專利名稱：用新的復性方法制備組織型纖溶酶原激活劑重組異構體的制作方法
技術領域：
本發明屬醫藥領域中的重組蛋白質藥物。
組織型纖溶酶原激活劑(t-PA)的39KD重組異構體(簡稱r-PA)是t-PA的一種分子改造衍生物。它包含有野生型t-PA的Kringle 2結構域和蛋白酶結構域，不含糖基化位點。r-PA具有t-PA的溶血栓活性，但半衰期延長，并且出血副作用小，比t-PA具有使用方便、安全、經濟的優勢，是取代t-PA的理想溶血栓藥物。
因為r-PA不含糖基化位點，可以用大腸桿菌來表達。我們構建了高效表達r-PA的工程菌以表達r-PA。由于r-PA含有十對二硫鍵，用細菌表達的r-PA形成包含體形式，溶解變性后用常規方法復性很難正確折疊和復性成活性形式。這是由于組成十對二硫鍵的20個半胱氨酸在復性時錯誤配對造成的。為了提高變性r-PA的復性率，我們發明了用二硫鍵異構酶(PDI)促進復性的生產工藝，我們在r-PA的復性體系中加入重組人二硫鍵異構酶(rhPDI)，使錯配的二硫鍵打開重新形成正確的二硫鍵，從而提高復性率，最終提高r-PA的產率，降低成本，并可應用于工業化生產。
本發明原理是二硫鍵異構酶PDI可以特異性地作用于蛋白分子中錯配的二硫鍵，打開該錯配二硫鍵，并促進其形成正確配對的二硫鍵，完成分子結構重排，形成正確活性形式，達到復性目的。
本發明的目的使用二硫鍵異構酶催化變性的r-PA形成正確配對的二硫鍵，從而復性成正確的有活性的分子構型。這樣可提高r-PA的復性率，降低異構體比例，簡化后續純化步驟，由此提高r-PA的產率，降低生產成本。
技術方案用工程菌表達r-PA→菌體破碎→包含體分離→鹽酸胍變性溶解→在復性體系中按一定比例加入重組人PDI以催化r-PA的復性→脫鹽→親和層析→陽離子交換層析，經上述步驟，即可制備得到純度大于95％，比活性達到6×105IU/mg的r-PA。
最佳實施例r-PA復性體系如下50mMTris,pH7～10，氧化型谷胱甘肽10～1mM，還原型谷胱甘肽1～0.1mM,r-PA蛋白濃度0.01～1mg/ml。在此復性體系中加入重組人二硫鍵異構酶PDI，使r-PA與PDI的摩爾比為100∶1～10∶1。在加入PDI的復性體系中進行復性，r-PA的復性率比不加PDI時有顯著提高，二硫鍵錯配造成的異構體比例大大降低，r-PA的終產率也相應提高。
r-PA制備方法如下將表達后的r-PA工程菌菌體離心收集，懸浮于50mM Tris,pH8.0，超聲破碎并10000×g，30分鐘離心后制得r-PA包含體。包含體用6M鹽酸胍，50mM Tris,100mMDTT充分溶解后，10000×g，30分鐘離心，取上清，即為變性的r-PA。
將變性的r-PA逐滴滴入加入PDI的復性體系中，使得r-PA終濃度達到0.1mg/ml，室溫下放置過夜。將上述復性液超濾脫鹽后，用親和層析柱純化，再經過CM-Sepharose柱層析(平衡緩沖20mM PB,pH6.0,0～1MNaCl線性梯度洗脫)，得到純度＞95％，比活性＞6×105IU/mg的r-PA。
本發明的優點本發明提供了一種用PDI促進變性r-PA折疊復性以制備r-PA的新型工藝方法。它與國外傳統的r-PA生產工藝相比具有以下特點①變性r-PA復性率高。②復性體系中r-PA蛋白濃度提高，復性體積減少，操作方便，節省試劑。③異構體比例低，簡化了后續純化步驟。④提高r-PA產率，降低生產成本。上述優勢使本發明具有明顯的技術創新性與工藝先進性，成本降低，更適合于工業化生產r-PA。
權利要求
1.用一種新的復性方法制備組織型纖溶酶原激活劑39KD重組異構體(r-PA)。其特征在于在變性r-PA的復性體系中加入二硫鍵異構酶，以提高r-PA的復性率。
2.組織型纖溶酶原激活劑39KD重組異構體(r-PA)的制備工藝，其特征在于經過工程菌表達→菌體破碎→包含體分離→變性→PDI催化復性→脫鹽→親和層析→陽離子交換層析等步驟完成。
3.如權利要求2所述的組織型纖溶酶原激活劑39KD重組異構體(r-PA)的變性，其特征在于用鹽酸胍作為變性劑，變性體系含6M鹽酸胍，20～100mM Tris,10～100mM DTT,pH7～10。
4.如權利要求2所述的PDI催化的組織型纖溶酶原激活劑39KD重組異構體(r-PA)的復性，其特征在于PDI為重組人PDI或其它來源的PDI,r-PA與PDI的摩爾比為100∶1～10∶1。
5.如權利要求2所述的陽離子交換層析，其特征在于采用CM-Sepharose陽離子交換柱，洗脫條件是0～1M NaCl,pH7～10，最佳洗脫濃度是0.2～0.3M NaCl。
全文摘要
本發明公開了一種用二硫鍵異構酶PDI促進變性的組織型纖溶酶原激活劑39KD重組異構體(r－PA)正確折疊并提高其復性率的新型方法。在r－PA的復性體系中加入一定比例的PDI,可以使r－PA中錯誤配對的二硫鍵打開并形成正確的二硫鍵,從而提高復性率,降低異構體比例,簡化后續純化工藝,提高r－PA產率。
文檔編號C12N15/09GK1299822SQ9912041
公開日2001年6月20日 申請日期1999年12月13日 優先權日1999年12月13日
發明者王革 申請人:王革