專利名稱：一種快速活化凝血酶原的方法
技術領域：
本發(fā)明是關于凝血酶原被快速活化的問題，屬于生物技術領域。
凝血酶原是一種維生素K依賴的糖蛋白(分子量M?！?8000，M人≈72000)。凝血酶原被激活時，在精氨酸(155)－絲氨酸(156)處裂解分出片斷1，在精氨酸(273)－蘇氨酸(274)處裂解出片斷2，在(322)精氨酸－異亮氨酸(323)處裂解生成凝血酶。凝血酶原的活化是發(fā)生在瀑布反應的最后階段，其活化態(tài)－凝血酶不僅可以加速纖維蛋白原轉化為纖維蛋白，還能夠反饋地激活凝血因子Ⅷ、因子Ⅴ、以及因子Ⅶ，從而加速血液凝固的速度。凝血酶常作特效止血藥用在外科臨床上。
凝血酶是一種選擇性很高的絲氨酸蛋白酶，在現(xiàn)代生物制藥工程中非常有用，在融合蛋白設計中常用作特異內切酶。融合基因表達是國際上目前十分流行的高效基因表達技術，它是利用DNA重組技術，將成熟的蛋白或肽的基因(標簽蛋白)加在某一目的蛋白末端，形成融合蛋白。標簽蛋白具有“純化標簽”性質，便于進行離子交換或親和層析，使之與雜質分離，達到純化目的。由于融合蛋白使目的蛋白可能失去其原有功能，并產(chǎn)生較明顯的抗原反應，所以需要特異內切酶將目的蛋白從融合蛋白上專一切割下來。凝血酶就是特異內切酶中的重要一員，它的結構標識序列和酶切點為Leu Val Pro Arg↓Gly Ser。目前，國外一些科學工作者正利用凝血酶作為特異內切酶設計融合蛋白。瑞典Pharmacia公司開發(fā)的GST融合基因載體，pGEX系列所采用的特異內切酶中就有凝血酶。在我國新藥開發(fā)研究中，已經(jīng)設計了若干酶切點就是凝血酶作為特異內切酶。這種應用的凝血酶要求比活性高，高純度，介質穩(wěn)定性理想，且酶用量較大。
然而凝血酶在血管內的血漿中只有痕量，只有在外傷出血階段才會出現(xiàn)幾個數(shù)量級的增加，盡管如此，仍然很難收集。我國尚無凝血酶作為特異內切酶的產(chǎn)品，主要是純度、比活性和價格都無法適應融合蛋白的工業(yè)化開發(fā)。因此，尋求一種高效制備凝血酶的方法非常有意義。我們目前正在研究一種可以用于工業(yè)化生產(chǎn)凝血酶的方法。凝血酶原的活化一般利用Oxyuranus scutellatus蛇毒中的凝血酶原活化酶(Os-Ⅱ)或活化的凝血因子Ⅹ(FXa)使之激活，但是這兩種酶單獨使用時活化凝血酶原的速度都比較慢，活化完全時所需時間比較長，容易造成在活化時凝血酶就部分失活。
分別向每毫升20mg/ml凝血酶原溶液加入活化酶量分別為0.5毫克Os-Ⅱ；0.5毫克FXa；先加0.1毫克Os-Ⅱ，1小時侯后再加0.4毫克FXa。室溫條件下活化，采用德國寶靈曼公司方法，用Chromozym TH作底物，在不同的時間檢測三種情況下的凝血酶活性，檢測結果見附
圖1。實驗表明同時利用Os-Ⅱ和FXa兩種酶可以快速活化凝血酶原。
本發(fā)明的目的就是同時利用Os-Ⅱ和FXa兩種酶快速活化凝血酶原，縮短凝血酶原的活化時間，提高凝血酶的收率。本發(fā)明的實行方案將100毫克凝血酶原溶解在5毫升50mmol/L Tris-HCl(pH8.2)緩沖液中，向毫升溶液中加入0.1毫克Oxyuranus scutellatus蛇毒中的凝血酶原活化酶(Os-Ⅱ)(從美國SIGMA公司購買Oxyuranus scutellatus蛇毒后，自己分離純化得到)，室溫條件下活化1小時，再向每毫升溶液中加入0.4毫克活化的凝血因子Ⅹ(FXa)(按Os-ⅡFXa為14)和5微升1.0 mol/L CaCl2溶液，室溫條件下放置活化6小時，溶液中的凝血酶原基本上都被活化為凝血酶，即可進行凝血酶的分離工作。
權利要求
1.一種快速活化凝血酶原的方法該方法是利用兩種凝血酶原活化酶－Oxyuranus scutellatus蛇毒中的凝血酶原活化酶(Os-Ⅱ)或活化的凝血因子Ⅹ(FXa)快速活化凝血酶原，即先用Os-Ⅱ活化凝血酶原1小時后再加入FXa，二者同時作用可以快速活化凝血酶原。
2.根據(jù)權利要求1的方法，該方法加入兩種活化酶順序為Os-Ⅱ應先加入到凝血酶原溶液中，1小時后再向溶液中加入FXa。
3.根據(jù)權利要求1的方法，該方法所用兩種活化酶的用量質量比Os-Ⅱ/FXa應為1/4。
全文摘要
本發(fā)明是關于凝血酶原被快速活化的問題,屬于生物技術領域。在制備凝血酶過程中,凝血酶原的活化速度較慢,從而降低了凝血酶的收率。本發(fā)明就是一種利用兩種凝血酶原活化酶－Oxyuranus scutellatus蛇毒中的凝血酶原活化酶(Os－Ⅱ)或活化的凝血因子X(FXa)快速活化凝血酶原的方法,即先用Os－Ⅱ活化凝血酶原1小時后再加入FXa,二者同時作用可以快速活化凝血酶原,提高凝血酶的收率。
文檔編號C12N9/74GK1298017SQ9912520
公開日2001年6月6日 申請日期1999年11月29日 優(yōu)先權日1999年11月29日
發(fā)明者吳雙頂, 趙超, 王晶瑩, 馬瑞京, 彭安, 劉清亮 申請人:中國科學技術大學, 中國科學院生態(tài)環(huán)境研究中心