一種非還原性糖形成酶、一種海藻糖釋放酶以及用這些酶制備糖的方法

專利名稱：一種非還原性糖形成酶、一種海藻糖釋放酶以及用這些酶制備糖的方法
技術領域：
本發明涉及一種非還原性糖形成酶、一種海藻糖釋放酶以及用這些酶制備糖的方法。
海藻糖是由2摩爾在其還原性殘基上結合的葡萄糖所組成的二糖，并且廣泛見于自然界中，例如在微生物、真菌、藻類、昆蟲、甲殼類等。由于該糖長期以來被看作是基本上無還原性并具有滿意的保濕功能的糖，所以預計其可用于廣泛的領域。包括食品、化妝品及藥品。然而，盡管其杰出的預期功能，但沒有建立該糖有效的制備方法，故這限制了海藻糖的用途。因而，強烈期待能夠廉價供應海藻糖。
作為對這種期待的建議，本發明者通過他們的深入研究已經建立了從原料淀粉酶促制備海藻糖的方法。該方法特征在于以下的步驟，即將還原性的部分淀粉水解物經過非還原性糖形成酶的作用，這將由還原性的部分淀粉水解物形成具有海藻糖結構作為末端單元的非還原性糖，并且還原性的部分淀粉水解物經海藻糖釋放酶的作用，該酶作用于具有海藻糖結構作為末端單元的非還原性糖從而水解海藻糖結構部分與其余部分之間的位點。這些酶及其方法公開于由與本發明相同的申請者申請的日本專利公開No.143,876/95，213,283/95，322,883/95，298,880/95，66,187/96，66,188/96，73,504/96，84,586/96，和336,388/96中。因此，獲得了海藻糖的廉價制備。
在研究期間，他們獲得了獨到的發現，即該非還原性糖形成酶可用于新制備非還原性糖，這種方法克服了傳統的存在于還原性部分淀粉水解物中的缺陷。作為問題，還原性部分淀粉水解物如糊精和麥芽糖寡糖具有可用作增甜劑及能量補充糖源的優勢，但作為其缺點，由于其還原性而與其他物質具有高度反應性和當與氨基酸和/或蛋白共存時易于褐變反應以及容易損壞其質量。為了克服此問題，僅僅知道用高壓氫化作用方法等將還原性部分淀粉水解物轉換成糖醇的方法。然而，在實際使用中，該方法需要較多的熱量和鑒于使用氫的安全性考慮而建立的裝備，這樣便導致了更高的成本及較多的勞動力消耗。相反，前述的非還原性糖形成酶按照前面所述作用于還原性部分淀粉水解物，形成具有海藻糖結構作為末端單元的非還原性糖，并且此反應由于為酶促反應而在相對較為溫和的條件下進行。利用該酶的作用，本發明者建立了用該酶制備非還原性糖的有效新方法，其可克服存在于還原性部分淀粉水解物中的傳統缺陷。由于這些發現，開發海藻糖及非還原性糖的適當用途充斥于多個領域。并因此擴大了這些糖的用途且現在顯著增加了這些糖在多個領域中的需求。
在這些條件下，在該領域中更加期望制備。海藻糖及具有海藻糖結構的非還原性糖的更為有效的方法。這種期望的關鍵是建立具有各種最佳條件的非還原性糖形成酶和海藻糖釋放酶，并且提供各種可用于這些糖制備的這些酶的來源。因此，根據可與上述酶聯合使用以制備所需糖的另一種酶的最佳條件以及設備和制備糖的最終用途，最佳的酶可選自各種類型的酶，從而導致有效制備這些糖。通常已知的非還原性糖形成酶可分成具有相對較低的大約40℃或更低最適溫度的那些種類和具有相對較高的大約60℃或更高最適溫度的那些種類。盡管通常已知的海藻糖釋放酶可分成具有相對較低的大約45℃或更低最適溫度的那些種類和具有相對較高的大約60℃或更高最適溫度的那些種類。然而，至今還沒有發現具有大約50℃適中溫度范圍最適溫度的非還原性糖形成酶和海藻糖釋放酶。
在用于從淀粉原料制備糖的糖相關性酶中，主要的一組酶具有適中溫度范圍的最適溫度。在制備前述海藻糖和非還原性糖的方法中需要這些酶；至今還沒有建立具有適中溫度范圍的最適溫度的非還原性糖形成酶和海藻糖釋放酶，從而還沒有認識到用這2種酶中任意一種或同時用此二者以及上述糖相關性酶以充足的產量制備這些糖的方法。根據用于制備這些糖的設備及其最終用途，需要有在其酶促反應中具有適中溫度范圍的最適溫度的酶。還遠不能說已經建立了用非還原性糖形成酶和海藻糖釋放酶以滿意的高產量制備糖的方法。如上述，還強烈需要建立具有適中溫度范圍的最適溫度的非還原性糖形成酶和海藻糖釋放酶和用于制備包括非還原性糖在內的糖的方法。
鑒于此，本發明的第一個目的是提供具有適中溫度范圍的最適溫度的非還原性糖形成酶。
本發明的第二個目的是提供編碼該非還原性糖形成酶的DNA。
本發明的第三個目的是提供用于制備該非還原性糖形成酶的方法。
本發明的第四個目的是提供具有適中溫度范圍的最適溫度的海藻糖釋放酶。
本發明的第五個目的是提供編碼該海藻糖釋放酶的DNA。
本發明的第六個目的是提供用于制備該海藻糖釋放酶的方法。
本發明的第七個目的是提供能夠產生非還原性糖形成酶和/或海藻糖釋放酶的微生物。
本發明的第八個目的是提供用該非還原性糖形成酶和/或海藻糖釋放酶制備包括非還原性糖的糖的方法。
為了達到上面的目的，本發明者廣泛地篩選了土壤中能夠實現這些目的的微生物。結果，他們發現，一種從日本Ako-Shi，Hyogo的土壤中新分離的微生物，產生的酶能夠解決上面的問題。本發明者從該微生物中單獨分離出了所需的非還原性糖形成酶和海藻糖釋放酶，并鑒定了其特性，揭示這兩種酶均具有適中溫度范圍的最適溫度。對該微生物的鑒定證實其為節桿菌屬的一種新的微生物，命名為節桿菌屬的種S34。該微生物于1998年8月6日保藏于國立工業科技與人類技術研究所，Higashi 1-1-3，Tsukuba-shi，Ibaraki，日本，并被接受且以許可號FERM BP-6450由該研究所保存。
本發明者繼續研究，從該微生物，節桿菌屬的種S34，FERMBP-6450中分離編碼上面鑒定酶的DNA，破譯核苷酸序列，并測定該酶的氨基酸序列。本發明者證實節桿菌屬的種S34，FERM BP-6450以及其中以常規方式導入了上面所得DNA的轉化子產生了所需量的酶。同時證實，這樣得到的酶可有利地用于在適中溫度范圍內制備包含海藻糖和具有海藻糖結構的非還原性糖的糖類。本發明根據這些發現得以完成。
本發明的第一個目的是通過新的非還原性糖形成酶加以解決，該酶可以從還原性部分淀粉水解物形成具有海藻糖結構作為末端單元，并具有適中溫度范圍的最適溫度。
本發明的第二個目的是通過編碼非還原性糖形成酶的DNA加以解決。
本發明的第三個目的是通過制備非還原性糖形成酶的方法加以解決，該方法特征在于包括培養能夠產生該酶的微生物和從培養物中收集所產生的酶的步驟。
本發明的第四個目的是通過一種新的海藻糖釋放酶加以解決，該酶特異性地水解具有海藻糖結構作為末端單元并且在海藻糖部分和其余部分之間的一個位點葡萄糖聚合程度至少為了的非還原性糖，并且具有適中溫度范圍內的最適溫度。
本發明的第五個目的是通過編碼海藻糖釋放酶的DNA解決。
本發明的第六個目的是通過制備海藻糖釋放酶的方法解決，該方法的特征在于包括培養能夠產生該酶的微生物和從培養物中收集所產生的酶的步驟。
本發明的第七個目的是通過選自節桿菌屬的種S34，FERM BP-6450及其突變體的微生物加以解決。
本發明的第八個目的是通過制備糖的方法加以解決，包括以下步驟，即讓上面2種酶中任意一種或2種作用于還原性部分淀粉水解物以制備非還原性糖，并收集非還原性糖或具有相對較低還原性且含有非還原性糖的糖組合物。


圖1顯示溫度對來自本發明節桿菌屬的種S34，FERM BP-6450的非還原性糖形成酶活性的影響。
圖2顯示pH對來自本發明節桿菌屬的種S34，FERM BP-6450的非還原性糖形成酶活性的影響。
圖3顯示溫度對來自本發明節桿菌屬的種S34，FERM BP-6450的非還原性糖形成酶穩定性的影響。
圖4顯示pH對來自本發明節桿菌屬的種S34，FERM BP-6450的非還原性糖形成酶穩定性的影響。
圖5為本發明重組DNA pGY1的限制性圖譜。粗體線顯示來自節桿菌屬的種S34，FERM BP-6450的核苷酸序列。粗體線內的黑箭頭顯示編碼本發明非還原性糖形成酶的核苷酸序列，而斜箭頭顯示編碼本發明海藻糖釋放酶的核苷酸序列。
圖6為本發明重組DNA pGY2的限制性圖譜。粗體線顯示來自節桿菌屬的種S34，FERM BP-6450的核苷酸序列。粗體線內的黑箭頭顯示編碼本發明非還原性糖形成酶的核苷酸序列。
圖7為本發明重組DNA pGY3的限制性圖譜。黑箭頭顯示來自節桿菌屬的種S34，FERM BP-6450的編碼本發明非還原性糖形成酶的核苷酸序列。
圖8顯示溫度對來自本發明節桿菌屬的種S34，FERM BP-6450的海藻糖釋放酶活性的影響。
圖9顯示pH對來自本發明節桿菌屬的種S34，FERM BP-6450的海藻糖釋放酶活性的影響。
圖10顯示溫度對來自本發明節桿菌屬的種S34，FERM BP-6450的海藻糖釋放酶穩定性的影響。
圖11顯示pH對來自本發明節桿菌屬的種S34，FERM BP-6450的海藻糖釋放酶穩定性的影響。
圖12為本發明重組DNA pGZ2的限制性圖譜。粗體線顯示來自節桿菌屬的種S34，FERM BP-6450的核苷酸序列。粗體線內的斜箭頭顯示編碼本發明海藻糖釋放酶的核苷酸序列。
圖13為本發明重組DNA pGZ3的限制性圖譜。斜箭頭顯示來自節桿菌屬的種S34，FERM BP-6450的核苷酸序列。
本發明涉及一種非還原性糖形成酶和一種海藻糖釋放酶，以及用這2種酶中任意1種或同時用這二者制備糖的方法。本發明中所稱的詞語“非還原性糖形成酶”代表具有從還原性部分淀粉水解物形成具海藻糖結構作為末端單元的非還原性糖這種作用的酶。本發明中所稱的詞語“海藻糖釋放酶”代表能夠特異性地水解具有海藻糖結構作為末端單元、葡萄糖聚合程度至少為3的非還原性糖、并且水解位點位于海藻糖部分和其余部分之間的酶。本發明中所稱的詞語“適中溫度范圍”代表通常用于從淀粉物質通過酶促反應而制備糖的反應溫度中的適中溫度范圍。在這些方法的大多數情況下，使用大約10℃到100℃及其周圍溫度的不同反應溫度。本發明的非還原性糖形成酶具有這種酶的功能，并且具有適中溫度范圍的最適溫度，優選具有高于40℃低于60℃的溫度范圍，且更為優選地，除了最適溫度外，其具有酸性pH范圍內的最適pH。本發明的海藻糖釋放酶具有這種酶的功能，并且具有適中溫度范圍內的最適溫度，優選高于45℃低于60℃的溫度范圍，且更為優選地，除了最適溫度外，其具有酸性pH范圍內的最適pH。本發明的這些酶不應限制其出處和來源。
按照如下測定本發明非還原性糖形成酶的活性將1ml酶溶液加入到4ml于20mM磷酸鹽緩沖液(pH6.0)中作為底物的1.25w/v％的麥芽糖五糖中，并將混合物于50℃培養60分鐘。將此反應混合物加熱至100℃ 10分鐘從而終止酶促反應，用去離子水將反應混合物準確稀釋10倍，然后根據Somogyi-Nelson方法測定稀釋液的還原能力。作為對照，按上述類似地處理已經于100℃加熱10分鐘而使酶失活的酶溶液。本發明酶的1單位活性定義為，當按上述測定方法測定時，每分鐘去除1μmol麥芽糖五糖還原能力的酶量。根據此測定方法測定本發明中所稱的酶的最適溫度。通過以下方法加以測定，即在不同的溫度包括50℃時調節酶促反應溫度，使預定量的酶在測定的不同溫度作用于底物，根據測定中的不同溫度測定還原能力的降低水平，然后對測得的降低水平進行相互比較，確定顯示最高活性的本發明酶的最適溫度。
按照如下測定本發明海藻糖釋放酶的活性將1ml酶溶液加入到4ml于20mM磷酸鹽緩沖液(pH6.0)中作為底物的1.25w/v％麥芽三糖基海藻糖，即α-maltotetraosyl-α-D-葡萄糖苷中，并將混合液于50℃培養30分鐘，然后通過加熱Somogyi銅溶液而終止酶促反應，并且根據Somogyi-Nelson方法測定還原能力。作為對照，用已經于100℃加熱10分鐘而失活的酶溶液，按上述類似地進行測定。本發明酶的1單位活性定義為，當按上述測定方法測定時，每分鐘增加1μmol葡萄糖還原能力的酶量。根據此測定方法測定本發明中所稱的酶的最適溫度。通過以下方法加以測定，即在不同的溫度包括50℃時調節酶促反應溫度，使預定量的酶在測定的不同溫度作用于底物，并且根據測定中的不同溫度測定還原能力的增加水平，然后對測得的增加水平進行比較，確定顯示最高活性的本發明酶的最適溫度。
解釋基于此氨基酸序列的本發明非還原性糖形成酶，總體上，該酶具有SEQID NO1的氨基酸序列，并且在有些情況下具有SEQ ID NO2到6的氨基酸序列作為其部分序列。除了具有上述整個氨基酸序列的這些酶之外，本發明還包括另幾種酶，其包括選自其中任何一種氨基酸序列中的一部分，或同時具有本發明非還原性糖形成酶功能和上述最適溫度。這些酶的氨基酸序列的實例有這些，它們在其氨基酸序列內含有與本發明非還原性糖形成酶特性的表達有關的部分氨基酸序列或氨基酸殘基，并且其中一個或更多個氨基酸被不同的氨基酸所取代或向其中添加了氨基酸和/或缺失了除上述氨基酸序列或氨基酸殘基外的其它氨基酸。在本發明中所稱的被不同的氨基酸所取代的氨基酸序列實例包括這些，其中組成SEQ ID NO1氨基酸序列不到30％并且優選不到20％的氨基酸序列被具有類似特性和結構的其它氨基酸所取代。這種氨基酸分組的實例有作為酸性氨基酸組的天冬氨酸與谷氨酸，作為堿性氨基酸的賴氨酸、精氨酸與組氨酸之一，作為酰胺型氨基酸的天冬酰胺與谷氨酰胺之一，作為羥基氨基酸的絲氨酸與蘇氨酸之一，作為支鏈氨基酸的纈氨酸、亮氨酸與異亮氨酸之一。含有選自SEQ ID NO1到6的氨基酸序列中任何一種的一部分的本發明酶其它氨基酸序列的實例有這些，即它們可能與SEQ ID NO1氨基酸序列具有基本上類似的立體結構，即氨基酸的替代、缺失和/或添加被導入到SEQ ID NO1氨基酸序列中。該蛋白的立體結構可通過以下方法加以估計，即對市售數據庫進行篩選，以獲得具有與目的序列有關的氨基酸序列并且已揭示了其立體結構的蛋白質的立體結構，參照選出的立體結構，并且用商業上可得到的軟件觀看立體結構。本發明非還原性糖形成酶的上述氨基酸序列與SEQ ID NO1具有至少57％，優選至少70％，更為優選至少80％的同源性。
如上所述，該非還原性糖形成酶不應限于特定的出處/來源。這些酶的實例有源自微生物，即節桿菌屬微生物，節桿菌屬的種S34，FERM BP-6450，及其變異體的那些酶。這些變異體可通過以下方法獲得，即用已知的誘變劑，如N-甲基-N′-硝基-N-亞硝基胍、甲基磺酸乙酯、紫外線和轉座子，以常規方式處理節桿菌屬的種S34，FERM BP-6450；篩選能夠產生非還原性糖形成酶并且具有適中溫度范圍的最適溫度、通常在高于40℃而低于60℃溫度范圍的溫度具有最適溫度的所需突變體。源自節桿菌屬的種S34，FERM BP-6450的酶通常具有SEQ IDNO1到6的氨基酸序列。源自突變體節桿菌屬的種S34，FERM BP-6450微生物以及其它微生物的其它非還原性糖形成酶包含SEQ ID NO1到6的氨基酸序列中任意一種的全部或部分序列。其它酶的具體實例包括作為本發明非還原性糖形成酶起作用、最適溫度在適中溫度范圍中、通常在高于40℃而低于60℃的溫度范圍中的重組酶。此重組酶可通過對編碼本發明非還原性糖形成酶的DNA應用重組DNA技術而得到，可具有SEQ ID NO1到6的氨基酸序列中任意一種的全部或部分序列。
本發明大多數非還原性糖形成酶具有以下的理化特性(1)作用從葡萄糖聚合程度為3或更高的還原性部分淀粉水解物形成具海藻糖結構作為末端單元的非還原性糖；(2)分子量根據十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)約為75,000±10,000道爾頓；(3)等電點(pI)
用兩性電解質等電點電泳，約為4.5±0.5；(4)最適溫度當于pH6.0溫育60分鐘時大約為50℃；(5)最適pH當于50℃溫育60分鐘時大約為pH6.0；(6)熱穩定性當于pH7.0溫育60分鐘時，在高達約55℃的溫度下穩定；和(7)pH穩定性當于4℃溫育24小時時，在大約pH5.0至10.0的pH穩定。
通過下述的制備方法，本發明非還原性糖形成酶可以預定的量獲得。
本發明提供了編碼本發明非還原性糖形成酶的DNA。這樣的DNA在制備重組蛋白形式的酶時十分有用。一般地，此DNA包括編碼與本發明非還原性糖形成酶不同出處/來源的酶的那些DNA。這些DNA的實例有含有全部或部分SEQ ID NO7的核苷酸序列或與其互補序列的那些DNA。包括全部SEQ ID NO7的核苷酸序列的DNA編碼SEQ ID NO1的氨基酸序列。含有全部或部分SEQ ID NO7的核苷酸序列的DNA包括以下DNA，它們具有與本發明非還原性糖形成酶的特性表達有關的氨基酸序列、并且具有相應于該氨基酸序列的核苷酸序列，以及導入了一個或更多個堿基替代、缺失和/或添加而仍然維持與本發明非還原性糖形成酶的特性表達有關的核苷酸序列的SEQ ID NO7核苷酸序列。根據本發明的DNA應該包括根據遺傳密碼子的簡并而以不同堿基替代一個或更多個堿基的那些DNA。根據本發明的DNA也包括那些含有編碼本發明非還原性糖形成酶的核苷酸序列并且進一步包括選自以下的一個或多個其它附加核苷酸序列的DNA核糖體結合序列，如起始密碼子，終止密碼子和Shine-Dalgarno序列；編碼信號肽的核苷酸序列，適當限制酶的識別序列；調節基因表達的啟動子和增強子核苷酸序列；以及終止子，所以這些序列都常用于重組DNA技術中而用于制備重組蛋白。例如，由于部分及全部的SEQ ID NO8核苷酸序列作為核糖體結合序列而起作用，故可任意地將部分及全部SEQ ID NO8核苷酸序列連接到編碼本發明非還原性糖形成酶的核苷酸序列上游的DNA用于制備重組蛋白形式的酶。
如上所述，編碼本發明非還原性糖形成酶的DNA不應限制其出處/來源，并且，它們可根據用包含編碼本發明酶至少一部分氨基酸序列，如SEQ ID NO1氨基酸序列的核苷酸序列的DNA進行的雜交，通過篩選不同來源的DNA而加以制備。這些來源的實例有節桿菌屬的微生物，并且優選為節桿菌屬的種S34，FERMBP-6450及其突變體，所有這些來源均產生非還原性糖形成酶。為了篩選這些微生物，可以使用該領域中用于篩選或克隆DNA的常規方法，如篩選重組文庫的方法、PCR方法及其改進的方法。篩選的結果是所需DNA可以通過按常規方式收集以預期方式雜交的DNA而獲得。一般地，這樣得到的DNA包括部分或全部SEQ IDNO7核苷酸序列。例如，包括全部SEQ ID NO7核苷酸序列的DNA一般從節桿菌屬的種S34，FERM BP-6450獲得。包括部分SEQ ID NO7核苷酸序列的DNA可通過類似地從非上述菌株來源的能夠產生本發明非還原性糖形成酶的微生物中篩選DNA而獲得。通過從用一種或更多種常規突變導入技術而導入上述DNA中一個或更多個堿基替代、添加和/或缺失的DNA中篩選編碼具有本發明酶特性酶的DNA，可以制備這樣的DNA。也可根據編碼本發明非還原性糖形成酶的核苷酸序列，如SEQ ID NO7的核苷酸序列，用常規化學合成法而得到此DNA。一旦獲得，便可應用或使用PCR方法和可自主復制的載體將本發明DNA擴增至所需的水平。
本發明編碼非還原性糖形成酶的DNA包括導入適當載體中的重組形式的DNA。只要該DNA可以得到，那么一般可通過重組DNA技術而相對容易地制備重組DNA。只要其能夠在適當的宿主中自主地復制，那么任何類型的載體均可用于本發明中。這些載體的實例有用大腸桿菌作為宿主的pUC18，pBluescript IISK(+)，pKK223-3，λgt.λC等；用芽孢桿菌屬微生物的pUB110，pTZ4，pC194，ρ11，φ1，φ105等；和用2種或更多種微生物作為宿主的pHY300PLK，pHV14，TRp7，YEp7，pBS7等。本發明中將該DNA插入載體中的方法可以是本領域中常用的方法。含有該DNA的基因及可自主復制的載體首先用限制酶消化和/或用超聲破碎儀處理，然后連接得到的DNA片段和載體片段。通過用特異性切割該DNA的限制酶，特別是kpnI，AccI，BamHI，BstXI，EcoRI，HindIII，NotI，PstI，SacI，SalI，SmaI，SpeI，XbaI，XhoI等來促進連接。為了連接該DNA片段和載體，如果必要，首先將其退火，然后在體內或體外用DNA連接酶作用。這樣得到的重組DNA可在適當宿主中基本上不受限制地復制。
編碼非還原性糖形成酶的本發明DNA進一步包括該DNA已導入適當載體中的轉化子。通過將該DNA或上述獲得的重組DNA導入適當的宿主中將其轉化，可容易地制備這些轉化子。作為宿主，可以使用來自植物和動物的細胞以及微生物，它們在本領域中常用，并根據重組DNA中的載體而挑選。作為宿主的微生物包括埃希氏桿菌屬、芽孢桿菌屬和節桿菌屬以及其它放線菌、酵母、真菌等。為了將此DNA導入這些宿主微生物，可以使用常規的感受態細胞方法和原生質體方法。編碼非還原性糖形成酶并導入本發明轉化子中的DNA可存在于染色體外的分離形式中，或以摻入形式存在于染色體中。摻入宿主染色體中的DNA具有能在其中穩定保持的特征，用于制備本發明重組蛋白比較有利。
本發明海藻糖釋放酶可以需要的量通過下面制備酶的方法而得到，該方法特征在于其包括在營養培養基中培養能夠產生該酶的微生物和從所得培養物中收集產生的酶。只要其能夠產生酶，用于此方法中的微生物可不同于前面的屬或種。這些微生物的實例有節桿菌屬的微生物，節桿菌屬的種S34，FERM BP-6450，其變異體以及可通過將編碼該酶的DNA導入到適當的宿主中而得到的轉化子。
只要前述的微生物能在其中生長并且產生此酶，則用于培養產生本發明非還原性糖形成酶的任何營養培養基均可使用。一般地，此營養培養基含有碳源和氮源，且如果必要，可加入礦物質。碳源的實例有糖如糊精、淀粉、部分淀粉水解物、葡萄糖等，和如糖蜜和酵母提取物之類含有糖的物質，以及有機酸如葡糖醛酸和琥珀酸。碳源的濃度根據所用的類型加以挑選，一般為30w/v％，并且優選15w/v％或更低。適用于本發明中的氮源的實例有含有無機氮的物質，如銨鹽、硝酸鹽等；含有有機氮的物質，如尿素、玉米漿、酪蛋白、蛋白胨、酵母提取物、牛肉提取物等。根據用途，可選擇性使用無機成份，如鈣、鎂、鉀、鈉，磷酸，錳，鋅，鐵，銅，鉬，鈷的鹽等。
用于制備本發明酶的培養條件可選擇性地使用適用于培養相應微生物的適當條件。例如，用節桿菌屬的微生物，包括節桿菌屬的種S34，FERM BP-6450的情況時，培養溫度一般在20-50℃，優選在25-37℃的范圍；培養pH一般在pH4-10，優選在pH5-9的范圍；培養時間在10-150小時的范圍。用這些條件，在有氧條件下培養該微生物。當使用通過將編碼本發明非還原性糖形成酶的DNA導入適當的宿主中而制備的轉化子時，該轉化子在下面的有氧條件下培養，如20-65℃的培養溫度。pH2-9的培養pH和1-6天的培養時間，盡管它們依微生物的屬、種、品系或型以及載體而變化。這樣得到的培養物在細胞級分中一般含有本發明酶。在培養通過用芽孢桿菌屬微生物作為宿主而得到的轉化子時，根據用于轉化宿主的載體，得到的培養基在上清液中可能含有本發明酶。這樣得到的培養物中本發明酶的含量通常在每ml培養物中0.01-1,000個單位盡管其依據所用微生物的屬、種、品系以及培養條件而變化。
從得到的培養物中收集本發明非還原性糖形成酶。收集方法沒有限制。通過分離和收集任何一種發現具有該酶主要活性的細胞級分和培養物上清，并且如果必要則對收集的級分進行適當的純化從而收集含有該酶的純化級分，可以得到本發明酶。為了分離細胞級分與培養物上清，可以任意使用常規的固-液分離方法，如用預先覆蓋濾膜和平紋及中空纖維膜進行離心和過濾。從分離的細胞級分和培養物上清中收集所需的級分。對于細胞級分，將細胞破碎成細胞碎片，然后將其分離成細胞提取物和不溶性細胞級分，再收集任意一種所需級分。如果必要，可通過常規方法將不溶性細胞級分溶解。作為裂解細胞的方法，可任意使用任何一種下面的技術，包括超聲處理、以細胞壁裂解酶如溶菌酶和葡聚糖酶處理以及機械壓力負荷。為了裂解細胞，可以用任何一種上述技術直接處理培養物，然后以任何一種上述的固-液分離方法處理所得混合物以收集液體級分。這樣可任意得到細胞提取物。
用于進一步純化本發明非還原性糖形成酶的方法包括一般純化糖相關性酶的常規方法，如鹽析、透析、過濾、濃縮、凝膠過濾層析、離子交換層析、疏水層析、反相層析、親和層析、凝膠電泳和等電點電泳。這些方法可根據目的聯合使用。從通過這些方法分離而得到的級分中，收集通過非還原性糖形成酶的方法測得具有所需活性的級分，從而獲得純化至所需水平的本發明非還原性糖形成酶。根據下述實施例中方法，本發明酶可純化至電泳純的水平。如上所述，該方法提供以下形式的本發明非還原性糖形成酶，包括培養物、細胞級分、培養物上清級分、細胞裂解物、細胞提取物、可溶和不溶的細胞級分、部分純化的酶級分和純化的酶級分形式。這些級分可能含有其它類型的本發明海藻糖釋放酶。使用前，這樣獲得的非還原性糖形成酶可用常規的方式加以固定。固定的方法有，例如結合至離子交換劑上的方法、共價結合/吸附到樹脂和膜上，用高分子量物質的截流固定方法。這樣獲得的非還原性糖形成酶可任意用于制備糖的方法中，包括下述用于制備糖的本發明方法。特別地，由于本發明非還原性糖形成酶具有適中溫度范圍的最適溫度，并且優選具有酸性pH范圍內的最適pH，故當其與本發明下述的海藻糖釋放酶、具有酸性pH范圍內最適pH的淀粉脫支酶和在適中的溫度范圍中有效發揮作用的環麥芽糖糊精葡聚糖轉移酶聯合使用時，其可有利地用于制備糖。
解釋基于此氨基酸序列的本發明海藻糖釋放酶，總體上，該酶具有SEQ IDNO9的氨基酸序列，并且在有些情況下具有SEQ ID NO10到16的氨基酸序列作為其部分序列。除了具有上述整個氨基酸序列的這些酶之外，本發明還包括另幾種酶，其包括選自其中的任何一種氨基酸序列的一部分或同時具有本發明海藻糖釋放酶功能和上述最適溫度。這些酶的氨基酸序列的實例有這些，它們在其氨基酸序列內含有與本發明海藻糖釋放酶特性的表達有關的部分氨基酸序列或氨基酸殘基，并且其中一個或更多個氨基酸被不同的氨基酸所取代或向其中添加了氨基酸和/或缺失了除上述氨基酸序列或氨基酸殘基外的其它氨基酸。在本發明中所稱的被不同的氨基酸所取代的氨基酸序列實例包括這些，其中組成SEQ ID NO9氨基酸序列不到30％并且優選不到20％的氨基酸序列被具有類似特性和結構的其它氨基酸所取代。這種氨基酸分組的實例有作為酸性氨基酸的天冬氨酸與谷氨酸，作為堿性氨基酸的賴氨酸、精氨酸與組氨酸之一，作為酰胺型氨基酸的天冬酰胺與谷氨酰胺之一，作為羥基氨基酸的絲氨酸與蘇氨酸之一，作為支鏈氨基酸的纈氨酸、亮氨酸與異亮氨酸之一。含有選自SEQ ID NO9到16的氨基酸序列中任何一種的一部分的本發明酶其它氨基酸序列的實例有這些，即它們可能與SEQ ID NO9氨基酸序列具有基本上類似的立體結構，即氨基酸的替代、缺失和/或添加被導入到SEQ ID NO9氨基酸序列中。蛋白的立體結構可通過以下方法加以估計，即對市售數據庫進行篩選，以獲得具有與目的序列有關的氨基酸序列并且已揭示了其立體結構的蛋白質的立體結構，參照選出的立體結構，并且用商業上可得到的軟件觀看立體結構。本發明海藻糖釋放酶的上述氨基酸序列與SEQID NO9具有至少60％，優選至少70％，更為優選至少80％的同源性。
如上所述，該海藻糖釋放酶不應限于特定的出處/來源。這些酶的實例有源自微生物，即節桿菌屬微生物，節桿菌屬的種S34，FERM BP-6450，及其變異體的那些酶。這些變異體可通過以下方法獲得，即用已知的誘變劑如N-甲基-N′-硝基-N-亞硝基胍、甲基磺酸乙酯、紫外線和轉座子，以常規方式處理節桿菌屬的種S34，FERM BP-6450；篩選能夠產生海藻糖釋放酶并且具有適中溫度范圍的最適溫度、通常在高于45℃而低于60℃溫度范圍的溫度具有最適溫度的所需突變體。源自節桿菌屬的種S34，FERM BP-6450的酶通常具有SEQ ID NO9到16的氨基酸序列。源自突變體節桿菌屬的種S34，FERM BP-6450微生物以及其它微生物的其它海藻糖釋放酶包括SEQ ID NO9到16的氨基酸序列中任意一種的全部或部分序列。其它酶的具體實例包括作為本發明海藻糖釋放酶起作用、最適溫度在適中溫度范圍中、通常在高于45℃而低于60℃的溫度范圍中的重組酶。此重組酶可通過對編碼本發明海藻糖釋放酶的DNA應用重組DNA技術而得到，可具有SEQ ID NO9到16的氨基酸序列中任意一種的全部或部分序列。
本發明大多數海藻糖釋放酶具有以下的理化特性(1)作用在海藻糖結構與其余部分之間的位點特異性水解具有海藻糖結構作為末端單元的非還原性糖；(2)分子量根據十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)約為62,000±5,000道爾頓；(3)等電點(pI)用兩性電解質等電電泳約為4.7±0.5；(4)最適溫度當于pH6.0溫育30分鐘時大約為50℃-55℃；(5)最適pH當于50℃溫育30分鐘時大約為pH6.0；(6)熱穩定性當于pH7.0溫育60分鐘時，在高達大約pH50℃的溫度下穩定；和(7)pH穩定性當于4℃溫育24小時時，在大約pH4.5至10.0時比較穩定。
通過下述的制備方法，本發明海藻糖釋放酶可以預定的量獲得。
本發明提供了編碼本發明海藻糖釋放酶的DNA。這樣的DNA在制備重組蛋白形式的酶時十分有用。一般地，此DNA包括編碼與本發明海藻糖釋放酶不同出處/來源的酶的那些DNA。這些DNA的實例有含有全部或部分SEQ ID NO17的核苷酸序列或與其互補的序列的那些DNA。包含全部SEQ ID NO17的核苷酸序列的DNA編碼SEQ ID NO9的氨基酸序列。含有全部或部分SEQ ID NO17核苷酸序列的DNA包括以下DNA，它們具有相應于與本發明海藻糖釋放酶的特性表達有關的氨基酸序列的核苷酸序列，以及導入了一個或更多個堿基替代、缺失和/或添加而仍然維持與本發明海藻糖釋放酶的特性表達有關的核苷酸序列的SEQ IDNO17核苷酸序列。根據本發明的DNA應該包括根據遺傳密碼子的簡并而以不同堿基替代一個或更多個堿基的那些DNA。根據本發明的DNA也包括那些含有編碼本發明海藻糖釋放酶的核苷酸序列，并且進一步包括選自以下的一個或多個其它附加核苷酸序列的DNA核糖體結合序列，如起始密碼子，終止密碼子和Shine-Dalgarno序列；編碼信號肽的核苷酸序列，適當限制酶的識別序列；調節基因表達的啟動子和增強子核苷酸序列；以及終止子，所以這些序列都常用于重組DNA技術中而用于制備重組蛋白。例如，由于部分及全部SEQ ID NO8的核苷酸序列作為核糖體結合序列而起作用，故可任意地將部分及全部SEQ ID NO8核苷酸序列連接到編碼本發明海藻糖釋放酶核苷酸序列上游的DNA用于制備重組蛋白形式的酶。
如上所述，編碼本發明海藻糖釋放酶的DNA不應限制其出處/來源，并且，它們可根據用包含編碼本發明酶至少一部分氨基酸序列，如SEQ ID NO9氨基酸序列的核苷酸序列的DNA進行的雜交，通過篩選不同來源的DNA而加以制備。這些來源的實例有節桿菌屬的微生物，并且優選為節桿菌屬的種S34，FERM BP-6450及其突變體，所有這些來源均產生海藻糖釋放酶。為了篩選這些微生物，可以使用該領域中用于篩選或克隆DNA的常規方法，如篩選重組文庫的方法、PCR方法及其改進的方法。篩選的結果是所需DNA可以通過按常規方式收集以預期方式雜交的DNA而獲得。一般地，這樣得到的DNA包括部分或全部SEQ ID NO17核苷酸序列。例如，包括全部SEQ ID NO17核苷酸序列的DNA一般從節桿菌屬的種S34，FERM BP-6450獲得。包括部分SEQ ID NO17核苷酸序列的DNA可通過類似地從非上述菌株來源的能夠產生本發明海藻糖釋放酶的微生物中篩選DNA而獲得。通過從用一種或更多種常規突變導入技術而導入上述DNA中一個或更多個堿基替代、添加和/或缺失的DNA中篩選編碼具有本發明酶特性的酶的DNA，可以制備這樣的DNA。也可根據編碼本發明海藻糖釋放酶的核苷酸序列，如SEQ IDNO17的核苷酸序列，用常規化學合成法而得到此DNA。一旦獲得，便可應用或使用PCR方法和可自主復制的載體將本發明DNA擴增至所需的水平。
本發明編碼海藻糖釋放酶的DNA包括導入適當載體中的重組形式的DNA。只要該DNA可以得到，那么一般可通過重組DNA技術而相對容易地制備重組DNA。只要其能夠在適當的宿主中自主地復制，那么任何類型的載體均可用于本發明中。這些載體的實例有用大腸桿菌作為宿主的pUC18，pBluescript II SK(+)，pKK223-3，λgt.λC等；用芽孢桿菌屬微生物的pUB110，pTZ4，pC194，ρ11，φ1，φ105等；和用2種或更多種微生物作為宿主的pHY300PLK，pHV14，TRp7，YEp7，pBS7等。本發明中將該DNA插入載體中的方法可以是本領域中常用的方法。含有該DNA的基因及可自主復制的載體首先用限制酶消化和/或用超聲破碎儀處理，然后連接得到的DNA片段和載體片段。通過用特異性切割該DNA的限制酶，特別是kpnI，AccI，BamHI，BstXI，EcoRI，HindIII，NotI，PstI，SacI，SalI，SmaI，SpeI，XbaI，XhoI等來促進連接。為了連接該DNA片段和載體，如果必要，首先將其退火，然后在體內或體外用DNA連接酶作用。這樣得到的重組DNA可在適當宿主中基本上不受限制地復制。
編碼海藻糖釋放酶的本發明DNA進一步包括該DNA已導入適當載體中的轉化子。通過將該DNA或上述獲得的重組DNA導入適當的宿主中將其轉化，可容易地制備這些轉化子。作為宿主，可以使用來自植物和動物的細胞以及微生物，它們在本領域中常用，并根據重組DNA中的載體而挑選。作為宿主的微生物包括埃希氏桿菌屬、芽孢桿菌屬和節桿菌屬以及其它放線菌、酵母、真菌等。為了將此DNA導入這些宿主微生物，可以使用常規的感受態細胞方法和原生質體方法。編碼海藻糖釋放酶并導入本發明轉化子中的DNA可存在于染色體外的分離形式中，或以摻入形式存在于染色體中。摻入宿主染色體中的DNA具有能在其中穩定保持的特征，用于制備本發明重組蛋白比較有利。
前述用于獲得本發明DNA(包括重組DNA和轉化子)的技術以及用于獲得DNA和重組蛋白的技術常用于本領域中；例如，在J.Sambrook等編，由冷泉港實驗室出版社(1989)出版的“分子克隆實驗手冊”第2版中詳細公開了用于獲得所需DNA的方法和所獲得的DNA在制備中的應用。例如，日本專利No.2,576,970公開了用目的基因缺陷的微生物作為宿主而穩定轉化DNA的方法。日本專利公開No.157,987/88公開了可在芽孢桿菌屬微生物中有效表達目的DNA的一種載體。日本專利公表No.502,162/93公開了穩定導入所需DNA至細菌染色體中的方法。日本專利公表No.506,731/96公開了用重組DNA技術有效制備淀粉水解酶的方法。日本專利公表No.500,543/97和500,024/98公開了用真菌有效制備重組蛋白的宿主一載體系統。常用于本領域中的這些方法可任意用于本發明中。
在本領域中，當所需的DNA可用上述方法得到時，通常可提供該DNA被導入適當植物和動物中的轉化子，即轉基因植物和動物。以DNA形式導入適當載體中、編碼非還原性糖形成酶和海藻糖釋放酶的本發明DNA也包括轉基因植物和動物。為了得到轉基因動物，大體上可通過以下方法獲得，即，將權編碼本發明任意一種酶的DNA或者與其它所需DNA(如啟動子及增強子)一起，插入根據宿主動物的種類而選擇的適當載體中，通過如顯微注射和電穿孔方法，或通過用含有該重組DNA的重組病毒的感染方法，將得到的重組DNA導入宿主動物的受精卵或胚胎干細胞。宿主動物的實例有常規實驗用嚙齒類，如小鼠、大鼠和倉鼠；和常用作家養動物的哺乳動物，如山羊、綿羊、豬和母牛，所以這些均具有容易飼養的優勢。將得到的導入有該DNA的細胞移植到與細胞相同種的假孕雌性動物的輸卵管或子宮內。之后，從自然產或破腹產新生動物中獲得轉基因動物，通過雜交或PCR方法證實其中導入有編碼本發明酶的DNA。這樣便獲得了轉基因動物形式的本發明DNA。轉基因動物的有關內容詳細公開于由Masami MATSUMURA，HirotoOKAYAMA和Tadashi YAMMOTO編、由日本東京Yodosha有限公司出版的“Jikken-Igaku-Bessatsu-Shin-Idennshi-Kogaku-Handbook”(遺傳工程手冊)第269-283頁(1996)中。獲得轉基因植物的方法包括，例如，提供對植物具有感染性的農桿菌屬微生物載體，將編碼本發明任一種酶的DNA導入該載體中，再將得到的重組DNA導入植物體中或原生質體中，或者以包括編碼本發明任一種酶的核苷酸序列的DNA包被重金屬顆粒并且直接將包被的顆粒用粒子槍注射入植物體內或原生質體內。盡管各種植物可用作宿主植物，但它們通常包括可食用植物，如土豆、大豆、小麥、大麥、水稻、玉米、番茄、萵苣、苜蓿、蘋果、桃、瓜等。通過對上面轉化的植物體或原生質體應用雜交或PCR方法，篩選出含有所需DNA的轉化子。此轉化的原生質體可再生成植物體，作為轉基因植物形式的本發明DNA。轉基因植物技術一般公開于由Jane K. Setlow編，美國紐約Plenum出版公司出版的《遺傳工程》(1994)16卷第93-113頁中。前述轉基因動植物形式的DNA可用作本發明非還原性糖形成酶和/或海藻糖釋放酶的來源，并可用作含有海藻糖或具有海藻糖結構的非還原性糖的食用動植物。
本發明海藻糖釋放酶可以需要的量通過下面制備酶的方法而得到，該方法特征在于其包括在營養培養基中培養能夠產生該酶的微生物和從所得培養物中收集產生的酶。只要其能夠產生本發明海藻糖釋放酶，用于此方法中的微生物可為不同的屬或種。這些微生物的實例有節桿菌屬的微生物，節桿菌屬的種S34，FERMBP-6450，其變異體以及可通過將編碼該酶的DNA導入到適當的宿主中而得到的轉化子。
只要前述的微生物能在其中生長并且產生此酶，則用于培養產生本發明海藻糖釋放酶的任何營養培養基均可使用。一般地，此營養培養基含有碳源和氮源，且如果必要，可加入礦物質。碳源的實例有糖如糊精、淀粉、部分淀粉水解物、葡萄糖等，和如糖蜜和酵母提取物之類含有糖的物質，以及有機酸如葡糖醛酸和琥珀酸。碳源的濃度根據所用的類型加以挑選，一般為30w/v％，并且優選15w/v％或更低。適用于本發明中的氮源的實例有含有無機氮的物質，如銨鹽、硝酸鹽等；含有有機氮的物質，如尿素、玉米漿、酪蛋白、蛋白胨、酵母提取物、牛肉提取物等。根據用途，可選擇性使用無機成份，如鈣、鎂、鉀、鈉，磷酸，錳，鋅，鐵，銅，鉬，鈷等的鹽。
用于制備本發明海藻糖釋放酶的培養條件可選擇性地使用適用于培養相應微生物的適當條件。例如，用節桿菌屬的微生物，包括節桿菌屬的種S34，FERMBP-6450的情況時，培養溫度一般在20-50℃，優選在25-37℃的范圍；培養pH一般在pH4-10，優選在pH5-9的范圍；培養時間在10-150小時的范圍。用這些條件，在有氧條件下培養該微生物。當使用通過將編碼本發明海藻糖釋放酶的DNA導入適當的宿主中而制備的轉化子時，該轉化子在下面的有氧條件下培養，如20-65℃的培養溫度，pH2-9的培養pH和1-6天的培養時間，盡管它們依微生物的屬、種、品系或型以及載體而變化。這樣得到的培養物在細胞級分中一般含有本發明酶。在培養通過用芽孢桿菌屬微生物作為宿主而得到的轉化子時，根據用于轉化宿主的載體，得到的培養基在上清液中可能含有本發明酶。這樣得到的培養物中本發明酶的含量通常在每ml培養物中0.01-3,000個單位，盡管其依據所用微生物的屬、種、品系以及培養條件而變化。
從得到的培養物中收集本發明海藻糖釋放酶。收集方法沒有限制。通過分離和收集任何一種發現具有該酶主要活性的細胞級分和培養物上清，并且如果必要則對收集的級分進行適當的純化從而收集含有該酶的純化級分，可以得到本發明酶。為了分離細胞級分與培養物上清，可以任意使用常規的固-液分離方法，如用預先覆蓋的濾膜和平紋及中空纖維膜進行離心和過濾。從分離的細胞級分和培養物上清中收集所需的級分。對于細胞級分，將細胞破碎成細胞碎片，然后將其分離成細胞提取物和不溶性細胞級分，再收集任意一種所需級分。如果必要，可通過常規方法將不溶性細胞級分溶解。作為裂解細胞的方法，可任意使用任何一種下面的技術，包括超聲處理、以細胞壁裂解酶如溶菌酶和葡聚糖酶處理以及機械壓力負荷。為了裂解細胞，可以用任何一種上述技術直接處理培養物，然后以任何一種上述的固-液分離方法處理所得混合物以收集液體級分。這樣可任意得到細胞提取物。
用于進一步純化本發明海藻糖釋放酶的方法包括一般純化糖相關性酶的常規方法，如鹽析、透析、過濾、濃縮、凝膠過濾層析、離子交換層析、疏水層析、反相層析、親和層析、凝膠電泳和等電點電泳。這些方法可根據目的聯合使用。從通過這些方法分離而得到的級分中，收集通過海藻糖釋放酶的方法測得具有所需活性的級分，從而獲得純化至所需水平的酶。根據下述實施例中方法，本發明酶可純化至電泳純的水平。如上所述，該方法提供以下形式的本發明海藻糖釋放酶，包括培養物、細胞級分、培養物上清級分、細胞裂解物、細胞提取物、可溶和不溶的細胞級分、部分純化的酶級分和純化的酶級分形式。這些級分中可能含有其它類型的本發明非還原性糖形成酶。使用前，這樣獲得的海藻糖釋放酶可用常規的方式加以固定。固定的方法有，例如結合至離子交換劑上的方法、共價結合/吸附到樹脂和膜上，用高分子量物質的截流固定方法。這樣獲得的海藻糖釋放酶可任意用于制備糖的方法中，包括下述用于制備糖的方法。特別地，由于本發明海藻糖釋放酶具有適中溫度范圍中的最適溫度，并且優選具有酸性pH范圍的最適pH，故當其與本發明上述的非還原性糖形成酶、具有酸性pH范圍內最適pH的淀粉脫支酶和在適中的溫度范圍中有效發揮作用的環麥芽糖糊精葡聚糖轉移酶聯合使用時，其可有利地用于制備糖。
本發明提供了通過用本發明前述的酶制備包含非還原性糖的糖類的方法；此方法包括以下步驟使非還原性糖形成酶和/或海藻糖釋放酶作用于還原性部分淀粉水解物以形成非還原性糖，以及收集得到的非還原性糖或具有較低還原性的非還原性糖組合物。在該方法中，一種或更多種其它非本發明非還原性糖形成酶和海藻糖釋放酶以及其它糖相關性酶的使用不應該排除在本發明之外。用于本發明方法中的還原性部分淀粉水解物可以不依賴于其出處/來源而加以使用。本發明中所稱的非還原性糖包括一般的非還原性糖，如海藻糖和具有海藻糖結構的糖。
用于本發明制備糖類的方法中的還原性部分淀粉水解物可以，例如通過常規方法液化淀粉或淀粉狀物質而獲得。此淀粉包括地面淀粉，如玉米淀粉、水稻淀粉和小麥淀粉；以及地下淀粉，如土豆淀粉、甜菜淀粉和木薯淀粉。為了液化這些淀粉，一般將它們在水中懸浮成淀粉懸液，優選為至少10w/w％的濃度，并且更為優選具有大約20到50w/w％的濃度，并且以機械、酸和/或酶處理。使用相對較低程度的液化比較讓人滿意，優選地，DE(葡萄糖當量)低于15，更為優選DE低于10。當用酸液化時，用鹽酸、磷酸、草酸等處理淀粉，然后在使用前用碳酸鈣、氧化鈣、碳酸鈉等中和得到的混合物至所需的pH。用酶液化淀粉時，使用α-淀粉酶，特別是熱穩定的α-淀粉酶比較讓人滿意。這樣得到的液化淀粉可進一步用α-淀粉酶、形成麥芽三糖的淀粉酶、形成麥芽四糖的淀粉酶、形成麥芽五糖的淀粉酶、形成麥芽六糖的淀粉酶等處理，得到的反應混合物可用作還原性部分淀粉水解物。淀粉相關性酶的特性詳細描述于由Pergamon出版社出版的《淀粉酶和相關酶手冊》，18-81和125-142頁(1988)中。
將這樣得到的還原性部分淀粉水解物用本發明非還原性糖形成酶和/或海藻糖釋放酶作用，并且如果必要，進一步用一種或更多種淀粉相關性酶作用，如α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡糖淀粉酶、淀粉脫支酶如異淀粉酶和支鏈淀粉酶、環麥芽糖糊精葡聚糖轉移酶(cyclomatodextrin glucanotransferase)、α-葡糖苷酶和β-呋喃果糖苷酶。用于酶促反應的條件為適于所用酶的那些條件；一般地，酶促反應條件選自pH4-10和20-70℃，并且優選pH5-7和30-60℃。特別地，非還原性糖可通過在適中溫度范圍，即高于40℃但低于60℃或高于45℃但低于60℃的溫度下及微酸性或酸性pH條件通過酶促反應而有效制備。使不同酶作用于還原性部分淀粉水解物的順序沒有限制，一種可在另一種酶之前或之后使用，或任意將多種酶同時作用于底物。
根據酶促條件和反應時間以及非還原性糖或含有該糖的較低還原性的糖組合物的最終用途而適當設定酶量。對于本發明非還原性糖形成酶和海藻糖釋放酶而言，前者以大約0.01到100單位/g固體還原性部分淀粉水解物的量使用，后者以大約1到10,000單位/g固體還原性部分淀粉水解物的量使用。環麥芽糖糊精葡聚糖轉移酶以大約0.05到500單位/g固體還原性部分淀粉水解物，d.s.b的量使用。用這些酶獲得的反應混合物一般含有海藻糖、α-葡糖基海藻糖、α-麥芽糖基海藻糖、α-麥芽三糖基海藻糖、α-麥芽四糖基海藻糖或α-麥芽五糖基海藻糖。在上面方法中，當聯合使用時，本發明非還原性糖形成酶和海藻糖釋放酶與淀粉脫支酶和環麥芽糖糊精葡聚糖轉移酶一起特征性更多地產生大量的海藻糖和具有海藻糖結構的相對低分子量的非還原性糖。
從得到的反應混合物中，收集非還原性糖和具有較低還原性的糖組合物。在這些制備步驟中，可適當選擇通常加工糖的方法。將得到的反應混合物經過濾和離心從而去除不溶性物質，然后用活性炭脫色而純化得到的溶液，用H-或OH-形式的離子交換劑脫鹽，并且濃縮成糖漿產物。如果必要，此糖漿產物可進一步純化成具有較高純度的非還原性糖；在純化中，可以使用一種或更多種方法，例如，柱層析分級分離，如離子交換柱層析，用活性炭或硅膠的柱層析，用有機物如丙酮和乙醇的分離沉淀；用具有適當分離能力的膜的分離；和堿處理以分解和去除剩下的還原性糖。特別地，離子交換柱層析可適當地用于本發明中作為工業規模制備目的糖。具有改進純度的非還原性糖例如，可通過用在日本專利公開No.23,799/83和72,598/83中所述的強酸性陽離子交換樹脂的柱層析以去除伴生的糖而任意地加以制備。在此情況下，可以利用任何固定床、移動床和半移動床方法。
如果必要，可用淀粉酶如α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡糖淀粉酶和α-葡糖苷酶水解得到的非還原性糖或含有非還原性糖的相對較低還原性的糖類，從而控制其甜度和還原能力或降低其粘度；這樣得到的產物可進一步進行以下的處理，其中將剩余的還原性糖氫化成糖醇從而降低其還原能力。特別地，通過使葡糖淀粉酶或α-葡糖苷酶作用于非還原性糖或含有非還原性糖的相對較低還原性的糖類，可容易地制備海藻糖。通過使葡糖淀粉酶或α-葡糖苷酶作用于這些糖從而形成海藻糖和葡萄糖的混合物，并且對此混合物進行前述的純化方法，如離子交換柱層析，以去去除葡萄糖，可獲得高海藻糖含量的級分。高海藻糖含量的級分可任意純化并且濃縮成糖漿產物。如果必要，此糖漿產物可濃縮成超飽和溶液，然后結晶水合或非水合的晶體海藻糖，并回收得到的晶體。
為了制備水合的晶體海藻糖，將純度大約60w/w％或更高的大約65-90w/w％溶液置于結晶儀中，如果必要，在0.1-20w/v％晶種存在下，在95℃或更低的溫度下，并且優選在10-90℃的溫度下，逐漸冷卻同時攪拌，從而獲得含有水合的晶體海藻糖的糖膏。可任意使用連續結晶方法，從而在真空濃縮條件下完成結晶。
常規方法如分離、大塊粉碎、流床顆粒化和噴霧干燥可用于本發明中，從而從糖膏水合晶體海藻糖或含有海藻糖晶體的晶體糖類中分離。
在分離的情況，通常對糖膏進行桶式離心，從而將水合晶體海藻糖與母液分離，如果必要，通過噴灑少量冷水沖洗該水合晶體海藻糖，以利于制備具有較高純度的水合晶體海藻糖。在噴灑干燥的情況，不具有或基本上不具有吸水性的結晶糖類通過下面方法可容易制備，包括通過高壓泵噴頭噴灑具有70-85w/w％濃度(基于干燥固體，dsb)大約20-60％結晶度(基于干燥固體，dsb)的糖膏；用加熱至60-100℃而不會融化所得晶體粉末的空氣干燥得到的產物；并且老化得到的粉末大約1到20小時，同時向其中吹入熱至30-60℃的空氣。在大塊粉碎的情況，不具有或基本上不具有吸水性的結晶糖類通過下面方法可容易制備，包括使具有10-20％w/w濕度含量和大約10-60％結晶度(d.s.b)的糖膏靜置大約0.1到3天從而使全部組分結晶并固化成塊；并且粉碎或切割得到的固體塊。
為了得到無水結晶海藻糖，將上面得到的水化晶體海藻糖在70-160℃并且優選在80-100℃的溫度于正常或減壓下干燥；或者將具有不到10％濕度的相對高濃度和含量的海藻糖溶液置于結晶儀中，在晶種存在下于50-160℃并且優選在80-140℃的溫度攪拌，從而制備含有非水合晶體海藻糖的糖膏，并且用諸如塊粉碎、流床粒化和噴灑干燥之類方法在相對高溫和干燥條件下處理此糖膏。
這樣獲得的非還原性糖或含有該成份并具有相對低還原性的糖組合物具有低的還原性和滿意的穩定性；當與其它物質如氨基酸、寡肽或蛋白混合并一起處理時，它們不變成棕色、不產生令人不快的氣味，并且不使后面的其它物質變質。即使具有相對低的還原性，但上述的糖仍具有相對低的粘度，并且那些具有平均相對較低葡萄糖聚合程度的糖類具有相對高的質量和甜度。這些糖可任意用于食品、化妝品和藥品等領域中，如在以下的日本專利公開中所公開的領域，包括No.66,187/96，66,188/96，73,482/96，73,506/96，73,504/96，336,363/96，9,986/97，154,493/97，252,719/97，66,540/98，和168,093/98；以及日本專利申請No.236,441/97，256,219/97，268,202/97，274,962/97，320,519/97，338,294/97，55,710/98，67,628/98，134,553/98和214,375/98，所以這些均由與本發明相同的申請人申請過。
下面的實施例更為詳細地描述本發明實施例1能夠產生非還原性糖形成酶和海藻糖釋放酶的微生物本發明者廣范地篩選土壤，以分離能夠產生非還原性糖形成酶和海藻糖釋放酶的微生物。結果，他們從日本Ako，Hyogo的土壤中分離到具有該特性的微生物，并且根據在由Takeji Hasegawa編由日本東京科學學會出版社出版的“Biseibutsu-no-Bunrui-to-Dotei”(微生物的分類和鑒定)(1985)中所述的方法加以鑒定。結果如下細胞形態學結果(1)當于37℃在營養瓊脂培養基中培養時的細胞特征通常以0.4-0.5×0.8-1.2um的桿狀形式存在；以單一形式存在，但極少數情況下以多態形式存在；無活動性；不產芽孢；非酸性快速；及革蘭氏染色陽性。
(2)當于37℃在EYG營養瓊脂中培養時的細胞特征顯示出桿狀和球狀的生長周期。
培養特性結果(1)當于37℃在營養瓊脂培養平板中培養時所形成菌落的特征形狀2天培養后具有大約1-2mm直徑的圓形菌落；邊緣完整；突出情況突出；光澤潮濕光澤表面平整；及顏色半透明或奶黃色。
(2)當于37℃在營養瓊脂斜面中培養時形成菌落的特征生長滿意；和形狀線樣。
(3)當于37℃在具有酵母提取物和蛋白胨的瓊脂斜面中培養時形成菌落的特征生長滿意；和形狀線樣。
(4)當于27℃在營養明膠培養基中穿刺培養時形成菌落的特征沒有液化明膠。
生理特性的結果(1)甲基紅測試陰性(2)VP測試陽性(3)吲哚的形成陰性(4)硫化氫的形成陰性(5)淀粉的水解陽性(6)明膠的液化陰性(7)檸檬酸的利用陽性(8)無機氮源的利用利用硝酸鹽但不利用銨鹽(9)色素的形成無(10)脲酶陰性(11)氧化酶陰性(12)過氧化氫酶陽性(13)生長范圍在pH4.5-8.0和20-50℃的范圍生長；并且最適溫度30-45℃。
(14)氧氣需求需氧(15)碳源的利用L-阿拉伯糖同化D-葡萄糖同化D-果糖不同化D-半乳糖不同化L-鼠李糖不同化D-木糖不同化D-甘露糖同化棉籽糖不同化海藻糖不同化蔗糖不同化麥芽糖不同化乳糖不同化D-半乳糖醇不同化D-甘露糖醇不同化葡萄糖醛酸同化琥珀酸同化煙酸不同化L-馬來酸同化乙酸同化乳酸同化(16)從糖中形成酸L-阿拉伯糖略微形成D-葡萄糖略微形成D-果糖不形成D-半乳糖略微形成L-鼠李糖略微形成D-木糖略微形成甘油略微形成棉籽糖不形成海藻糖略微形成蔗糖略微形成麥芽糖略微形成乳糖不形成(17)氨基酸的利用不利用L-谷氨酸鈉、L-天冬氨酸鈉、L-組氨酸和L-精氨酸。(18)對氨基酸的脫羧酶測試對L-賴氨酸、L-鳥氨酸和L-精氨酸為陰性。(19)脫氧核糖核酸酶陰性(20)細胞壁的N-酰基類型乙酰基(21)細胞壁的主要二氨基酸賴氨酸(22)DNA的鳥嘌呤(G)加上胞嘧啶(C)的摩爾百分數71.2％
參照《伯杰氏系統細菌學手冊》(Borgey’s Manual of SystematicBactenioligy)第二卷(1984)，將這些細菌學特性與已知微生物的特性進行比較。結果顯示此微生物被鑒定為節桿菌屬的新種。根據這些結果，本發明者將此微生物命名為“節桿菌屬的種S34”(“Arthrobacter sp S34”)。該微生物于1998年8月6日以FERM BP-6450的許可號保藏于日本國際貿易與工業部工業科技署國立生物科學與人類技術研究所專利微生物保藏中心(1-3，Higashi，1chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken 305-8566)并被接受。
根據《伯杰氏系統細菌學手冊》第一卷(1984)中的DNA-DNA雜交方法，檢測此鑒定出的微生物與保藏于美國典型培養物保藏中心(ATCC)(美國的國際微生物保藏庫)的節桿菌屬模式株DNA之間的同源性。示于下表1中的12種模式株分別以正常方式培養，并且從得到的培養物中收集增殖的細胞。通過下述實施例2-1中的種子培養物方法，培養節桿菌屬的種S34，FERM BP-6450，然后收集增殖的細胞。根據常規方法，從每種模式株微生物中獲得DNA，將該DNA的2微克等分液用限制酶PstI消化。將得到的消化的混合物分別點于“Hybond-N+”(一種由Amersham International，Arlington Heights，IL，USA商業化的尼龍膜)上，并且以常規的方式用堿處理，中和并干燥，從而將此DNA固定于尼龍膜上。取從節桿菌屬的種S34，FERM BP-6450獲得的1微克DNA并且用限制酶PstI消化。用由Amersham International，Arlington Heights，IL，USA商業化的[α-32P]dCTP，和“READY-TO-GODNA標記試劑盒”(一種由Pharnacia LKBBiotechnology AB，Uppsala，Sweden商業化的DNA標記試劑盒)，將消化產物用同位素標記以獲得探針。將該探針與上述固定于尼龍膜上的DNA在振蕩條件下于65℃于“快速雜交緩沖液”(一種Amersham Corp.，Div.，AmershamInternational，Arlington Heights，IL，USA商業化的雜交緩沖液)中雜交2小時。雜交后的尼龍模以常規的方式沖洗、干燥并且以常規方式進行放射自顯影。放射自顯影中觀察到的雜交信號于“IMAGE MASTER”(一種由Pharmacia LKBBiotechnology AB，Uppsala，Sweden商業化的圖形分析系統上)進行分析，然后數字化表示雜交信號的強度。根據數字，通過以下方法計算來自模式株DNA的點的相對強度(％)，即將節桿菌屬的種S34，FERM BP-6450的DNA點的信號強度看作100，并且用作該微生物與模式株間DNA同源性的指標。結果列于表1中。
表1微生物菌株雜交信號強度黑藍節桿菌，ATCC 1375242.0金黃節桿菌，ATCC 1334412.4檸檬節桿菌，ATCC 1162436.2成晶節桿菌，ATCC 1548131.6球形節桿菌，ATCC 8010 55.1煙草節桿菌，ATCC 1523618.8氧化節桿菌，ATCC 1435828.3滋養節桿菌，ATCC 1334624.6原玻璃蠅節桿菌，ATCC 1927129.3分枝節桿菌，ATCC 1372798.6產脲節桿菌，ATCC 7562 42.3粘節桿菌，ATCC 19584 0.0節桿菌屬的種S34，FERM BP-6450 100如表1中所示，來自分枝節桿菌模式菌株，ATCC 13727的DNA點的雜交信號強度高達98.6％。此數據顯示在此實施例中所用的12種模式菌株中，節桿菌屬的種S34，FERM BP-6450與其中的分枝節桿菌模式菌株，ATCC 13727具有最高的同源性。上述結果顯示，節桿菌屬的種S34，FERM BP-6450為與分枝節桿菌模式菌株，ATCC 13727密切相關的新的微生物。
實施例2非還原性糖形成酶實施例2-1酶的制備制備由以下成份所組成的營養培養基1.0w/v％的“PINE-DEX#4”(一種由Matsutani Chemical Ind.，東京，日本所商業化的糊精)、0.5w/v％的蛋白胨、0.1％w/v％的酵母提取物、0.1w/v％的磷酸二氫鈉、0.06w/v％的磷酸氫二鉀、0.05w/v％的硫酸鎂和水，并將培養基調節至pH7.0。將大約100ml等分的培養基置于500-ml Erlenmeyer瓶中，然后于120℃高壓蒸汽滅菌20分鐘并且冷卻，然后接種節桿菌屬的種S34，FERM BP-6450種子液，并且在260rpm的振蕩條件下于37℃培養48小時，以獲得種子培養物。
除了含有0.05w/v％的“KM-75”(一種由日本東京Shi-Etsu化工有限公司商業化的抗泡沫劑)外，將與用于種子培養物中的相同的營養培養基大約20升置于30升的發酵罐中，滅菌，冷卻至37℃，并且用1v/v％的種子培養物接種至該培養基中，然后在有氧并攪拌的條件下于37℃，及5.5-7.5的pH培養大約72小時。
取樣得到的部分培養物并離心，從而分離成細胞和培養物上清。將細胞超聲破碎并且離心，從而從細胞提取物中收集上清。對每個培養物上清及細胞提取物中非還原性糖形成酶活性的測定顯示酶活性相對較低。后者相對于1毫升培養物中顯示出大約0.1單位。
實施例2-2酶的純化將按實施例2-1中方法獲得的大約80升培養物以8,000rpm離心30分鐘，從而獲得大約800克濕重細胞。將濕細胞懸浮于2升10M的磷酸鹽緩沖液(pH7.0)中，并且用“MODEL UH-600”(一種日本東京SMT公司商業化的超聲勻漿器)處理。得到的培養物以10,000rpm離心30分鐘，從而獲得大約2升的培養物上清。向此培養物上清中加入硫酸銨并且使其溶解，從而得到0.7的飽和度，使該混合物在4℃靜置24小時并以10,000rpm離心30分鐘從而獲得沉淀物。將這樣獲得的沉淀物溶解于10mM磷酸鹽緩沖液(pH7.0)中，并且對與上述同樣的新鮮緩沖液制品透析48小時，然后將透析的內部溶液以10,000rpm離心30分鐘從而去除不溶性物質。將大約1升的所得溶液用裝入了大約1.3升“SEPABEADS FP-DA13 GEL”(一種由日本東京Mitsubishi化工有限公司商業化的陰離子交換劑)的柱進行離子交換柱層析。用含有從0M增加到0.6M鹽的10mM磷酸鹽緩沖液(pH7.0)這種線性梯度緩沖液進行洗脫步驟。分級分離柱中的洗脫物，分別分析這些級分的非還原性糖形成酶活性。結果發現，在用具有大約0.2M鹽濃度的緩沖液洗脫后收集到的級分中發現有異常高的酶活性。
將硫酸銨加入到得到的溶液中以得到1M的濃度，使該混合物在4℃靜置12小時，以10,000rpm離心30分鐘從而收集上清。將這樣得到的的上清用裝入了“BUTYL TOYOPEARL 650M GEL”(一種由日本東京Tosoh公司商業化的疏水凝膠)的柱進行疏水柱層析。所用的凝膠體積大約300ml，用含有1M硫酸銨的10mM磷酸鹽緩沖液(pH7.0)平衡后使用。在進樣過程中用含有從1M降低到0M硫酸銨的10mM磷酸鹽緩沖液(pH7.0)線性梯度緩沖液進行洗脫步驟。分級分離柱中的洗脫物，并且分別分析這些級分的非還原性糖形成酶活性。結果，在以具有大約0.75M鹽濃度的緩沖液洗脫后收集到的級分中發現有異常高的酶活性，將這些級分合并在一起。
將獲得的溶液于10mM磷酸鹽緩沖液(pH7.0)中透析，將所得透析過的內部溶液以10,000rpm離心30分鐘從而收集上清，然后將此上清用裝入大約40ml“DEAE TOYOPEARL 650S GEL”(一種由日本東京Tosoh公司商業化的陰離子交換劑)的柱進行離子交換柱層析。在進樣過程中用含有從0M增加到0.2M的線性鹽水溶液進行洗脫步驟。分級分離柱中的洗脫物，并且分別分析這些級分的非還原性糖形成酶活性。結果，在以具有大約0.15M鹽濃度的緩沖液洗脫后收集到的級分中發現有異常高的酶活性。將這樣得到的溶液進一步用裝入了大約380ml“ULTROGELR AcA44 GEL”(一種由法國Sepracor/IBF s.a. Villeneuve laGarenne商業化的用于凝膠柱層析的凝膠)的柱進行凝膠柱層析，然后收集具有所需酶活性的級分。上述純化步驟中非還原性糖形成酶活性、比活性和產率的水平列于表2中。
表2純化步驟非還原性糖形 比活性 產率成酶活性(單位/mg蛋白) (％)細胞提取物 8,000 - 100以硫酸銨鹽析 7,500 0.2 94后透析內部溶液來自SEPABEADS 5,200 0.7 65柱的洗脫物來自疏水柱的 2,600 6.3 33洗脫物來自TOYO 91067.411PEARL的洗脫物凝膠過濾洗脫物 59.0 168 0.7將從上面凝膠過濾層析中洗脫和收集的溶液以常規方式用7.5w/v％的聚丙烯酰胺凝膠進行電泳，得到單一的蛋白條帶。該數據顯示來自此凝膠過濾層析的洗脫物為純化至電泳純形式的非還原性糖形成酶純化標本。
實施例2-3酶的特性實施例2-3(a)作用制備含有葡萄糖、麥芽糖、麥芽三糖、麥芽四糖、麥芽五糖、麥芽六糖或麥芽七糖的20％水溶液作為酶底物并且與利用實施例2-2方法獲得的非還原性糖形成酶純化標本的2單位/克底物(d.s.b)混合，在50℃于pH6.0酶促反應48小時。將此反應混合物脫鹽，并且用日本東京Mitsubishi化工有限公司商業化的“MCI GEL CK04SS COLUMN”2根層析柱(它們串聯使用)進行高效液相色譜(下文簡稱“HPLC”)分析，然后測定反應混合物的糖組成。用于HPLC的條件和儀器如下用“CO-8020”(一種由日本東京Tosoh公司商業化的柱烤爐)將柱維持于85℃。以0.4ml/min的流速送入水作為流動相。洗脫結果于“RI-8020”(一種由日本東京Tosoh公司商業化的差動式折射計)上進行分析。結果列于表3中。
表3底物反應產物洗脫時間(分鐘) 百分數(％)萄萄糖 葡萄糖 57.2 100.0麥芽糖 麥芽糖 50.8 100.0麥芽三糖葡糖基海藻糖43.2 36.2麥芽三糖46.2 63.8麥芽四糖麥芽糖基海藻糖 38.9 87.2麥芽四糖42.3 12.8麥芽五糖麥芽三糖基海藻糖35.4 93.0麥芽五糖38.4 7.0麥芽六糖麥芽四糖基海藻糖32.7 93.8麥芽六糖35.2 6.2麥芽七糖麥芽五糖基海藻糖30.2 94.2麥芽七糖32.4 5.8正如來自表3的結果證明，每個反應的產物基本包括剩余的底物和新形成的非還原性糖α-葡糖基海藻糖，α-麥芽糖基海藻糖，α-麥芽三糖基海藻糖，α-麥芽四糖基海藻糖，或α-麥芽五糖基海藻糖(在表3，表示為葡糖基海藻糖，麥芽糖基海藻糖，麥芽三糖基海藻糖，麥芽四糖基海藻糖，或麥芽五糖基海藻糖)。在反應混合物中基本沒有檢測到其它多糖。將非還原性糖占每個反應的產物的百分數認為和評估為生產率，結果表明葡萄糖多聚化程度為3的α-葡糖基海藻糖的產量是相對低的，具有葡萄糖多聚化程度為4或更高的糖如麥芽糖基海藻糖，α-麥芽三糖基海藻糖，α-麥芽四糖基海藻糖，和α-麥芽五糖基海藻糖的產量高達約85％或更高。沒有觀察到從葡萄糖和麥芽糖形成非還原性糖。
實施例2-3(b)分子量以常用方法，與日本東京日本Bio-Rad實驗室出售的分子量標記平行試驗，利用10w/v％聚丙烯酰胺凝膠將按實施例2-2的方法獲得的非還原性糖形成酶的純化樣品進行SDS-PAGE。在電泳后與分子量標記的位置比較，該非還原性糖形成酶顯示分子量約為75,000±10,000道爾頓。
實施例2-3(c)等電點利用含有2w/v％可在Pharmacia LKB Biotechnology AB，Uppsala，瑞典銷售的“AMPHOLINE”(一種兩性電解質)的聚丙烯酰胺凝膠，將按實施例2-2的方法獲得的非還原性糖形成酶的純化樣品進行等電點電泳。在等電點電泳后，測量凝膠的pH，表明非還原性糖形成酶具有約4.5±0.5的等電點。
實施例2-3(d)最適溫度和pH利用按實施例2-2的方法獲得的非還原性糖形成酶的純化樣品，檢測溫度和pH對非還原性糖形成酶的活性的影響。當檢測溫度的影響時，與酶活性的測試類似地進行實驗，不同的是在不同溫度讓酶反應。在pH的影響的檢測中，與酶活性的測試類似地進行了實驗，不同的是利用適當的20毫摩爾/升緩沖液在不同pH與酶反應。在每個檢測中，將每個反應系統中底物還原能力降低水平的相對值(％)計算成它相應的相對酶活性(％)。圖1顯示了溫度影響的結果，圖2顯示了pH影響的結果。圖1和2的橫軸分別顯示反應溫度和反應pH。如圖1所示，當在pH6.0溫育60分鐘時，酶的最適溫度約為50℃。也如圖2所示，當在50℃溫育60分鐘時，酶的最適pH約為pH6.0。
實施例2-3(e)熱和pH穩定性利用按實施例2-2的方法獲得的非還原性糖形成酶的純化樣品，檢測酶對熱和pH的穩定性。根據酶活性的測試的方法，通過利用20毫摩爾/升磷酸鹽緩沖液(pH7.0)稀釋樣品，在預定的溫度溫育稀釋液60分鐘，冷卻溫育的稀釋液，和確定稀釋液中剩余的酶活性，即可檢測熱穩定性。根據酶活性的測試方法，通過利用具有適當的不同pH的50毫摩爾/升緩沖液稀釋樣品，在4℃溫育稀釋液24小時，調節稀釋液pH到pH6，確定稀釋液中剩余的酶活性，即可檢測酶的pH穩定性。圖3和4中分別顯示了酶的熱和pH穩定性的結果。圖3和4的橫軸分別顯示了酶的溫育溫度和pH。如圖3所示，酶在高達約55℃的溫度下穩定，如圖4所示，酶在約pH5.0-10.0的pH范圍是穩定的。
這些結果證明，按實施例2-2的方法獲得的非還原性糖形成酶是具有中等溫度范圍的最適溫度的本發明非還原性糖形成酶。
實施例2-4部分氨基酸序列對蒸餾水透析按實施例2-2的方法獲得的非還原性糖形成酶純化樣品的部分，以便獲得蛋白質重量約80微克的樣品用于分析N-末端氨基酸序列。利用美國，Foster市，應用生物系統公司出售的蛋白質序列儀“473A型蛋白質序列儀”，分析N-末端氨基酸序列直到N末端的20個氨基酸殘基。測序結果揭示出的N末端氨基酸序列是SEQ ID NO4的部分氨基酸序列。對10毫摩爾/升Tris-HCl緩沖液(pH9.0)透析按實施例2-2的方法獲得的非還原性糖形成酶純化樣品的部分，并且利用日本，東京，Tosoh公司出售的超濾膜“ULRACENT-30”，以常用的方法濃縮到約1毫克/毫升溶液。在0.2毫升濃縮物中加入10微克日本東京Wako純化化學工業公司出售的試劑胰蛋白酶“TPCK-TRYPSIN”，使其在30℃反應22小時，以便消化該酶形成肽。通過利用直徑3.9毫米和長度150毫米的美國，Milford，Millipore公司，Waters Chromatography Div.，的產品“μBONDASPHERE C18 COLUMN”，將反應混合物進行反相HPLC，以便分離肽。在大氣溫度下，利用含有0.1v/v％的三氟乙酸和在60分鐘內從24v/v％增加到48v/v％的乙腈的水溶液加在柱中進行洗脫步驟，加洗脫液期間的流速是0.9毫升/分鐘。通過在波長210納米檢測吸光值，從而檢測從柱中洗脫下來的肽。與其它物質很好分離開的兩個肽，即分離出了在約2小時保留時間洗脫的“S5”和在30分鐘保留時間洗脫的“S8”，分別真空干燥，在含有50微升0.1v/v％三氟乙酸的50v/v％乙腈水溶液中溶解。將肽溶液進行蛋白質序列分析，以便分析多達20個氨基酸殘基。從肽“S5”和“S8”，獲得了SEQ ID NO5和6的氨基酸序列。
實施例3編碼非還原性糖形成酶的DNA實施例3-1基因文庫的構建和篩選除了設定培養的溫度和時間分別為27℃和24小時之外，與實施例2-1類似地培養節桿菌S34，FERM BP-6450。
離心培養物以便取出細胞，然后懸浮于適當量的Tris-EDTA-鹽緩沖鹽(下文中命名為“TES緩沖液”)(pH8.0)中。以占細胞懸浮液體積0.05w/v％的量混合溶菌酶，接著在37℃溫育30分鐘。在-80℃停留1小時以冷凍得到的混合物，然后與在60℃預熱的TES緩沖液和苯酚混合物混合和充分攪拌，冷卻和離心收集形成的上清液。在上清液中加入冷乙醇，然后收集形成的沉淀物，在適當量的SSC緩沖液中溶解(pH7.1)，與7.5微克核糖核酸酶和125微克蛋白酶混合，并且在37℃溫育1小時。混合得到的混合物并且與氯仿/異戊醇混合攪拌，使其靜置，接著收集形成的上層，在該層中加入冷乙醇，并且收集形成的沉淀物。利用冷的70v/v％乙醇漂洗沉淀，真空干燥獲得DNA，接著在SSC緩沖液(pH7.1)中溶解，使濃度約為1毫克/毫升，并且在-80℃冷凍。
取50微升的DNA，與約50單位的限制酶KpnI混合，在37℃溫育1小時以便消化DNA。根據試劑盒附帶的方案，將3微克消化的DNA和0.3微克美國，加里弗尼亞，Stratagene克隆系統銷售的質粒載體“pBluescript II SK(+)”利用Takara Shuzo公司，東京，日本銷售的“DNA連接試劑盒”連接，稱重，反應。根據常規的感受態細胞方法，利用連接產物轉化100微升美國，加里弗尼亞，StratageneCloning Systems銷售的大腸桿菌菌株“Epicurian(oli XL1-Blue”，由此獲得了基因文庫。
將這樣獲得的基因文庫接種到含有10克/升胰蛋白胨，5克/升酵母提取物，5克/升氯化鈉，75毫克/升氨芐青霉素鈉鹽，和50毫克/升，5-溴-4-氯-3-吲哚-β-半乳糖苷的瓊脂營養培養基平板(pH7.0)上，并且在37℃溫育18小時。將培養基上形成的白色菌落約5000個以常用方法固定在Amersham公司，Div.Amersham Intermational，Arlington Heights，IL，美國銷售的尼龍膜“HYBOND-N-+”上。根據實施例2-4中顯示的SEQ ID N05氨基酸序列中的1-8個氨基酸殘基，化學合成具有SEQ ID NO18核苷酸序列的寡核苷酸，并且以常用方法，利用[γ-32P]ATP和T4多核苷酸激酶標記，以獲得探針。利用該探針，通過常規菌落雜交方法篩選已經固定在尼龍薄膜上和前面獲得的菌落。在含有6×SSC，5×Denhalt溶液，和100毫克/升變性鯨精子DNA的雜交溶液中在65℃進行雜交16小時。在雜交后，利用6×SSC，在65℃洗滌上面的尼龍薄膜30分鐘，利用含有0.1w/v％SDS的2×SSC在65℃進一步洗滌2小時。以常用方法將得到的尼龍薄膜進行放射自顯影，然后根據放射自顯影觀察到的信號，選擇與探針強烈雜交的菌落，并且命名為“GY1”，作為轉化體。
實施例3-2核苷酸序列的譯碼根據常用方法，在含有100微克/毫升鈉形式氨芐青霉素的L肉湯培養基(pH7.0)中接種轉化體GY1，并且在振搖條件下，在37℃培養24小時。在完成培養后，通過離心從培養物收集增殖細胞，并且利用常規堿性SDS方法處理以便提取重組DNA。將重組DNA命名為pGY1。利用上面的探針，在常規Southern印跡技術上分析重組DNA，pGY1，并且根據分析的數據，構建了如圖5所示的限制圖譜。如圖5所示，表明了重組DNA，pGY1含有由包括黑線表示的來自節桿菌S34，FERM BP-6450的約5,500個堿基對(bp)的堿基組成的一段核苷酸序列，并且該重組DNA在限制酶EcoRI的兩個識別位點之間的約4,000bp堿基的區域內，含有黑線區域內的黑箭頭表示的編碼本發明非還原性糖形成酶的核苷酸序列。根據這一結果，利用EcoRI完全消化重組DNA pGY1，然后利用常規瓊脂糖凝膠電泳分離和純化約4,000bp的DNA片段。利用常規連接方法連接已經利用EcoRI消化的美國，加里弗尼亞Stratagene Cloning System銷售的質粒載體“pBluescriptII SK(+)”和該DNA片段。利用連接產物，轉化美國，加里弗尼亞，StratageneCloning System銷售的大腸桿菌菌株“XL1-BLUE”以便獲得轉化體。以常用方法，從轉化體提取重組DNA，以常規方法證實它含有色括約4000bp堿基的前面所述DNA片段，并且命名為“pGY2”。導入了“pGY2”的轉化體命名為“GY2”。
以常用的二脫氧方法分析重組DNA pGY2的核苷酸序列，表明它含有包括起源于節桿菌S34，FERM BP-6450的3252個減基對的SEQ ID NO19核苷酸序列。核苷酸序列編碼如SEQ ID NO19平行所示的氨基酸序列。比較實施例2-4所證實作為本發明非還原性糖形成酶部分氨基酸序列的氨基酸序列SEQ ID NO4-6，發現SEQ ID NO4-6的氨基酸序列與SEQ ID NO19中的氨基酸2-21，619-638，和98-117完全一致。這些數據表明，實施例2中獲得的本發明非還原性糖形成酶包括SEQ ID NO19的氨基酸2-757，或具有SEQ ID NO1的氨基酸序列，并且SEQ ID NO19的堿基746-3013的核苷酸序列，或SEQ ID NO7的核苷酸序列編碼節桿菌S34，FERM BP-6450的酶。重組DNA pGY2的結構在圖6中。
根據Lipman，David J.在科學，227卷，1,435-1,441(1985)中介紹的方法，利用軟件開發公司，東京，日本銷售的計算機程序“GENETYX-MAC，VER.8”比較按上面實施例2的方法獲得的本發明非還原性糖類形成酶的氨基酸序列和具有非還原性糖類形成活性的已知酶的氨基酸序列，以便計算它們的同源性(％)。用作已知酶的酶是來自日本專利
發明者山本拓生, 丸田和彥, 久保田倫夫, 福田惠溫, 三宅俊雄 申請人:株式會社林原生物化學研究所