一種形成素蛋白及編碼它的多核苷酸序列的制作方法

專利名稱：一種形成素蛋白及編碼它的多核苷酸序列的制作方法
技術領域：
本發(fā)明公開了一種新的人形成素蛋白(以下簡稱為HFP)及編碼它的多核苷酸序列，還涉及所述蛋白質(zhì)和多核苷酸的制備方法，及其在診斷、預防和治療與該蛋白質(zhì)表達異常相關疾病中的應用。
細胞分裂是個體生長和生命繁衍的基本特征，細胞分裂有生殖細胞的減數(shù)分裂和正常細胞的有絲分裂兩種。一細胞的分裂包括核分裂和胞質(zhì)分裂兩個過程。核分裂和胞質(zhì)分裂是兩個緊緊相隨的過程，通常在核分裂后即發(fā)生胞質(zhì)分裂。胞質(zhì)分裂是一細胞成功地分裂成兩個完全相同的子細胞所必不可少的步驟。胞質(zhì)分裂的失敗往往會形成各種多倍體產(chǎn)物，在生殖細胞中這將影響胚胎細胞的生長與一些組織的正常分化，從而引起胚胎死亡或畸形，如各種器官先天性發(fā)育不良；而在正常細胞的有絲分裂過程中發(fā)生這一現(xiàn)象將直接影響細胞的增殖及表達，即影響細胞與組織的正常生長及分化，從而引發(fā)各種因發(fā)育紊亂而引起的疾病，如癲癇、大腦麻痹、貧血、甲狀腺功能減退等。
形成素蛋白為LD基因編碼的蛋白，在胚胎生成過程中高表達，尤其在鼠翼及器官發(fā)育過程中表達水平較高。在人中，其在胚胎形成及發(fā)育過程中也起著重要的生物學功能。在生物體內(nèi)，形成素蛋白通過調(diào)節(jié)細胞骨架形成及細胞信號轉(zhuǎn)導來控制胚胎及細胞極性的產(chǎn)生[Peter Uetz，等人，生物化學雜志(J．Biolog．Chem。)，1996(271)33525-33530]。其對細胞完成胞質(zhì)分裂也是必需的，在胞質(zhì)分裂過程中可能作為收縮環(huán)的組成部分，并調(diào)節(jié)著收縮環(huán)的作用[Diego H．Castrillon等人，發(fā)育(Development)，1994(120)3367-3377]。LD蛋白家族的成員均含有兩個相似的序列結(jié)構(gòu)域，F(xiàn)H1(即富含脯氨酸的結(jié)構(gòu)域)和FH2(即含有GxxGNxMN基元的一段高度保守的氨基酸序列)。FH1結(jié)構(gòu)域在生物形態(tài)發(fā)生及發(fā)育過程中起著調(diào)節(jié)信號轉(zhuǎn)導的作用；同時，F(xiàn)H1結(jié)構(gòu)域在細胞的胞質(zhì)分裂過程中發(fā)揮著重要的作用，其可能在細胞內(nèi)調(diào)節(jié)著肌動蛋白的聚合及胞質(zhì)分裂過程的完成。而FH2結(jié)構(gòu)域在生物體內(nèi)則協(xié)同或阻礙FH1結(jié)構(gòu)域在生物體內(nèi)的作用。[Diego H．Castrillon，等人，發(fā)育，1994(120)3367-3377]。
如上所述，形成素蛋白參與包括信號轉(zhuǎn)導、細胞分裂、生長發(fā)育、胚胎形成等多種生理過程，參與同組織分化、細胞分裂等異常相關疾病的病理過程，因而本領域中一直需要鑒定更多參與這些過程的形成素蛋白，特別是鑒定這些形成素蛋白的氨基酸序列。一種新的人形成素蛋白(以下簡稱為HFP)編碼基因的分離也為確定該蛋白在人類健康和疾病狀態(tài)下作用的提供了基礎。這種蛋白可能構(gòu)成開發(fā)診斷和／或治療與該蛋白質(zhì)表達異常相關疾病的藥物的基礎，因此分離其編碼DNA非常重要，其可進一步用于相關疾病的診斷和治療。
本發(fā)明的目的就是提供一種新的人形成素蛋白及編碼它的多核苷酸。本發(fā)明的人形成素蛋白基因與雞翼變形蛋白(LD)在蛋白水平上有55％的相同性。其與LD蛋白家族的特征性結(jié)構(gòu)域FH2結(jié)構(gòu)域非常相似，且含有FH2結(jié)構(gòu)域中的幾個高度保守的氨基酸殘基。認為本發(fā)明的形成素蛋白(命名為FHP)的編碼基因與LD蛋白家族FH2結(jié)構(gòu)域相似，推斷具有相似的生物學功能。
本發(fā)明涉及一種分離的多肽，它包含具有SEQ ID No．2氨基酸序列的多肽、或其保守性變體、生物活性片段或衍生物。
本發(fā)明還涉及一種分離的多核苷酸，它包含選自下組的一種核苷酸序列或其變體(a)編碼具有SEQ ID No．2氨基酸序列的多肽的多核苷酸；(b)與多核苷酸(a)互補的多核苷酸；和(c)與(a)或(b)的多核苷酸序列具有至少80％相同性的多核苷酸。
本發(fā)明另外涉及一種含有本發(fā)明多核苷酸的載體，特別是表達載體；一種用該載體遺傳工程化的宿主細胞，包括轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導或轉(zhuǎn)染的宿主細胞；一種包括培養(yǎng)所述宿主細胞和回收表達產(chǎn)物的制備本發(fā)明多肽的方法。
本發(fā)明還涉及一種能與本發(fā)明多肽特異性結(jié)合的抗體。
本發(fā)明還涉及一種篩選模擬、激活、拮抗或抑制本發(fā)明的形成素蛋白活性的化合物的方法，其包括利用本發(fā)明的多肽。本發(fā)明還涉及用該方法獲得的化合物。
本發(fā)明還涉及利用本發(fā)明的多核苷酸或其片段作為引物用于核酸擴增反應，或者作為探針用于雜交反應，或者用于制造基因芯片或微陣列的用途。
本發(fā)明還涉及一種體外檢測與本發(fā)明的形成素蛋白異常表達相關的疾病或疾病易感性的方法，包括檢測生物樣品中所述多肽或其編碼多核苷酸序列中的突變，或者檢測生物樣品中本發(fā)明多肽的量或生物活性。
本發(fā)明也涉及一種藥物組合物，它含有本發(fā)明多肽或其模擬物、激活劑、拮抗劑或抑制劑以及藥學上可接受的載體。
本發(fā)明還涉及本發(fā)明的多肽和／或多核苷酸在制備用于治療和／或預防例如各種發(fā)育紊亂所引起的疾病及多種免疫系統(tǒng)疾病，如癌癥，貧血，神經(jīng)系統(tǒng)疾病及各種獲得性和遺傳性疾病的藥物的用途。
本發(fā)明還涉及本發(fā)明多肽的拮抗劑或反義多核苷酸在制備用于治療與本發(fā)明形成素蛋白相關疾病的藥物中的用途。


圖1是人形成素蛋白(HFP)(上排)和雞翼變形蛋白(LD)(Genebank準入號A41724)(下排)的氨基酸序列比較。
圖2是人形成素蛋白(HFP)(上排)和人體中發(fā)現(xiàn)的一種蛋白KIAA0666(Genebank準入號AB014566)(下排)的氨基酸序列比較。
本發(fā)明上述的和其它的方面對于本領域的技術人員來說，從本文以下的詳細描述看應該是很清楚的。
本說明書和權利要求書中使用的下列術語除非特別說明具有如下的含義“核酸序列”是指寡核苷酸、核苷酸或多核苷酸及其片段或部分，也可以指基因組或合成的DNA或RNA，它們可以是單鏈或雙鏈的，代表有義鏈或反義鏈。類似地，術語“氨基酸序列”是指寡肽、肽、多肽或蛋白質(zhì)序列及其片段或部分。當本發(fā)明中的“氨基酸序列”涉及一種天然存在的蛋白質(zhì)分子的氨基酸序列時，這種“多肽”或“蛋白質(zhì)”不意味著將氨基酸序列限制為與所述蛋白質(zhì)分子相關的完整的天然氨基酸。
蛋白質(zhì)或多核苷酸“變體”是指一種具有一個或多個氨基酸或核苷酸改變的氨基酸序列或編碼它的多核苷酸序列。所述改變可包括氨基酸序列或核苷酸序列中氨基酸或核苷酸的缺失、插入或替換。變體可具有“保守性”改變，其中替換的氨基酸具有與原氨基酸相類似的結(jié)構(gòu)或化學性質(zhì)，如用亮氨酸替換異亮氨酸。變體也可具有非保守性改變，如用色氨酸替換甘氨酸。
“缺失”是指在氨基酸序列或核苷酸序列中一個或多個氨基酸或核苷酸的缺失。
“插入”或“添加”是指在氨基酸序列或核苷酸序列中的改變導致與天然存在的分子相比，一個或多個氨基酸或核苷酸的增加。
“替換”是指由不同的氨基酸或核苷酸替換一個或多個氨基酸或核苷酸。
“生物活性”是指具有天然分子的結(jié)構(gòu)、調(diào)控或生物化學功能的蛋白質(zhì)。類似地，術語“免疫學活性”是指天然的、重組的或合成蛋白質(zhì)及其片段在合適的動物或細胞中誘導特定免疫反應以及與特異性抗體結(jié)合的能力。
“激動劑”是指當與HFP結(jié)合時，一種可引起該蛋白質(zhì)改變從而上調(diào)該蛋白質(zhì)活性的分子。激動劑可以包括蛋白質(zhì)、核酸、碳水化合物或任何其它可結(jié)合HFP的分子。
“拮抗劑”或“抑制物”是指當與HFP結(jié)合時，一種可封閉或下調(diào)HFP的生物學活性或免疫學活性的分子。拮抗劑和抑制物可以包括蛋白質(zhì)、核酸、碳水化合物或任何其它可結(jié)合HFP的分子。
“調(diào)節(jié)”是指HFP的功能發(fā)生改變，包括蛋白質(zhì)活性的升高或降低、結(jié)合特性的改變及HFP的任何其它生物學性質(zhì)、功能或免疫性質(zhì)的改變。
＂基本上純＂是指基本上不含天然與其相關的其它蛋白、脂類、糖類或其它物質(zhì)。本領域的技術人員能用標準的蛋白質(zhì)純化技術純化HFP?；旧霞兊腍FP在非還原性聚丙烯酰胺凝膠上能產(chǎn)生單一的主帶。HFP多肽的純度可用氨基酸序列分析。
“互補的”或“互補”是指在允許的鹽濃度和溫度條件下通過堿基配對的多核苷酸天然結(jié)合。例如，序列“C-T-G-A”可與互補的序列“G-A-C-T”結(jié)合。兩個單鏈分子之間的互補可以是部分的或全部的。核酸鏈之間的互補程度對于核酸鏈之間雜交的效率及強度有明顯影響。
“同源性”是指互補的程度，可以是部分同源或完全同源?！安糠滞础笔侵敢环N部分互補的序列，其至少可部分抑制完全互補的序列與靶核酸的雜交。這種雜交的抑制可通過在嚴格性程度降低的條件下進行雜交(Southern印跡或Northern印跡等)來檢測?；旧贤吹男蛄谢螂s交探針可競爭和抑制完全同源的序列與靶序列在的嚴格性程度降低的條件下的結(jié)合。這并不意味嚴格性程度降低的條件允許非特異性結(jié)合，因為嚴格性程度降低的條件要求兩條序列相互的結(jié)合為特異性或選擇性相互作用。
“相同性百分率”是指在兩種或多種氨基酸或核酸序列比較中序列相同或相似的百分率?？捎秒娮臃椒y定相同性百分率，如通過MEGALIGN程序(Lasergene軟件包，DNASTAR，Inc．，Madison Wis．)。MEGALIGN程序可根據(jù)不同的方法如Cluster法比較兩種或多種序列(Higgins，D．G．和P．M．Sharp(1988)Gene 73237-244)。Cluster法通過檢查所有配對之間的距離將各組序列排列成簇。然后將各簇以成對或成組分配。兩個氨基酸序列如序列A和序列B之間的相同性百分率通過下式計算 也可以通過Cluster法或用本領域周知的方法如Jotun Hein測定核酸序列之間的相同性百分率(Hein J．，(1990)酶學方法(Methods inenzymology)183625-645)。
“相似性”是指氨基酸序列之間排列對比時相應位置氨基酸殘基的相同或保守性取代的程度。用于保守性取代的氨基酸例如，帶負電荷的氨基酸可包括天冬氨酸和谷氨酸；帶正電荷的氨基酸可包括賴氨酸和精氨酸；具有不帶電荷的頭部基團有相似親水性的氨基酸可包括亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸；甘氨酸和丙氨酸；天冬酰胺和谷氨酰胺；絲氨酸和蘇氨酸；苯丙氨酸和酪氨酸。
“反義”是指與特定的DNA或RNA序列互補的核苷酸序列?！胺戳x鏈”是指與“有義鏈”互補的核酸鏈。
“衍生物”是指HFP或編碼其的核酸的化學修飾物。這種化學修飾物可以是用烷基、?；虬被鎿Q氫原子。核酸衍生物可編碼保留天然分子的主要生物學特性的多肽。
“抗體”是指完整的抗體分子及其片段，如Fa、F(ab’)2及Fv，其能特異性結(jié)合HFP的抗原決定簇。
“分離的”一詞指將物質(zhì)從它原來的環(huán)境(例如，若是自然產(chǎn)生的就指其天然環(huán)境)之中移出。比如說，一個自然產(chǎn)生的多核苷酸或多肽存在于活動物中就是沒有被分離出來，但同樣的多核苷酸或多肽同一些或全部在自然系統(tǒng)中與之共存的物質(zhì)分開就是分離的。這樣的多核苷酸可能是某一載體的一部分，也可能這樣的多核苷酸或多肽是某一組合物的一部分。既然載體或組合物不是它天然環(huán)境的成分，它們?nèi)匀皇欠蛛x的。
本發(fā)明一方面提供了一種新的人形成素蛋白，及其具有生物活性的片段、類似物和衍生物。本發(fā)明的另一方面，提供了編碼這些多肽的分離的核酸分子，包括mRNA、DNA、cDNA和基因組DNA，及其具有生物活性的片段、類似物和衍生物。本發(fā)明的再一方面提供了核酸的探針，它包含足夠長度的核酸分子以及可與HFP基因序列進行特異性雜交的序列。
依據(jù)本發(fā)明的一方面，它提供了一種分離的多核苷酸，這些核苷酸編碼具有SEQ ID No．2所示的推定的氨基酸序列的多肽。編碼HFP的多核苷酸可以從許多成人和胎兒的cDNA文庫中分離，如人胎腦cDNA文庫。SEQ ID No．1所示的多核苷酸序列全長為2174堿基，具有編碼一個含235個氨基酸殘基的多肽的開放閱讀框架(440bp-1147bp)。根據(jù)氨基酸序列同源比較發(fā)現(xiàn)，此多肽與雞翼變形蛋白具有55％的相同性，且具有翼變形蛋白家族的特征性結(jié)構(gòu)域FH2結(jié)構(gòu)域。
本發(fā)明的多核苷酸可以RNA或DNA的形式存在，其中DNA包括cDNA、基因組DNA和合成的DNA。DNA可以是雙鏈或者單鏈的，單鏈也可以是有義鏈或者反義鏈。編碼多肽的多核苷酸序列可以與SEQ IDNo．1所示的多核苷酸序列相同，或者可以是一個由于遺傳密碼的冗余或簡并性而不同的多核苷酸序列，但它與SEQ ID No．1編碼相同的成熟多肽。
編碼SEQ ID No．2的多肽的多核苷酸可以包括僅僅編碼成熟多肽的多核苷酸序列(如SEQ ID No．1中440-1147位多核苷酸)、包含編碼成熟多肽的多核苷酸序列和任選的其它編碼序列或非編碼序列(例如內(nèi)含子或編碼成熟多肽的多核苷酸序列5’端和／或3’端的非編碼序列)的多核苷酸序列(如SEQ ID No．1中1-2174位多核苷酸)。
本發(fā)明進一步涉及上面所描述的多核苷酸的各種變體，它們編碼含有SEQ ID No．2所示的推定的氨基酸序列多肽的片段、類似物和衍生物。這些多核苷酸變體可以是天然存在的等位基因變體或非天然存在的多核苷酸變體。
編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸也可能與特定的標記序列在同一讀框中相融合，標記序列可幫助本發(fā)明多肽的純化。標記序列在使用細菌宿主時可以是pQE載體的六聚組氨酸標記，以利于融合有標記的成熟多肽的純化，或者當使用哺乳類宿主(如猴腎成纖維細胞的COS-7細胞系)時，標記序列可以是一種血細胞凝集素(HA)標記。此外，包含編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸序列還可包含同源或異源的特定信號肽序列，以幫助目的蛋白質(zhì)分泌到原核細胞或真核細胞膜外。本領域普通技術人員知曉，上述標記序列和信號肽序列也可通過重組方法或化學法添加在用于表達本發(fā)明多肽的載體上。
本發(fā)明的多核苷酸序列也包括全長cDNA的片段，例如編碼SEQ IDNo．2中至少20個，優(yōu)選至少30個，更優(yōu)選至少50個，最好至少80個氨基酸的多核苷酸片段。這些片段例如具有SEQ ID No．1所示序列中連續(xù)的至少10個，優(yōu)選的至少20個核苷酸，更優(yōu)選的至少50個核苷酸，特別是至少60、90、150或240個核苷酸。
本發(fā)明進一步涉及能與上述序列雜交的多核苷酸，這兩個序列間至少有70％，較優(yōu)選至少80％，優(yōu)選至少90％，更優(yōu)選至少95％的同源性。本發(fā)明特別涉及在嚴格條件下能與上述多核苷酸雜交的多核苷酸。這里所用的術語“嚴格條件”意味著兩序列之間有95％，優(yōu)選至少97％同源性才能發(fā)生雜交。在一優(yōu)選的實施方案中，與上述多核苷酸互補鏈雜交的多核苷酸編碼的多肽基本保持了與SEQ ID No．2所示多肽相同的生物功能或活性。
另外，本發(fā)明涉及可與本發(fā)明的多核苷酸雜交的多核苷酸，其至少含20個堿基，優(yōu)選至少30個堿基，更優(yōu)選至少50個堿基并且具有上面所描述的同源性，其可以保留或不保留活性。例如，這樣的多核苷酸可以用作為檢測SEQ ID No．1所示多核苷酸或其它來源的相似序列的探針；又如，其可以用于本發(fā)明多核苷酸的回收或者作為一種診斷探針或PCR引物。
本發(fā)明的DNA序列可用多種方法獲得。例如，用本領域熟知的雜交技術分離DNA。這些技術包括但不局限于1)用探針與基因組或cDNA文庫雜交以檢出同源性多核苷酸序列，和2)表達文庫的抗體篩選以檢出具有共同結(jié)構(gòu)特征的克隆的DNA片段。
編碼HFP的特異DNA片段序列也能用下列方法獲得1)從基因組DNA分離雙鏈DNA序列；2)化學合成DNA序列以獲得所需多肽的雙鏈DNA。
分離感興趣的cDNA的標準方法是從高表達該基因的供體細胞中分離mRNA并進行逆轉(zhuǎn)錄，形成質(zhì)?；蚴删wcDNA文庫。提取mRNA的方法已有多種成熟的技術，試劑盒也可從商業(yè)途徑獲得(Qiagene)。而構(gòu)建cDNA文庫也是本領域技術人員周知的方法(Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(Molecular Cloning，A Laboratory Manual)，冷泉港實驗室，紐約，1989)。還可得到商業(yè)供應的cDNA文庫，如Clontech公司的不同cDNA文庫。當結(jié)合使用聚合酶反應技術時，即使極少的表達產(chǎn)物也能克隆。
可用常規(guī)方法從這些cDNA文庫中篩選本發(fā)明的多核苷酸序列。這些方法包括但不限于(1)DNA-DNA或DNA-RNA雜交；(2)標志基因的功能出現(xiàn)或喪失；(3)測定HFP的轉(zhuǎn)錄本的水平；(4)應用免疫學技術或測定生物學活性檢測基因表達的蛋白產(chǎn)物。上述方法可單獨使用，也可多種方法聯(lián)合應用。
在第(1)種方法中，雜交所用的探針可與本發(fā)明多核苷酸的任何一部分具有相同性，其長度至少是15個核苷酸，優(yōu)選是20-30個核苷酸，更優(yōu)選是50-60個核苷酸，最優(yōu)選是100個核苷酸以上。此處所用的探針通常是在本發(fā)明的基因DNA序列信息的基礎上化學合成的DNA序列。本發(fā)明的基因本身或者片段當然可以用做探針。DNA探針可用放射性同位素、熒光素或酶(如堿性磷酸酶)等標記。第(4)種方法中，檢測HFP基因表達的蛋白產(chǎn)物可用免疫學技術如Western印跡、放射免疫沉淀法、酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)等。
由于本申請?zhí)峁┝薍FP的全長cDNA序列，應用PCR技術擴增DNA／RNA的方法(Saiki，等人，科學(Science)1985；2301350-1354)優(yōu)先用于獲得本發(fā)明的基因。特別是很難從文庫中得到全長的cDNA時，可優(yōu)選使用RACE法(RACEcDNA末端快速擴增法)，在上述PCR方面所用的引物根據(jù)本文所公開的本發(fā)明的序列信息可適當?shù)剡x擇，并可用常規(guī)方法合成。可用常規(guī)方法如通過凝膠電泳分離和純化擴增的DNA／RNA片段。
如上所述得到的本發(fā)明的基因，或者各種DNA片段的核苷酸序列的測定可用常規(guī)方法如雙脫氧鏈終止法(Sanger等人，美國國家科學院院報，1977，745463-5467)。這類核苷酸序列測定也可用商業(yè)測序試劑盒等。為了獲得全長的cDNA序列，測序需反復進行。有時需要測定多個克隆的cDNA序列，以拼接成全長的cDNA序列。
本發(fā)明的多核苷酸序列的全部或部分也可通過本領域周知的化學方法合成(Caruthers，M．H．等人，(1980)Nucl．Acids Res．Symp．Ser．215-223；Horn，T．等人，(1980)Nucl．Acid Res．Symp．Ser．225-232)。
本發(fā)明進一步涉及具有SEQ ID No．2所示推定氨基酸序列的多肽及其活性片段、類似物和衍生物。SEQ ID No．2所示推定氨基酸序列的多肽為一個含235個氨基酸殘基的多肽。
SEQ ID No．2所示多肽的“片段”、“衍生物”和“類似物”指能基本保留該多肽的生物學功能或活性的多肽或無活性的前體。由此，本發(fā)明的多肽包括了其前原蛋白、前蛋白和蛋白原等形式，其經(jīng)過加工后(如蛋白質(zhì)水解或修飾)可被激活，產(chǎn)生一個有活性的成熟多肽。
本發(fā)明的多肽可以是重組多肽、天然存在的多肽或合成的多肽，優(yōu)選為重組多肽。SEQ ID No．2所示的多肽的片段、衍生物和類似物可以是(ⅰ)一個或多個氨基酸殘基被保守性或非保守性氨基酸殘基所取代(優(yōu)選是保守性氨基酸殘基)的多肽，取代的氨基酸殘基是或不是由遺傳密碼所編碼的氨基酸。例如，可以通過氨基酸殘基的插入、取代和／或刪除，得到HFP的沉默突變體或功能等同物?？苫诎被釟埢g在極性、電荷、溶解性、疏水性、親水性和／或兩親性等方面的相似性進行保守性氨基酸取代，只要保留HFP的活性；或(ⅱ)一個或多個氨基酸殘基帶有取代基團的多肽；或(ⅲ)成熟多肽與其它功能性化合物，如提高多肽半壽期的化合物(例如聚乙二醇)融合在一起的多肽；或(ⅳ)成熟多肽與其它氨基酸序列相融合的多肽，其中所述其它氨基酸序列包括諸如幫助純化成熟蛋白的氨基酸序列或蛋白原序列等。這些幫助純化的結(jié)構(gòu)域包括但不限于金屬鰲合肽，如用于在固定化金屬上純化的組氨酸-色氨酸模塊；用于在固定化免疫球蛋白上純化的蛋白A結(jié)構(gòu)域以及用于FLAGS延伸／親和純化系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)域(IMMUNEX公司，Seattle，Wash)。特異于因子XA或腸激酶的斷裂接頭序列也可用于幫助目的蛋白質(zhì)的純化(Porath，J．等人(1992)，Prot．Exp．Purif．3263-281)。從這些公開內(nèi)容看，這樣的片段、衍生物和類似物的應處于本領域技術人員的知識范圍內(nèi)。
本發(fā)明的多肽包括SEQ ID No．2所示的多肽(特別指成熟多肽)，也包括與SEQ ID No．2多肽至少有70％相似性(優(yōu)選是70％相同性)的多肽，優(yōu)選至少有90％相似性(優(yōu)選是90％的相同性)的多肽，更優(yōu)選至少有95％相似性(優(yōu)選是95％相同性)的多肽，也包括這些多肽的一些部分，通常這些多肽部分至少含有30個氨基酸、優(yōu)選至少50個氨基酸。
本發(fā)明的多肽、其保守性變體和生物活性片段及衍生物可以用常規(guī)的肽合成的方法制備，例如固相肽合成(Merrifield J．(1963)，美國化學會雜志(J．Am．Chem．Soc．)852149-2154；Roberge，J．Y．等人，(1995)科學，269202-204)。蛋白質(zhì)合成可以手工完成，也可利用肽自動合成儀如Applied Biosystems 431A肽合成儀進行(Perkin Elmer)。本發(fā)明多肽也可以從天然生物材料中經(jīng)分離純化得到，但優(yōu)選利用本發(fā)明提供的多核苷酸用重組DNA技術制備。根據(jù)重組生產(chǎn)方法中所用的宿主不同，本發(fā)明中的多肽可能被糖基化或不被糖基化。該多肽也可能具有起始的甲硫氨酸殘基。
根據(jù)普通的重組DNA技術，利用本發(fā)明的多核苷酸序列可表達或制備重組的HFP多肽(科學，1984；2241431)。本發(fā)明因而涉及制備本發(fā)明HFP多肽的方法，一般包括以下步驟(1)用本發(fā)明編碼HFP的多核苷酸(或變體)或含有該多核苷酸的重組表達載體轉(zhuǎn)化合適的宿主細胞；(2)在合適的培養(yǎng)基中及適當?shù)呐囵B(yǎng)條件下培養(yǎng)宿主細胞；(3)從培養(yǎng)基或細胞中分離、純化目的蛋白質(zhì)。
本發(fā)明也涉及包含本發(fā)明多核苷酸的重組載體、帶有本發(fā)明重組載體的遺傳工程化宿主細胞和通過重組技術制備本發(fā)明多肽的方法。
本發(fā)明的多核苷酸可以用來經(jīng)重組技術產(chǎn)生多肽。例如，該多核苷酸可以存在于選自多種用于表達多肽的表達載體中的任一載體上，這些載體包括染色體的、非染色體的及合成的DNA序列，例如，SV40的衍生物、細菌質(zhì)粒、噬菌體DNA、酵母質(zhì)粒、衍生于質(zhì)粒和噬菌體DNA結(jié)合的載體、病毒DNA、桿狀病毒、牛痘病毒、腺病毒、禽痘病毒及偽狂犬病毒，包括但不限于pQE系列(Qiagen)、pBS、pD10、phagescript、psiX174、pBluescript SK、pBSKS、pNH系列(Stratagene)、pTRC99a、pKK223-3、pDR540、pRIT5(Pharmacia)；pWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pXT1、pSG(Stratagene)、pSVK3、pBPV、pMSG、pSVL(Pharmacia)。不過，只要是能在宿主中復制和存活，其它質(zhì)?；蜉d體也可應用。
本發(fā)明也包括含有本發(fā)明多核苷酸的重組構(gòu)建體。該構(gòu)建體包括載體，如上述質(zhì)粒、粘?；虿《据d體，其中可正向或反向插入本發(fā)明的多核苷酸序列。構(gòu)建體中還包含調(diào)節(jié)序列，例如，有效地連接到本發(fā)明多核苷酸序列上的啟動子(包括組成型和誘導型啟動子)，介導下游結(jié)構(gòu)序列的轉(zhuǎn)錄。合適的啟動子包括但不限于，λ噬菌體的PL啟動子、桿狀病毒多角體蛋白啟動子；細菌啟動子如；LacI、LacZ、T3、T7、gpt、λPR、PL和trp；真核啟動子如CMV立即早期啟動子、HSV胸苷激酶啟動子、早期和晚期SV40啟動子、逆轉(zhuǎn)錄病毒的LTR和小鼠金屬硫蛋白I啟動子；還包括衍生自植物細胞基因組中的啟動子，如熱休克蛋白、RUBISCO啟動子。
表達載體也包含翻譯起始所需要的核糖體結(jié)合位點和轉(zhuǎn)錄終止子，其還可以具有增強表達的合適序列，如增強子。增強子是DNA的順式作用因子，通常有大約10-300bp，作用于啟動子，提高它的轉(zhuǎn)錄。例如，SV40中位于復制起點后側(cè)100-270bp處的增強子，巨細胞病毒早期啟動子增強子、位于復制起點后側(cè)的多形瘤增強子及腺病毒增強子。此外，表達載體優(yōu)選還包含能提供表型特征的一種或多種選擇性基因、抗性基因和／或標記基因，以便于轉(zhuǎn)化宿主細胞的篩選。選擇性基因如幫助細胞利用吲哚或組氨醇的trpB、hisD(Hartman，S．C．，和R．C．Mulligan(1988)美國國家科學院院報858047-51)，用于tk-或aprt-細胞的肝皰疹病毒胸腺嘧啶激酶(Wigler，M．等人(1977)細胞11223-32)和腺嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(Lowy，I．等人(1980)細胞22817-23)；抗性基因如賦予氨甲蝶呤抗性的二氫葉酸還原酶DHFR(Wigler，M．等人(1989)，美國國家科學院院報，773567-70)或賦予新霉素和G-418抗性的npt(Colbere-Garapin，F(xiàn)．等人(1981)分子生物學雜志(J．Mol．Biol．)，1501-14)，以及四環(huán)素或氨芐青霉素抗性基因。哺乳類表達載體一般包括復制起點、適當?shù)膯幼?、增強子及任何必需的核糖體結(jié)合位點、多腺苷化位點、拼接供體和受體位點、轉(zhuǎn)錄終止序列和5’側(cè)翼非轉(zhuǎn)錄序列。衍生于SV40拼接序列的DNA序列和多腺苷化位點可用于提供所需要的非轉(zhuǎn)錄遺傳元件。此外，包含編碼本發(fā)明多肽的核苷酸序列的載體還可包含同源或異源的特定信號肽序列，以幫助目的蛋白質(zhì)分泌到原核細胞或真核細胞膜外。本領域普通技術人員知曉，上述表達載體及構(gòu)建體中含有的標記序列和信號肽序列也可通過重組方法或化學法添加在編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸上。
合適載體和啟動子的選擇為本領域普通技術人員周知。細菌適用的有效表達載體可以這樣來構(gòu)建將編碼目的蛋白的結(jié)構(gòu)DNA序列隨同適當?shù)姆g起始和終止信號被插入到帶有一個功能啟動子的可操縱的閱讀框中。本領域普通技術人員周知用于構(gòu)建含有本發(fā)明核苷酸序列以及合適的轉(zhuǎn)錄及翻譯調(diào)控元件的方法。這些方法包括體外重組DNA技術、合成技術以及體內(nèi)遺傳重組技術(Sambrook，J．(1989)，《分子克隆，實驗室手冊》，Cold Spring Harbor Press；Plainview，N．Y．；Ausubel，F(xiàn)．M．(1989)現(xiàn)代分子生物學方法(Current Protocols in Molecular Biology)，John Wiley & Sons，N．Y．)。
包含上述合適的DNA序列、合適的啟動子或控制序列的載體可以用于轉(zhuǎn)化合適的宿主，讓宿主表達該蛋白。
本領域技術人員知曉，根據(jù)本發(fā)明DNA序列所插入的表達載體或構(gòu)建體的種類和特性選擇合適的宿主以表達目的蛋白質(zhì)。適于表達本發(fā)明的多肽的宿主包括但不限于原核宿主，諸如大腸桿菌、芽孢桿菌屬、鏈霉菌屬等；真核宿主，諸如酵母屬、曲霉屬、昆蟲細胞，諸如果蠅S2和草地夜蛾Sf9；動物細胞，如CHO、COS(猴腎成纖維細胞系，Gluzman，細胞，23175，1981)及其它的能表達相容載體的細胞系，例如C127、3T3、CHO、HeLa、BHK、Bowes黑素瘤細胞；植物細胞以及腺病毒等等。各種哺乳動物細胞的培養(yǎng)系統(tǒng)也能用于表達重組蛋白。從這些講授看，合適宿主的選擇應該在本領域技術人員的知識范圍內(nèi)。
帶有如上所述的含有本發(fā)明核苷酸序列之載體或構(gòu)建體能夠通過傳統(tǒng)的方法導入合適的宿主細胞中以產(chǎn)生重組產(chǎn)物。將構(gòu)建體導入上述宿主細胞的方法為本領域技術人員周知，包括但不限于氯化鈣介導的轉(zhuǎn)化、磷酸鈣轉(zhuǎn)染、DEAE-葡聚糖介導的轉(zhuǎn)染、電穿孔、顯微注射、粒子轟擊法或基因槍方法(Sambrook，J．(1989)，《分子克隆，實驗室手冊》，ColdSpring Harbor Press；Plainview，N．Y．；Ausubel，F(xiàn)．M．(1989)現(xiàn)代分子生物方法，John Wiley & Sons，N．Y．；Hobbs，S．等人，McGraw Hill科技年鑒(1992)，McGraw Hill，N．Y．191-196；Engelhard，E．K．等人，美國國家科學院院報，913224-3227；Logan，J．等人，美國國家科學院院報，813655-3659)。
在適當?shù)呐囵B(yǎng)條件與培養(yǎng)基中培養(yǎng)經(jīng)轉(zhuǎn)化的宿主菌株或細胞，使其生長到恰當?shù)募毎芏戎?，用適當?shù)姆椒?例如溫度轉(zhuǎn)變或化學藥品誘導)誘導所選擇的啟動子，并將細胞再培養(yǎng)一段時間。針對不同的宿主菌株或細胞選擇以及所表達的目的蛋白質(zhì)的性質(zhì)相應的培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基在本領域技術人員知識范圍之內(nèi)。
在合適的啟動子控制下可以在哺乳類細胞、酵母、細菌或其它細胞中表達成熟蛋白。利用由本發(fā)明的DNA構(gòu)建體衍生的RNA，也可以用無細胞翻譯體系產(chǎn)生這種蛋白質(zhì)(Sambrook，J．(1989)，《分子克隆，實驗室手冊》，第18章第4節(jié)，Cold Spring Harbor Press；Plainview，N．Y．)。
通常用離心的方法收獲細胞或培養(yǎng)液。對于目的蛋白質(zhì)保留在胞內(nèi)的情況，一般可用任何便捷的物理、化學方法或酶法，包括凍融循環(huán)、超聲波、機械破碎，或使用細胞溶解劑或特定的酶破碎細胞，將粗提物保留以進一步純化。對于對于目的蛋白質(zhì)分泌到胞外的情況，可直接回收培養(yǎng)上清液。這些方法都是本領域的技術人員熟知的。
多肽可以從重組細胞培養(yǎng)物中回收和純化出來，回收和純化的方法有硫酸銨或乙醇沉淀、酸提取、陰離子或陽離子交換層析、體積排阻層析、疏水相互作用層析、親和層析、羥基磷灰石層析和植物凝集素層析。形成成熟蛋白的完整構(gòu)象還需要蛋白質(zhì)的重折疊步驟。通常高效液相層析(HPLC)或毛細管電泳可應用于最后的純化步驟。
本發(fā)明中的多核苷酸和多肽可用作研究試劑和材料，以發(fā)現(xiàn)治療或診斷腫瘤、各種發(fā)育紊亂所引起的疾病和多種免疫性疾病，如癌癥，貧血，神經(jīng)系統(tǒng)疾病及各種獲得性和遺傳性疾病的方法。這種多核苷酸和其編碼的多肽也可用于體外的相關科學研究、DNA合成和DNA載體的制備，還用于篩選本發(fā)明多肽的拮抗劑、激動劑和／或抑制劑。
全長HFP基因的片段可以用作cDNA文庫的雜交探針，從而分離出全長基因和與之有高度序列相似性或相似生物學活性的其它基因。這種類型的探針一般至少有20個堿基。但是，這些探針優(yōu)選至少有30個堿基并且一般不超過50個堿基，盡管它們可以具有更多的堿基。該探針也可以用于鑒定相應于全長轉(zhuǎn)錄物的cDNA克隆或具有完整基因，包括調(diào)節(jié)和啟動子區(qū)域、外顯子及內(nèi)含子的基因組克隆。篩選的一種方法是，利用已知的DNA序列合成一個寡核苷酸探針，用它去分離出基因的編碼區(qū)域。與本發(fā)明的多核苷酸序列互補的經(jīng)標記的寡核苷酸可用于篩選人類cDNA文庫、基因組文庫、mRNA文庫，以確定文庫中哪些成員可與探針雜交。
可利用部分核苷酸序列及利用本領域已知方法延伸編碼HFP的核酸序列，以檢測其上游序列如啟動子和調(diào)控元件。例如，可利用通用引物通過限制位點PCR(RESTRICTION-SITE PCR)以找回與已知基因座相鄰的未知序列(Sarkar，G．(1993)PCR方法應用(PCR MethodApplic．)2318-322)?；谝阎獏^(qū)域利用不同的引物通過逆轉(zhuǎn)錄PCR擴增或延伸序列(Triglia，T．等人，(1988)，核酸研究(Nucleic Acids Res．)168186)。其他可用的PCR方法包括捕獲PCR(capture PCR)，如用鄰近人和酵母人工染色體DNA的DNA片段進行PCR擴增(Lagerstrom，M等人，(1991)PCR方法應用1111-119)。此外，本領域技術人員也可通過PCR利用巢式引物(nested primer)及PromoterFinderTM文庫進行基因組DNA步行(Clontech，Palo Alto，Calif．)。
本發(fā)明還涉及利用HFP基因產(chǎn)物檢測與HFP的多核苷酸序列突變相關的疾病或?qū)膊〉囊赘行缘脑\斷方法。這些疾病與本發(fā)明的HFP基因的mRNA及編碼的蛋白質(zhì)表達異常有關，如各種腫瘤、發(fā)育紊亂所引起的疾病和多種免疫性疾病，如癌癥，貧血，神經(jīng)系統(tǒng)疾病及各種獲得性和遺傳性疾病。可以用各種技術在DNA的水平上檢測出HFP基因突變的個體。用于診斷的核酸可以從病人的細胞中獲得，例如血液、尿液、唾液、活組織檢查和尸體解剖材料。基因組DNA可以直接用于檢測，也可以在檢測分析前用PCR進行酶法擴增(Saiki等人，自然324163-166，1986)。RNA或cDNA也可用于同樣目的。例如，與編碼HFP基因的核酸互補的PCR引物可用來鑒定和分析HFP基因的突變。例如，從擴增產(chǎn)物的大小與正?；蛐拖啾劝l(fā)生的變化中可以檢出缺失和／或插入突變。將擴增的DNA與放射性標記的HFP RNA雜交可檢測點突變，或者使用放射性標記HFP反義DNA序列來進行雜交。用RNA酶A消化或從解鏈溫度的不同或改變可以區(qū)分完全配對的序列與錯配的雙螺旋。
通過檢測DNA片段在含有或不含有變性劑的凝膠中電泳遷移率的變化，可以進行基于DNA序列差異的遺傳學測試。小序列的缺失和插入可以從高分辨率的凝膠電泳中看出。例如，不同大小的DNA片段可以在變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)中區(qū)別出來。含有點突變的DNA序列與正常的DNA序列分別變性后在不含變性劑的聚丙烯酰胺凝膠中可因構(gòu)象的不同(泳動速度不同)而區(qū)別開來。
本發(fā)明的多核苷酸的一部分或全部可作為探針固定在微陣列(Microarray)或DNA芯片(又稱為基因芯片)上，用于分析組織中基因的差異表達分析和基因診斷。
核酸酶保護實驗可以揭示特定位置的序列變化，比如RNA酶和S1酶保護法或者化學斷裂法(Cotton等人，美國國家科學院院報854397-4401，1985)。
總之，特異DNA序列可以用下述方法檢測雜交、RNA酶保護、化學斷裂、直接DNA測序或使用限制性內(nèi)切酶(例如，限制片段長度的多態(tài)性RFLP)及基因組DNA的Southern印跡技術。
除了較傳統(tǒng)的凝膠電泳和DNA測序方法外，突變還可用原位分析檢測出來。
本發(fā)明也涉及用于檢測各種組織中HFP基因的mRNA表達異常的診斷方法。mRNA水平的變化可用逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)、Northern印跡、點雜交或RNA原位雜交等方法進行檢測。這些方法對于本領域的技術人員來說是周知的。
本發(fā)明還涉及用于檢測各種組織中HFP基因蛋白水平改變的診斷方法，與正常對照組織樣品相比，HFP蛋白的減少可檢測疾病或?qū)膊∫赘行缘拇嬖?。測定宿主樣品中HFP基因蛋白水平的方法是本領域技術人員熟知的，包括放射性免疫測定法、競爭性結(jié)合測定法、Western印跡分析、酶聯(lián)免疫吸附法和夾心測定法。酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)(Coligan等人，現(xiàn)代免疫學方法(Current Protocols in Immunology)卷1，No．2，第6章，1991)要預先準備針對HFP抗原的特異性抗體，優(yōu)選是單克隆抗體。另外，還要準備抗單克隆抗體的報告抗體。報告抗體上連有一個可檢測的試劑，諸如放射性同位素、熒光或辣根過氧化物酶等標記。
例如，從宿主取得樣品并在一個固相載體上溫育，例如聚苯乙烯反應板，它能吸附樣品中的蛋白。然后用一種非特異性蛋白如牛血清白蛋白(BSA)溫育，覆蓋板上任何游離的蛋白結(jié)合位點。第二步，加入單克隆抗體在板中溫育，這時，單克隆抗體與附著在聚苯乙烯反應板上的HFP基因蛋白結(jié)合。所有未結(jié)合上的單克隆抗體用緩沖液洗去。與辣根過氧化物酶相連的報告抗體此時加入板中，結(jié)果報告抗體就與結(jié)合在HFP抗原上的單克隆抗體相結(jié)合。未結(jié)合上的報告抗體也被洗掉。然后加入過氧化物酶的底物，在一定的時間內(nèi)所形成的顏色的深淺與標準曲線作比較，就能測出一定體積的病人樣品中HFP基因蛋白的含量。
競爭測定法也可用于這項檢測。將HFP抗原的特異性抗體連到一個固相載體上，然后讓標記的HFP和從宿主獲得的樣品一起通過固相載體并檢測標記物的數(shù)量，例如用液相閃爍計數(shù)器。標記物的數(shù)量與樣品中的HFP的數(shù)量相關。夾心測定法類似于酶聯(lián)免疫吸附法，包括雙抗原夾心法和雙抗體夾心法。在雙抗體夾心測定法中，HFP通過固體載體，與吸附在固相載體上的抗體結(jié)合。第二種抗體又結(jié)合到HFP上。第三種抗體是被標記的并對第二種抗體有特異性，當它通過固相載體時就結(jié)合到第二種抗體上，然后檢測它的數(shù)量。
利用標記的HFP在受體結(jié)合實驗中可以檢測表達HFP受體的細胞?？梢愿鶕?jù)HFP受體的存在與否和其密度區(qū)分細胞，從而提供預測這種細胞對HFP活性之敏感性的基礎。
形成素蛋白在免疫應答細胞及組織中均有表達，在癌癥及無限增殖細胞株中也有表達。因而，其在癌癥、發(fā)育及免疫系統(tǒng)紊亂所引起的疾病中都起著重要的作用。本發(fā)明的形成素蛋白，其在生物體內(nèi)可能起著調(diào)節(jié)相關蛋白功能的作用，如與含F(xiàn)H1結(jié)構(gòu)域的蛋白相互作用從而調(diào)節(jié)這些蛋白在生物體內(nèi)的功能。
本發(fā)明的形成素蛋白多肽或其片段或其衍生物可以用來治療發(fā)育紊亂所引起的疾病，即影響細胞及組織生長和分化的疾病。這些疾病包括但不限于以下幾種腎小管酸化，貧血，庫興氏綜合癥，軟骨發(fā)育不良矮小癥，癲癇，生殖腺發(fā)育不全，遺傳性神經(jīng)系統(tǒng)疾病如神經(jīng)纖維瘤，甲狀腺功能減退，腦積水，抽搐紊亂性疾病如大腦麻痹，脊柱裂，先天性青光眼，白內(nèi)障及感覺神經(jīng)性聽覺損失等。
HFP蛋白還可用于預防及治療各種癌癥，這些癌癥包括腺癌，白血病，淋巴瘤，黑色素瘤，骨髓瘤，肉瘤，畸形癌，尤其是腎上腺，膀胱，骨，腦，乳房，子宮，心臟，腎臟，肝，肺，肌肉，卵巢，唾液腺，皮膚，睪丸，胸腺，子宮頸，胰腺，甲狀腺，陰莖等癌癥。
HFP多肽及其具有生物活性的片段、類似物和衍生物可以與藥學可接受載體一起在組合物中使用，這樣的組合物中包括有效治療劑量的多肽和藥學可接受的載體或賦形劑。這樣的載體包括但并不限制于鹽水、緩沖鹽水、右旋糖、水、甘油、乙醇及其組合。配制品應該適合給藥方式。
本發(fā)明的藥物組合物還包括利用本發(fā)明的多肽制備的疫苗，其包括本發(fā)明的多肽或其具有生物學活性或免疫學活性的片段，其中任選地還含有弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑以及其它藥學可接受的載體。
本發(fā)明也提供了一種藥物包裝或試劑盒，包括一個或多個裝有一種或多種本發(fā)明的藥物組合物的成分的容器。另外，這些多肽及其具有生物活性的片段、類似物和衍生物也可與其它的治療化合物組合使用。
這些藥物組合物可用一種方便的方式給藥，諸如表皮、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌肉內(nèi)、腫瘤內(nèi)、皮下、鼻內(nèi)或真皮內(nèi)途徑。這些藥物組合物以治療和／或預防具體適應癥的有效劑量使用。
本發(fā)明的HFP多核苷酸可用于基因治療，經(jīng)體內(nèi)表達HFP或利用反義技術而達到治療目的。
基因治療方法例如包括將病人的細胞在離體情況下用編碼HFP多肽的多核苷酸(DNA或RNA)工程化，再將工程化的細胞供給待治療的病人。這樣的方法是本領域中大家所熟悉的。例如，可以用包含編碼本發(fā)明HFP多肽的RNA的逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒進行細胞工程化。
同樣，用本領域所知的方法可以在體內(nèi)工程化細胞以體內(nèi)表達多肽。如本領域中所知，用于產(chǎn)生含有編碼本發(fā)明多肽的RNA的逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒的生產(chǎn)細胞可以注入病人體內(nèi)，使體內(nèi)細胞工程化并在體內(nèi)表達該多肽。從本發(fā)明的講授看，這些以及其它的多肽給藥方式對于本領域技術人員是很清楚的。例如除了逆轉(zhuǎn)錄病毒外，還有別的用于工程化細胞的表達載體，例如腺病毒，把它與一個合適的運輸載體結(jié)合后可在體內(nèi)工程化細胞。
可以衍生出上述逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒載體的逆轉(zhuǎn)錄病毒包括但不限于Moloney鼠白血病病毒、脾壞死病毒、勞斯氏肉瘤病毒、Harvey肉瘤病毒、禽白血病病毒、長臂猿白血病病毒、人免疫缺陷病毒、腺病毒、骨髓增生性肉瘤病毒和哺乳動物腫瘤病毒。
上述載體中可包含一個或多個啟動子?？墒褂玫暮线m啟動子包括但不限于逆轉(zhuǎn)錄病毒的LTR、SV40啟動子、人巨細胞病毒(CMV)啟動子(Miller生物技術(Biotechniques)，卷7，No．9，980-990頁，1989)或其它啟動子(例如，真核細胞啟動子包括但不限制于組蛋白、polIII、β-肌動蛋白啟動子)。其它可用的病毒啟動子包括但不限于腺病毒啟動子、胸苷激酶(TK)啟動子和B19細小病毒啟動子。從這里的講授，合適啟動子的選擇在本領域技術人員知識范圍之內(nèi)。
編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸序列應在合適啟動子的控制之下。合適的啟動子包括但不限于，腺病毒的啟動子，比如腺病毒主要晚期啟動子；或異源啟動子，比如巨細胞病毒(CMV)啟動子；呼吸道合胞體病毒(RSV)啟動子；可誘導的啟動子，比如MMT啟動子、金屬硫蛋白啟動子；熱休克啟動子；白蛋白啟動子；ApoAI啟動子；人珠蛋白啟動子；病毒胸苷激酶啟動子，比如單純性皰疹胸苷激酶啟動子；逆轉(zhuǎn)錄病毒的LTR(包括上面所描述的修飾的逆轉(zhuǎn)錄病毒的LTR)；β-肌動蛋白啟動子；及人生長激素啟動子。也可以是控制編碼該多肽的基因的自身啟動子。
用逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)導包裝細胞系而形成生產(chǎn)細胞系。用于轉(zhuǎn)染的包裝細胞包括，但不限制于，PE501、PA317、ψ-2、ψ-AM、PA12、T19-14X、VT-19-17-H2、ψCRE、ψCRIP、GP+E-86、GP+envAM12和DNA細胞系，如Miller所描述(人類基因治療(Human GeneTherapy)，卷1，5-14頁，1990)，此處全文引入作為參考?？捎帽绢I域的已知方法用載體轉(zhuǎn)導包裝細胞系。這些方法包括但不限于，電穿孔、使用脂質(zhì)體和磷酸鈣沉淀。一種可選擇的方法是將逆轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒載體包裹進脂質(zhì)體中或與脂類偶聯(lián)，然后注入宿主中。
生產(chǎn)細胞系產(chǎn)生具感染性的逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒，此病毒顆粒中包含編碼這些多肽的核酸序列。這樣的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體顆?？捎糜隗w外或體內(nèi)轉(zhuǎn)染真核細胞。被轉(zhuǎn)染的真核細胞將表達編碼多肽的核酸序列?？捎糜谵D(zhuǎn)染的真核細胞包括但不限于，胚胎干細胞、胚胎癌細胞、造血干細胞、肝細胞、成纖維細胞、成肌細胞、角質(zhì)細胞、內(nèi)皮細胞和支氣管上皮細胞。
另一方面，利用反義技術可以改變本發(fā)明多肽的體內(nèi)表達也以治療與多肽表達相關的的疾病?？梢岳肏FP基因編碼區(qū)、控制或調(diào)節(jié)區(qū)的反義分子(DNA，RNA，或肽核酸(PNA))。最近，文獻中報道了利用三螺旋DNA在治療中的應用(Gee，J．E．等人，(1994)in Huber，B．E．與B．I．Carr，分子及免疫學方法(Molecular and ImmunologicApproaches)，F(xiàn)utura Publishing Co．，Mt．Kisco，N．Y．，163-177頁)。互補序列或反義分子也可通過防止轉(zhuǎn)錄本與核糖體的結(jié)合以阻止mRNA的翻譯。
“肽核酸”是指一種反義分子或反基因物，其包含與以賴氨酸結(jié)尾的氨基酸殘基之肽骨架連接的寡核苷酸，寡核苷酸的長度至少為5個核苷酸。末端的賴氨酸賦予對組合物的溶解性。肽核酸優(yōu)先結(jié)合互補性單鏈DNA或RNA，終止轉(zhuǎn)錄的延伸，也可延長其在細胞中的半壽期(Nielsen，P．E．等人，(1993)抗腫瘤藥物研究(Anticancer Drug Res．)，853-63)。
本發(fā)明多肽及其片段、衍生物或類似物或表達它們的細胞可用作免疫原以產(chǎn)生其抗體。這些抗體可以是多克隆或單克隆抗體。本發(fā)明也包含了嵌和的、單鏈的和人源化的抗體以及Fab片段、或Fab表達文庫的產(chǎn)物。本領域已知的各種方法可用于這樣的抗體和片段的產(chǎn)生。
所產(chǎn)生的針對本發(fā)明多肽的抗體可通過直接將本發(fā)明的多肽注射給動物或?qū)⑵鋵雱游?最好不是人)而獲得。所得到的抗體可與多肽本身結(jié)合。用這種方法，甚至用只編碼本發(fā)明多肽的片段序列也能獲得結(jié)合整個天然多肽的抗體。然后，抗體可用來把多肽從表達它的組織中分離出來。
制備單克隆抗體可以用連續(xù)細胞系培養(yǎng)產(chǎn)生抗體的技術。例如，用雜交瘤技術(Kohle & Milstein自然256495-497，1975)、Trioma技術、人B細胞雜交瘤技術(Kozbor等人，今日免疫學(Immunology Today)472，1983)和EBV-雜交瘤技術產(chǎn)生人的單克隆抗體(Cole等人，單克隆抗體和癌癥治療(Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy)，Alan R．Liss，Inc．，77-96，1985)。將人恒定區(qū)和非人源的可變區(qū)結(jié)合的嵌合抗體可用現(xiàn)有技術產(chǎn)生(Morrison等人，美國國家科學院院報，1985，816851)。
單鏈抗體產(chǎn)生技術(美國專利4，946，778)適用于產(chǎn)生本發(fā)明的免疫原性多肽產(chǎn)物的單鏈抗體。轉(zhuǎn)基因動物也可用來表達本發(fā)明的免疫原性多肽產(chǎn)物的人源化抗體。
抗體也可用于設計針對體內(nèi)某一特殊部位的免疫毒素。如與本發(fā)明形成素蛋白有高親和性的單克隆抗體可與細菌或植物毒素(如白喉毒素，蓖麻蛋白，紅豆堿等)共價結(jié)合。一種通常的方法是用巰基交聯(lián)劑如SPDP，攻擊抗體的氨基，通過二硫鍵的交換，將毒素結(jié)合于抗體上，這種雜合抗體可用于中和該形成素蛋白陽性的細胞。
本發(fā)明還涉及一種篩選HFP的激動劑、拮抗劑及抑制劑的方法，包括使用本發(fā)明的多肽或其片段篩選多肽庫或藥物候選物文庫用于尋找有治療價值的能抑制或刺激HFP功能的分子。本發(fā)明多肽的激動劑、拮抗劑以及抑制劑的篩選可利用本領域普通技術人員周知的方法進行。本發(fā)明也提供了篩選藥物以鑒定提高(激動劑)或阻遏(拮抗劑)HFP活性的藥物的方法。激動劑提高HFP的生物功能，而拮抗劑阻止和治療與HFP的生物功能相關的紊亂。例如，哺乳動物細胞或表達HFP的膜制劑能在藥物的存在下與標記的HFP一起培養(yǎng)。然后測定藥物提高或阻遏此相互作用的能力。HFP蛋白的拮抗劑可以與人HFP蛋白結(jié)合并消除其功能，或是抑制人HFP蛋白的產(chǎn)生，或是與多肽的活性位點結(jié)合使多肽不能發(fā)揮生物學功能。在篩選化合物作為拮抗劑時，可以將此種新的人HFP蛋白加入生物分析測定中，通過測定此種新的人HFP蛋白此種新的人HFP蛋白化合物影響和其受體之間的相互作用來確定化合物是否是拮抗劑。以上述篩選化合物的同樣方法，可以篩選出起拮抗劑作用的分子。這些通過本發(fā)明方法獲得的HFP或其片段的激動劑、拮抗劑及抑制劑可如上所述配制成藥物組合物用于上述疾病的治療。
本發(fā)明將在下面的實施例中進一步描述。但是本發(fā)明并不局限于這些實施例。所有的份和量，除非另有說明都按重量計。
DNA的“消化”指用限制酶對DNA進行催化性切割，限制酶只作用于DNA序列的特定位點。這里所用的各種限制酶可從商業(yè)獲得，它們的反應條件、輔助因子和其它的要求按照一般技術人員所知的應用。為了分析需要，通常在大約20μl的緩沖溶液中加入1μg質(zhì)粒或DNA片段和大約2個單位的酶。為了分離DNA片段用于質(zhì)粒構(gòu)建，通常在一個較大的的體積中用20到250個單位的酶消化5到50μg的DNA。生產(chǎn)廠家會指明對特異限制酶合適的緩沖液和底物的量。通常所用的溫育時間大約是37℃一個小時，但根據(jù)廠家的指示可以有所改變。限制性消化之后直接在聚丙烯酰胺膠上進行電泳，分離出想要的片段。
根據(jù)所切割成的片段大小進行分離可用8％的聚丙烯酰胺凝膠(Goedde等人，核酸研究84057，1980)。
“連接”指在兩個雙鏈核酸片段間形成磷酸二酯鍵的過程。除非提供了別的方法，連接可以在已知的緩沖液和條件下進行，即每0．5mg約等摩爾量的用于連接的DNA片段加10個單位的T4 DNA連接酶(“連接酶”)。
除非另有說明，轉(zhuǎn)化均用Graham & Van der Eb病毒學(Virology)52456-457，1973中所描述的方法進行。實施例1HFP的cDNA的克隆用異硫氰酸胍／酚／氯仿一步法提取人胎腦總RNA。用Quik mRNA分離試劑盒(Qiegene)從總RNA中分離poly(A)mRNA。2μg poly(A)mRNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄形成cDNA．用Smart cDNA克隆試劑盒(購自Clontech)將cDNA片段定向插入到載體pBSK(+)(Clontech公司產(chǎn)品)的多克隆位點上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α形成cDNA文庫。共獲得3228個克隆。用雙末端循環(huán)反應測序試劑盒(Perkin-Elmer公司產(chǎn)品)和ABI377型自動測序儀(Perkin-ELmer公司產(chǎn)品)測定所有克隆的5′和3′末端的序列。將測定的cDNA序列與已有的公共DNA序列數(shù)據(jù)庫(GeneBank)進行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其中一個克隆0202g05的cDNA序列為新的DNA。通過合成一系列引物對此克隆所含的DNA序列進行雙向序列測定。計算機分析表明，該克隆所含的全長cDNA是一個新的DNA序列(Seq ID No 1)，從第440bp至1147bp有一個708bp的開放閱讀框架，編碼一個新的235個氨基酸殘基的多肽(Seq ID No 2)。我們將此蛋白質(zhì)命名為形成素蛋白(HFP)。實施例2用RT-PCR方法克隆HFP用胎腦細胞總RNA為模板，以oligo-dT為引物進行逆轉(zhuǎn)錄反應合成cDNA，用Qiagen的試劑盒純化后，用下列引物進行PCR擴增正向引物P1 5′-GGAGTAAGGATTTTATTGTA-3′(SEQ ID NO3)；反向引物P25′-AGTATCTTTATTCTTTTATT-3′(SEQ ID NO4)引物1為位于SEQ ID NO1的5’端的第1bp開始的正向序列；引物2為位于SEQ IDNO1的3’端的2155-2174bp的反向序列。
擴增反應的條件在50μl的反應體積中含有50mmol／L KCl，10mmol／L Tris-Cl，(pH8．5)，1．5mmol／L MgCl2，200μmol／L dNTP，25pmol引物，2．5U的Taq DNA聚合酶(Clontech公司產(chǎn)品)。在PE9600型DNA熱循環(huán)儀上按下列條件反應25個周期94℃ 30秒；55℃，30秒；72℃2分鐘。在RT-PCR時同時以模板空白為陰性對照。擴增產(chǎn)物QIAGEN試劑盒純化后，用TA克隆試劑盒連接到pCR載體上(Invitrogen)，并測定DNA序列。結(jié)果PCR產(chǎn)物的DNA序列與Seq ID No 1所示的1-2174bp完全相同。實施例3重組HFP在大腸桿菌系統(tǒng)中的表達、分離和純化根據(jù)SEQ ID NO1的編碼區(qū)序列，分別在HFP的基因的起始密碼子處及終止密碼子處設計了一對引物引物5’-CAGCCATGGATGCAGGTTCTAGGTTTGGTTC-3’(如SeqID No 5所示)引物5’-CCGAAGCTTTCTTTTACTCTCTCTTGTAGAA-3’(如SeqID No 6所示)此兩段序列分別含有NcoⅠ和HindⅢ酶切位點，其后分別為目的基因5’端和3’端的編碼序列，以含有全長目的基因的PBS質(zhì)粒為模板，進行PCR反應。NcoⅠ和HindⅢ的酶切位點相應于表達載體質(zhì)粒PET-28b(+)(Novagen公司提供Cat．No．69865．3)上的選擇性內(nèi)切酶位點。PCR反應條件為總體積50μl中含pBS-0414B11質(zhì)粒10pg、引物3和4分別為10pmmol、高等聚合酶混合物(Clontech公司產(chǎn)品)1μl。循環(huán)參數(shù)94℃ 20秒，60℃ 30秒，72℃ 2分鐘，共25個循環(huán)。用NcoRⅠ和HindⅢ分別對擴增產(chǎn)物和質(zhì)粒pET-28(+)進行雙酶切，分別回收大片段，并用T4連接酶連接。連接產(chǎn)物用氯化鈣法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入宿主菌大腸桿菌BL21(DE3)plySs，并用IPTG誘導進行表達。表達產(chǎn)物經(jīng)過超聲破菌，再上含6個組氨酸的親和層析柱(Pharmacia公司提供)，得到了純化的目的HFP蛋白。經(jīng)SDS-page電泳，在55．7KD處得到明顯的主條帶。將該條帶轉(zhuǎn)移至PVDF膜上用Edams水解法進行N-端氨基酸序列分析，結(jié)果N-端15個氨基酸與SEQ ID NO2所示的N-端15個氨基酸殘基完全相同。
用BamHI、HindⅢ消化pcDNA3載體，隨后將插入片段連接到pcDNA3載體。隨后用連接混合物轉(zhuǎn)化E．coli DH5α菌株。在含有Amp的LB培養(yǎng)皿上篩選轉(zhuǎn)化子，在補加Amp(100μg／ml)的LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)(O／N)含所需構(gòu)建物的克隆。抽提質(zhì)粒，用EcoRⅠ酶切鑒定插入片段大小及方向，測序驗證結(jié)果表明HFP蛋白的cDNA插入片段已正確裝入載體。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染是采用脂轉(zhuǎn)染法，用Lipofectin試劑盒(GiBco Life)進行的。轉(zhuǎn)染48小時后，經(jīng)2-3周的持續(xù)G418加壓篩選，收集細胞及細胞上清測定表達蛋白酶活力。去G418，連續(xù)傳代培養(yǎng)；對混合克隆細胞極限稀釋，選擇具有較高蛋白活性的細胞亞克隆。按常規(guī)方法大量培養(yǎng)上述陽性亞克隆。48小時后，開始收集細胞及上清，用超聲裂解方法破碎細胞。以含0．05％Triton的50mM Tris·HCl(pH7．6)溶液為平衡液及洗脫液，用經(jīng)預平衡的Superdex G-75柱收集上述蛋白的活性峰。再用50mMTris·HCl(pH8．0)平衡的DEAE-Sepharose柱，以含0-1M NaCl的50mMTris·HCl(pH8．0)溶液為洗脫液進行梯度洗脫，收集上述蛋白的活性峰。然后以PBS(pH7．4)為透析液對表達蛋白溶液進行透析。最后凍干保存。實施例5抗HFP的抗體的產(chǎn)生用多肽合成儀(PE-ABI)合成HFP特異性的多肽Met-Gln-Val-Leu-Gly-Leu-Val-Leu-Ala-Phe-Gly-Asn-Tyr-Met-Asn-Gly-Gly-Asn-Lys-Thr(SEQ．ID．NO7)。
將該多肽分別與血藍蛋白和牛血清蛋白耦和形成復合物，方法參見Avrameas．等人，免疫化學(Immunochemistry)，1969；643。用4mg上述血藍蛋白多肽復合物加上完全弗氏佐劑免疫家兔，15天后再用血藍蛋白多肽復合物加上不完全弗氏佐劑加強免疫一次。采用經(jīng)15μg／ml牛血清蛋白多肽復合物包被的滴定板做ELISA測定抗體的滴度。用蛋白A-Sepharose從抗體陽性的家兔血清中分離總IgG。將多肽結(jié)合與溴化氰活化的Sepharose 4B柱上，用親和層析法從總IgG中分離多肽抗體。免疫沉淀法證明純化的抗體可特異性的與HFP結(jié)合。實施例6cDNA克隆的同源檢索用本發(fā)明提供的人HFP的多核苷酸的序列及其編碼的蛋白序列在Genbank、swissport等數(shù)據(jù)庫進行同源檢索，用于檢索的程序為Blast(Basic local alignment search tool)(Altschul，S．F．等人，生物化學雜志，215403-10)。結(jié)果顯示HFP與雞的翼變形蛋白相同性為55％，相似性為75％(結(jié)果見圖1)；與人的KIAA0666蛋白相同性為31％，相似性為47％(結(jié)果見圖2)。
序列表(1)一般信息(i)申請人(A)姓名上海博道基因技術有限公司(B)街道中山北路1111號3號樓12層(C)城市上海(E)國家中國(F)郵政編碼200092(ii)發(fā)明名稱一種形成素蛋白及編碼它的多核苷酸序列(iii)序列數(shù)7(2)SEQ ID NO1的信息(ⅰ)序列特征(A)長度2174個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓撲類型線性(ⅱ)分子類型cDNA(ⅸ)特性(A)名稱／關鍵詞CDS(B)位置440．．1147(ⅹⅰ)SEQ ID NO1的序列描述1 GGAGTAAGGATTTTATTGTATGGAATGTACCAGTTTGTTTATCCATTCTCCAGTTGAGAA61 ACATTTGGGTAGTTTTTAGTTCCTGGTGATGACAGATAAAGCTGCTGCAAACATTCATGT121 GCATATTTTCGTGAGGATGTAGTTTTCATTTCACTTGAGTAAATGCAAAGCAGTGAGATT181 GCTGGGTCATACAAGAGCACAGTCAGACGAACTCGAAAAAATAGAAAAGCACGGCCGATC241 TTCCAAAGACAAGGAAAATGCCAAGTCTCTGGACAAACCTGAACAGTTCCTTTATGAACT301 GTCACTAATCCCCAACTTTTCAGAGCGAGTCTTTTGCATCCTGTTCCAGTCCACATTTTC361 AGAAAGCATTTGCTCAATTCGTCGCAAACTGGAATTACTACAGAAATTGTGTGAGACATT421 AAAAAATGGCCCAGGGGTTATGCAGGTTCTAGGTTTGGTTCTTGCCTTTGGCAACTACAT481 GAATGGAGGAAATAAGACTCGAGGACAGGCAGATGGCTTTGGATTAGACATTCTTCCAAA541 ACTGAAAGATGTCAAGAGCAGTGACAATAGCAGAAGCCTTTTGTCATATATTGTTTCGTA601 TTATCTCCGAAATTTTGATGAGGATGCTGGAAAAGAACAGTGCCTCTTTCCACTGCCAGA661 ACCCCAGGACCTTTTTCAGGCCTCACAGATGAAGTTTGAAGATTTTCAAAAAGATCTCAG721 AAAACTGAAGAAAGACTTGAAAGCCTGTGAAGTTGAAGCAGGGAAAGTATACCAGGTCTC781 CTCAAAAGAGCATATGCAGCCTTTCAAGGAAAACATGGAACAATTTATTATTCAAGCCAA841 AATTGACCAAGAGGCAGAGGAAAATTCACTGACAGAGACTCATAAATGCTTTTTGGAGAC901 CACGGCATATTTCTTCATGAAACCAAAACTTGGAGAGAAGGAGGTGTCCCCAAATGCTTT961 CTTCAGTATCTGGCATGAATTCAGCTCTGACTTTAAAGACTTCTGGAAGAAAGAGAACAA1021 ACTTCTTCTACAAGAGAGAGTAAAAGAAGCCGAAGAGGTGTGTAGACAGAAGAAAGGAAA1081 ATCACTTTATAAAATAAAACCAAGACATGACTCTGGAATTAAAGCAAAGATAAGCATGAA1141 AACTTGAGCAATGAAAAGCAGAATGAAAATGAGTCATTGCAACGACTTTCACAAAATTCA1201 GCTGACCTGAGAGTGGGAGGGAAACTACCGTCATTCTGCTCATGTTTCTTCTTGACCTCT1261 TGCGTAATCTTTTTGTTTTCTAGACAGTTCACTAATTGTTGAATTTTACTGTATATTCAT1321 ATAAAAATGCAAACGTACTAGACCAGTGGAGAATTTGACACCTTTTCTTTTTGTAAAAGT1381 TTATGGTATTATACCGATAGACCAAAACAGCATGTGTAAGAGGCAGTATCTGCACTAATT1441 CTCAACATGCTAAACATTAACTACAATTCACTGTTGTGAGAATATTCCTCGTCACAGCAA1501 AAACACTTTCCTTTCTACTGACAACCAGTCCTCCACATCACAGCATTTAGACATATGGGT1561 AAAATGTTATTTCTAGTGAATTGTTTGTATCAGTTTCATGTCTAAGTATAAATTTTCTAT1621 TTTAAAATTTAAGAACCGTTTATAATCAGTGCTTTCCCAACTCTTGGGTTGCTCTCCATA1681 ACTATGTATTTGTGAAAGAAAATGGTCATTTTTTTTTACTGAAGTCATATAATGACTTGG1741 GTCAGCTCGTAATGCATTGTGATGGTTTTGTATGAGCTGGGTGTTTTTTTCCATTACTTT1801 TAATGATCTTCGTTGCAAGTTATAGTTGTGGATAAAGGGGAGAATTTATTGCTCTTGCAA1861 ACCAATTATGGAAAGCAACTTAAGAAAACCAATGTTCTAAATCATAATTGTTTGTATTTA1921 TGTAAAGTATGGTCTCTTACTTTTTAGTTTGTAGTTTAAGTGCAAAGAAACAGTAGTGGT1981 TTTTTTTCTATTGTTTTGTAGTCTTCCTGTCCCCTTCAGTCCCTCCAGTGTGTATATTAC2041 CATTCTCCAATGAAATAATAGGGCATTTAACAAAGATCGCTATGTGCAATACTGTATTTA2101 GTGTTTCTATTTCAATTTTTCTAGGATGTTAATTTATATGAAAATAAAATGAATAATAAA2161 AGAATAAAGATACT(2)SEQ ID NO2的信息(ⅰ)序列特征(A)長度235個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型多肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO21 Met Gln Val Leu Gly Leu Val Leu Ala Phe Gly Asn Tyr Met Asn16 Gly Gly Asn Lys Thr Arg Gly Gln Ala Asp Gly Phe Gly Leu Asp31 Ile Leu Pro Lys Leu Lys Asp Val Lys Ser Ser Asp Asn Ser Arg46 Ser Leu Leu Ser Tyr Ile Val Ser Tyr Tyr Leu Arg Asn Phe Asp61 Glu Asp Ala Gly Lys Glu Gln Cys Leu Phe Pro Leu Pro Glu Pro76 Gln Asp Leu Phe Gln Ala Ser Gln Met Lys Phe Glu Asp Phe Gln91 Lys Asp Leu Arg Lys Leu Lys Lys Asp Leu Lys Ala Cys Glu Val106 Glu Ala Gly Lys Val Tyr Gln Val Ser Ser Lys Glu His Met Gln121 Pro Phe Lys Glu Asn Met Glu Gln Phe Ile Ile Gln Ala Lys Ile136 Asp Gln Glu Ala Glu Glu Asn Ser Leu Thr Glu Thr His Lys Cys151 Phe Leu Glu Thr Thr Ala Tyr Phe Phe Met Lys Pro Lys Leu Gly166 Glu Lys Glu Val Ser Pro Asn Ala Phe Phe Ser Ile Trp His Glu181 Phe Ser Ser Asp Phe Lys Asp Phe Trp Lys Lys Glu Asn Lys Leu196 Leu Leu Gln Glu Arg Val Lys Glu Ala Glu Glu Val Cys Arg Gln211 Lys Lys Gly Lys Ser Leu Tyr Lys Ile Lys Pro Arg His Asp Ser226 Gly Ile Lys Ala Lys Ile Ser Met Lys Thr(2)SEQ ID NO3的信息(ⅰ)序列特征(A)長度20個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲類型線性(ⅱ)分子類型寡核苷酸(ⅹⅰ)SEQ ID NO3的序列描述GGAGTAAGGATTTTATTGTA(2)SEQ ID NO4的信息(ⅰ)序列特征(A)長度20個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲類型線性(ⅱ)分子類型寡核苷酸(ⅹⅰ)SEQ ID NO4的序列描述AGTATCTTTATTCTTTTATT(2)SEQ ID NO5的信息(ⅰ)序列特征(A)長度31個堿基對(B)類型核酸
(C)鏈型單鏈(D)拓撲類型線性(ⅱ)分子類型寡核苷酸(ⅹⅰ)SEQ ID NO5的序列描述1CAGCCATGGATGCAGGTTCTAGGTTTGGTTC 3l(2)SEQ ID NO6的信息(ⅰ)序列特征(A)長度31個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲類型線性(ⅱ)分子類型寡核苷酸(ⅹⅰ)SEQ ID NO6的序列描述1 CCGAAGCTTTCTTTTACTCTCTCTTGTAGAA 31(2)SEQ ID NO7的信息(ⅰ)序列特征(A)長度20個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲類型線性(ⅱ)分子類型肽(ⅹⅰ)SEQ ID NO7的序列描述1 Met-Gln-Val-Leu-Gly-Leu-Val-Leu-Ala-Phe-Gly-Asn-Tyr-Met-Asn-Gly-Gly-Asn-Lys-Thr 20
權利要求
1．一種分離的多肽，其特征在于它包含具有SEQ ID NO．2所示的氨基酸序列的多肽、或其保守性變體、或其生物活性片段或衍生物。
2．如權利要求1所述的多肽，其特征在于它包含具有SEQ ID NO．2所示的氨基酸序列的多肽或其氨基酸變異不超過5％的衍生物。
3．如權利要求2所述的多肽，其特征在于它包含具有SEQ ID NO．2所示的氨基酸序列的多肽。
4．一種分離的多核苷酸，其特征在于，其包含一種選自下組的多核苷酸(a)編碼權利要求1、2或3所述多肽的多核苷酸；(b)與多核苷酸(a)互補的多核苷酸；和(c)與(a)或(b)有至少80％相同性的多核苷酸。
5．如權利要求4所述的多核苷酸，其特征在于所述多核苷酸包含編碼具有SEQ ID NO．2所示氨基酸序列的多核苷酸。
6．如權利要求4所述的多核苷酸，其特征在于所述多核苷酸的序列包含SEQ ID NO．1中440-1147位的序列或SEQ ID NO．1中1-2174位的序列。
7．一種含有權利要求4、5或6所述多核苷酸的重組載體。
8．如權利要求7所述的載體，其是質(zhì)粒、粘?；虿《据d體。
9．一種含有權利要求4、5或6所述多核苷酸或者含有權利要求7或8所述載體的宿主細胞。
10．一種具有人形成素蛋白活性的多肽的制備方法，其特征在于所述方法包括(a)在表達人形成素蛋白條件下，培養(yǎng)權利要求9所述的宿主細胞；和(b)從培養(yǎng)物中分離出具有人形成素蛋白活性的多肽。
11．一種能與人形成素蛋白特異性結(jié)合的抗體。
12．一種模擬、促進、拮抗或抑制人形成素蛋白活性或表達的化合物。
13．如權利要求12所述的化合物，其特征在于它是SEQ ID NO1所示的多核苷酸或其片段的反義序列。
14．一種檢測與權利要求1、2或3所述多肽相關的疾病或疾病易感性的方法，其特征在于該方法包括檢測所述多肽的表達的量，或者檢測所述多肽的活性，或者檢測編碼所述多肽的多核苷酸序列中的核苷酸變異。
15．如權利要求1、2或3所述多肽用于篩選促進人形成素蛋白活性的激動劑，或者篩選抑制人形成素蛋白活性的拮抗劑。
16．如權利要求4、5或6所述的多核苷酸或其片段作為引物用于核酸擴增反應，或者作為探針用于雜交反應，或者用于制造基因芯片或微陣列。
17．一種藥物組合物，其特征在于，它含有權利要求1、2、或3所述的多肽、權利要求4、5或6所述的多核苷酸或者權利要求12的化合物以及藥學上可接受的載體。
18．權利要求1、2或3所述的多肽或者權利要求4、5或6所述的多核苷酸或權利要求12的化合物在制備用于治療與胞內(nèi)蛋白人形成素蛋白異常表達相關的疾病的藥物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種分離的人形成素蛋白基因的多核苷酸序列及其編碼的多肽,以及制備這種多肽的方法。并且公開了通過檢測該基因核酸水平的突變及多肽水平的改變,檢測與該基因的核酸及其編碼的多肽異常有關的疾病的診斷方法,也公開了利用該基因的多核苷酸序列和多肽治療與該基因異常有關的疾病如腫瘤、各種發(fā)育紊亂所引起的疾病和多種免疫性疾病,如:癌癥,貧血,神經(jīng)系統(tǒng)疾病及各種獲得性和遺傳性疾病的用途和制備用于上述治療的藥物組合物中的用途。
文檔編號C12P21/02GK1294195SQ9912336
公開日2001年5月9日 申請日期1999年10月26日 優(yōu)先權日1999年10月26日
發(fā)明者毛裕民, 謝毅 申請人:上海博道基因技術有限公司