專利名稱：：丁內(nèi)銨鹽/巴豆甜菜堿－l－肉毒堿代謝基因及其在微生物法生產(chǎn)l－肉毒堿中的用途的制作方法本申請是申請?zhí)枮?4193701．1(國際申請?zhí)枮镻CT／EP94／03317)的申請的分案申請。本發(fā)明涉及丁內(nèi)銨鹽／巴豆甜菜堿-L-肉毒堿基因的重組遺傳物質(zhì)，含有該遺傳物質(zhì)的微生物和這類微生物在生物法生產(chǎn)L-肉毒堿中的用途。L-肉毒堿是一種在人體代謝過程中具有重要意義的天然、類維生素物質(zhì)。在脂肪酸的利用中，L-肉毒堿可以作為線粒體膜的遞質(zhì)并由此作為代謝能的轉(zhuǎn)運因子，因此是必需的。如果人體L-肉毒堿合成不足，就必須在飲食中進行添加以避免缺乏癥。特別是在仍無法合成其自身的L-肉毒堿的嬰兒的飲食中，L-肉毒堿是一種必需營養(yǎng)素。L-肉毒堿被用作藥物的有效成分。在肉毒堿缺乏癥和其它癥狀，特別是心臟病等疾病的治療方法中需補充L-肉毒堿。高等生物中的L-肉毒堿的生物合成是已知的，它在代謝中的其它功能和重要性是更加深入的研究課題。除了對于已描述的微生物、特別是Pseudomonas屬的代謝途徑(羥基酶催化，Lindstedt等，Biochemistry16，2181-2188，1977)，L-肉毒堿在某些微生物如Agrobacterium(土壤桿菌)／Rhizobium(根瘤菌屬)的代謝中被作為中間體合成。EP-A-O158194揭示了一種以例如γ-丁內(nèi)銨鹽為起始物的用微生物生產(chǎn)L-肉毒堿的方法，其中，利用常規(guī)微生物選擇法得到-L-肉毒堿?；?L-carnityl)脫氫酶陰性生產(chǎn)突變株，使用它已經(jīng)可以在20至30小時的反應(yīng)時間內(nèi)得到較好的L-肉毒堿產(chǎn)率。但是，利用常規(guī)的微生物方法不可能進一步優(yōu)化該方法的體積／時間比率。所以，本發(fā)明的目的是提供一種更為經(jīng)濟的生產(chǎn)L-肉毒堿的生物技術(shù)法，該方法可在大大縮短的反應(yīng)時間內(nèi)得到更好產(chǎn)率的L-肉毒堿。就γ-丁內(nèi)銨鹽／巴豆甜菜堿代謝的研究鑒定出5個基因，bcoA／B，bcoC，bcoD，bcoE和bcoT，它們編碼γ-丁內(nèi)銨鹽／巴豆甜菜堿代謝途徑中的酶并含于一個稱為丁內(nèi)銨鹽-L-肉毒堿操縱子(bco)的操縱子中。本文中，縮寫具有如下定義bcoA／Bγ-丁內(nèi)銨鹽-CoA(輔酶A)合成酶(bcoA)／巴豆甜菜堿-CoA合成酶(bcoB)基因，即，編碼既具有γ-丁內(nèi)銨鹽-CoA合成酶活性又具有巴豆甜菜堿-CoA合成酶活性的一種酶產(chǎn)物的單個基因。bcoCγ-丁內(nèi)銨鹽-CoA脫氫酶基因bcoD巴豆甜菜堿-CoA水解酶基因bcoEL-肉毒堿酰基脫氫酶基因bcoT轉(zhuǎn)運系統(tǒng)的潛在基因。已發(fā)現(xiàn)，bcoA／B，bcoC和bcoD基因的產(chǎn)物負責L-肉毒堿的生物合成，而bcoE編碼將代謝中間體L-肉毒堿?；鵆oA降解為甜菜堿的肉毒堿脫氫酶。bcoT可能是一個編碼丁內(nèi)銨鹽代謝轉(zhuǎn)運系統(tǒng)中的一種轉(zhuǎn)運蛋白的基因。該基因?qū)-肉毒堿的生物合成來說不是必需的。本發(fā)明因而涉及DNA片段和載體，它們含有編碼γ-丁內(nèi)銨鹽／巴豆甜菜堿代謝中用于L-肉毒堿合成的酶類的bcoC、bcoA／B和bcoD基因及可選的、另外的潛在轉(zhuǎn)運基因bcoT中一個或多個。本發(fā)明還涉及含有這些DNA片段和／或載體的微生物。本發(fā)明還涉及使用本發(fā)明中的微生物生產(chǎn)L-肉毒堿的生物技術(shù)方法。如同所定義的，本文的說明書和權(quán)利要求中所用的表示法bcoA／B，bcoC，bcoD和bcoT既包括編碼具有上述酶活性的γ-丁內(nèi)銨鹽／巴豆甜菜堿代謝的酶的野生型生物的基因，特別是丁內(nèi)銨鹽-L-肉毒堿操縱子基因，也包括它們的功能相當?shù)倪z傳變異體和突變體，即由野生型生物的基因衍生而來的基因，且其基因產(chǎn)物的生物活性基本不變。所以，這些功能相當?shù)倪z傳變異體和突變體包括，例如已知的遺傳密碼的簡并化過程中的堿基置換，例如為了將基因序列改變成某種進行表達的微生物所利用的優(yōu)選密碼子可人工生成的那些。變異體和突變體還包括了堿基或密碼子的刪除、插入和替換，這些作用的程度使它們產(chǎn)生的經(jīng)修飾過的基因的產(chǎn)物的生物功能基本不變。在此包括，例如與野生型序列高度同源，如同源性大于70％，并可在嚴緊雜交條件下，例如50至70℃的溫度和0．5至1．5M的鹽濃度，與野生型序列的互補序列雜交的基因序列。本文中的轉(zhuǎn)錄單位應(yīng)被理解為指基因以單個轉(zhuǎn)錄方向排列并在一般轉(zhuǎn)錄調(diào)控下被轉(zhuǎn)錄成一連續(xù)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的DNA序列，除基因外還含有基因表達所必需的遺傳調(diào)控元素，如啟動子和核糖體結(jié)合位點。以下附圖更為具體地說明了本發(fā)明。圖1顯示了γ-丁內(nèi)銨鹽-或巴豆甜菜堿-L-肉毒堿代謝途徑中的酶。圖2顯示了具有bco操縱子的取自Rhizobium／Agrobaterium的一段1．6kb的DNA片段的限制性酶切圖。圖3和圖4顯示了質(zhì)粒pVK1011和pAZ101；箭頭指示出bco基因和beu基因(甜菜堿利用基因；EP-A-O543344)的位置和方向。用黑體顯示質(zhì)粒的插入位置。圖5顯示了用于生產(chǎn)recA宿主株的可能起始物的質(zhì)粒pCC49。圖6顯示了質(zhì)粒pVK1011、pAZ101、pVKiooq和pAZ7的構(gòu)建圖。圖7顯示了一recA-宿主株的構(gòu)建圖。用于分離γ-丁內(nèi)銨鹽-／巴豆甜菜堿-L-肉毒堿代謝途徑中的基因bcoA／B，bcoC，bcoD和bcoT的起始物可以是進行如圖1所示的丁內(nèi)銨鹽和／或巴豆甜菜堿代謝的所有微生物。合適的菌株是Es-cherichia，Pseudomonas，Agrobacterium，Rhizobium和Agrobac-terium／Rhizobium屬的微生物，優(yōu)選的是后者。Agrobacterium／Rhizobium屬微生物的一個優(yōu)選實例是Agrobacterium／Rhizobiumsp．HK4(DSM2938)，EP-A-O158194中已對其有所描述。特別優(yōu)選使用那些呈肉毒堿脫氫酶陰性的微生物，即例如沒有或只有一個缺陷型的bcoE基因(后文中也被表示為bcoE′)。優(yōu)選的肉毒堿脫氫酶陰性微生物的實例是已在EP-A-O158194中有所描述的A-grobacterium／Rhizobiumsp．HK13(DSM2903)和HK1331b(DSM3225)，或在EP-A-O543344中有所描述的Agrobacterium／Rhizobiumsp．HK1349(DSM3944)。通過例如對微生物進行轉(zhuǎn)座子插入誘變并由此以合適的標記，如卡那霉素抗性標記γ-丁內(nèi)銨鹽-／巴豆甜菜堿-L-肉毒堿基因來在微生物的染色體上定位γ-丁內(nèi)銨鹽-／巴豆甜菜堿-L-肉毒堿代謝基因bcoA／B，bcoC，bcoD和bcoT。然后就可分離得到經(jīng)如此標記的不能再利用丁內(nèi)銨鹽代謝中間體的突變體。以此方式，可進行γ-丁內(nèi)銨鹽-／巴豆甜菜堿-L-肉毒堿代謝基因的鑒定并與它們的功能關(guān)聯(lián)起來。標記過的基因可以繼而被克隆并用合適的限制酶進行更為詳細的鑒定。然后，本發(fā)明的完整基因或DNA片段的分離可從一相應(yīng)的未誘變過的微生物的基因庫開始，通過已知方式用以上得到的誘變株的克隆基因與之雜交來從中分離和鑒定出bco基因或其片段。所得到的基因可被克隆入合適的載體并利用限制酶進行酶切分析。只知基因bcoA／B，bcoC和bcoD負責L-肉毒堿的生物合成。所以，只有這些基因的存在才是生產(chǎn)L-肉毒堿所必需的。根據(jù)選定的起始條件，例如選定的起始物或生產(chǎn)菌株，用于L-肉毒堿生產(chǎn)的DNA片段和載體可含有一個或多個L-內(nèi)毒堿生物合成基因。如有必要，除了基因bcoA／B，bcoC和bcoD，本發(fā)明的DNA片段和載體還可包括潛在轉(zhuǎn)運基因bcoT。L-肉毒堿?；摎涿富?，即bcoE基因的存在是不合要求的，因為有它存在時會發(fā)生L-肉毒堿的降解。但是，缺陷型bcoE基因(bcoE′)的存在是無妨的。最好，用于L-肉毒堿生產(chǎn)的基因，即bcoC，bcoA／B和bcoD和可選的潛在轉(zhuǎn)運基因bcoT一起位于一個DNA片段或載體分子中，例如最好在基因調(diào)控元素的常規(guī)的5＇-3′-方向下游，其順序為bcoC，bcoA／B和bcoD或bcoC，bcoA／B，bcoD和bcoT，并在如上所述的單個轉(zhuǎn)錄單位中，對應(yīng)于丁內(nèi)銨鹽-L-肉毒堿操縱子中的天然排列方式?？衫脠D2的限制性酶切圖的相應(yīng)部分來對這樣一個轉(zhuǎn)錄單位的bcoC，bcoA／B，bcoD和bcoT基因進行鑒定。bco基因的轉(zhuǎn)錄和表達最好在一個合適的、最好是強啟動子的調(diào)控下進行。啟動子的選擇取決于要求的表達情況，如要求是組成型表達還是誘導(dǎo)型表達，或進行表達的微生物。合適的啟動子是，例如天然丁內(nèi)銨鹽-L-肉毒堿操縱子中的啟動子Pbco。如果從例如具有缺陷型bcoE基因(bcoE′)的微生物中分離負責L-肉毒堿生物合成的bco基因，可較好地分離并克隆整個bco操縱子，而這些微生物的bcoE′基因及相關(guān)的基因調(diào)控元素可一起被分離及克隆，然后用在L-肉毒堿生產(chǎn)的合適微生物中。這種類型有一個如分離自例如A-grobacterium／Rhizobiumsp．HK1349的突變的bcoE基因的轉(zhuǎn)錄單位也可以利用圖2所示的限制性酶切圖來進行鑒定，如果bcoE的缺陷將只是因為例如一個點突變而與限制性酶切位置無關(guān)。另外，適用于表達的啟動子是，例如PNm、PS1啟動子(M．Labes等，Gene，89，37-46，1990)，trp啟動子(Amann等，Gene，25，167-178，1983)，lac啟動子(Amann等，Gene，25，167-178，1983)和tac啟動子，可使用所述的trp啟動子和lac啟動子的雜交體作為組成型或誘導(dǎo)型啟動子(Russell和Bennett，Gene，20，231-243，1982)。為了用于在合適的生產(chǎn)菌株中生產(chǎn)L-肉毒堿，包含所述的最好是一起存在于單個轉(zhuǎn)錄單位中的bco基因的本發(fā)明中的DNA片段最好借助于已知技術(shù)來插入已知的合適載體，特別是表達載體，如噬菌體或質(zhì)粒。所用的載體可以是自主和自身復(fù)制載體或所謂的整合載體。整合載體在本文中應(yīng)被理解為以質(zhì)粒為例，具有至少一段與接受株的基因組序列同源的序列并可通過該序列的同源重組在接受株的基因組中插入外源基因的載體。優(yōu)選使用自主和自身復(fù)制載體。根據(jù)所選載體的特性，L-肉毒堿生物合成酶的基因可在多種微生物中表達。合適的載體可以是具有特異性宿主譜的，也可以是具有廣宿主譜(較廣的宿主范圍)的，及上述整合載體。所用的廣譜宿主載體可以是所有適用于革蘭氏陰性菌的載體。這種廣譜宿主載體的實例為pVK100(Kneuf和Nester，Plasmid，8，45-54，1982)，pME285(Haas和Itoh，Gene，36，27-36，1985)和pKT240(Bagdasarian等，Gene，26，273-282，1983)或其衍生物?？捎玫膒VK100的衍生物為例如pVK1001，可用的pME285的衍生物為例如pAZ10，可用的pKT240的衍生物為例如pLO32(如EP-A-O543344中所述的)。用于Agrobacterium／Rhizobiumsp．株的整合載體可以是基于pACYC184或pBR322(Comai等，Plasmid，10，21-30，1983)而構(gòu)建的。以這種方式可得到質(zhì)粒pVK100q、pVK1011(圖3)、pAZ7beu、pAZ101(圖4)和pLO41。質(zhì)粒pVK100q于1993年11月16日保藏于GermanCollectionforMicroorganismsandCellCultureGmbH，D-38124Braunschweig，Mascheroderweg1b，Rhizobium／AgrobacteriumHK．1349中，保藏號為DSM8726。為了得到發(fā)酵用生產(chǎn)菌株，即L-內(nèi)毒堿生產(chǎn)菌株，必須將本發(fā)明的DNA片段或載體整合入合乎要求并適于表達的宿主菌株中。最好，為此目的用含有本發(fā)明DNA片段的載體轉(zhuǎn)化微生物。微生物可由此含有在載體分子上或與其自身的染色體整合的本發(fā)明DNA片段。合適的生產(chǎn)菌株可以是所有能由巴豆甜菜堿和／或γ-丁內(nèi)銨鹽生產(chǎn)L-肉毒堿而其L-肉毒堿降解(分解代謝)能力被完全或部分抑制的微生物。L-肉毒堿的降解能力被抑制的微生物是，例如肉毒堿脫氫酶陰性株，即由突變或缺失造成肉毒堿脫氫酶基因bcoE缺失的菌株，和／或L，D-肉毒堿消旋酶陰性和L-肉毒堿脫氫酶陰性的菌株。合適的宿主菌株，最好是具有高底物和起始物耐受性的菌株，例如Escherichia，Pserdomonas，Agrobacterium，Rhizobium、Coma-monas和Rhizobium／Agrobacterium屬的微生物，優(yōu)選的是后者。前文已對Rhizobium／Agrobacteriumsp．HK13、HK1331b和HK1349進行了描述，HK1349．4(如EP-A-O543344中所述)仍是特別優(yōu)選的。還發(fā)現(xiàn)，如果降低宿主菌株的重組能力，即重組傾向和重組頻率，可以進一步提高L-肉毒堿的產(chǎn)率。因為由此抑制了基于染色體同源性的與載體的重組。例如，可通過recA基因的定點突變(recA突變)以已知方式來降低宿主菌株的重組能力。特別優(yōu)選的重組能力受損的微生物是Rhizobium／Agrobacteriumsp．，例如后文中所描述的本發(fā)明的Rhizobium／AgrobacteriumHK1349．49菌株。所以，合適的生產(chǎn)菌株是，例如微生物Rhizobium／Agrobacteri-umHK1349、HK1349．4和HK1349．49，它們均含有質(zhì)粒pVK100q、pVK1001、pAZ7、pAZ7beu、pAZ101或pLO41。由一選擇培養(yǎng)基分離得到經(jīng)轉(zhuǎn)化的宿主菌株(生產(chǎn)株)，該培養(yǎng)基中加有菌株因具有一位于載體或DNA片段上的標記基因而具抗性的抗生素。如果將EP-A-O543344所述的微生物用作生產(chǎn)株，即其編碼甜菜堿利用的染色體基因是突變過的而以含有編碼甜菜堿利用的基因的質(zhì)粒所轉(zhuǎn)化的微生物，就甜菜堿的利用而言，它們也可被選用。就甜菜堿的利用而被選用的微生物實例為上述HK1349．4和HK1349．49，它們含有例如質(zhì)粒pLO41、pAZ101、pAZ7beu或pVK1011。使用含有本發(fā)明DNA片段或載體的微生物來進行L-肉毒堿的生物技術(shù)生產(chǎn)。L-肉毒堿的生產(chǎn)過程以已知方法進行，例如EP-A-O158，194中所述，在合適的碳源和氮源存在下，從γ-丁內(nèi)銨鹽開始。所用的碳源和氮源可以是例如谷氨酸鹽、乙酸鹽和甜菜堿或甘油和甜菜堿。如果是利用就甜菜堿的利用而被選用的微生物進行生物技術(shù)生產(chǎn)，甜菜堿被用作唯一的氮源。可利用類似于EP-A-O158194中所述的方法進行發(fā)酵和其后的分離。通過改變培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分，及通過改變發(fā)酵條件以適應(yīng)特定的微生物，可進一步提高L-肉毒堿的產(chǎn)率。將0．2ml的Tn5供體培養(yǎng)物E．coliS17-1／pSUP2021(R．Simon等，Biotechnology，1983，1，784-790〕與2ml受體培養(yǎng)物HK4混合并離心。在0．9％的生理鹽水(NaCl溶液)中洗滌細胞并重懸于100μl0．9％的生理鹽水中。在30℃，干的營養(yǎng)瓊脂上將供體株與受體株的接合進行過夜。將收獲的細胞稀釋倒平皿在受體(SmR)和轉(zhuǎn)座子(新霉素抗性(NmR))選擇培養(yǎng)基上。使用Sm(1000μg／ml)和Nm(100μg／ml)可在營養(yǎng)瓊脂上得到Tn5突變體。通過檢測其在基本培養(yǎng)基上并不象圖1那樣利用丁內(nèi)銨鹽代謝中間體，可進行突變體的表型鑒定。將連接混合物的等分物用于轉(zhuǎn)化E．coliED8654(Barek等，Mol，Gen．Genet．，146，199-207，1976)(Cohen等，1972，PNAS69，2110-2114)。在營養(yǎng)培養(yǎng)基中利用其氨芐青霉素(Ap100μg／ml)抗性和卡那霉素(Km25μg／ml)抗性篩選出轉(zhuǎn)化子。所有篩選出的雜交質(zhì)粒均帶有以Tn5標記的一個HK4插入片段。根據(jù)限制性酶切圖2以各種限制性酶進行這些插入體的酶切分析。限制性酶切圖的比較可確定一系列具有不同表型的Tn5突變體中的相同基因組片段中轉(zhuǎn)座子的插入。可通過利用均一酶切的DNA質(zhì)粒的Southernblot雜交(“基因技術(shù)方法”，(基因工程方法)，S．Bertram和H．G．Gassen，G．FischerVerlag編，1991，219f．)和其后的電泳分離來證實上述結(jié)果。所用的探針是得自轉(zhuǎn)座子突變體的克隆DNA的小片段。實施例3在lambda噬菌體中構(gòu)建HK4基因組庫為了使DNA可被lambda噬菌體包裝，其長度須為40-52kb并有一個“cos位點”。為了在lambda噬菌體中構(gòu)建HK4基因組庫，可使用長度為23kb的cos質(zhì)粒載體pVK100(Knauf和Naster，1982，Plasmid8，45-54)，由此可允許克隆17-29kb的DNA片段。以EcoRI消化pVK100，脫磷酸作用后并與被EcoRI部分消化的HK4DNA連接。通過測試0．58U／μgDNA或0．02U／μl反應(yīng)混合物的消化度來測定理想的部分消化HK4DNA的EcoRI濃度，反應(yīng)混合物中含8．5μg的HK4DNA。由瓊脂糖電泳分離出大于17kb的DNA片段。在含有100μgcos質(zhì)粒載體和400ng運載DNA的10微升(μl)體積溶液中進行連接反應(yīng)。根據(jù)PromegaBiotec．提供的方案和在其混合試劑中進行“體外包裝”，在25℃進行2小時。在轉(zhuǎn)染E．coliS17-1后，利用Km抗性篩選帶cos質(zhì)粒載體。一批可獲得5500個克隆(單個菌落)。將基因庫保藏于-70℃，各含1000克隆的5批冷凍培養(yǎng)基(營養(yǎng)酵母培養(yǎng)基，NYB，Oxoid和50％甘油)中。每批取50μl在10mlNYB中培養(yǎng)過夜來進行基因庫的擴增，并進行分份。具有合適的DNA序列的克隆表現(xiàn)出雜交信號并對每一種HK4突變體的缺陷型基因形成互補。來自各種突變體的DNA的雜交確定了一個10．6kb的DNA上的幾個丁內(nèi)銨鹽代謝基因的“簇”(圖2)。以常規(guī)方法進行克隆雜交(S．Bertram和H．G．Gassen，1991，ibid，221f．)。點雜交也以已知方法進行(S．Bertram和H．G．Gassen，1991，ibid，217f．)。通過與E．coliS17-1的接合將特定的表達載體pVK100HK-DNA引入實施例1中的Rhizobium／Agrobacteriumsp．HK4菌株中，其中含有不同代謝步驟(圖1)的突變體。根據(jù)對供體的脯氨酸(pro)營養(yǎng)缺陷型的彌補和載體的抗生素抗性(KmRTc(四環(huán)素)R)進行篩選。根據(jù)EP-A-O534344的實施例3，以已知方法在E．coliS17-1中進行克隆。為此，從HK1349基因庫中分離出10．6kb的bco操縱子并將它連接入pVK100。由此制得質(zhì)粒pVK100q(參見構(gòu)建圖，圖6)。在NYBKm(25μg／ml)培養(yǎng)基上在E．coliS17-1中進行篩選。根據(jù)實施例5所述的方法在HK突變體中鑒定正確插入。電泳分離被EcRI酶切的得自HK1349的DNA，并從凝膠上分離得10．6kb的片段。將分離得的片段連入EcRI酶切的pVK100載體。利用該雜交質(zhì)?；旌衔铮D(zhuǎn)化E．co1iS17-1(脯氨酸營養(yǎng)缺陷型)，并在含Km(25μg／ml)的營養(yǎng)培養(yǎng)基上進行篩選。在以0．2％(w／v)的丁內(nèi)銨鹽作為C源和N源的基本培養(yǎng)基上的含丁內(nèi)銨鹽-CoA脫氫酶陰性突變體(HK4V)的膜上進行“片狀雜交”以鑒定出由載體和帶bco操縱子的10．6kbDNA形成的正確的雜交質(zhì)粒克隆。在將正確的克隆接合轉(zhuǎn)入突變體后，可在對該C源的利用上與細胞互補。由此鑒定的克隆pVK100q可直接用作生產(chǎn)質(zhì)?；蜃鳛閹co操縱子的DNA片段保存以用于以后的次級克隆。6．2pAZ101、pAZ7、pVK1011和pVK100q，pLO41和pAZ7beu的構(gòu)建根據(jù)構(gòu)建6構(gòu)建pAZ101、pAZ7、pVK1011和pVK100q。將bco基因(10．6kb的EcoRI／EcoRI片段)插入pLO32(EP-A-O543344)來構(gòu)成pLO41，將beu基因(3kbPstI／PstI片段，EP-A-O543344)插入pAZ7(圖6)來構(gòu)成pAZ7beu質(zhì)粒。根據(jù)制造商提供的細節(jié)，相應(yīng)的限制性酶的用量為3-5U／μgDNA。將bco基因插入pVK100(Knauf和Nester，ibid)來構(gòu)成pVK100q。由質(zhì)粒pVK100s(EP-A-O543344)的EcoRI缺失克隆來制備起始質(zhì)粒pVK100sl(構(gòu)建圖6)。根據(jù)測得的限制性酶切圖，一個3．1kb的BglⅡ-NruⅠ酶切片段，該片段在Southernblot雜交中被recA探針標記過，被克隆入BglⅡ-HindⅢ酶切過的載體pWS233。pWS233是一個“基因置換”載體，其描述可見W．Selbitschka等，Ap-pl．Microbiol．Biotechnol．38，1993，615-618。得自Tn5(pSUP2021，R．Simon等，Biotechnology，1，1983，ibid)的、編碼Km抗性的一段XhoⅠDNA片段被克隆入pCC45質(zhì)粒的XhoⅠ酶切位置，由此制得pCC49質(zhì)粒。與W．Selbitschka等，1993，ibid中所述的相似，如下進行“基因置換”將3ml指數(shù)期的HK1349．4培養(yǎng)物與1ml指數(shù)期的供體培養(yǎng)物(S17-1／pCC49)混合，離心并用0．9％的NaCl溶液洗滌。將細胞在30℃，在50μlNYB營養(yǎng)瓊脂中培養(yǎng)過夜。然后將重懸于0．9％的NaCl溶液中的細胞適當稀釋后涂布在選擇培養(yǎng)基上。用Sm(100μg／ml)和Nm(150μg／ml)，在營養(yǎng)瓊脂上可得到Sm抗性受體HK1349．4轉(zhuǎn)移接合體，它們對復(fù)合培養(yǎng)基中5％的葡萄糖敏感，這與“置換”載體上的sacRB基因有關(guān)。將選得的轉(zhuǎn)移接合體在營養(yǎng)瓊脂上不加選擇壓力地進行培養(yǎng)后，可獲得低頻(10-8雙重組。約1周后，可分離出可耐受培養(yǎng)基中5％葡萄糖的細胞，它們?nèi)匀痪哂蠳m抗性，但已變得對艮它霉素敏感(載體標記)。這種表現(xiàn)型證實了等位的標記交換并指示出其為HK1349．4的recA突變體?？梢杂^察到典型的recA突變體的表現(xiàn)型(如UV敏感性等)。在由此制得的HK1439．49菌株中，帶有同源序列的質(zhì)粒插入染色體的傾向(同源重組)顯然被降低了。所以，這種菌株極適合作為實施例6．2中的雜交質(zhì)粒的宿主。所用的生產(chǎn)菌是本發(fā)明的HK1349．4／pLO41、HK1349．4／pVK1011、HK1349．4／pAZ7beu、HK1349．4／pAZ101、HK1349／pVK100q和HK1349／pAZ7。結(jié)果以與從EP-A-O543344中已知的HK13的衍生物HK1349(DSM3944)和HK1349．4的比較形式列于表1。用Bergmeyer(H．K．Bergmeyer，1974，Methodenderenzyma-tischenAnalyse(酶分析法)，VerlagChemie，Weinheim，1810f．)中描述的DTNB(5，5′-二硫二(2-硝基苯甲酸酯)法來測得由γ-丁內(nèi)銨鹽開始的L-肉毒堿的形成。表1<tablesid="table1"num="001"><table>菌株MM培養(yǎng)基和甘油比活性(nmol／l／h／OD)HK1349(非本發(fā)明)HK1349／pVK100qHK1349／pZA7加甜菜堿加甜菜堿加甜菜堿0．240．360．49HK1349(非本發(fā)明)HK1349．4(非本發(fā)明)HK1349．4／pLO41加L-谷氨酸鹽加L-谷氨酸鹽加L-谷氨酸鹽0．140．110．29HK1349(非本發(fā)明)HK1349．4／pVK1011HK1349．4／pAZ7beuHK1349／pZA101加氨加甜菜堿加甜菜堿加甜菜堿0．120．540．471．08</table></tables>權(quán)利要求1．生產(chǎn)L-肉毒堿的生物學方法，它包括a)在合適的碳源和氮源存在下，利用以表達載體轉(zhuǎn)化的微生物發(fā)酵生產(chǎn)巴豆甜菜堿和／或γ-丁內(nèi)銨鹽，所述載體含有一段DNA片段，所述的DNA片段含有生物合成L-肉毒堿基因bcoC、bcoA／B和bcoD中一個或多個，所述的DNA片段是插入在質(zhì)粒pVK100q中的一段10．6kb的EcoRI片段，該質(zhì)粒保藏在根瘤菌／農(nóng)桿菌HK1349中，保藏號為DSM8726，其中bcoC編碼γ-丁內(nèi)銨鹽-CoA脫氫酶，bcoA／B編碼γ-丁內(nèi)銨鹽／巴豆甜菜堿-CoA合成酶，bcoD編碼巴豆甜菜堿水解酶；和b)分離產(chǎn)生的L-肉毒堿。2．根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中的DNA片段還包含編碼γ-丁內(nèi)銨鹽／巴豆甜菜堿代謝中潛在轉(zhuǎn)運蛋白的基因bcoT。3．根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中DNA片段所含的基因的排列順序為bcoC、bcoA／B和bcoD，或者是bcoC、bcoA／B、bcoD和bcoT。4．根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中的DNA片段與表達所需的基因調(diào)控元件操作性連接。5．根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中的基因調(diào)控元件包含天然bco操縱子的啟動子Pbco。6．根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中DNA片段如圖2所示。7．根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中的載體選自pVK100q、pVK1011和pAZ101。8．根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中的載體是pVK100q，該質(zhì)粒保藏在保藏號為DSM8726的根瘤菌／農(nóng)桿菌HK1349中。9．根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中的微生物屬于根瘤菌／農(nóng)桿菌屬。10．根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中的微生物是保藏號為DSM8726的根瘤菌／農(nóng)桿菌HK1349。11．微生物用于發(fā)酵生產(chǎn)巴豆甜菜堿和／或γ-丁內(nèi)銨鹽的用途，所述的微生物被表達載體轉(zhuǎn)化，所述載體含有一段DNA片段，所述的DNA片段含有生物合成L-肉毒堿基因bcoC、bcoA／B和bcoD中一個或多個，所述的DNA片段是插入在質(zhì)粒pVK100q中的一段10．6kb的EcoRI片段，該質(zhì)粒保藏在根瘤菌／農(nóng)桿菌HK1349中，保藏號為DSM8726，其中bcoC編碼γ-丁內(nèi)銨鹽-CoA脫氫酶，bcoA／B編碼γ-丁內(nèi)銨鹽／巴豆甜菜堿-CoA合成酶，bcoD編碼巴豆甜菜堿水解酶。全文摘要本發(fā)明描述了含有L－肉毒堿生物合成的酶的編碼基因的DNA片段和載體,含有這些DNA片段或載體的微生物以及使用所述微生物的L－內(nèi)毒堿的微生物生產(chǎn)法。文檔編號C12N15/52GK1282791SQ9912070公開日2001年2月7日申請日期1994年10月7日優(yōu)先權(quán)日1993年10月8日發(fā)明者T·齊默爾曼,J·韋爾朗申請人:瑞士隆薩股份公司