專利名稱：溶栓劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明系溶栓劑，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。
血栓栓塞性疾病如心肌梗塞，肺梗塞、冠狀動脈梗塞、腦梗塞中風(fēng)以及動靜脈脈管梗塞等心腦血管疾病已經(jīng)成為嚴(yán)重危害人們身體健康和生命安全的頭號殺手。人們在攻克這種疾病的過程中，逐漸了解血栓形成的主要原因之一是人體血液中的纖維蛋白原在凝血酶作用下形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的纖維蛋白。因此，人們希望找到能溶解這些纖維蛋白的溶栓劑，使網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的纖維蛋白溶解，達(dá)到血液暢通流動的效果。如目前已經(jīng)商品化的溶栓劑主要有從溶血鏈球菌培養(yǎng)液中分離獲得的鏈激酶(簡稱SK)和從人尿液中提取純化的尿激酶(UK)，以及采用基因工程方法生產(chǎn)的人組織型纖維溶酶激活劑(簡稱tPA)，由于這些溶栓劑均為人體內(nèi)纖維溶酶原激活劑，故不能直接溶解血栓中的纖維蛋白。同時，這些溶栓劑在使用上均為靜脈注射劑型，不能口服，只能用作治療急性血栓病，不能用于血栓病的預(yù)防。在其制備上，由于制備工藝復(fù)雜，價格昂貴，難以廣泛推廣使用。
日本學(xué)者Sumi H等曾報道從日本傳統(tǒng)發(fā)酵食品“納豆”中分離到一種能分解纖維蛋白的蛋白酶，此稱為納豆激酶(簡稱NK)，并對其基因結(jié)構(gòu)，理化性質(zhì)等作了較為詳細(xì)的研究，但至今仍未商品化，(Sumi.H，et al.Experientia，43(10)1110-1111，1987；Fujita.M，et al.Biol Pharm Bull 18(10)，1387～1391，1995)。
在中國專利(申請?zhí)?7106442.3)一文中，提到從土壤、干草中定向分離到一大批細(xì)菌，并從中篩選到一株能大量產(chǎn)生并分泌到體外具有強(qiáng)烈降解纖維蛋白水解酶菌株，但該菌株的產(chǎn)酶能力仍較低，需進(jìn)一步提高，且需對酶的基因結(jié)構(gòu)，酶的主要特性，藥理藥效進(jìn)一步進(jìn)行研究。
基于目前溶栓劑發(fā)展的現(xiàn)狀，本發(fā)明試圖研制一種溶栓劑，它具有原料來源廣泛，制備容易，純化方便，價格較便宜，特異性強(qiáng)、療效較顯著，副作用小，適于口服，具有治療和預(yù)防雙功效的一種溶栓劑。
本發(fā)明的技術(shù)特征在于用基因工程的方法，將分離出的溶栓酶基因克隆到特定的載體上并轉(zhuǎn)入經(jīng)過改造的枯草桿菌受體中，獲得能正確高效表達(dá)溶栓酶的基因工程菌。然后采用微生物發(fā)酵工程方法，經(jīng)菌種接種培養(yǎng)發(fā)酵，分離純化等步驟，使工藝簡化、產(chǎn)量提高、質(zhì)量符合口服制劑要求的溶栓劑。
本發(fā)明所用的菌株為從干草中定向篩選獲得，并命名為MBL-1，其特征在于在固體或液體培養(yǎng)基中，通過培養(yǎng)可以產(chǎn)生分泌一種強(qiáng)烈溶解纖維蛋白的蛋白水解酶，按《伯杰氐細(xì)菌鑒定手冊》方法，對菌株形態(tài)特征，生理生化特性等進(jìn)行試驗(yàn)，根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行綜合分析比較，將MBL-1菌鑒定為枯草芽孢桿菌(Bacillus Subtilis)MBL-1，其所產(chǎn)生的纖維蛋白水解酶稱為芽激酶(Bacillus-Kinase，BK)。
本發(fā)明所述的溶栓劑-溶栓酶基因來自于MBL-1菌株，根據(jù)Nakaomura T.et al.報道(Biosci Biotec Biochem 56(11)1869-1871，1992)，設(shè)計(jì)一對引物，用常規(guī)方法提純MBL-1染色體DNA，用基因擴(kuò)增技術(shù)(PCR)擴(kuò)增出DNA片段，用限制性核酸內(nèi)切酶同時切PCR產(chǎn)物和pUB18質(zhì)粒DNA，瓊脂糖凝膠電泳分離回收所需DNA片段，用T4DNA連接酶進(jìn)行連接反應(yīng)，得到重組DNA分子，轉(zhuǎn)化受體菌，獲得轉(zhuǎn)化子，用含1％脫脂奶粉和卡那霉素(5μg/ml)的選擇性平板篩選含有溶栓酶基因的轉(zhuǎn)化子(帶有透明圈的單克隆)，經(jīng)鑒定獲得基因工程菌。將基因工程菌的插入溶栓酶基因片段進(jìn)行序列分析，由ABI自動測序儀完成，所得溶栓酶的結(jié)構(gòu)基因序列如
圖1所示。
本發(fā)明溶栓酶的結(jié)構(gòu)基因由825個核苷酸構(gòu)成，從核苷酸序列推導(dǎo)的氨基酸序列如圖1所示。對溶栓酶的理化特性研究表明該酶為堿性絲氨酸蛋白酶，分子量為28000(SDS-PAGE電泳法)，進(jìn)一步質(zhì)譜分析，精確測定分子量為27735.37+6.99；其等電點(diǎn)為8.6。
本發(fā)明所述的溶栓劑-溶栓酶基因結(jié)構(gòu)還包括其變體。技上述方法設(shè)計(jì)一對引物，用常規(guī)方法分離純化MBL-1菌株染色體DNA，用嚴(yán)格控制反應(yīng)條件的基因擴(kuò)增技術(shù)擴(kuò)增出DNA片段，用限制性核酸內(nèi)切酶Bam HI和EcoRI同時切PCR產(chǎn)物和pUB18質(zhì)粒DNA，瓊脂糖凝膠電泳分離回收所需DNA片段，用T4DNA連接酶進(jìn)行連接反應(yīng)，得到重組DNA分子，轉(zhuǎn)化枯草桿菌受體細(xì)胞，獲得轉(zhuǎn)化子，用含1％脫脂奶粉和卡那霉素(5μg/ml)的選擇性平板，篩選含有溶栓酶基因的轉(zhuǎn)化子(帶有透明圈的單克隆)，經(jīng)鑒定獲得基因工程菌。將基因工程菌的溶栓酶基因片段進(jìn)行序列分析，由ABI自動測序儀完成，所得溶栓酶的結(jié)構(gòu)基因序列與圖1相比，第61位堿基為C，第21個密碼子為CAC，其對應(yīng)的氨基酸為H。第581位堿基為T，第194個密碼子為TTT，其對應(yīng)的氨基酸為F。這一基因結(jié)構(gòu)變體所編碼的酶具有強(qiáng)烈溶解纖維蛋白和溶解血栓能力。
本發(fā)明溶栓酶制劑，按陳奇方法(中藥藥理研究方法學(xué)，北京人民衛(wèi)生出版社，1994年第一版)測定溶栓劑溶解人纖維蛋白和血塊的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該溶栓劑有很強(qiáng)的溶解人纖維蛋白和人血凝血塊的能力；將溶栓劑作口服制劑給實(shí)驗(yàn)小白鼠和大白鼠口服試驗(yàn)結(jié)果表明，該溶栓劑能明顯縮短血漿優(yōu)球蛋白溶解時間，提高體內(nèi)纖溶酶活性，提高tPA的分泌量；采用本發(fā)明溶栓劑對小鼠進(jìn)行口服試驗(yàn)，其結(jié)果表明有明顯降低全血粘度，抑制血栓的形成；按本發(fā)明實(shí)施例1、2方法制備的溶栓劑裝入腸溶性膠囊給48-65歲人群自原者口服3天，經(jīng)測試表明人血漿優(yōu)球蛋白溶解時間縮短33～50％。這些結(jié)果顯示本發(fā)明溶栓劑能明顯誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌tPA，提高人體的纖溶活性，從而起到防止血栓形成和溶解血栓的效能。
本發(fā)明溶栓劑來自于微生物發(fā)酵產(chǎn)物，可無限生長發(fā)酵，克服如UK那樣原料來源困難，溶栓酶的菌為枯草芽孢桿菌，基因產(chǎn)物為外分泌型，這樣可簡化純化工藝，同時安全性更好。本發(fā)明溶栓劑口服有效，可克服現(xiàn)有溶栓劑多為靜脈滴注，起到預(yù)防和治療雙重療效。
實(shí)施例1 將精選的優(yōu)質(zhì)大豆淘洗干凈，以2-10％(W/V)濃度量放入盛有含無機(jī)復(fù)合鹽的緩沖液容器中，經(jīng)1.1-1.2kg/cm2壓力高壓蒸煮制備大豆浸出液，作發(fā)酵培養(yǎng)基，經(jīng)高壓滅菌后接入一定量的含有纖溶酶基因的基因工程菌，置于25-40℃條件下通氣培養(yǎng)20-48小時，3000-8000轉(zhuǎn)/分4℃離心10-30分鐘，棄沉淀得上清液，加入分析純固體硫酸銨，使其為30-85％的飽和度(或分級沉淀)，4℃靜止沉淀過夜，3000-5000轉(zhuǎn)/分4℃離心20分鐘，棄上清液取沉淀物，將其溶解在含有2-10mM CaCl2的0.01MTris-HCl PH 7.0-7.5的緩沖液中，裝入透析袋，用同樣緩沖液4℃透析12-36小時，將透析液濃縮，冷凍干燥，制得溶栓酶制品?？芍苯佑糜谥苽淇诜苿?。
實(shí)施例2 按實(shí)施例1方法制備溶栓酶粗制品，將其溶解于5mMPH6.0磷酸緩沖液中，上樣在預(yù)先用同樣緩沖液平衡過的CMSepharose Fast Flow柱。上樣后用含0～1M Nacl的同樣緩沖液進(jìn)行線性梯度洗脫，收集纖溶酶活性峰。用50-80％飽和度的固體硫酸銨沉淀纖溶酶，再上Sephadet G-75柱進(jìn)行凝膠過濾，流動相為含0.05M Nacl的0.1M PH 7.5的磷酸緩沖液，收集活性峰，硫酸銨沉淀透析脫鹽，冷凍干燥，得溶栓酶精制品。
實(shí)施例3 按實(shí)施例1或2制備的溶栓酶溶解在0.03M PH7.8的磷酸緩沖液中成一定濃度，分別取10ul加入三種經(jīng)不同處理的纖維蛋白平板上(參照Astrup T.et al.Biochem.Biophs，40346-351，1952)。即含有纖溶酶原的人纖維蛋白平板和經(jīng)80℃處理2小時使纖溶酶原失活的人纖維蛋白平板及不含纖溶酶原的牛纖維蛋平板，并與UK樣品作對照，37℃保溫5小時，用卡尺精確測量樣品孔周圍透明圈的大小。結(jié)果表明在含有纖溶酶原的不加熱人纖維蛋白平板上，BK溶栓酶和UK都能產(chǎn)生大小相似的透明圈；在加熱平板(纖溶酶原失活)上UK樣品周圍無透明圈出現(xiàn)，BK樣品周圍仍然有透明圈，表明BK溶栓酶有直接纖溶酶活性；而在不含纖溶原的牛纖維蛋白平板上，同時加有BK溶栓酶和纖溶酶原的樣品孔周圍透明圈明鮮大于只加BK溶栓酶樣品孔周圍的透明圈，只加纖溶酶原樣品孔周圍無任何透明圈，表明BK溶栓酶具有激活纖溶酶原成纖溶酶的能力。
實(shí)施例4 按實(shí)施例1，制備的BK溶栓酶溶解在生理鹽水中，制成一定濃度的溶栓酶溶液，按5400u/kg/天給昆明種小白鼠口服，連續(xù)3天，取血測定血漿纖溶酶活性和血漿中tPA(按檢測試劑說明書進(jìn)行操作)。結(jié)果表明，藥組血漿纖溶活性比對照組增加30％，tPA含量增加51％。
實(shí)施例5 按實(shí)施例2制備的BK溶栓酶溶解在生理鹽水中，制成不濃度的溶栓酶溶液，用微電腦血栓檢測儀在體外試驗(yàn)BK溶栓酶抑制血栓形成和溶解血栓的效果(具體方法按血栓檢測儀說明書進(jìn)行)。結(jié)果見表1、2。
表1，BK溶栓酶抑制血栓形成作用
表2，BK溶栓酶溶解血栓作用
表1、2結(jié)果說明BK溶栓酶在體外能明鮮抑制血栓形成和溶解已經(jīng)形成的血栓并隨著酶濃度的增加，血栓長度、濕重、干重均隨之減少，具有一定量效關(guān)系。
權(quán)利要求
1.本發(fā)明系溶栓劑，其特征在于該溶栓劑的主要有效成份是由特異性枯草芽孢桿菌產(chǎn)生的纖維蛋白水解酶，后者系采用基因工程方法從干草中獲得的枯草芽孢桿菌染色體DNA中，克隆出目的基因片段，與載體連接組成重組DNA分子，轉(zhuǎn)化特定受體菌獲得基因工程菌，再經(jīng)微生物發(fā)酵，分離純化獲得。具體步驟包括(1)按常規(guī)方法提取純化枯草桿菌MBL-1染色體DNA；(2)根據(jù)特定DNA順序設(shè)計(jì)一對特異性引物，通過基因擴(kuò)增(PCR)技術(shù)擴(kuò)增出特定DNA片段；(3)用BamHI和EcoRI限制性核酸內(nèi)切酶切開PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和質(zhì)粒載體pUB18DNA；(4)用1％濃度瓊脂糖凝膠電泳分離回收所需DNA片段；(5)將回收的DNA片段與pUB18載體DNA混和并通過T4DNA連接酶進(jìn)行連接，得到重組DNA分子；(6)用重組DNA分子轉(zhuǎn)化枯草桿菌DB403；(7)在含有脫脂奶粉(1％濃度)和卡那霉素(5μg/ml)的選擇性平板篩選帶有透明圈的單菌落；(8)經(jīng)鑒定獲得帶目的基因的基因工程菌；(9)用ABI DNA自動測序儀測定基因工程菌中表達(dá)溶栓酶基因的核昔酸順序，獲得的順序?yàn)?，GCGCAATCTG TTCCTTATGG CATTTCTCAA ATTAAAGCGC CGGCTCTTCA CTCTCAAGGCA Q S V P Y G I S Q I K A P A L H S Q GTACACAGGCT CTAACGTAAA AGTAGCTGTT ATCGACAGCG GAATTGACTC TTCTCATCCTY T G S N V K V A V I D S G I D S S H PGACTTAAACG TCAGAGGCGG AGCAAGCTTC GTTCCTTCTG AAACAAACCC ATACCAGGACD L N V R G G A S F V P S E T N P Y Q DGGCAGTTCTC ACGGTACGCA TGTCGCCGGT ACGATTGCCG CTCTTAATAA CTCAATCGGTG S S H G T H V A G T I A A L N N S I GGTTCTGGGCG TAGCGCCAAG CGCATCATTA TATGCAGTAA AAGTGCTTGA TTCAACAGGAV L G V A P S A S L Y A V K V L D S T GAGCGGCCAAT ATAGCTGGAT TATTAACGGC ATTGAGTGGG CCATTTCCAA CAATATGGATS G Q Y S W I I N G I E W A I S N N M DGTTATCAACA TGAGCCTTGG CGGACCTACT GGTTCTACAG CGCTGAAAAC AGTAGTTGATV I N M S L G G P T G S T A L K T V V DAAAGCGGTTT CCAGCGGTAT CGTCGTTGCT GCCGCAGCCG GAAACGAAGG TTCATCCGGAK A V S S G I V V A A A A G N E G S S GAGCACAAGCA CAGTCGGCTA CCCTGCAAAA TATCCTTCTA CTATTGCAGT AGGTGCGGTAS T S T V G Y P A K Y P S T I A V G A VAACAGCAGCA ACCAAAGAGC TTCATTCTCC AGCGTAGGTT CTGAGCTTGA TGTAATGGCTN S S N Q R A S F S S V G S E L D V M ACCTGGCGTGT CCATCCAAAG CACACTTCCT GGAGGCACTT ACGGCGCTTA TAACGGAACGP G V S I Q S T L P G G T Y G A Y N G TTCCATGGCGA CTCCTCACGT TGCCGGAGCA GCAGCGCTAA TTCTTTCTAA GCACCCGACTS M A T P H V A G A A A L I L S K H P TTGGACAAACG CGCAAGTCCG TGATCGTTTA GAAAGCACTG CAACATATCT TGGAAACTCTW T N A Q V R D R L E S T A T Y L G N STTCTACTATG GAAAAGGGTT AATCAACGTA CAAGCAGCTG CACAAF Y Y G K G L I N V Q A AA Q(10) 在上述第(2)步PCR擴(kuò)增操作中，在嚴(yán)格控制反應(yīng)條件下獲得溶栓酶基因結(jié)構(gòu)變體，與圖1相比，該變體的第61位堿基為C，第21個密碼子為CAC，其對應(yīng)的氨基酸為H。第581位堿基為T，第194個密碼子為TTT其對應(yīng)的氨基酸為F。這一基因結(jié)構(gòu)變體所編碼的酶具有強(qiáng)烈溶解纖維蛋白和溶解血栓能力。
2.根據(jù)權(quán)項(xiàng)1所述的溶栓劑，其特征在于由含有溶栓酶基因的基因工程菌，通過微生物液體發(fā)酵，分離純化獲得，將溶栓酶與淀粉等輔料以重量比1∶50～1∶300的比例混和，灌裝成膠囊作為預(yù)防和治療血栓栓塞性疾病的藥物。
3.根據(jù)權(quán)項(xiàng)1、2所述的溶栓劑，其特征在于將溶栓酶與淀粉等輔料以重量比1∶50～1∶300的比例混和，灌裝成腸溶性膠囊，以口服溶栓劑劑型作為預(yù)防和治療血栓栓塞性疾病的藥物。
4.根據(jù)權(quán)項(xiàng)1所述的溶栓劑，其特征在于作為保健食品的組成成份。
全文摘要
本發(fā)明涉及采用基因工程技術(shù),通過PCR基因擴(kuò)增從特定枯草芽孢桿菌中“釣“出能強(qiáng)烈分解纖維蛋白的蛋白水解酶基因,再經(jīng)轉(zhuǎn)化獲得基因工程菌,由基因工程菌經(jīng)培養(yǎng)發(fā)酵分離,純化,獲得溶栓酶制劑。經(jīng)試驗(yàn),表明本溶栓劑具有溶解纖維蛋白(原),特別是溶解交聯(lián)纖維蛋白的能力,有效抑制血栓形成和溶解血栓基質(zhì),使血流暢通,作口服液,可預(yù)防和治療心腦血管疾病,本發(fā)明溶栓劑原料來源廣經(jīng)濟(jì),工藝成熟,提取簡便,成本低。
文檔編號C12N15/00GK1263778SQ99125780
公開日2000年8月23日 申請日期1999年12月27日 優(yōu)先權(quán)日1999年12月27日
發(fā)明者吳自成, 戚蓓靜, 彭欣夏, 黃靜, 方為軍, 王林發(fā) 申請人:華東師范大學(xué)