-I給藥對肝病的作用，此肝病具有不同于實施例1由DCA誘導模式的機理。(1)方法由Charles River購得5周齡Wistar雄性大鼠，在空調良好的飼養室內預飼養1周，室內控制溫度為23±1℃，濕度50±5％，光周期循環為12小時照明/12小時暗。6周齡時，把大鼠分成兩組，每組6只，以使各組中的體重平均值和偏差基本上彼此相同，一組給藥本發明的組合物，而另一組為對照組。給給藥組飼喂含5％RS-I的MF粉狀飼料，而對照組飼喂MF粉狀飼料。這些飼料與自來水一起由兩組的大鼠自由采食3周。
在以RS-I飼料飼喂第3周時，腹膜內注射約1ml的D-半乳糖胺鹽酸鹽水溶液，所述溶液事先已制備好，以使大鼠每kg體重給藥500mg的D-半乳糖胺鹽酸鹽。在半乳糖胺給藥后第1、2、3和6天，從尾靜脈取血并化驗血清的GOT、CHL、GLU和BUN值。(2)結果半乳糖胺給藥后，大鼠血清GOT迅速升高。1天時，對照組血清GOT值升至5148±1711(Karmen)(圖5)而RS-I給藥組的血清GOT為2244±1241(Karmen)。這樣，由于半乳糖胺使RS-I給藥顯示出明顯抑制GOT活性的上升(P＜0.05)(圖5)。未觀察到RS-I給藥對血清CHL、GLU和BUN值有任何影響。實施例4對DMH結腸癌變鼠的作用在本例中，使用由二甲基肼(DMH)誘導的結腸癌變鼠完成下面有關本發明組合物抑制致癌作用的實驗。(1)方法使CF#1(其品系保留在物理與化學研究所內)鼠交配，并飼養60只雄鼠。該品系小鼠對DMH特別敏感，尤其是能誘導結腸息肉。進行飼養的條件是溫度為23±1℃，濕度為50±5％和光周期循環為12小時光照/12小時黑暗。作為喂養的飼料，由東方酵母有限公司生產的專用飼料(CMF)與自來水一起自由地供應。
第5周時，按表3所列將鼠分成3組(每組20只)，以便體重的平均值和誤差相同(圖6)。正如表3所示，三個組是由RS-II給藥組、RS-I給藥組和對照組組成，各組按所列的各自量給藥。按每kg體重20mg給小鼠腹膜內注射DMH溶液，每周一次，共10周。給對照組只飼喂CMF。
表3
在DMH給藥后35周時(40周齡)觀察所述三組小鼠的結腸息肉。(2)結果對照組息肉發生率為94％而RS-II給藥組為65％。這樣，給藥組與對照組相比，發生率顯著降低(P＜0.05)(圖7A)。然而，RS-I給藥組顯示的息肉發生率為94％，與觀察到的對照組沒有差別。
對照組每只小鼠息肉數為4.0±2.7(平均值±標準偏差)，而在RS-II給藥組為1.4±1.5，顯著(P＜0.01)低于對照組(圖7B)。RS-I給藥組顯示息肉數為2.7±1.9，也顯著(P＜0.05)低于對照組的數值(圖7B)。
對照組腫塊尺寸為3.1±1.8mm，RS-II給藥組為2.5±1.3mm。RS-II給藥組與對照組相比，顯示出腫塊尺寸顯著(P＜0.05)地小(圖7C)。
根據上述結果，可以認識到本發明的組合物具有抑制致癌作用。實施例5由乳酸菌產生的物質的抗致突變試驗已知大多數具有致突變作用的物質都有致癌性。
由于實施例4的結果顯示本發明的組合物能抑制結腸癌，所以提出本發明的組合物也具有抑制致突變的作用。
由此，研究本發明的組合物對下列致突變物質的作用。(1)實驗方法(i)致突變物質將4-硝基喹啉-1-氧化物(4NQO0.25μg/平板)、N-甲基-N′-硝基-N-亞硝基胍(MNNG0.5μg/平板)和3-氨基-1-甲基-5H-吡啶并(4，3-b)吲哚乙酸酯(Trp-P-25μg/平板)分別溶解于DMSO中。
Trp-P-2是燃燒蛋白質或氨基酸如燒魚時產生的物質。MNNG是引起胃癌的一種物質。(ii)抗致突變試驗抗致突變試驗是由Ames法完成的。所用試驗細胞是鼠傷寒桿菌(Salmonella typhimurium)菌株TA100(his+)。菌株TA100在營養肉湯中培養過夜并用Na-K緩沖液洗滌。將懸浮液中細胞的最終濃度調節到約2×109/ml。
把干燥的RS-I產品按各濃度溶解在滅菌水中。按順序往試管中加RS-I溶液、100μl致突變物質、0.5ml S9混合物或Na-K緩沖液以及有待試驗的0.5ml細菌溶液。于37℃下反應30分鐘后，進行離心并棄去上清液。加入含組氨酸(1μM)和生物素(1μM)的軟瓊脂，再于葡萄糖瓊脂基本培養基中接種。將其在37℃下培養并于2或3天后計數菌落數。(2)結果對于4NQO，在0.06mg/平板的RS-I濃度下突變抑制作用為64％；對于MNNG，在0.25mg/平板的RS-I濃度下為86％；而對于Trp-P-2，在0.5mg/平板的RS-I濃度下為72％(圖8)。試驗DMH、苯并芘(BP)和DCA的濃度分別達到20μg/平板、20μg/平板和0.5μg/平板，但通過這些物質未出現菌株TA100的致突變作用。因此，未檢測到RS-I的抑制率。
根據上述結果，已發現本發明的組合物對4NQO、MNNG和Trp-P-2具有抗致突變活性作用。實施例6改進腸內微生物區系的活性實施本例是為了檢驗由本發明組合物改進腸內菌叢的活性，通過改進人腸內菌叢有助于增強人體的健康，也就是說，在抑制腸內有害細菌如大腸桿菌(Escherichia coli)生長的同時，增加有益細菌包括雙岐桿菌(Bifi-dobacterium)和乳桿菌的數量。(1)實驗方法(i)在液體培養基中的抗菌性能的研究使用的培養基是含腦心浸液的培養基(Difco)和適于好氧細菌的ABCM培養基(Eiken)和GAM培養基(Nissui Seiyaku)或加入有半態-維生素K3的GAM培養基和適于厭氧細菌的ABCM培養基。把培養基分配到小試管中，各2ml，以1％(w/v)的濃度加入溶于相同培養基中的RS-I。
將含指定預培養細胞的細胞溶液(表4)稀釋至最終濃度1×105/ml，加到上述培養基中再于37℃下培養18-24小時，使用微量培養板讀出器(Bio-Rad，型號3550)測量655nm下的吸收值，再把如此測量的濁度表達成相對對照值(100)的相對值并表示生長率。(2)結果正如從表4中的結果所見，顯示本發明組合物在1％的濃度時促進有益菌如雙岐桿菌和乳桿菌(表4，上部)生長的活性。另一方面，還觀察到了抑制有害菌如大腸桿菌和擬桿菌(Bacteroides)(表4，下部)生長的活性。
表4<
本文引證的全部出版物，專利和專利說明書在此以其整體引入作為參考。
工業用途根據本發明，提供了乳酸菌混有酵母的組合物或未處理或處理的培養物以及含所述組合物的功能性食品。由此，能期望本發明的組合物可促進人腸內有益細菌如雙岐桿菌和乳桿菌的生長并且抑制有害細菌如大腸桿菌的生長，因此對促進人體的健康能作出貢獻。
權利要求
1.一種含混合微生物的未處理或處理的培養物的組合物，其中所述微生物包括與啤酒酵母混合的至少三種乳酸菌，該乳酸菌選自德氏乳桿菌、嗜酸乳桿菌、植物乳桿菌、發酵乳桿菌、干酪乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、乳酸乳球菌和嗜熱鏈球菌。
2.按權利要求1所述的組合物，其中混合微生物是選自下列各組的至少一組德氏乳桿菌、干酪乳桿菌、乳酸乳球菌和啤酒酵母；嗜酸乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、乳酸乳球菌和啤酒酵母；植物乳桿菌、干酪乳桿菌、嗜熱鏈球菌和啤酒酵母；和發酵乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、嗜熱鏈球菌和啤酒酵母。
3.一種功能性食品，含有權利要求1或2的所述組合物。
全文摘要
本發明提供一種含混合物微生物的未處理或處理的培養物的組合物和一種含所述組合物的功能性食品。含混合微生物的未處理或處理的培養物的組合物含有與啤酵母濁合的至少三種乳酸菌,所述乳酸菌選自德氏乳桿菌、嗜酸乳桿菌、植物乳桿菌、發酵乳桿菌、干酪乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、乳酸乳球菌和嗜熱鏈球菌中的至少三種乳酸菌。
文檔編號C12R1/46GK1255943SQ9980011
公開日2000年6月7日 申請日期1999年2月4日 優先權日1998年2月5日
發明者水谷武夫, 新良一, 鈴木百百代, 三浦一志 申請人:理化學研究所, A·L·A·公司, 水谷武夫 被以下專利引用 (4),