一種新的多肽——人加雙氧酶13和編碼這種多肽的多核苷酸的制作方法

專(zhuān)利名稱(chēng)：一種新的多肽——人加雙氧酶13和編碼這種多肽的多核苷酸的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說(shuō)，本發(fā)明描述了一種新的多肽--人加雙氧酶13，以及編碼此多肽的多核苷酸序列。本發(fā)明還涉及此多核苷酸和多肽的制備方法和應(yīng)用。
這些加雙氧酶含有一個(gè)芳香環(huán)羥化酶成分，羥化酶有兩個(gè)亞單元，這兩個(gè)亞單元在不同的加雙氧酶中都很類(lèi)似。羥化酶成分中α-亞單元既結(jié)合了一個(gè)2Fe-2S型的鐵硫蛋白，又結(jié)合了一個(gè)鐵原子，而β-亞單元沒(méi)有包含任何可探測(cè)到的鐵原子或不穩(wěn)定的硫化合物(Neidle E.L.,Hartnett C.,Ornston N.L.,Bairoch A.,Rekik M.,Harayama S.1991 J.Bacteriol.173:5385-5395)。在α-亞單元蛋白的N末端有一個(gè)含24個(gè)氨基酸殘基的保守區(qū)域，該區(qū)域含有能結(jié)合鐵硫蛋白的2個(gè)半胱氨酸和2個(gè)組氨酸殘基。我們把該區(qū)域作為一個(gè)信號(hào)模式。
保守序列為C-x-H-R-[GA]-x(8)-G-N-x(5)-C-x-[FY]-H其中，2個(gè)C和2個(gè)H被認(rèn)為是[2Fe-2S]的配位體。
加雙氧酶的電子轉(zhuǎn)移成分N末端區(qū)域類(lèi)似于葉綠體型黃素蛋白，而C末端區(qū)域類(lèi)似于幾個(gè)氧化還原酶。電子轉(zhuǎn)移成分中有一個(gè)單獨(dú)的鐵硫黃素蛋白，具有NADH-細(xì)胞色素c的還原活性，使電子從NADH轉(zhuǎn)移到芳香環(huán)上，并使之羥化。
本次發(fā)現(xiàn)的加雙氧酶中芳香環(huán)羥化酶α-亞單元上的保守序列，有助于進(jìn)一步揭示黃素類(lèi)輔酶的作用機(jī)制，以及金屬離子例如Fe(Ⅱ)和金屬-硫簇在反應(yīng)中的催化性作用。
本發(fā)明的多肽被推斷鑒定為人加雙氧酶13。
由于如上所述人加雙氧酶13蛋白在機(jī)體重要功能中起重要作用，而且相信這些調(diào)節(jié)過(guò)程中涉及大量的蛋白，因而本領(lǐng)域中一直需要鑒定更多參與這些過(guò)程的人加雙氧酶13蛋白，特別是鑒定這種蛋白的氨基酸序列。新人加雙氧酶13蛋白編碼基因的分離也為研究確定該蛋白在健康和疾病狀態(tài)下的作用提供了基礎(chǔ)。這種蛋白可能構(gòu)成開(kāi)發(fā)疾病診斷和/或治療藥的基礎(chǔ)，因此分離其編碼DNA是非常重要的。
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供分離的新的多肽--人加雙氧酶13以及其片段、類(lèi)似物和衍生物。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供編碼該多肽的多核苷酸。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供含有編碼人加雙氧酶13的多核苷酸的重組載體。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供含有編碼人加雙氧酶13的多核苷酸的基因工程化宿主細(xì)胞。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供生產(chǎn)人加雙氧酶13的方法。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供針對(duì)本發(fā)明的多肽--人加雙氧酶13的抗體。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供了針對(duì)本發(fā)明多肽--人加雙氧酶13的模擬化合物、拮抗劑、激動(dòng)劑、抑制劑。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供診斷治療與人加雙氧酶13異常相關(guān)的疾病的方法。
本發(fā)明涉及一種分離的多肽，該多肽是人源的，它包含具有SEQ ID No.2氨基酸序列的多肽、或其保守性變體、生物活性片段或衍生物。較佳地，該多肽是具有SEQ ID NO:2氨基酸序列的多肽。
本發(fā)明還涉及一種分離的多核苷酸，它包含選自下組的一種核苷酸序列或其變體(a)編碼具有SEQ ID No.2氨基酸序列的多肽的多核苷酸；(b)與多核苷酸(a)互補(bǔ)的多核苷酸；(c)與(a)或(b)的多核苷酸序列具有至少70％相同性的多核苷酸。
更佳地，該多核苷酸的序列是選自下組的一種(a)具有SEQ ID NO:1中177-545位的序列；和(b)具有SEQ ID NO:1中1-864位的序列。
本發(fā)明另外涉及一種含有本發(fā)明多核苷酸的載體，特別是表達(dá)載體；一種用該載體遺傳工程化的宿主細(xì)胞，包括轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)或轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞；一種包括培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞和回收表達(dá)產(chǎn)物的制備本發(fā)明多肽的方法。
本發(fā)明還涉及一種能與本發(fā)明多肽特異性結(jié)合的抗體。
本發(fā)明還涉及一種篩選的模擬、激活、拮抗或抑制人加雙氧酶13蛋白活性的化合物的方法，其包括利用本發(fā)明的多肽。本發(fā)明還涉及用該方法獲得的化合物。
本發(fā)明還涉及一種體外檢測(cè)與人加雙氧酶13蛋白異常表達(dá)相關(guān)的疾病或疾病易感性的方法，包括檢測(cè)生物樣品中所述多肽或其編碼多核苷酸序列中的突變，或者檢測(cè)生物樣品中本發(fā)明多肽的量或生物活性。
本發(fā)明也涉及一種藥物組合物，它含有本發(fā)明多肽或其模擬物、激活劑、拮抗劑或抑制劑以及藥學(xué)上可接受的載體。
本發(fā)明還涉及本發(fā)明的多肽和/或多核苷酸在制備用于治療癌癥、發(fā)育性疾病或免疫性疾病或其它由于人加雙氧酶13表達(dá)異常所引起疾病的藥物的用途。
本發(fā)明的其它方面由于本文的技術(shù)的公開(kāi)，對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的。
本說(shuō)明書(shū)和權(quán)利要求書(shū)中使用的下列術(shù)語(yǔ)除非特別說(shuō)明具有如下的含義“核酸序列”是指寡核苷酸、核苷酸或多核苷酸及其片段或部分，也可以指基因組或合成的DNA或RNA，它們可以是單鏈或雙鏈的，代表有義鏈或反義鏈。類(lèi)似地，術(shù)語(yǔ)“氨基酸序列”是指寡肽、肽、多肽或蛋白質(zhì)序列及其片段或部分。
當(dāng)本發(fā)明中的“氨基酸序列”涉及一種天然存在的蛋白質(zhì)分子的氨基酸序列時(shí)，這種“多肽”或“蛋白質(zhì)”不意味著將氨基酸序列限制為與所述蛋白質(zhì)分子相關(guān)的完整的天然氨基酸。
蛋白質(zhì)或多核苷酸“變體”是指一種具有一個(gè)或多個(gè)氨基酸或核苷酸改變的氨基酸序列或編碼它的多核苷酸序列。所述改變可包括氨基酸序列或核苷酸序列中氨基酸或核苷酸的缺失、插入或替換。變體可具有“保守性”改變，其中替換的氨基酸具有與原氨基酸相類(lèi)似的結(jié)構(gòu)或化學(xué)性質(zhì)，如用亮氨酸替換異亮氨酸。變體也可具有非保守性改變，如用色氨酸替換甘氨酸。
“缺失”是指在氨基酸序列或核苷酸序列中一個(gè)或多個(gè)氨基酸或核苷酸的缺失。
“插入”或“添加”是指在氨基酸序列或核苷酸序列中的改變導(dǎo)致與天然存在的分子相比，一個(gè)或多個(gè)氨基酸或核苷酸的增加?！疤鎿Q”是指由不同的氨基酸或核苷酸替換一個(gè)或多個(gè)氨基酸或核苷酸。
“生物活性”是指具有天然分子的結(jié)構(gòu)、調(diào)控或生物化學(xué)功能的蛋白質(zhì)。類(lèi)似地，術(shù)語(yǔ)“免疫學(xué)活性”是指天然的、重組的或合成蛋白質(zhì)及其片段在合適的動(dòng)物或細(xì)胞中誘導(dǎo)特定免疫反應(yīng)以及與特異性抗體結(jié)合的能力。
“激動(dòng)劑”是指當(dāng)與人加雙氧酶13結(jié)合時(shí)，一種可引起該蛋白質(zhì)改變從而調(diào)節(jié)該蛋白質(zhì)活性的分子。激動(dòng)劑可以包括蛋白質(zhì)、核酸、碳水化合物或任何其它可結(jié)合人加雙氧酶13的分子。
“拮抗劑”或“抑制物”是指當(dāng)與人加雙氧酶13結(jié)合時(shí)，一種可封閉或調(diào)節(jié)人加雙氧酶13的生物學(xué)活性或免疫學(xué)活性的分子。拮抗劑和抑制物可以包括蛋白質(zhì)、核酸、碳水化合物或任何其它可結(jié)合人加雙氧酶13的分子。
“調(diào)節(jié)”是指人加雙氧酶13的功能發(fā)生改變，包括蛋白質(zhì)活性的升高或降低、結(jié)合特性的改變及人加雙氧酶13的任何其它生物學(xué)性質(zhì)、功能或免疫性質(zhì)的改變。
＂基本上純＂是指基本上不含天然與其相關(guān)的其它蛋白、脂類(lèi)、糖類(lèi)或其它物質(zhì)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能用標(biāo)準(zhǔn)的蛋白質(zhì)純化技術(shù)純化人加雙氧酶13。基本上純的人加雙氧酶13在非還原性聚丙烯酰胺凝膠上能產(chǎn)生單一的主帶。人加雙氧酶13多肽的純度可用氨基酸序列分析。
“互補(bǔ)的”或“互補(bǔ)”是指在允許的鹽濃度和溫度條件下通過(guò)堿基配對(duì)的多核苷酸天然結(jié)合。例如，序列“C-T-G-A”可與互補(bǔ)的序列“G-A-C-T”結(jié)合。兩個(gè)單鏈分子之間的互補(bǔ)可以是部分的或全部的。核酸鏈之間的互補(bǔ)程度對(duì)于核酸鏈之間雜交的效率及強(qiáng)度有明顯影響。
“同源性”是指互補(bǔ)的程度，可以是部分同源或完全同源?！安糠滞础笔侵敢环N部分互補(bǔ)的序列，其至少可部分抑制完全互補(bǔ)的序列與靶核酸的雜交。這種雜交的抑制可通過(guò)在嚴(yán)格性程度降低的條件下進(jìn)行雜交(Southern印跡或Northern印跡等)來(lái)檢測(cè)。基本上同源的序列或雜交探針可競(jìng)爭(zhēng)和抑制完全同源的序列與靶序列在的嚴(yán)格性程度降低的條件下的結(jié)合。這并不意味嚴(yán)格性程度降低的條件允許非特異性結(jié)合，因?yàn)閲?yán)格性程度降低的條件要求兩條序列相互的結(jié)合為特異性或選擇性相互作用。
“相同性百分率”是指在兩種或多種氨基酸或核酸序列比較中序列相同或相似的百分率?？捎秒娮臃椒y(cè)定相同性百分率，如通過(guò)MEGALIGN程序(Lasergene softwarepackage,DNASTAR,Inc.,Madison Wis.)。MEGALIGN程序可根據(jù)不同的方法如Cluster法比較兩種或多種序列(Higgins,D.G.和P.M.Sharp(1988)Gene 73:237-244)。Cluster法通過(guò)檢查所有配對(duì)之間的距離將各組序列排列成簇。然后將各簇以成對(duì)或成組分配。兩個(gè)氨基酸序列如序列A和序列B之間的相同性百分率通過(guò)下式計(jì)算序列A與序列B之間匹配的殘基個(gè)數(shù)100(序列A的殘基數(shù)-序列A中間隔殘基數(shù)-序列B中間隔殘基數(shù))也可以通過(guò)Cluster法或用本領(lǐng)域周知的方法如Jotun Hein測(cè)定核酸序列之間的相同性百分率(Hein J.,(1990)Methods in emzumology 183:625-645)。
“相似性”是指氨基酸序列之間排列對(duì)比時(shí)相應(yīng)位置氨基酸殘基的相同或保守性取代的程度。用于保守性取代的氨基酸例如，帶負(fù)電荷的氨基酸可包括天冬氨酸和谷氨酸；帶正電荷的氨基酸可包括賴(lài)氨酸和精氨酸；具有不帶電荷的頭部基團(tuán)有相似親水性的氨基酸可包括亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸；甘氨酸和丙氨酸；天冬酰胺和谷氨酰胺；絲氨酸和蘇氨酸；苯丙氨酸和酪氨酸。
“反義”是指與特定的DNA或RNA序列互補(bǔ)的核苷酸序列?！胺戳x鏈”是指與“有義鏈”互補(bǔ)的核酸鏈。
“衍生物”是指HFP或編碼其的核酸的化學(xué)修飾物。這種化學(xué)修飾物可以是用烷基、?；虬被鎿Q氫原子。核酸衍生物可編碼保留天然分子的主要生物學(xué)特性的多肽。
“抗體”是指完整的抗體分子及其片段，如Fa、F(ab’)2及Fv，其能特異性結(jié)合人加雙氧酶13的抗原決定簇。
“人源化抗體”是指非抗原結(jié)合區(qū)域的氨基酸序列被替換變得與人抗體更為相似，但仍保留原始結(jié)合活性的抗體。
“分離的”一詞指將物質(zhì)從它原來(lái)的環(huán)境(例如，若是自然產(chǎn)生的就指其天然環(huán)境)之中移出。比如說(shuō)，一個(gè)自然產(chǎn)生的多核苷酸或多肽存在于活動(dòng)物中就是沒(méi)有被分離出來(lái)，但同樣的多核苷酸或多肽同一些或全部在自然系統(tǒng)中與之共存的物質(zhì)分開(kāi)就是分離的。這樣的多核苷酸可能是某一載體的一部分，也可能這樣的多核苷酸或多肽是某一組合物的一部分。既然載體或組合物不是它天然環(huán)境的成分，它們?nèi)匀皇欠蛛x的。
如本發(fā)明所用，“分離的”是指物質(zhì)從其原始環(huán)境中分離出來(lái)(如果是天然的物質(zhì)，原始環(huán)境即是天然環(huán)境)。如活體細(xì)胞內(nèi)的天然狀態(tài)下的多聚核苷酸和多肽是沒(méi)有分離純化的，但同樣的多聚核苷酸或多肽如從天然狀態(tài)中同存在的其他物質(zhì)中分開(kāi)，則為分離純化的。
如本文所用，“分離的人加雙氧酶13”是指人加雙氧酶13基本上不含天然與其相關(guān)的其它蛋白、脂類(lèi)、糖類(lèi)或其它物質(zhì)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能用標(biāo)準(zhǔn)的蛋白質(zhì)純化技術(shù)純化人加雙氧酶13?；旧霞兊亩嚯脑诜沁€原聚丙烯酰胺凝膠上能產(chǎn)生單一的主帶。人加雙氧酶13多肽的純度能用氨基酸序列分析。
本發(fā)明提供了一種新的多肽--人加雙氧酶13，其基本上是由SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列組成的。本發(fā)明的多肽可以是重組多肽、天然多肽、合成多肽，優(yōu)選重組多肽。本發(fā)明的多肽可以是天然純化的產(chǎn)物，或是化學(xué)合成的產(chǎn)物，或使用重組技術(shù)從原核或真核宿主(例如，細(xì)菌、酵母、高等植物、昆蟲(chóng)和哺乳動(dòng)物細(xì)胞)中產(chǎn)生。根據(jù)重組生產(chǎn)方案所用的宿主，本發(fā)明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本發(fā)明的多肽還可包括或不包括起始的甲硫氨酸殘基。
本發(fā)明還包括人加雙氧酶13的片段、衍生物和類(lèi)似物。如本發(fā)明所用，術(shù)語(yǔ)“片段”、“衍生物”和“類(lèi)似物”是指基本上保持本發(fā)明的人加雙氧酶13相同的生物學(xué)功能或活性的多肽。本發(fā)明多肽的片段、衍生物或類(lèi)似物可以是(Ⅰ)這樣一種，其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基被保守或非保守氨基酸殘基(優(yōu)選的是保守氨基酸殘基)取代，并且取代的氨基酸可以是也可以不是由遺傳密碼子編碼的；或者(Ⅱ)這樣一種，其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基上的某個(gè)基團(tuán)被其它基團(tuán)取代包含取代基；或者(Ⅲ)這樣一種，其中成熟多肽與另一種化合物(比如延長(zhǎng)多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合；或者(Ⅳ)這樣一種，其中附加的氨基酸序列融合進(jìn)成熟多肽而形成的多肽序列(如前導(dǎo)序列或分泌序列或用來(lái)純化此多肽的序列或蛋白原序列)通過(guò)本文的闡述，這樣的片段、衍生物和類(lèi)似物被認(rèn)為在本領(lǐng)域技術(shù)人員的知識(shí)范圍之內(nèi)。
本發(fā)明提供了分離的核酸(多核苷酸)，基本由編碼具有SEQ ID NO:2氨基酸序列的多肽的多核苷酸組成。本發(fā)明的多核苷酸序列包括SEQ ID NO:1的核苷酸序列。本發(fā)明的多核苷酸是從人胎腦組織的cDNA文庫(kù)中發(fā)現(xiàn)的。它包含的多核苷酸序列全長(zhǎng)為864個(gè)堿基，其開(kāi)放讀框(177-545)編碼了122個(gè)氨基酸。此多肽具有加雙氧酶的特征序列，可推斷出該人加雙氧酶13具有加雙氧酶所代表的結(jié)構(gòu)和功能。
本發(fā)明的多核苷酸可以是DNA形式或是RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因組DNA或人工合成的DNA。DNA可以是單鏈的或是雙鏈的。DNA可以是編碼鏈或非編碼鏈。編碼成熟多肽的編碼區(qū)序列可以與SEQ ID NO:1所示的編碼區(qū)序列相同或者是簡(jiǎn)并的變異體。如本發(fā)明所用，“簡(jiǎn)并的變異體”在本發(fā)明中是指編碼具有SEQ ID NO:2的蛋白質(zhì)或多肽，但與SEQ ID NO:1所示的編碼區(qū)序列有差別的核酸序列。
編碼SEQ ID NO:2的成熟多肽的多核苷酸包括只有成熟多肽的編碼序列；成熟多肽的編碼序列和各種附加編碼序列；成熟多肽的編碼序列(和任選的附加編碼序列)以及非編碼序列。
術(shù)語(yǔ)“編碼多肽的多核苷酸”是指包括編碼此多肽的多核苷酸和包括附加編碼和/或非編碼序列的多核苷酸。
本發(fā)明還涉及上述描述多核苷酸的變異體，其編碼與本發(fā)明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片斷、類(lèi)似物和衍生物。此多核苷酸的變異體可以是天然發(fā)生的等位變異體或非天然發(fā)生的變異體。這些核苷酸變異體包括取代變異體、缺失變異體和插入變異體。如本領(lǐng)域所知的，等位變異體是一個(gè)多核苷酸的替換形式，它可能是一個(gè)或多個(gè)核苷酸的取代、缺失或插入，但不會(huì)從實(shí)質(zhì)上改變其編碼的多肽的功能。
本發(fā)明還涉及與以上所描述的序列雜交的多核苷酸(兩個(gè)序列之間具有至少50％，優(yōu)選具有70％的相同性)。本發(fā)明特別涉及在嚴(yán)格條件下與本發(fā)明所述多核苷酸可雜交的多核苷酸。在本發(fā)明中，“嚴(yán)格條件”是指(1)在較低離子強(qiáng)度和較高溫度下的雜交和洗脫，如0.2×SSC,0.1％SDS,60℃；或(2)雜交時(shí)加用變性劑，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll,42℃等；或(3)僅在兩條序列之間的相同性至少在95％以上，更好是97％以上時(shí)才發(fā)生雜交。并且，可雜交的多核苷酸編碼的多肽與SEQ ID NO:2所示的成熟多肽有相同的生物學(xué)功能和活性。
本發(fā)明還涉及與以上所描述的序列雜交的核酸片段。如本發(fā)明所用，”核酸片段”的長(zhǎng)度至少含10個(gè)核苷酸，較好是至少20-30個(gè)核苷酸，更好是至少50-60個(gè)核苷酸，最好是至少100個(gè)核苷酸以上。核酸片段也可用于核酸的擴(kuò)增技術(shù)(如PCR)以確定和/或分離編碼人加雙氧酶13的多核苷酸。
本發(fā)明中的多肽和多核苷酸優(yōu)選以分離的形式提供，更佳地被純化至均質(zhì)。
本發(fā)明的編碼人加雙氧酶13的特異的多核苷酸序列能用多種方法獲得。例如，用本領(lǐng)域熟知的雜交技術(shù)分離多核苷酸。這些技術(shù)包括但不局限于1)用探針與基因組或cDNA文庫(kù)雜交以檢出同源的多核苷酸序列，和2)表達(dá)文庫(kù)的抗體篩選以檢出具有共同結(jié)構(gòu)特征的克隆的多核苷酸片段。
本發(fā)明的DNA片段序列也能用下列方法獲得1)從基因組DNA分離雙鏈DNA序列；2)化學(xué)合成DNA序列以獲得所述多肽的雙鏈DNA。
上述提到的方法中，分離基因組DNA最不常用。DNA序列的直接化學(xué)合成是經(jīng)常選用的方法。更經(jīng)常選用的方法是cDNA序列的分離。分離感興趣的cDNA的標(biāo)準(zhǔn)方法是從高表達(dá)該基因的供體細(xì)胞分離mRNA并進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，形成質(zhì)?；蚴删wcDNA文庫(kù)。提取mRNA的方法已有多種成熟的技術(shù)，試劑盒也可從商業(yè)途徑獲得(Qiagene)。而構(gòu)建cDNA文庫(kù)也是通常的方法(Sambrook,et al.,MoleCularCloning,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory.New York,1989)。還可得到商業(yè)供應(yīng)的cDNA文庫(kù)，如Clontech公司的不同cDNA文庫(kù)。當(dāng)結(jié)合使用聚合酶反應(yīng)技術(shù)時(shí)，即使極少的表達(dá)產(chǎn)物也能克隆。
可用常規(guī)方法從這些cDNA文庫(kù)中篩選本發(fā)明的基因。這些方法包括(但不限于)(1)DNA-DNA或DNA-RNA雜交；(2)標(biāo)志基因功能的出現(xiàn)或喪失；(3)測(cè)定人加雙氧酶13的轉(zhuǎn)錄本的水平；(4)通過(guò)免疫學(xué)技術(shù)或測(cè)定生物學(xué)活性，來(lái)檢測(cè)基因表達(dá)的蛋白產(chǎn)物。上述方法可單用，也可多種方法聯(lián)合應(yīng)用。
在第(1)種方法中，雜交所用的探針是與本發(fā)明的多核苷酸的任何一部分同源，其長(zhǎng)度至少10個(gè)核苷酸，較好是至少30個(gè)核苷酸，更好是至少50個(gè)核苷酸，最好是至少100個(gè)核苷酸。此外，探針的長(zhǎng)度通常在2000個(gè)核苷酸之內(nèi)，較佳的為1000個(gè)核苷酸之內(nèi)。此處所用的探針通常是在本發(fā)明的基因序列信息的基礎(chǔ)上化學(xué)合成的DNA序列。本發(fā)明的基因本身或者片段當(dāng)然可以用作探針。DNA探針的標(biāo)記可用放射性同位素，熒光素或酶(如堿性磷酸酶)等。
在第(4)種方法中，檢測(cè)人加雙氧酶13基因表達(dá)的蛋白產(chǎn)物可用免疫學(xué)技術(shù)如Western印跡法，放射免疫沉淀法，酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)等。
應(yīng)用PCR技術(shù)擴(kuò)增DNA/RNA的方法(Saiki,et al.Science1985；230:1350-1354)被優(yōu)選用于獲得本發(fā)明的基因。特別是很難從文庫(kù)中得到全長(zhǎng)的cDNA時(shí)，可優(yōu)選使用RACE法(RACE-cDNA末端快速擴(kuò)增法)，用于PCR的引物可根據(jù)本文所公開(kāi)的本發(fā)明的多核苷酸序列信息適當(dāng)?shù)剡x擇，并可用常規(guī)方法合成。可用常規(guī)方法如通過(guò)凝膠電泳分離和純化擴(kuò)增的DNA/RNA片段。
如上所述得到的本發(fā)明的基因，或者各種DNA片段等的多核苷酸序列可用常規(guī)方法如雙脫氧鏈終止法(Sanger et al.PNAS,1977,74:5463-5467)測(cè)定。這類(lèi)多核苷酸序列測(cè)定也可用商業(yè)測(cè)序試劑盒等。為了獲得全長(zhǎng)的cDNA序列，測(cè)序需反復(fù)進(jìn)行。有時(shí)需要測(cè)定多個(gè)克隆的cDNA序列，才能拼接成全長(zhǎng)的cDNA序列。
本發(fā)明也涉及包含本發(fā)明的多核苷酸的載體，以及用本發(fā)明的載體或直接用人加雙氧酶13編碼序列經(jīng)基因工程產(chǎn)生的宿主細(xì)胞，以及經(jīng)重組技術(shù)產(chǎn)生本發(fā)明所述多肽的方法。
本發(fā)明中，編碼人加雙氧酶13的多核苷酸序列可插入到載體中，以構(gòu)成含有本發(fā)明所述多核苷酸的重組載體。術(shù)語(yǔ)“載體”指本領(lǐng)域熟知的細(xì)菌質(zhì)粒、噬菌體、酵母質(zhì)粒、植物細(xì)胞病毒、哺乳動(dòng)物細(xì)胞病毒如腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒或其它載體。在本發(fā)明中適用的載體包括但不限于在細(xì)菌中表達(dá)的基于T7啟動(dòng)子的表達(dá)載體(Rosenberg,et al.Gene,1987,56:125)；在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)的pMSXND表達(dá)載體(Lee and Nathans,J Bio Chem.263:3521,1988)和在昆蟲(chóng)細(xì)胞中表達(dá)的來(lái)源于桿狀病毒的載體。總之，只要能在宿主體內(nèi)復(fù)制和穩(wěn)定，任何質(zhì)粒和載體都可以用于構(gòu)建重組表達(dá)載體。表達(dá)載體的一個(gè)重要特征是通常含有復(fù)制起始點(diǎn)、啟動(dòng)子、標(biāo)記基因和翻譯調(diào)控元件。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的方法能用于構(gòu)建含編碼人加雙氧酶13的DNA序列和合適的轉(zhuǎn)錄/翻譯調(diào)控元件的表達(dá)載體。這些方法包括體外重組DNA技術(shù)、DNA合成技術(shù)、體內(nèi)重組技術(shù)等(Sambroook,et al.Molecular Cloning,a LaboratoryManual,cold Spring Harbor Laboratory.New York,1989)。所述的DNA序列可有效連接到表達(dá)載體中的適當(dāng)啟動(dòng)子上，以指導(dǎo)mRNA合成。這些啟動(dòng)子的代表性例子有大腸桿菌的lac或trp啟動(dòng)子；λ噬菌體的PL啟動(dòng)子；真核啟動(dòng)子包括CMV立即早期啟動(dòng)子、HSV胸苷激酶啟動(dòng)子、早期和晚期SV40啟動(dòng)子、反轉(zhuǎn)錄病毒的LTRs和其它一些已知的可控制基因在原核細(xì)胞或真核細(xì)胞或其病毒中表達(dá)的啟動(dòng)子。表達(dá)載體還包括翻譯起始用的核糖體結(jié)合位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄終止子等。在載體中插入增強(qiáng)子序列將會(huì)使其在高等真核細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄得到增強(qiáng)。增強(qiáng)子是DNA表達(dá)的順式作用因子，通常大約有10到300個(gè)堿基對(duì)，作用于啟動(dòng)子以增強(qiáng)基因的轉(zhuǎn)錄?？膳e的例子包括在復(fù)制起始點(diǎn)晚期一側(cè)的100到270個(gè)堿基對(duì)的SV40增強(qiáng)子、在復(fù)制起始點(diǎn)晚期一側(cè)的多瘤增強(qiáng)子以及腺病毒增強(qiáng)子等。
此外，表達(dá)載體優(yōu)選地包含一個(gè)或多個(gè)選擇性標(biāo)記基因，以提供用于選擇轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的表型性狀，如真核細(xì)胞培養(yǎng)用的二氫葉酸還原酶、新霉素抗性以及綠色熒光蛋白(GFP)，或用于大腸桿菌的四環(huán)素或氨芐青霉素抗性等。
本領(lǐng)域一般技術(shù)人員都清楚如何選擇適當(dāng)?shù)妮d體/轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件(如啟動(dòng)子、增強(qiáng)子等)和選擇性標(biāo)記基因。
本發(fā)明中，編碼人加雙氧酶13的多核苷酸或含有該多核苷酸的重組載體可轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)入宿主細(xì)胞，以構(gòu)成含有該多核苷酸或重組載體的基因工程化宿主細(xì)胞。術(shù)語(yǔ)“宿主細(xì)胞”指原核細(xì)胞，如細(xì)菌細(xì)胞；或是低等真核細(xì)胞，如酵母細(xì)胞；或是高等真核細(xì)胞，如哺乳動(dòng)物細(xì)胞。代表性例子有大腸桿菌，鏈霉菌屬；細(xì)菌細(xì)胞如鼠傷寒沙門(mén)氏菌；真菌細(xì)胞如酵母；植物細(xì)胞；昆蟲(chóng)細(xì)胞如果蠅S2或Sf9；動(dòng)物細(xì)胞如CHO、COS或Bowes黑素瘤細(xì)胞等。
用本發(fā)明所述的DNA序列或含有所述DNA序列的重組載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)技術(shù)進(jìn)行。當(dāng)宿主為原核生物如大腸桿菌時(shí)，能吸收DNA的感受態(tài)細(xì)胞可在指數(shù)生長(zhǎng)期后收獲，用CaCl2法處理，所用的步驟在本領(lǐng)域眾所周知。可供選擇的是用MgCl2。如果需要，轉(zhuǎn)化也可用電穿孔的方法進(jìn)行。當(dāng)宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉(zhuǎn)染方法磷酸鈣共沉淀法，或者常規(guī)機(jī)械方法如顯微注射、電穿孔、脂質(zhì)體包裝等。
通過(guò)常規(guī)的重組DNA技術(shù)，利用本發(fā)明的多核苷酸序列可用來(lái)表達(dá)或生產(chǎn)重組的人加雙氧酶13(Science,1984；224:1431)。一般來(lái)說(shuō)有以下步驟(1)．用本發(fā)明的編碼人人加雙氧酶13的多核苷酸(或變異體)，或用含有該多核苷酸的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)合適的宿主細(xì)胞；(2)．在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)宿主細(xì)胞；(3)．從培養(yǎng)基或細(xì)胞中分離、純化蛋白質(zhì)。
在步驟(2)中，根據(jù)所用的宿主細(xì)胞，培養(yǎng)中所用的培養(yǎng)基可選自各種常規(guī)培養(yǎng)基。在適于宿主細(xì)胞生長(zhǎng)的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)宿主細(xì)胞生長(zhǎng)到適當(dāng)?shù)募?xì)胞密度后，用合適的方法(如溫度轉(zhuǎn)換或化學(xué)誘導(dǎo))誘導(dǎo)選擇的啟動(dòng)子，將細(xì)胞再培養(yǎng)一段時(shí)間。
在步驟(3)中，重組多肽可包被于細(xì)胞內(nèi)、或在細(xì)胞膜上表達(dá)、或分泌到細(xì)胞外。如果需要，可利用其物理的、化學(xué)的和其它特性通過(guò)各種分離方法分離和純化重組的蛋白。這些方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。這些方法包括但并不限于常規(guī)的復(fù)性處理、蛋白沉淀劑處理(鹽析方法)、離心、滲透破菌、超聲波處理、超離心、分子篩層析(凝膠過(guò)濾)、吸附層析、離子交換層析、高效液相層析(HPLC)和其它各種液相層析技術(shù)及這些方法的結(jié)合。
本發(fā)明的多肽以及該多肽的拮抗劑、激動(dòng)劑和抑制劑可直接用于疾病治療，例如，可治療惡性腫瘤、腎上腺缺乏癥、皮膚病、各類(lèi)炎癥、HIV感染和免疫性疾病等。
羥基化加雙氧酶作為呼吸鏈復(fù)合物中的一個(gè)組成成分，具有黃素類(lèi)輔酶的作用機(jī)制，在電子轉(zhuǎn)遞過(guò)程中重要的，調(diào)控著生物體呼吸代謝的過(guò)程。羥基化加雙氧酶的α-亞單元是其功能所必需。羥基化加雙氧酶的α-亞單元特異的保守序列形成其活性所必需的motif。
由此可見(jiàn)，特異的羥基化加雙氧酶的α-亞單元motif的表達(dá)異常，將致使本發(fā)明的含此motif的多肽的功能異常，從而導(dǎo)致呼吸鏈氧化磷酸化過(guò)程異常，影響物質(zhì)與能量的代謝，并產(chǎn)生相關(guān)的疾病如物質(zhì)與能量代謝障礙性疾病、胚胎發(fā)育紊亂、生長(zhǎng)發(fā)育障礙、腫瘤等。
由此可見(jiàn)，本發(fā)明的人加雙氧酶13的表達(dá)異常將產(chǎn)生各種疾病尤其是物質(zhì)與能量代謝紊亂癥、胚胎發(fā)育紊亂癥、生長(zhǎng)發(fā)育障礙性疾病、各種腫瘤，這些疾病包括但不限于物質(zhì)與能量代謝紊亂癥異戊酸血癥，丙酸血癥，甲基丙二酸尿癥，聯(lián)合羧化酶缺陷，戊二酸血癥Ⅰ型，苯丙酮尿癥，白化病，色氨基血癥，甘氨酸血癥，高肌氨酸血癥，谷氨酸代謝缺陷病，尿素循環(huán)的代謝缺陷病，組氨酸代謝缺陷病，賴(lài)氨酸代謝缺陷病，粘脂貯積癥，雷-尼綜合癥，黃嘌呤尿癥，乳清酸尿癥，腺嘌呤核苷脫氨酶缺陷，高脂蛋白血癥，遺傳性果糖不耐受，半乳糖血癥，果糖代謝缺陷，糖原貯積癥胚胎發(fā)育紊亂癥先天性流產(chǎn)、腭裂、肢體缺如、肢體分化障礙、隱、先天性腹股溝疝、雙子宮、陰道閉鎖、尿道下裂、兩性畸形、房間隔缺損、室間隔缺損、肺動(dòng)脈狹窄、動(dòng)脈導(dǎo)管未閉、神經(jīng)管缺陷、先天性腦積水、虹膜缺損、先天性青光眼或白內(nèi)障、先天性耳聾生長(zhǎng)發(fā)育障礙性疾病精神發(fā)育遲緩，腦性癱瘓，腦發(fā)育障礙，智力障礙，家族性腦神經(jīng)核發(fā)育不全綜合癥，斜視，皮膚、脂肪和肌肉發(fā)育不良性疾病如先天性皮膚松弛癥、早老癥、先天性角化不良，呆小癥，侏儒癥，性發(fā)育遲緩癥各種腫瘤胃癌、肝癌、肺癌、食管癌、乳腺癌、白血病、淋巴瘤、甲狀腺腫瘤、子宮肌瘤、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、星形細(xì)胞瘤、室管膜瘤、膠質(zhì)細(xì)胞瘤、結(jié)腸癌、黑色素瘤、腎上腺癌、膀胱癌、骨癌、骨肉瘤、骨髓瘤、骨髓癌、腦癌、子宮癌、子宮內(nèi)膜癌、膽囊癌、結(jié)腸癌、胸腺腫瘤、鼻腔及鼻竇腫瘤、鼻咽癌、喉癌、氣管腫瘤、纖維瘤、纖維肉瘤、脂肪瘤、脂肪肉瘤、平滑肌瘤本發(fā)明的人加雙氧酶13的表達(dá)異常還將產(chǎn)生某些遺傳性，血液性疾病及免疫系統(tǒng)疾病等。
本發(fā)明的多肽以及該多肽的拮抗劑、激動(dòng)劑和抑制劑可直接用于疾病治療，例如，可治療各種疾病尤其是物質(zhì)與能量代謝紊亂癥、胚胎發(fā)育紊亂癥、生長(zhǎng)發(fā)育障礙性疾病、各種腫瘤、炎癥，某些遺傳性，血液性疾病及免疫系統(tǒng)疾病等。
本發(fā)明也提供了篩選化合物以鑒定提高(激動(dòng)劑)或阻遏(拮抗劑)人加雙氧酶13的藥劑的方法。激動(dòng)劑提高人加雙氧酶13刺激細(xì)胞增殖等生物功能，而拮抗劑阻止和治療與細(xì)胞過(guò)度增殖有關(guān)的紊亂如各種癌癥。例如，能在藥物的存在下，將哺乳動(dòng)物細(xì)胞或表達(dá)人加雙氧酶13的膜制劑與標(biāo)記的人加雙氧酶13一起培養(yǎng)。然后測(cè)定藥物提高或阻遏此相互作用的能力。
人加雙氧酶13的拮抗劑包括篩選出的抗體、化合物、受體缺失物和類(lèi)似物等。人加雙氧酶13的拮抗劑可以與人加雙氧酶13結(jié)合并消除其功能，或是抑制該多肽的產(chǎn)生，或是與該多肽的活性位點(diǎn)結(jié)合使該多肽不能發(fā)揮生物學(xué)功能。
在篩選作為拮抗劑的化合物時(shí)，可以將人加雙氧酶13加入生物分析測(cè)定中，通過(guò)測(cè)定化合物對(duì)人加雙氧酶13和其受體之間相互作用的影響來(lái)確定化合物是否是拮抗劑。用上述篩選化合物的同樣方法，可以篩選出起拮抗劑作用的受體缺失物和類(lèi)似物。能與人加雙氧酶13結(jié)合的多肽分子可通過(guò)篩選由各種可能組合的氨基酸結(jié)合于固相物組成的隨機(jī)多肽庫(kù)而獲得。篩選時(shí)，一般應(yīng)對(duì)人加雙氧酶13分子進(jìn)行標(biāo)記。
本發(fā)明提供了用多肽，及其片段、衍生物、類(lèi)似物或它們的細(xì)胞作為抗原以生產(chǎn)抗體的方法。這些抗體可以是多克隆抗體或單克隆抗體。本發(fā)明還提供了針對(duì)人加雙氧酶13抗原決定簇的抗體。這些抗體包括(但不限于)多克隆抗體、單克隆抗體、嵌合抗體、單鏈抗體、Fab片段和Fab表達(dá)文庫(kù)產(chǎn)生的片段。
多克隆抗體的生產(chǎn)可用人加雙氧酶13直接注射免疫動(dòng)物(如家兔，小鼠，大鼠等)的方法得到，多種佐劑可用于增強(qiáng)免疫反應(yīng)，包括但不限于弗氏佐劑等。制備人加雙氧酶13的單克隆抗體的技術(shù)包括但不限于雜交瘤技術(shù)(Kohler andMilstein.Nature,1975,256:495-497)，三瘤技術(shù)，人B-細(xì)胞雜交瘤技術(shù)，EBV-雜交瘤技術(shù)等。將人恒定區(qū)和非人源的可變區(qū)結(jié)合的嵌合抗體可用已有的技術(shù)生產(chǎn)(Morrison et al,PNAS,1985,81:6851)。而已有的生產(chǎn)單鏈抗體的技術(shù)(U.S.Pat No.4946778)也可用于生產(chǎn)抗人加雙氧酶13的單鏈抗體。
抗人加雙氧酶13的抗體可用于免疫組織化學(xué)技術(shù)中，檢測(cè)活檢標(biāo)本中的人加雙氧酶13。
與人加雙氧酶13結(jié)合的單克隆抗體也可用放射性同位素標(biāo)記，注入體內(nèi)可跟蹤其位置和分布。這種放射性標(biāo)記的抗體可作為一種非創(chuàng)傷性診斷方法用于腫瘤細(xì)胞的定位和判斷是否有轉(zhuǎn)移。
抗體還可用于設(shè)計(jì)針對(duì)體內(nèi)某一特殊部位的免疫毒素。如人加雙氧酶13高親和性的單克隆抗體可與細(xì)菌或植物毒素(如白喉毒素，蓖麻蛋白，紅豆堿等)共價(jià)結(jié)合。一種通常的方法是用巰基交聯(lián)劑如SPDP，攻擊抗體的氨基，通過(guò)二硫鍵的交換，將毒素結(jié)合于抗體上，這種雜交抗體可用于殺滅人加雙氧酶13陽(yáng)性的細(xì)胞。
本發(fā)明中的抗體可用于治療或預(yù)防與人加雙氧酶13相關(guān)的疾病。給予適當(dāng)劑量的抗體可以刺激或阻斷人加雙氧酶13的產(chǎn)生或活性。
本發(fā)明還涉及定量和定位檢測(cè)人加雙氧酶13水平的診斷試驗(yàn)方法。這些試驗(yàn)是本領(lǐng)域所熟知的，且包括FISH測(cè)定和放射免疫測(cè)定。試驗(yàn)中所檢測(cè)的人加雙氧酶13水平，可以用作解釋人加雙氧酶13在各種疾病中的重要性和用于診斷人加雙氧酶13起作用的疾病。
本發(fā)明的多肽還可用作肽譜分析，例如，多肽可用物理的、化學(xué)或酶進(jìn)行特異性切割，并進(jìn)行一維或二維或三維的凝膠電泳分析，更好的是進(jìn)行質(zhì)譜分析。
編碼人加雙氧酶13的多核苷酸也可用于多種治療目的?；蛑委熂夹g(shù)可用于治療由于人加雙氧酶13的無(wú)表達(dá)或異常/無(wú)活性表達(dá)所致的細(xì)胞增殖、發(fā)育或代謝異常。重組的基因治療載體(如病毒載體)可設(shè)計(jì)用于表達(dá)變異的人加雙氧酶13，以抑制內(nèi)源性的人加雙氧酶13活性。例如，一種變異的人加雙氧酶13可以是縮短的、缺失了信號(hào)傳導(dǎo)功能域的人加雙氧酶13，雖可與下游的底物結(jié)合，但缺乏信號(hào)傳導(dǎo)活性。因此重組的基因治療載體可用于治療人加雙氧酶13表達(dá)或活性異常所致的疾病。來(lái)源于病毒的表達(dá)載體如逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺病毒相關(guān)病毒、單純皰疹病毒、細(xì)小病毒等可用于將編碼人加雙氧酶13的多核苷酸轉(zhuǎn)移至細(xì)胞內(nèi)。構(gòu)建攜帶編碼人加雙氧酶13的多核苷酸的重組病毒載體的方法可見(jiàn)于已有文獻(xiàn)(Sambrook,et al.)。另外重組編碼人加雙氧酶13的多核苷酸可包裝到脂質(zhì)體中轉(zhuǎn)移至細(xì)胞內(nèi)。
多核苷酸導(dǎo)入組織或細(xì)胞內(nèi)的方法包括將多核苷酸直接注入到體內(nèi)組織中；或在體外通過(guò)載體(如病毒、噬菌體或質(zhì)粒等)先將多核苷酸導(dǎo)入細(xì)胞中，再將細(xì)胞移植到體內(nèi)等。
抑制人加雙氧酶13mRNA的寡核苷酸(包括反義RNA和DNA)以及核酶也在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。核酶是一種能特異性分解特定RNA的酶樣RNA分子，其作用機(jī)制是核酶分子與互補(bǔ)的靶RNA特異性雜交后進(jìn)行核酸內(nèi)切作用。反義的RNA和DNA及核酶可用已有的任何RNA或DNA合成技術(shù)獲得，如固相磷酸酰胺化學(xué)合成法合成寡核苷酸的技術(shù)已廣泛應(yīng)用。反義RNA分子可通過(guò)編碼該RNA的DNA序列在體外或體內(nèi)轉(zhuǎn)錄獲得。這種DNA序列已整合到載體的RNA聚合酶啟動(dòng)子的下游。為了增加核酸分子的穩(wěn)定性，可用多種方法對(duì)其進(jìn)行修飾，如增加兩側(cè)的序列長(zhǎng)度，核糖核苷之間的連接應(yīng)用磷酸硫酯鍵或肽鍵而非磷酸二酯鍵。
編碼人加雙氧酶13的多核苷酸可用于與人加雙氧酶13的相關(guān)疾病的診斷。編碼人加雙氧酶13的多核苷酸可用于檢測(cè)人加雙氧酶13的表達(dá)與否或在疾病狀態(tài)下人加雙氧酶13的異常表達(dá)。如編碼人加雙氧酶13的DNA序列可用于對(duì)活檢標(biāo)本進(jìn)行雜交以判斷人加雙氧酶13的表達(dá)狀況。雜交技術(shù)包括Southern印跡法，Northern印跡法、原位雜交等。這些技術(shù)方法都是公開(kāi)的成熟技術(shù)，相關(guān)的試劑盒都可從商業(yè)途徑得到。本發(fā)明的多核苷酸的一部分或全部可作為探針固定在微陣列(Microarray)或DNA芯片(又稱(chēng)為“基因芯片”)上，用于分析組織中基因的差異表達(dá)分析和基因診斷。用人加雙氧酶13特異的引物進(jìn)行RNA-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)體外擴(kuò)增也可檢測(cè)人加雙氧酶13的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。
檢測(cè)人加雙氧酶13基因的突變也可用于診斷人加雙氧酶13相關(guān)的疾病。人加雙氧酶13突變的形式包括與正常野生型人加雙氧酶13 DNA序列相比的點(diǎn)突變、易位、缺失、重組和其它任何異常等?？捎靡延械募夹g(shù)如Southern印跡法、DNA序列分析、PCR和原位雜交檢測(cè)突變。另外，突變有可能影響蛋白的表達(dá)，因此用Northern印跡法、Western印跡法可間接判斷基因有無(wú)突變。
本發(fā)明的序列對(duì)染色體鑒定也是有價(jià)值的。該序列會(huì)特異性地針對(duì)某條人染色體具體位置且并可以與其雜交。目前，需要鑒定染色體上的各基因的具體位點(diǎn)?，F(xiàn)在，只有很少的基于實(shí)際序列數(shù)據(jù)(重復(fù)多態(tài)性)的染色體標(biāo)記物可用于標(biāo)記染色體位置。根據(jù)本發(fā)明，為了將這些序列與疾病相關(guān)基因相關(guān)聯(lián)，其重要的第一步就是將這些DNA序列定位于染色體上。
簡(jiǎn)而言之，根據(jù)cDNA制備PCR引物(優(yōu)選15-35bp)，可以將序列定位于染色體上。然后，將這些引物用于PCR篩選含各條人染色體的體細(xì)胞雜合細(xì)胞。只有那些含有相應(yīng)于引物的人基因的雜合細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生擴(kuò)增的片段。
體細(xì)胞雜合細(xì)胞的PCR定位法，是將DNA定位到具體染色體的快捷方法。使用本發(fā)明的寡核苷酸引物，通過(guò)類(lèi)似方法，可利用一組來(lái)自特定染色體的片段或大量基因組克隆而實(shí)現(xiàn)亞定位?？捎糜谌旧w定位的其它類(lèi)似策略包括原位雜交、用標(biāo)記的流式分選的染色體預(yù)篩選和雜交預(yù)選，從而構(gòu)建染色體特異的cDNA庫(kù)。
將cDNA克隆與中期染色體進(jìn)行熒光原位雜交(FISH)，可以在一個(gè)步驟中精確地進(jìn)行染色體定位。此技術(shù)的綜述，參見(jiàn)Verma等，Human Chromosomes:a Manualof Basic Techniques,Pergamon Press,New York(1988)。
一旦序列被定位到準(zhǔn)確的染色體位置，此序列在染色體上的物理位置就可以與基因圖數(shù)據(jù)相關(guān)聯(lián)。這些數(shù)據(jù)可見(jiàn)于例如，V.Mckusick,MendelianInheritance in Man(可通過(guò)與Johns Hopkins University Welch Medical Library聯(lián)機(jī)獲得)。然后可通過(guò)連鎖分析，確定基因與業(yè)已定位到染色體區(qū)域上的疾病之間的關(guān)系。
接著，需要測(cè)定患病和未患病個(gè)體間的cDNA或基因組序列差異。如果在一些或所有的患病個(gè)體中觀察到某突變，而該突變?cè)谌魏握€(gè)體中未觀察到，則該突變可能是疾病的病因。比較患病和未患病個(gè)體，通常涉及首先尋找染色體中結(jié)構(gòu)的變化，如從染色體水平可見(jiàn)的或用基于cDNA序列的PCR可檢測(cè)的缺失或易位。根據(jù)目前的物理作圖和基因定位技術(shù)的分辨能力，被精確定位至與疾病有關(guān)的染色體區(qū)域的cDNA，可以是50至500個(gè)潛在致病基因間之一種(假定1兆堿基作圖分辨能力和每20kb對(duì)應(yīng)于一個(gè)基因)。
可以將本發(fā)明的多肽、多核苷酸及其模擬物、激動(dòng)劑、拮抗劑和抑制劑與合適的藥物載體組合后使用。這些載體可以是水、葡萄糖、乙醇、鹽類(lèi)、緩沖液、甘油以及它們的組合。組合物包含安全有效量的多肽或拮抗劑以及不影響藥物效果的載體和賦形劑。這些組合物可以作為藥物用于疾病治療。
本發(fā)明還提供含有一種或多種容器的藥盒或試劑盒，容器中裝有一種或多種本發(fā)明的藥用組合物成分。與這些容器一起，可以有由制造、使用或銷(xiāo)售藥品或生物制品的政府管理機(jī)構(gòu)所給出的指示性提示，該提示反映出生產(chǎn)、使用或銷(xiāo)售的政府管理機(jī)構(gòu)許可其在人體上施用。此外，本發(fā)明的多肽可以與其它的治療化合物結(jié)合使用。
藥物組合物可以以方便的方式給藥，如通過(guò)局部、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、鼻內(nèi)或皮內(nèi)的給藥途徑。人加雙氧酶13以有效地治療和/或預(yù)防具體的適應(yīng)癥的量來(lái)給藥。施用于患者的人加雙氧酶13的量和劑量范圍將取決于許多因素，如給藥方式、待治療者的健康條件和診斷醫(yī)生的判斷。
下列附圖用于說(shuō)明本發(fā)明的具體實(shí)施方案，而不用于限定由權(quán)利要求書(shū)所界定的本發(fā)明范圍。


圖1是本發(fā)明人加雙氧酶13在40-103共64個(gè)氨基酸和結(jié)構(gòu)域加雙氧酶的氨基酸序列同源性比較圖。上方序列是人加雙氧酶13，下方序列是結(jié)構(gòu)域加雙氧酶。相同氨基酸在兩個(gè)序列間用單字符氨基酸表示，相似氨基酸用“+”表示。
圖2為分離的人加雙氧酶13的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖(SDS-PAGE)。13kDa為蛋白質(zhì)的分子量。箭頭所指為分離出的蛋白條帶。
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New York:Cold SpringHarbor Laboratory Press,1989)中所述的條件，或按照制造廠(chǎng)商所建議的條件。實(shí)施例1人加雙氧酶13的克隆用異硫氰酸胍/酚/氯仿一步法提取人胎腦總RNA。用Quik mRNA Isolation Kit(Qiegene公司產(chǎn)品)從總RNA中分離poly(A)mRNA。2ug poly(A)mRNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄形成cDNA。用Smart cDNA克隆試劑盒(購(gòu)自Clontech)將cDNA片段定向插入到pBSK(+)載體(Clontech公司產(chǎn)品)的多克隆位點(diǎn)上，轉(zhuǎn)化DH5α，細(xì)菌形成cDNA文庫(kù)。用Dyeterminate cycle reaction sequencing kit(Perkin-Elmer公司產(chǎn)品)和ABI 377自動(dòng)測(cè)序儀(Perkin-Elmer公司)測(cè)定所有克隆的5＇和3＇末端的序列。將測(cè)定的cDNA序列與已有的公共DNA序列數(shù)據(jù)庫(kù)(Genebank)進(jìn)行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其中一個(gè)克隆0568d07的cDNA序列為新的DNA。通過(guò)合成一系列引物對(duì)該克隆所含的插入cDNA片段進(jìn)行雙向測(cè)定。結(jié)果表明，0568d07克隆所含的全長(zhǎng)cDNA為864bp(如Seq ID NO:1所示)，從第177bp至545bp有一個(gè)369bp的開(kāi)放閱讀框架(ORF)，編碼一個(gè)新的蛋白質(zhì)(如Seq IDNO:2所示)。我們將此克隆命名為pBS-0568d07，編碼的蛋白質(zhì)命名為人加雙氧酶13。
實(shí)施例2:cDNA克隆的結(jié)構(gòu)域分析將本發(fā)明的人加雙氧酶13的序列及其編碼的蛋白序列，用GCG中的profile scan程序(Basiclocal Alignment search tool)[Altschul,SF et al.J.Mol.Biol.1990:215:403-10]，在prosite等數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行結(jié)構(gòu)域分析。本發(fā)明的人加雙氧酶13在40-103與結(jié)構(gòu)域加雙氧酶有同源，同源結(jié)果示于圖1，同源率為23％，得分為14.75；閾值為14.45。實(shí)施例3用RT-PCR方法克隆編碼人加雙氧酶13的基因用胎腦細(xì)胞總RNA為模板，以oligo-dT為引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA，用Qiagene的試劑盒純化后，用下列引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增
Primer1:5’-ACGGCTGCGAGAAGACGAGGCTTA-3’(SEQ ID NO:3)Primer2:5’-AGAGGGGATTTTTATTTGTTTGAG-3’(SEQ ID NO:4)Primer1為位于SEQ ID NO:1的5’端的第1bp開(kāi)始的正向序列；Primer2為SEQ ID NO:1的中的3’端反向序列。
擴(kuò)增反應(yīng)的條件在50μl的反應(yīng)體積中含有50mmol/L KCl,10mmol/LTris-Cl,(pH8.5),1.5mmol/L MgCl2,200μmol/L dNTP,10pmol引物，1U的Taq DNA聚合酶(Clontech公司產(chǎn)品)。在PE9600型DNA熱循環(huán)儀(Perkin-Elmer公司)上按下列條件反應(yīng)25個(gè)周期94℃ 30sec；55℃ 30sec；72℃ 2min。在RT-PCR時(shí)同時(shí)設(shè)β-actin為陽(yáng)性對(duì)照和模板空白為陰性對(duì)照。擴(kuò)增產(chǎn)物用QIAGEN公司的試劑盒純化，用TA克隆試劑盒連接到pCR載體上(Invitrogen公司產(chǎn)品)。DNA序列分析結(jié)果表明PCR產(chǎn)物的DNA序列與SEQ ID NO:1所示的1-864bp完全相同。實(shí)施例4:Northern印跡法分析人加雙氧酶13基因的表達(dá)用一步法提取總RNA[Anal.Biochem 1987,162,156-159]。該法包括酸性硫氰酸胍苯酚-氯仿抽提。即用4M異硫氰酸胍-25mM檸檬酸鈉，0.2M乙酸鈉(pH4.0)對(duì)組織進(jìn)行勻漿，加入1倍體積的苯酚和1/5體積的氯仿-異戊醇(49∶1)，混合后離心。吸出水相層，加入異丙醇(0.8體積)并將混合物離心得到RNA沉淀。將得到的RNA沉淀用70％乙醇洗滌，干燥并溶于水中。用20μg RNA，在含20mM 3-(N-嗎啉代)丙磺酸(pH7.0)-5mM乙酸鈉-1mM EDTA-2.2M甲醛的1.2％瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳。然后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。用α-32P dATP通過(guò)隨機(jī)引物法制備32P-標(biāo)記的DNA探針。所用的DNA探針為圖1所示的PCR擴(kuò)增的人加雙氧酶13編碼區(qū)序列(177bp至545bp)。將32P-標(biāo)記的探針(約2×106cpm/ml)與轉(zhuǎn)移了RNA的硝酸纖維素膜在一溶液中于42℃雜交過(guò)夜，該溶液包含50％甲酰胺-25mM KH2PO4(pH7.4)-5×SSC-5×Denhardt’s溶液和200μg/ml鮭精DNA。雜交之后，將濾膜在1×SSC-0.1％SDS中于55℃洗30min。然后，用Phosphor Imager進(jìn)行分析和定量。實(shí)施例5重組人加雙氧酶13的體外表達(dá)、分離和純化根據(jù)SEQ ID NO:1和圖1所示的編碼區(qū)序列，設(shè)計(jì)出一對(duì)特異性擴(kuò)增引物，序列如下Primer3:5'-CCCCATATGATGTTTTCAGTGGACTCAGTGAAG-3’(Seq ID No:5)Primer4:5'-CATGGATCCTTAGGCGAACTGGCCCACACACTT-3’(Seq ID No:6)此兩段引物的5’端分別含有NdeⅠ和BamHⅠ酶切位點(diǎn)，其后分別為目的基因5’端和3’端的編碼序列，NdeⅠ和BamHⅠ酶切位點(diǎn)相應(yīng)于表達(dá)載體質(zhì)粒pET-28b(+)(Novagen公司產(chǎn)品，Cat.No.69865.3)上的選擇性?xún)?nèi)切酶位點(diǎn)。以含有金長(zhǎng)目的基因的pBS-0568d07質(zhì)粒為模板，進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)條件為總體積50μl中含pBS-0568d07質(zhì)粒10pg、引物Primer-3和Primer-4分別為10pmol、Advantage polymera se Mix(Clontech公司產(chǎn)品)1μl。循環(huán)參數(shù)94℃ 20s,60℃ 30s,68℃ 2 min，共25個(gè)循環(huán)。用NdeⅠ和BamHⅠ分別對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物和質(zhì)粒pET-28(+)進(jìn)行雙酶切，分別回收大片段，并用T4連接酶連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化用氯化鈣法大腸桿細(xì)菌DH5α，在含卡那霉素(終濃度30μg/ml)的LB平板培養(yǎng)過(guò)夜后，用菌落PCR方法篩選陽(yáng)性克隆，并進(jìn)行測(cè)序。挑選序列正確的陽(yáng)性克隆(pET-0568d07)用氯化鈣法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)plySs(Novagen公司產(chǎn)品)。在含卡那霉素(終濃度30μg/ml)的LB液體培養(yǎng)基中，宿主菌BL21(pET-0568d07)在37℃培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，加入IPTG至終濃度1mmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)5小時(shí)。離心收集菌體，經(jīng)超聲波破菌，離心收集上清，用能與6個(gè)組氨酸(6His-Tag)結(jié)合的親和層析柱His.Bind Quick Cartridge(Novagen公司產(chǎn)品)進(jìn)行層析，得到了純化的目的蛋白人加雙氧酶13。經(jīng)SDS-PAGE電泳，在13kDa處得到一單一的條帶(圖2)。將該條帶轉(zhuǎn)移至PVDF膜上用Edams水解法進(jìn)行N-端氨基酸序列分析，結(jié)果N-端15個(gè)氨基酸與SEQ ID NO:2所示的N-端15個(gè)氨基酸殘基完全相同。實(shí)施例 6抗人加雙氧酶13抗體的產(chǎn)生用多肽合成儀(PE公司產(chǎn)品)合成下述人加雙氧酶13特異性的多肽NH2-Met-Phe-Ser-Val-Asp-Ser-Val-Lys-Ile-Cys-Pro-Gln-Arg-Gly-Gln-COOH(SEQ ID NO:7)。將該多肽分別與血藍(lán)蛋白和牛血清白蛋白耦合形成復(fù)合，方法參見(jiàn)Avrameas,et al.Immunochemistry,1969；6:43。用4mg上述血藍(lán)蛋白多肽復(fù)合物加上完全弗氏佐劑免疫家兔，15天后再用血藍(lán)蛋白多肽復(fù)合物加不完全弗氏佐劑加強(qiáng)免疫一次。采用經(jīng)15μg/ml牛血清白蛋白多肽復(fù)合物包被的滴定板做ELISA測(cè)定兔血清中抗體的滴度。用蛋白A-Sepharose從抗體陽(yáng)性的家兔血清中分離總IgG。將多肽結(jié)合于溴化氰活化的Sepharose4B柱上，用親和層析法從總IgG中分離抗多肽抗體。免疫沉淀法證明純化的抗體可特異性地與人加雙氧酶13結(jié)合。實(shí)施例7本發(fā)明的多核苷酸片段用作雜交探針的應(yīng)用從本發(fā)明的多核苷酸中挑選出合適的寡核苷酸片段用作雜交探針有多方面的用途，如用該探針可與不同來(lái)源的正常組織或病理組織的基因組或cDNA文庫(kù)雜交以鑒定其是否含有本發(fā)明的多核苷酸序列和檢出周源的多核苷酸序列，進(jìn)一步還可用該探針檢測(cè)本發(fā)明的多核苷酸序列或其同源的多核苷酸序列在正常組織或病理組織細(xì)胞中的表達(dá)是否異常。
本實(shí)施例的目的是從本發(fā)明的多核苷酸SEQ ID NO:1中挑選出合適的寡核苷酸片段用作雜交探針，并用濾膜雜交方法鑒定一些組織中是否含有本發(fā)明的多核苷酸序列或其同源的多核苷酸序列。濾膜雜交方法包括斑點(diǎn)印跡法、Southern印跡法、Northern印跡法和復(fù)印方法等，它們都是將待測(cè)的多核苷酸樣品固定在濾膜上后使用基本相同的步驟雜交。這些相同的步驟是固定了樣品的濾膜首先用不含探針的雜交緩沖液進(jìn)行預(yù)雜交，以使濾膜上樣品的非特異性的結(jié)合部位被載體和合成的多聚物所飽和。然后預(yù)雜交液被含有標(biāo)記探針的雜交緩沖液替換，并保溫使探針與靶核酸雜交。雜交步驟之后，未雜交上的探針被一系列洗膜步驟除掉。本實(shí)施例利用較高強(qiáng)度的洗膜條件(如較低鹽濃度和較高的溫度)，以使雜交背景降低且只保留特異性強(qiáng)的信號(hào)。本實(shí)施例選用的探針包括兩類(lèi)第一類(lèi)探針是完全與本發(fā)明的多核苷酸SEQ ID NO:1相同或互補(bǔ)的寡核苷酸片段；第二類(lèi)探針是部分與本發(fā)明的多核苷酸SEQ ID NO:1相同或互補(bǔ)的寡核苷酸片段。本實(shí)施例選用斑點(diǎn)印跡法將樣品固定在濾膜上，在較高強(qiáng)度的的洗膜條件下，第一類(lèi)探針與樣品的雜交特異性最強(qiáng)而得以保留。一、探針的選用從本發(fā)明的多核苷酸SEQ ID NO:1中選擇寡核苷酸片段用作雜交探針，應(yīng)遵循以下原則和需要考慮的幾個(gè)方面1，探針大小優(yōu)選范圍為18-50個(gè)核苷酸；2，GC含量為30％-70％，超過(guò)則非特異性雜交增加；3，探針內(nèi)部應(yīng)無(wú)互補(bǔ)區(qū)域；4，符合以上條件的可作為初選探針，然后進(jìn)一步作計(jì)算機(jī)序列分析，包括將該初選探針?lè)謩e與其來(lái)源序列區(qū)域(即SEQ ID NO:1)和其它已知的基因組序列及其互補(bǔ)區(qū)進(jìn)行同源性比較，若與非靶分子區(qū)域的同源性大于85％或者有超過(guò)15個(gè)連續(xù)堿基完全相同，則該初選探針一般就不應(yīng)該使用；5，初選探針是否最終選定為有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值的探針還應(yīng)進(jìn)一步由實(shí)驗(yàn)確定。
完成以上各方面的分析后挑選并合成以下二個(gè)探針探針1(probe1)，屬于第一類(lèi)探針，與SEQ ID NO:1的基因片段完全同源或互補(bǔ)(41Nt)5’-TGTTTTCAGTGGACTCAGTGAAGATCTGCCCTCAGCGTGGG-3’(SEQ ID NO:8)
探針2(probe2)，屬于第二類(lèi)探針，相當(dāng)于SEQ ID NO:1的基因片段或其互補(bǔ)片段的替換突變序列(41Nt):
5’-TGTTTTCAGTGGACTCAGTGCAGATCTGCCCTCAGCGTGGG-3’(SEQ ID NO:9)與以下具體實(shí)驗(yàn)步驟有關(guān)的其它未列出的常用試劑及其配制方法請(qǐng)參考文獻(xiàn)DNA PROBES G.H.Keller；M.M.Manak；Stockton Press,1989(USA)以及更常用的分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)書(shū)籍如《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(1998年第二版)[美]薩姆布魯克等著，科學(xué)出版社。
樣品制備1，從新鮮或冰凍組織中提取DNA步驟1)將新鮮或新鮮解凍的正常肝組織放入浸在冰上并盛有磷酸鹽緩沖液(PBS)的平皿中。用剪刀或手術(shù)刀將組織切成小塊。操作中應(yīng)保持組織濕潤(rùn)。2)以1000g離心切碎組織10分鐘。3)用冷勻漿緩沖液(0.25mol/L蔗糖；25mmol/LTris-HCl,pH7.5；25mmol/LnaCl；25mmol/L MgCl2)懸浮沉淀(大約10ml/g)。4)在4℃用電動(dòng)勻漿器以全速勻漿組織懸液，直至組織被完全破碎。5)1000g離心10分鐘。6)用重懸細(xì)胞沉淀(每0.1g最初組織樣品加1-5ml)，再以1000g離心10分鐘。7)用裂解緩沖液重懸沉淀(每0.1g最初組織樣品加1ml)，然后接以下的苯酚抽提法。2，DNA的苯酚抽提法步驟1)用1-10ml冷PBS洗細(xì)胞，1000g離心10分鐘。2)用冷細(xì)胞裂解液重懸浮沉淀的細(xì)胞(1×108細(xì)胞/ml)最少應(yīng)用100ul裂解緩沖液。3)加SDS至終濃度為1％，如果在重懸細(xì)胞之前將SDS直接加入到細(xì)胞沉淀中，細(xì)胞可能會(huì)形成大的團(tuán)塊而難以破碎，并降低的總產(chǎn)率。這一點(diǎn)在抽提＞107細(xì)胞時(shí)特別嚴(yán)重。4)加蛋白酶K至終濃度200ug/ml。5)50℃保溫反應(yīng)1小時(shí)或在37℃輕輕振搖過(guò)夜。6)用等體積苯酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)抽提，在小離心機(jī)管中離心10分鐘。兩相應(yīng)清楚分離，否則重新進(jìn)行離心。7)將水相轉(zhuǎn)移至新管。8)用等體積氯仿∶異戊醇(24∶1)抽提，離心10分鐘。9)將含DNA的水相轉(zhuǎn)移至新管。然后進(jìn)行DNA的純化和乙醇沉淀。3，DNA的純化和乙醇沉淀步驟1)將1/10體積2mol/L醋酸鈉和2倍體積冷100％乙醇加到DNA溶液中，混勻。在-20℃放置1小時(shí)或至過(guò)夜。2)離心10分鐘。3)小心吸出或倒出乙醇。4)用70％冷乙醇500ul洗滌沉淀，離心5分鐘。5)小心吸出或倒出乙醇。用500ul冷乙醇洗滌沉淀，離心5分鐘。6)小心吸出或倒出乙醇，然后在吸水紙上倒置使殘余乙醇流盡?？諝飧稍?0-15分鐘，以使表面乙醇揮發(fā)。注意不要使沉淀完全干燥，否則較難重新溶解。7)以小體積TE或水重懸DNA沉淀。低速渦旋振蕩或用滴管吹吸，同時(shí)逐漸增加TE，混合至DNA充分溶解，每1-5×106細(xì)胞所提取的大約加1ul。
以下第8-13步驟僅用于必須除去污染時(shí)，否則可直接進(jìn)行第14步驟。8)將RNA酶A加到DNA溶液中，終濃度為100ug/ml,37℃保溫30分鐘。9)加入SDS和蛋白酶K，終濃度分別為0.5％和100ug/ml。37℃保溫30分鐘。10)用等體積的苯酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)抽提反應(yīng)液，離心10分鐘。11)小心移出水相，用等體積的氯仿∶異戊醇(24∶1)重新抽提，離心10分鐘。12)小心移出水相，加1/10體積2mol/L醋酸鈉和2.5體積冷乙醇，混勻置-20℃ 1小時(shí)。13)用70％乙醇及100％乙醇洗滌沉淀，空氣干燥，重懸核酸，過(guò)程同第3-6步驟。14)測(cè)定A260和A280以檢測(cè)DNA的純度及產(chǎn)率。15)分裝后存放于-20℃。樣膜的制備1)取4×2張適當(dāng)大小的硝酸纖維素膜(NC膜)，用鉛筆在其上輕輕標(biāo)出點(diǎn)樣位置及樣號(hào)，每一探針需兩張NC膜，以便在后面的實(shí)驗(yàn)步驟中分別用高強(qiáng)度條件和強(qiáng)度條件洗膜。
2)吸取及對(duì)照各15微升，點(diǎn)于樣膜上，在室溫中晾干。
3)置于浸潤(rùn)有0.1mol/LNaOH,1.5mol/LNaCl的濾紙上5分鐘(兩次)，晾干置于浸潤(rùn)有0.5mol/L Tris-HCl(pH7.0),3mol/LNaCl的濾紙上5分鐘(兩次)，晾干。
4)夾于干凈濾紙中，以鋁箔包好，60-80℃真空干燥2小時(shí)。
探針的標(biāo)記1)3μlProbe(0.10D/10μl)，加入2μlKinase緩沖液，8-10uCiγ-32P-dATP+2UKinase，以補(bǔ)加至終體積20μl。
2)37℃保溫2小時(shí)。
3)加1/5體積的溴酚藍(lán)指示劑(BPB)。
4)過(guò)Sephadex G-50柱。
5)至有32P-Probe洗出前開(kāi)始收集第一峰(可用Monitor監(jiān)測(cè))。
6)5滴/管，收集10-15管。
7)用液體閃爍儀監(jiān)測(cè)同位素量8)合并第一峰的收集液后即為所需制備的32P-Probe(第二峰為游離γ-32P-dATP)。
預(yù)雜交將樣膜置于塑料袋中，加入3-10mg預(yù)雜交液(10×Denhardts；6×SSC,0.1mg/mlCT DNA(小牛胸腺DNA)。)，封好袋口后，68℃水浴搖2小時(shí)。
雜交將塑料袋剪去一角，加入制備好的探針，封好袋口后，42℃水浴搖過(guò)夜。
洗膜高強(qiáng)度洗膜1)取出已雜交好的樣膜。
2)2×SSC,0.1％SDS中，40℃洗15分鐘(2次)。
3)0.1×SSC,0.1％SDS中，40℃洗15分鐘(2次)。
4)0.1×SSC,0.1％SDS中，55℃洗30分鐘(2次)，室溫晾干。低強(qiáng)度洗膜1)取出已雜交好的樣膜。
2)2×SSC,0.1％SDS中，37℃洗15分鐘(2次)。
3)0.1×SSC,0.1％SDS中，37℃洗15分鐘(2次)。
4)0.1×SSC,0.1％SDS中，40℃洗15分鐘(2次)，室溫晾干。
X-光自顯影-70℃,X-光自顯影(壓片時(shí)間根據(jù)雜交斑放射性強(qiáng)弱而定)。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用低強(qiáng)度洗膜條件所進(jìn)行的雜交實(shí)驗(yàn)，以上兩個(gè)探針雜交斑放射性強(qiáng)弱沒(méi)有明顯區(qū)別；而采用高強(qiáng)度洗膜條件所進(jìn)行的雜交實(shí)驗(yàn)，探針1的雜交斑放射性強(qiáng)度明顯強(qiáng)于另一個(gè)探針雜交斑的放射性強(qiáng)度。因而可用探針1定性和定量地分析本發(fā)明的多核苷酸在不同組織中的存在和差異表達(dá)。實(shí)施例10 DNA Microarray基因芯片或基因微矩陣(DNA Microarray)是目前許多國(guó)家實(shí)驗(yàn)室和大制藥公司都在著手研制和開(kāi)發(fā)的新技術(shù)，它是指將大量的靶基因片段有序地、高密度地排列在玻璃、硅等載體上，然后用熒光檢測(cè)和計(jì)算機(jī)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的比較和分析，以達(dá)到快速、高效、高通量地分析生物信息的目的。本發(fā)明的多核苷酸可作為靶DNA用于基因芯片技術(shù)用于高通量研究新基因功能；尋找和篩選組織特異性新基因特別是腫瘤等疾病相關(guān)新基因；疾病的診斷，如遺傳性疾病。其具體方法步驟在文獻(xiàn)中已有多種報(bào)道，如可參閱文獻(xiàn)DeRisi,J.L.,Lyer,V.&Brown,P.O.(1997)Science278,680-686.及文獻(xiàn)Helle,R.A.,Schema,M.,Chai,A.,Shalom,D.,(1997)PNAS 94:2150-2155.(一)點(diǎn)樣各種不同的全長(zhǎng)cDNA共計(jì)4000條多核苷酸序列作為靶DNA，其中包括本發(fā)明的多核苷酸。將它們分別通過(guò)PCR進(jìn)行擴(kuò)增，純化所得擴(kuò)增產(chǎn)物后將其濃度調(diào)到500ng/ul左右，用Cartesian 7500點(diǎn)樣儀(購(gòu)自美國(guó)Cartesian公司)點(diǎn)于玻璃介質(zhì)上，點(diǎn)與點(diǎn)之間的距離為280μm。將點(diǎn)樣后的玻片進(jìn)行水合、干燥、置于紫外交聯(lián)儀中交聯(lián)，洗脫后干燥使DNA固定在玻璃片上制備成芯片。其具體方法步驟在文獻(xiàn)中已有多種報(bào)道，本實(shí)施例的點(diǎn)樣后處理步驟是1．潮濕環(huán)境中水合4小時(shí)；2．0.2％SDS洗滌1分鐘；3．ddH2O洗滌兩次，每次1分鐘；4．NaBH4封閉5分鐘；5．95℃水中2分鐘；6．0.2％SDS洗滌1分鐘；7．ddH2O沖洗兩次；8．涼干，25℃儲(chǔ)存于暗處備用。(二)探針標(biāo)記用一步法分別從正常肝與肝癌中抽提總mRNA，并用Oligotex mRNA Midi Kit(購(gòu)自QiaGen公司)純化mRNA，通過(guò)反轉(zhuǎn)錄分別將熒光試劑Cy3dUTP(5-Amino-propargyl-2’-deoxyuridine 5’-triphate coupled to Cy3 fluorescent dye，購(gòu)自Amersham Phamacia Biotech公司)標(biāo)記正常肝組織的mRNA，用熒光試劑Cy5dUTP(5-Amino-propargyl-2’-deoxyuridine 5’-triphate coupled to Cy5fluorescent dye，購(gòu)自Amersham Phamacia Biotech公司)標(biāo)記肝癌組織mRNA，經(jīng)純化后制備出探針。具體步驟參照及方法Schena,M.,Shalon,D.,Heller,R.(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.Vol.93:10614-10619.Schena,M.,Shalon,Dari.,Davis,R.W.(1995)Science.270.(20):467-480.(三)雜交分別將來(lái)自以上兩種組織的探針與芯片一起在UniHybTMHybridizationSolution(購(gòu)自TeleChem公司)雜交液中進(jìn)行雜交16小時(shí)，室溫用洗滌液(1×SSC,0.2％SDS)洗滌后用ScanArray 3000掃描儀(購(gòu)自美國(guó)General Scanning公司)進(jìn)行掃描，掃描的圖象用Imagene軟件(美國(guó)Biodiscovery公司)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析處理，算出每個(gè)點(diǎn)的Cy3/Cy5比值，該比值小于0.5大于2的點(diǎn)被認(rèn)為是表達(dá)有差異的基因。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Cy3 signal=9611.02(取四次實(shí)驗(yàn)的平均值)，Cy5signal=12210.28(取四次實(shí)驗(yàn)的平均值)，Cy3/Cy5=0.787，本發(fā)明的多核苷酸在以上兩種組織中的表達(dá)無(wú)明顯差異。
序列表(1)一般信息(ⅱ)發(fā)明名稱(chēng)人加雙氧酶13及其編碼序列(ⅲ)序列數(shù)目9(2)SEQ ID N0:1的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度864bp(B)類(lèi)型核酸(C)鏈性雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ⅱ)分子類(lèi)型cDNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:1:1 ACGGCTGCGAGAAGACGAGGCTTAGGGCTGGAGTGCAACGATGTGATCTTGGCTCACTGC61 AACCTCTGCCTCCCGGGTTCGAGAGATTCTCCTGCCTCAGCCTCCTGAGTAGCTGGGACT121 AAGGCACACACACTGTACTTGGCAGCTGGCGAAGCATTGTTTCTGAGTGTGTGAGGATGT181 TTTCAGTGGACTCAGTGAAGATCTGCCCTCAGCGTGGGCAGGCACATCCACTTGGTTGGG241 GACCCAGATGGAACACAAAGGGAGAAGACAAGCAAATTCTCTTTTCTGGAGGGAGACACC301 CATCTCCTGCCCTTGGACATCAGGACTCCAGGTTCTTCGGCCTTTGGACTCAGGCTTGCC361 ACAGAGGCCTCCCAGGGCTCTCGGCCAGTCAGCCTCAGAATGAGAGTTACACCACTGGCT421 TCCTTGGTTCAACCACCTTCTTACCTGGACTGAGCCTCACTTACAGCTTCTCTAGGTCTC481 CAGCTTGCAGACAGCCTATGGGAGGACTTCTCAGCCTCCATAAGTGTGTGGGCCAGTTCG541 CCTAATAAATCCCCTCTCCTGGCCGGGCGCGGTAGCTCTCCCCTGTAATCTCAGCATTTT601 GGGAGGCAGAGGTAGGTGGATCACCTGAGGTCAGGAGTTCAAGACCAGCCTGGCCAACAT661 GGTGAGACCCCCGTCTCTACTAAAAGTACAAAAAGTAGCTGGGTGTGGTGCTGGGTGCCT721 GTAATCCCAGCTACTCGGGAGGCTGAAGCAGGAGAATCACTTCGACCTGGGAGGTAGAGG781 TTGCAGTGAGCCGAGATCGAGCCACTGCACTCCAGCCTGGGTGACAGGGCAAGACTCTGT841 CTCAAACAAATAAAAATCCCCTCT(3)SEQ ID NO:2的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度122個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸
(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ⅱ)分子類(lèi)型多肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:2:1 Met Phe Ser Val Asp Ser Val Lys Ile Cys Pro Gln Arg Gly Gln16 Ala His Pro Leu Gly Trp Gly Pro Arg Trp Asn Thr Lys Gly Glu31 Asp Lys Gln Ile Leu Phe Ser Gly Gly Arg His Pro Ser Pro Ala46 Leu Gly His Gln Asp Ser Arg Phe Phe Gly Leu Trp Thr Gln Ala61 Cys His Arg Gly Leu Pro Gly Leu Ser Ala Ser Gln Pro Gln Asn76 Glu Ser Tyr Thr Thr Gly Phe Leu Gly Ser Thr Thr Phe Leu Pro91 Gly Leu Ser Leu Thr Tyr Ser Phe Ser Arg Ser Pro Ala Cys Arg106 Gln Pro Met Gly Gly Leu Leu Ser Leu His Lys Cys Val Gly Gln121 Phe Ala(4)SEQ ID NO:3的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度24堿基(B)類(lèi)型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ⅰ)分子類(lèi)型寡核苷酸(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:3:CCCCATATGATGTTTTCAGTGGACTCAGTGAAG24(5)SEQ ID NO:4的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度24堿基(B)類(lèi)型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ⅱ)分子類(lèi)型寡核苷酸(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:4:CATGGATCCTTAGGCGAACTGGCCCACACACTT24(6)SEQ ID NO:5的信息(ⅰ)序列特征
(A)長(zhǎng)度33堿基(B)類(lèi)型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ⅱ)分子類(lèi)型寡核苷酸(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:5:TGTTTTCAGTGGACTCAGTGAAGATCTGCCCTCAGCGTGGG 33(7)SEQ ID NO:6的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度33堿基(B)類(lèi)型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ⅱ)分子類(lèi)型寡核苷酸(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:6:TGTTTTCAGTGGACTCAGTGCAGATCTGCCCTCAGCGTGGG 33(8)SEQ ID NO:7的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度15個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ⅱ)分子類(lèi)型多肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:7:Met-Phe-Ser-Val-Asp-Ser-Val-Lys-Ile-Cys-Pro-Gln-Arg-Gly-Gln15(9)SEQ ID NO:8的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度41堿基(B)類(lèi)型核酸
(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ⅱ)分子類(lèi)型寡核苷酸(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:8:TGTTTTCAGTGGACTCAGTGAAGATCTGCCCTCAGCGTGGG 41(10)SEQ ID NO:9的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度41堿基(B)類(lèi)型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ⅱ)分子類(lèi)型寡核苷酸(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:9:TGTTTTCAGTGGACTCAGTGCAGATCTGCCCTCAGCGTGGG 4權(quán)利要求
1.一種分離的多肽-人加雙氧酶13，其特征在于它包含有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的多肽、或其多肽的活性片段、類(lèi)似物或衍生物。
2.如權(quán)利要求1所述的多肽，其特征在于所述多肽、類(lèi)似物或衍生物的氨基酸序列具有與SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列至少95％的相同性。
3.如權(quán)利要求2所述的多肽，其特征在于它包含具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的多肽。
4.一種分離的多核苷酸，其特征在于所述多核苷酸包含選自下組中的一種(a)編碼具有SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的多肽或其片段、類(lèi)似物、衍生物的多核苷酸；(b)與多核苷酸(a)互補(bǔ)的多核苷酸；或(c)與(a)或(b)有至少70％相同性的多核苷酸。
5.如權(quán)利要求4所述的多核苷酸，其特征在于所述多核苷酸包含編碼具有SEQ IDNO:2所示氨基酸序列的多核苷酸。
6.如權(quán)利要求4所述的多核苷酸，其特征在于所述多核苷酸的序列包含有SEQ ID NO:1中177-545位的序列或SEQ ID NO:1中1-864位的序列。
7.一種含有外源多核苷酸的重組載體，其特征在于它是由權(quán)利要求4-6中的任一權(quán)利要求所述多核苷酸與質(zhì)粒、病毒或運(yùn)載體表達(dá)載體構(gòu)建而成的重組載體。
8.一種含有外源多核苷酸的遺傳工程化宿主細(xì)胞，其特征在于它是選自于下列一種宿主細(xì)胞(a)用權(quán)利要求7所述的重組載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細(xì)胞；或(b)用權(quán)利要求4-6中的任一權(quán)利要求所述多核苷酸轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細(xì)胞。
9.一種具有人加雙氧酶13活性的多肽的制備方法，其特征在于所述方法包括(a)在表達(dá)人加雙氧酶13條件下，培養(yǎng)權(quán)利要求8所述的工程化宿主細(xì)胞；(b)從培養(yǎng)物中分離出具有人加雙氧酶13活性的多肽。
10.一種能與多肽結(jié)合的抗體，其特征在于所述抗體是能與人加雙氧酶13特異性結(jié)合的抗體。
11.一類(lèi)模擬或調(diào)節(jié)多肽活性或表達(dá)的化合物，其特征在于它們是模擬、促進(jìn)、拮抗或抑制人加雙氧酶13的活性的化合物。
12.如權(quán)利要求11所述的化合物，其特征在于它是SEQ ID NO:1所示的多核苷酸序列或其片段的反義序列。
13.一種權(quán)利要求11所述化合物的應(yīng)用，其特征在于所述化合物用于調(diào)節(jié)人加雙氧酶13在體內(nèi)、體外活性的方法。
14.一種檢測(cè)與權(quán)利要求1-3中的任一權(quán)利要求所述多肽相關(guān)的疾病或疾病易感性的方法，其特征在于其包括檢測(cè)所述多肽的表達(dá)量，或者檢測(cè)所述多肽的活性，或者檢測(cè)多核苷酸中引起所述多肽表達(dá)量或活性異常的核苷酸變異。
15.如權(quán)利要求1-3中的任一權(quán)利要求所述多肽的應(yīng)用，其特征在于它應(yīng)用于篩選人加雙氧酶13的模擬物、激動(dòng)劑，拮抗劑或抑制劑；或者用于肽指紋圖譜鑒定。
16.如權(quán)利要求4-6中的任一權(quán)利要求所述的核酸分子的應(yīng)用，其特征在于它作為引物用于核酸擴(kuò)增反應(yīng)，或者作為探針用于雜交反應(yīng)，或者用于制造基因芯片或微陣列。
17.如權(quán)利要求1-6及11中的任一權(quán)利要求所述的多肽、多核苷酸或化合物的應(yīng)用，其特征在于用所述多肽、多核苷酸或其模擬物、激動(dòng)劑、拮抗劑或抑制劑以安全有效劑量與藥學(xué)上可接受的載體組成作為診斷或治療與人加雙氧酶13異常相關(guān)的疾病的藥物組合物。
18.權(quán)利要求1-6及11中的任一權(quán)利要求所述的多肽、多核苷酸或化合物的應(yīng)用，其特征在于用所述多肽、多核苷酸或化合物制備用于治療如惡性腫瘤，血液病，HIV感染和免疫性疾病和各類(lèi)炎癥的藥物。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種新的多肽——人加雙氧酶13,編碼此多肽的多核苷酸和經(jīng)DNA重組技術(shù)產(chǎn)生這種多肽的方法。本發(fā)明還公開(kāi)了此多肽用于治療多種疾病的方法,如惡性腫瘤,血液病,HIV感染和免疫性疾病和各類(lèi)炎癥等。本發(fā)明還公開(kāi)了抗此多肽的拮抗劑及其治療作用。本發(fā)明還公開(kāi)了編碼這種新的人加雙氧酶13的多核苷酸的用途。
文檔編號(hào)C12N9/02GK1301841SQ9912578
公開(kāi)日2001年7月4日 申請(qǐng)日期1999年12月27日 優(yōu)先權(quán)日1999年12月27日
發(fā)明者毛裕民, 謝毅 申請(qǐng)人:上海博德基因開(kāi)發(fā)有限公司