一種新的人膜轉(zhuǎn)移蛋白及其編碼序列的制作方法

專利名稱：一種新的人膜轉(zhuǎn)移蛋白及其編碼序列的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及細(xì)胞學(xué)、免疫學(xué)、腫瘤學(xué)和神經(jīng)生理學(xué)領(lǐng)域，更具體的，本發(fā)明涉及一種新的人膜轉(zhuǎn)移蛋白hRab18及其核酸序列。本發(fā)明還涉及該蛋白和核酸序列的制備方法和用途。
哺乳動物細(xì)胞的Rab家族是Ras超家族的成員之一，它包括40多個家族成員。Rab蛋白在真核細(xì)胞的膜泡分泌和內(nèi)吞途徑中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)和指導(dǎo)作用。Rab蛋白的羧基端在異戊二烯轉(zhuǎn)移酶的作用下發(fā)生雙重異戊二烯化，使其具有與膜相聚集的功能。Rab蛋白有GTP水解酶活性，可分別與GTP和GDP結(jié)合，根據(jù)其分子量小，單體結(jié)構(gòu)等特征，又被稱為“小分子GTP激酶”。Rab蛋白中GTP結(jié)合與GTP水解為GDP之間的循環(huán)形成了一種分子開關(guān)機制，即通過鳥嘌呤核苷酸不同形式的結(jié)合形成不同的激酶構(gòu)象－Rab蛋白的活性形式和非活性形式。Rab作為細(xì)胞內(nèi)膜泡運輸過程中膜泡融合的調(diào)節(jié)因子，需要有精細(xì)的定位，每一Rab家族成員均有特定的細(xì)胞內(nèi)膜定位。這種復(fù)雜性與哺乳動物細(xì)胞類型的多樣性、膜泡運輸路線的多樣性緊密相關(guān)。作為一大的蛋白家族，Rab通過其不同的家族成員而發(fā)揮其廣泛的生物學(xué)功能和臨床應(yīng)用價值，主要有以下幾個方面(a)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的膜泡運輸主要表現(xiàn)在(1)細(xì)胞內(nèi)運輸膜泡的形成是受精細(xì)調(diào)控的，只有當(dāng)膜泡中含有停泊(docking)融合所需的物質(zhì)時，出芽反應(yīng)才能發(fā)生，運輸膜泡的形成需要Rab的參與(Pfeffer，S.R et al，Curr.Biol.1994，6，522-526；Nuoffer，C et al，Annu.Rev.Biochem.1994，63，949-990)。(2)不同的Rab蛋白定位于不同的細(xì)胞內(nèi)膜區(qū)域，分別指導(dǎo)著不同路線的膜泡運輸反應(yīng)。如Rab6參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與高爾基體之間的膜泡運輸(Beranger F et al，Mol Cell Biol 1994 Jan；14(1)744-58)；Rab30則與高爾基體的堆積有關(guān)(de Leeuw HP et al，Br J Haematol 1998Oct；103(1)15-9)。
(b)影響細(xì)胞骨架的組成對Rab6的研究發(fā)現(xiàn)由肌動蛋白，微管組成的細(xì)胞骨架與Rab調(diào)節(jié)的膜泡運輸之間有一定的聯(lián)系(Echard A et al，Science 1998 279，580-585)；Rab3A-GTP調(diào)節(jié)的突觸膜泡的胞吐現(xiàn)象與肌動蛋白構(gòu)成的細(xì)胞骨架之間也有某種不確定關(guān)系(Kato M et al，J.Biol.Chm.1996 271，31775-31778)。
(c)對信號傳導(dǎo)有重要的調(diào)節(jié)作用Rab3a和Rab15均在腦中特異表達(dá)，它們分布于神經(jīng)元和神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞中，通過調(diào)節(jié)神經(jīng)末梢膜的流動性而在神經(jīng)遞質(zhì)的釋放過程中發(fā)揮重要的作用(Burns ME et al，J Gen Physiol 1998 Feb；111(2)243-55)。
(d)與多種免疫疾病相關(guān)(1)賽塞莉綜合癥(Sezary syndrome，紅皮病)是一種皮膚T細(xì)胞淋巴瘤，表現(xiàn)為泛發(fā)性剝脫性紅皮病，劇烈瘙癢，外周淋巴結(jié)病以及皮膚、淋巴結(jié)和外周血中出現(xiàn)含染色質(zhì)過多的異常單核細(xì)胞。在17個賽塞莉綜合癥病人中，有13個病人其外周單核細(xì)胞中有Rab2蛋白的過量表達(dá)(Culine S et al，JBiol Chem 1993 Jun5；268(16)11548-52)；(2)在實體瘤病人的治療過程中，發(fā)現(xiàn)其外周單核細(xì)胞中Rab2蛋白的過量表達(dá)隨治療過程發(fā)生改變。對覃狀真菌病和實體瘤病人調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)，Rab2蛋白的過量表達(dá)與機體內(nèi)的免疫事件有關(guān)。(Culine Set al，Eur J Cancer 1994；30A(5)670-4)Culine S et al，Nouv Rev Fr Hematol 1993Feb；35(1)41-4；Culine S et al，Cancer Res 1992 Jun 1；52(11)3083-8)(3)謝迪亞克-東綜合癥(Chediak-Higashi syndrome)是一種常染色體隱性全身性疾病，伴隨癥狀有眼皮膚白化病、出現(xiàn)大量白細(xì)胞包涵體(巨大溶酶體)、身體多種器官組織細(xì)胞浸潤和各類血細(xì)胞減少，以及可能發(fā)生惡性淋巴瘤。推測該疾病是由于細(xì)胞內(nèi)膜泡運輸方面的缺陷引起的。Rab4蛋白已被確定與謝迪亞克-東綜合癥有關(guān)。(Ikeda Het al，Biochem Mol Biol Int 1996 Nov；40(4)647-51)(4)近期研究表明，Rab4在小鼠(Mus musculus)A20 B細(xì)胞株中對受體調(diào)節(jié)的抗原作用途徑起到關(guān)鍵的控制作用。(Lazzarino DA et al，J Exp Med 1998 Nov 16；188(10)1769-74)(e)調(diào)節(jié)機體代謝GTP結(jié)合的Rablb的突變體可抑制新生的低密度脂蛋白(LDL)受體在細(xì)胞內(nèi)的正常運輸及成熟(Castellano.F et al，J.Recept.Transduct.Res.1995 Sep-Dec；15(7-8)847-62)，而低密度脂蛋白的異常與動脈硬化及冠心病密切相關(guān)。
Rab18主要表達(dá)于腎中央小管細(xì)胞(renal proximal tubule cell)的頂面(apicalside)以及腸上皮細(xì)胞的頂面和基底面(Genomics 1997 45，623-625)。小鼠Rab18主要與腎中央小管細(xì)胞頂面細(xì)胞器的功能有關(guān)。研究顯示，Rab18出現(xiàn)在細(xì)胞膜下的衣被結(jié)構(gòu)中，這說明它和細(xì)胞膜與早期內(nèi)吞體之間的運輸有關(guān)(J.Cell Sci.1994107，3437-3448)。在神經(jīng)元細(xì)胞中，早期內(nèi)吞體被認(rèn)為介導(dǎo)了突觸泡的運輸(Curr.Opin.Cell Biol.1991 3，654-660)，而在上皮細(xì)胞中則介導(dǎo)了細(xì)胞間轉(zhuǎn)運體的產(chǎn)生(J.Cell Biol.1992 116，577-583)。但是Rab18的功能并不限于頂面運輸機制，它亦與基底面的運輸有關(guān)(J.Cell Sci.1994 Dec；107(Pt 12)3437-3448)。
然而在本申請之前，尚沒有公開或報道過本發(fā)明所涉及的人hRab18蛋白。
本發(fā)明的第一目的就是提供一種新的人基因序列hRab18(Genbank AccessionNo.AF136974)，該基因是一個Ras蛋白相關(guān)基因。
本發(fā)明的第二目的是提供一種新的人蛋白hRab18。
本發(fā)明的第三目的是提供一種利用重組技術(shù)生產(chǎn)上述的新的人hRab18蛋白和核酸序列的方法。
本發(fā)明還提供了這種hRab18蛋白多肽和編碼序列的應(yīng)用。
在本發(fā)明的一個方面，提供了一種分離出的DNA分子，該分子包括編碼具有人hRab18蛋白質(zhì)活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.6中從核苷酸第6-623位DNA分子的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度嚴(yán)緊條件下與SEQ ID NO.6中從核苷酸第6-623位的核苷酸序列雜交。較佳地，所述的序列編碼具有SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列的多肽。更佳地，所述的序列具有SEQ ID NO.6中從核苷酸第6-623位的核苷酸序列。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種分離出的人hRab18蛋白質(zhì)多肽，它包括具有SEQ ID NO.7氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。較佳地，該多肽是具有SEQ ID NO.7序列的多肽。
在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種載體，它包含上述的DNA分子。
在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種用上述載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。在一個實例中該宿主細(xì)胞是大腸桿菌；在另一實例中，該宿主細(xì)胞是真核細(xì)胞。
在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種產(chǎn)生具有人hRab18蛋白質(zhì)活性的多肽的方法，該方法包括(1)將編碼具有人hRab18蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地連于表達(dá)調(diào)控序列，形成人hRab18蛋白表達(dá)載體，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.6中從核苷酸第6-623位的核苷酸序列有至少70％的同源性；(2)將步驟(1)中的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞，形成人hRab18蛋白的重組細(xì)胞；(3)在適合表達(dá)人hRab18蛋白多肽的條件下，培養(yǎng)步驟(2)中的重組細(xì)胞；(4)分離出具有人hRab18蛋白活性的多肽。
較佳地，在該方法中使用的核酸序列具有SEQ ID NO.6中第6-623位的序列。
本發(fā)明還提供了與hRab18蛋白多肽特異性結(jié)合的抗體。
在本發(fā)明中，“分離的”、“純化的”或“基本純的”DNA是指，該DNA或片段已從天然狀態(tài)下位于其兩側(cè)的序列中分離出來，還指該DNA或片段已經(jīng)與天然狀態(tài)下伴隨核酸的組份分開，而且已經(jīng)與在細(xì)胞中伴隨其的蛋白質(zhì)分開。
在本發(fā)明中，術(shù)語“人hRab18蛋白(或多肽)編碼序列”指編碼具有人hRab18蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO.6中第6-623位核苷酸序列及其簡并序列。該簡并序列是指，位于SEQ ID NO.6序列的編碼框第6-623位核苷酸中，有一個或多個密碼子被編碼相同氨基酸的簡并密碼子所取代后而產(chǎn)生的序列。由于密碼子的簡并性，所以與SEQ ID NO.6中第6-623位核苷酸序列同源性低至約70％的簡并序列也能編碼出SEQ ID NO.7所述的序列。該術(shù)語還包括能在中度嚴(yán)緊條件下，更佳的在高度嚴(yán)緊條件下與SEQ ID NO.6中從核苷酸第6-623位的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。該術(shù)語還包括與SEQ ID NO.6中從核苷酸第6-623位的核苷酸序列的同源性至少70％，較佳地至少80％，更佳地至少90％，最佳地至少95％的核苷酸序列。
該術(shù)語還包括能編碼具有與人hRab18相同功能的蛋白的、SEQ ID NO.6中開放閱讀框序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(通常為1-90個，較佳地1-60個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加數(shù)個(通常為60個以內(nèi)，較佳地為30個以內(nèi)，更佳地為10個以內(nèi)，最佳地為5個以內(nèi))核苷酸。
在本發(fā)明中，“基本純的”蛋白質(zhì)或多肽是指其至少占樣品總物質(zhì)的至少20％，較佳地至少50％，更佳地至少80％，最佳地至少90％(按干重或濕重計)。純度可以用任何合適的方法進(jìn)行測量，如用柱層析、PAGE或HPLC法測量多肽的純度?；炯兊亩嚯幕旧喜缓烊粻顟B(tài)下的伴隨其的組分。
在本發(fā)明中，術(shù)語“人hRab18蛋白或多肽”指具有天然人hRab18蛋白活性的SEQ ID NO.7序列的多肽。該術(shù)語還包括具有與人hRab18相同功能的、SEQID NO.7序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(通常為1-50個，較佳地1-30個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個(通常為20個以內(nèi)，較佳地為10個以內(nèi)，更佳地為5個以內(nèi))氨基酸。例如，在本領(lǐng)域中，用性能相近或相似的氨基酸進(jìn)行取代時，通常不會改變蛋白質(zhì)的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個氨基酸通常也不會改變蛋白質(zhì)的功能。該術(shù)語還包括hRab18蛋白的活性片段和活性衍生物。
本發(fā)明人hRab18多肽的變異形式包括同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導(dǎo)突變體、在高或低的嚴(yán)緊條件下能與人hRab18 DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用抗人hRab18多肽的抗血清獲得的多肽或蛋白。本發(fā)明還提供了其他多肽，如包含人hRab18多肽或其片段的融合蛋白。除了幾乎全長的多肽外，本發(fā)明還包括人hRab18多肽的可溶性片段。通常，該片段具有人hRab18多肽序列的至少約10個連續(xù)氨基酸，通常至少約30個連續(xù)氨基酸，較佳地至少約50個連續(xù)氨基酸，更佳地至少約80個連續(xù)氨基酸，最佳地至少約100個連續(xù)氨基酸。
在本發(fā)明中，“hRab18保守性變異多肽”指與SEQ ID NO.7的氨基酸序列相比，有至多10個，較佳地至多8個，更佳地至多5個氨基酸被性質(zhì)相似或相近的氨基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據(jù)表1進(jìn)行替換而產(chǎn)生。表1
發(fā)明還包括人hRa18蛋白或多肽的類似物。這些類似物與天然人hRab18多肽的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導(dǎo)的遺傳變異體。誘導(dǎo)變異體可以通過各種技術(shù)得到，如通過輻射或暴露于誘變劑而產(chǎn)生隨機誘變，還可通過定點誘變法或其他已知分子生物學(xué)的技術(shù)。類似物還包括具有不同于天然L-氨基酸的殘基(如D-氨基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的類似物。應(yīng)理解，本發(fā)明的多肽并不限于上述例舉的代表性的多肽。
修飾(通常不改變一級結(jié)構(gòu))形式包括體內(nèi)或體外的多肽的化學(xué)衍生形式如乙?；螋然Ｐ揎椷€包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進(jìn)一步加工步驟中進(jìn)行糖基化修飾而產(chǎn)生的多肽。這種修飾可以通過將多肽暴露于進(jìn)行糖基化的酶(如哺乳動物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優(yōu)化了溶解性能的多肽。
在本發(fā)明中，可選用本領(lǐng)域已知的各種載體，如市售的載體，包括質(zhì)粒，粘粒等。在生產(chǎn)本發(fā)明的人hRab18多肽時，可以將hRab18編碼序列可操作地連于表達(dá)調(diào)控序列，從而形成人hRab18蛋白表達(dá)載體。
如本文所用，“可操作地連于”指這樣一種狀況，即線性DNA序列的某些部分能夠影響同一線性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信號肽DNA作為前體表達(dá)并參與多肽的分泌，那么信號肽(分泌前導(dǎo)序列)DNA就是可操作地連于多肽DNA；如果啟動子控制序列的轉(zhuǎn)錄，那么它是可操作地連于編碼序列；如果核糖體結(jié)合位點被置于能使其翻譯的位置時，那么它是可操作地連于編碼序列。一般，“可操作地連于”意味著相鄰，而對于分泌前導(dǎo)序列則意味著在閱讀框中相鄰。
在本發(fā)明中，術(shù)語“宿主細(xì)胞”包括原核細(xì)胞和真核細(xì)胞。常用的原核宿主細(xì)胞的例子包括大腸桿菌、枯草桿菌等。常用的真核宿主細(xì)胞包括酵母細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞和哺乳動物細(xì)胞。較佳地，該宿主細(xì)胞是真核細(xì)胞，如CHO細(xì)胞、COS細(xì)胞等。
本發(fā)明還提供了對人hRab18特異的抗體，包括多克隆抗體和單克隆抗體。
在本發(fā)明中，可以使用一系列本領(lǐng)域已知的方法來制備針對hRab18特異的抗體。例如，將提純的人hRab18基因產(chǎn)物或它的抗原片段注射入動物體內(nèi)以產(chǎn)生多克隆抗體。同樣，表達(dá)人hRab18或它的抗原片段的細(xì)胞也可以用來對動物致免疫而產(chǎn)生抗體。根據(jù)本發(fā)明制備的抗體也可以是單克隆抗體，這些單克隆抗體可以用雜交瘤技術(shù)制備(例如，Kohler et al.，Nature 256495，1975；Kohler et al.，Eur.J.Immunol.6511，1976；Kohler et al.，Eur.J.Immunol.6292，1976)。本發(fā)明的抗體包括可以阻抑hRab18功能的抗體，也可以是不影響人hRab18功能的抗體。每一類抗體都可以通過對人hRab18基因產(chǎn)物的片段或功能域致免疫而產(chǎn)生，而人hRab18基因產(chǎn)物及其片段可以用重組方法產(chǎn)生或用多肽合成儀進(jìn)行合成。與非修飾形式的hRab18基因產(chǎn)物結(jié)合的抗體，可以通過用在原核細(xì)胞例如E.coli中產(chǎn)生的基因產(chǎn)物來免疫動物而得到。與翻譯后修飾形式如糖基化或磷酸化蛋白或多肽結(jié)合的抗體，可以通過用在真核細(xì)胞如酵母或昆蟲細(xì)胞中產(chǎn)生的基因產(chǎn)物的來免疫動物而得到。
本發(fā)明的人hRab18抗體可以用來鑒定表達(dá)人hRab18蛋白或多肽的細(xì)胞，如Jurkat T細(xì)胞。例如，可以用一種可檢測的分子例如熒光素異硫氰酸(FITC)來標(biāo)記hRab18特異抗體，然后讓人hRab18特異抗體與細(xì)胞樣品接觸，再用熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀檢測出與hRab18特異抗體結(jié)合的細(xì)胞。
除了在細(xì)胞表面檢測人hRab18外，還可以用Western印跡技術(shù)分析該蛋白質(zhì)。細(xì)胞裂解液可以從培養(yǎng)細(xì)胞或取自病人的組織標(biāo)本如腎上腺中提取，并溶解在含有去污劑的裂解緩沖液中。然后用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離細(xì)胞提取物(同時將提純的人hRab18多肽作為陽性對照)，接著通過電泳雜交將其轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素上。為了用Western印跡免疫探測hRab18多肽，可以使用典型的抗體結(jié)合檢測方法，例如放射自顯影或堿性磷酸酶檢測方法。并可使用免疫接種血清或不相關(guān)的單克隆抗體作為非特異反應(yīng)的對照。
還可用Nothern印跡法技術(shù)分析hRab18基因產(chǎn)物的表達(dá)，即分析人hRab18的RNA轉(zhuǎn)錄物在細(xì)胞中的存在與否和數(shù)量。
人hRab18 DNA的Nothern印跡分析和人hRab18特異抗體的Western印跡分析還可以聯(lián)合使用，以證實人hRab18在生物樣本中的表達(dá)。人hRab18 DNA還可以用于Southern印跡分析或原位雜交分析，以將該基因定位于染色體上，并可進(jìn)行遺傳連鎖分析以找出其它可能的疾病相關(guān)基因。
此外，本發(fā)明還提供了一種可用作探針的核酸分子，該分子通常具有hRab18核苷酸編碼序列的8-100個，較佳地15-50個連續(xù)核苷酸。該探針可用于檢測樣品中是否存在編碼hRab18的核酸分子。
本發(fā)明還提供了檢測樣品中是否存在hRab18核苷酸序列的方法，它包括用上述的探針與樣品進(jìn)行雜交，然后檢測探針是否發(fā)生了結(jié)合。較佳地，該樣品是PCR擴增后的產(chǎn)物，其中PCR擴增引物對應(yīng)于hRab18核苷酸編碼序列，并可位于該編碼序列的兩側(cè)或中間。引物長度一般為20-50個核苷酸。
此外，根據(jù)本發(fā)明的hRab18核苷酸序列和氨基酸序列，可以在核酸同源性或表達(dá)蛋白質(zhì)的同源性基礎(chǔ)上，篩選hRab18同源基因或同源蛋白。
為了得到與hRab18基因相關(guān)的人cDNAs或基因組DNAs的點陣，可以用DNA探針篩選人cDNA或基因組DNA文庫，這些探針是在低嚴(yán)緊條件下，用32p對hRab18的全部或部分做放射活性標(biāo)記而得的。最適合于篩選的cDNA文庫是來自人腎上腺組織的文庫。來自參與內(nèi)分泌的其它人體組織或特定人體細(xì)胞株的cDNA文庫也可用于篩選目的。構(gòu)建來自感興趣的細(xì)胞或者組織的cDNA文庫的方法是分子生物學(xué)領(lǐng)域眾所周知的。另外，許多這樣的cDNA文庫也可以購買到，例如購自Clontech，Palo Alto，Cal.。這種篩選方法可以識別與hRab18相關(guān)的基因家族的核苷酸序列。
根據(jù)核苷酸相似性篩選hRab18同源物可以按如下方法完成。人體腎上腺cDNA文庫，例如Clontech Cat.#7430-1(Clontech，Palo Alto，Cal.)可以使用一段包含hRab18基因序列的全部或部分的隨機引物化DNA探針篩選。要完成對與hRab18序列至少有70％同源性的DNA插入序列的克隆的鑒定，可以使用雜交溫度為55℃的雜交液，然后用0.5×SSC和0.1％SDS清洗。用這種方法識別的克隆的DNA插入序列可以進(jìn)一步用DNA限制性內(nèi)切酶分析和DNA測序來評價它與hRab18基因的相似性。組織表達(dá)的分布可以用上述的Northern印跡法技術(shù)分析。
hRab18同源物也可以用針對hRab18蛋白或多肽的抗體來識別。例如，可以用標(biāo)準(zhǔn)的方法對商品化的或者用已知方法構(gòu)建的，來自細(xì)胞或者組織例如腎上腺的表達(dá)文庫進(jìn)行篩選。將文庫倒入平皿，菌落轉(zhuǎn)移到一張硝化纖維素膜上，使表達(dá)的重組蛋白結(jié)合到膜上。然后就可以用特異性的人hRab18抗體進(jìn)行典型的抗體結(jié)合和檢測。用這種方法所識別出克隆中的DNA插入序列，可以進(jìn)一步用DNA限制性內(nèi)切酶分析和DNA測序進(jìn)行分析以評價它與hRab18基因的相似性。新識別的基因的組織表達(dá)分布可以同樣地按上述方法進(jìn)行分析。
本發(fā)明的人hRab18核苷酸全長序列或其片段通?？梢杂肞CR擴增法、重組法或人工合成的方法獲得。對于PCR擴增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開的有關(guān)核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設(shè)計引物，并用市售的cDNA庫或按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法所制備的cDNA庫作為模板，擴增而得有關(guān)序列。當(dāng)序列較長時，常常需要進(jìn)行兩次或多次PCR擴增，然后再將各次擴增出的片段按正確次序拼接在一起。
一旦獲得了有關(guān)的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關(guān)序列。這通常是將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)人細(xì)胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細(xì)胞中分離得到有關(guān)序列。
此外，還可用人工化學(xué)合成的方法來合成有關(guān)序列。在本申請之前，現(xiàn)有技術(shù)已完全可以通過先合成多個多核苷酸小片段，然后再進(jìn)行連接而獲得編碼本發(fā)明人hRab18蛋白的的核酸序列。然后，可將該核酸序列引入本領(lǐng)域中各種現(xiàn)有的DNA分子(如載體)和細(xì)胞中。此外，還可通過化學(xué)合成將突變引入本發(fā)明蛋白序列中。
除了用重組法產(chǎn)生之外，本發(fā)明蛋白的片段還可用固相技術(shù)，通過直接合成肽而加以生產(chǎn)(Stewart等人，(1969)Solid-Phase Peptide Synthesis，WH Freeman Co.，San Francisco；Merrifield J.(1963)J.Am Chem.Soc 852149-2154)。在體外合成蛋白質(zhì)可以用手工或自動進(jìn)行。例如，可以用Applied Biosystems的431A型肽合成儀(Foster City，CA)來自動合成肽?？梢苑謩e化學(xué)合成本發(fā)明蛋白的各片段，然后用化學(xué)方法加以連接以產(chǎn)生全長的分子。
本發(fā)明蛋白的編碼序列可用于基因定位。例如，通過熒光原位雜交技術(shù)(FISH)，將cDNA克隆與分裂中期的染色體進(jìn)行雜交，可以準(zhǔn)確地進(jìn)行染色體定位。該技術(shù)可以使用短至約500bp的cDNA；也可以使用長至約2000bp或者更長的cDNA。對于該技術(shù)，可參見Verma等人，Human ChromosomesA Manual ofBasic Techniques，Pergamon Press，New York(1988)。
一旦序列被定位于染色體上的某個精確位置，將可以將序列在染色體上的物理位置與遺傳圖譜數(shù)據(jù)相關(guān)聯(lián)。這些遺傳圖譜數(shù)據(jù)是可以獲得的，例如通過孟德爾(Mendelian)人遺傳數(shù)據(jù)庫(可通過Johns Hopkins University Welch MedicalLibrary在網(wǎng)上獲得)。然后，通過連鎖分析來鑒定基因與已定位于同一染色體區(qū)域的疾病之間的相關(guān)性。
接著，有必要確定患病個體和健康個體之間的cDNA或基因組序列方面的差異。如果某一突變存在于部分或全部患病個體但不存在于正常個體，那么該突變可能就是該疾病的致病因素。
利用本發(fā)明的人hRab18蛋白，通過各種常規(guī)篩選方法，可篩選出與人hRab18發(fā)生相互作用的物質(zhì)，如受體、抑制劑或拮抗劑等。
本發(fā)明人hRab18蛋白及其抗體、抑制劑、拮抗劑或受體等，當(dāng)在治療上進(jìn)行施用(給藥)時，可提供不同的效果。通常，可將這些物質(zhì)配制于無毒的、惰性的和藥學(xué)上可接受的水性載體介質(zhì)中，其中pH通常約為5-8，較佳地pH約為6-8，盡管pH值可隨被配制物質(zhì)的性質(zhì)以及待治療的病癥而有所變化。配制好的藥物組合物可以通過常規(guī)途徑進(jìn)行給藥，其中包括(但并不限于)肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下、皮內(nèi)、或局部給藥。
以本發(fā)明的人hRab18蛋白為例，可以將其與合適的藥學(xué)上可接受的載體聯(lián)用。這類藥物組合物含有治療有效量的蛋白質(zhì)和藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。這類載體包括(但并不限于)鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。藥物制劑應(yīng)與給藥方式相匹配。本發(fā)明的人hRab18蛋白可以被制成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過常規(guī)方法進(jìn)行制備。諸如片劑和膠囊之類的藥物組合物，可通過常規(guī)方法進(jìn)行制備。藥物組合物如針劑、溶液、片劑和膠囊宜在無菌條件下制造?；钚猿煞值慕o藥量是治療有效量，例如每天約1微克/千克體重-約5毫克/千克體重。此外，本發(fā)明的多肽還可與其他治療劑一起使用。
當(dāng)本發(fā)明的人hRab18蛋白多肽被用作藥物時，可將治療有效劑量的該多肽施用于哺乳動物，其中該治療有效劑量通常至少約10微克/千克體重，而且在大多數(shù)情況下不超過約8毫克/千克體重，較佳地該劑量是約10微克/千克體重-約1毫克/千克體重。當(dāng)然，具體劑量還應(yīng)考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫(yī)師技能范圍之內(nèi)的。
通過同源檢索發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的新基因具有與已發(fā)表并被確認(rèn)為小鼠(Musmusculus)Rab18蛋白的基因(GeneBank Accession X803333)高度同源的序列，并且本發(fā)明的新蛋白具有小鼠(Mus musculus)Rab18蛋白(GenPept AccessionCAA56583)高度保守的氨基酸序列。所以，本發(fā)明的hRab18是小鼠(Mus musculus)Rab18蛋白基因的一個同源基因并具有相似的功能。
通過同源檢索發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的新蛋白具有與已發(fā)表并被確認(rèn)為Rab18的基因高度同源的序列，并且本發(fā)明的新蛋白具有Rab基因家族高度保守的氨基酸序列。進(jìn)一步的研究表明，本發(fā)明與已發(fā)表并被確認(rèn)為小鼠Rab18基因具有高度同源性(小鼠Rab18基因?qū)儆赗ab基因家族)，此外與其他Rab家族成員也存在較高同源性。所以，本發(fā)明的hRab18基因?qū)儆赗ab基因家族，是小鼠Rab18基因的一個同源基因而具有相似的功能。


圖1為本發(fā)明的人hRab18與小鼠Rab18(mRab18)基因核酸序列(GenBankAccession No.X80333)的同源比較(FASTA)圖。其中，相同的核苷酸用“|”標(biāo)出。
圖2為本發(fā)明的人hRab18蛋白與其他Rab基因家族成員的氨基酸序列的同源比較(PILEUP)圖。RB18_MOUSE小鼠Rab蛋白氨基酸序列(GenePept ACCESSION No.CAA56583)；hrab13人Rab13蛋白氨基酸序列(Swissprot Accession No.P51153)；hrablc人Rablc蛋白氨基酸序列(Swissprot Accession No.Q15286)；hrab30人Rab30蛋白氨基酸序列(Swissprot Accession No.Q15771)；hrab18人Rab18蛋白氨基酸序列；hrab14人Rab14蛋白氨基酸序列；hrab2人Rab2蛋白氨基酸序列(Swissprot AccessionNo.P08886)下面結(jié)合具體實施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New YorkColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實施例1hRab18基因的克隆1．組織分離(Tissue isolation)腎上腺來源于5個正常成年男性供體，在死后四小時內(nèi)取出腎上腺組織，立即置于液氮中冷凍保存。
2．mRNA的分離(mRNA isolation)取出組織，用研缽研碎，加人盛有裂解液的50ml管，充分振蕩后，再移人玻璃勻漿器內(nèi)。勻漿后移至50ml新管，抽提總RNA(TRlzol Reagents，Gibco，NY，USA)。用甲醛變性膠電泳鑒定總RNA質(zhì)量。用帶Oligo d(T)的纖維素柱分離總RNA中的mRNA，定量。
3．cDNA文庫的構(gòu)建(Construction of cDNA library)以mRNA為模板，合成雙鏈cDNA，反轉(zhuǎn)錄引物見SEQ ID NO.1。補平末端后，加含EcoRI切點的接頭，接頭序列分別見SEQ ID NO.2和3。磷酸化EcoRI末端后，用XhoI限制性內(nèi)切酶消化1.5小時，再進(jìn)行片段分離。過柱篩選長度＞500bp的片段，用酚-氯仿抽提，乙醇沉淀，無菌水溶解，連接至Uni-ZAP XR載體(Stratagene，CA9203，USA)，以Zap-cDNA Gigapack Ⅲ Gold Cloning Kit(Stratagene，CA9203，USA)進(jìn)行包裝，宿主菌使用XL 1-Blue MRF細(xì)菌。涂板并測定滴度。
4．測序及數(shù)據(jù)庫建立(Seqencing and Database Constructing)
挑選文庫中有外源片段插入的克隆，擴增后抽提質(zhì)粒(Qiagen，Germany)，用T3和T7作為3i端和5端的通用引物，采用終止物熒光標(biāo)記(Big-Dye，Perkin-Elmer，USA)的方法，在ABI 377測序儀(Perkin-Elmer，USA)上進(jìn)行EST大規(guī)模測序。測序結(jié)果用FACTURA軟件去除載體序列，傳輸?shù)絊UN Ultra 450 Server上進(jìn)行下一步的處理。所有的序列信息再用GCG軟件包(Wisconsin group，USA)中的BLAST和FASTA軟件搜索已有的數(shù)據(jù)庫(Genebank+EMBL)，將無同源性或同源性低于95％的序列視為新基因建立數(shù)據(jù)庫。
5．基因的全長克隆(Cloning of Full-length cDNA)在得到的新基因片段序列信息基礎(chǔ)上，進(jìn)行cDNA全長克隆，分兩階段進(jìn)行(1)“電子克隆”(Electronic Cloning)以新基因片段序列作為探針?biāo)褜bEST數(shù)據(jù)庫，將重疊序列＞50bp，同源性在98％以上的表達(dá)序列標(biāo)簽(Expressed Sequence Tag，簡稱“EST”)序列認(rèn)為同一序列(consensus sequence)，取出并用AUTOASSEMBLER軟件進(jìn)行拼接，部分EST可以延伸探針序列。再用STRIDER軟件分析被延伸的序列是否具有完整的開放閱讀框架(Open Reading Frame，ORF)，用BLAST搜尋Genbank或SwissProt以確定該序列在核苷酸和氨基酸水平上是否與其他物種有同源性，以幫助判別所得到的基因全長完整性如何。通過電子克隆的方法，通?？色@取hRab18基因的全長序列。
(2)cDNA末端快速擴增(Rapid Amplification of cDNA Ends，RACE)如果通過“電子克隆”方法仍未得到完整的cDNA全長，則在已有序列的5′或3′端設(shè)計引物，在人類腎上腺Marathon-Ready cDNA文庫(Clontech Lab，Inc，USA)中進(jìn)行長距離PCR反應(yīng)。然后對PCR產(chǎn)物克隆、測序。用AUTOASSEMBLER及STRIDER軟件分析被延長的序列有無完整的ORF，如無，重復(fù)上述過程直至獲得全長。
(3)RT-PCR對于5′和3′端已知的序列，中間尚有一段間隙(gap)無法從已有的公共數(shù)據(jù)庫或自身數(shù)據(jù)庫獲得，可考慮采用RT-PCR的方法。在序列5′端設(shè)計引物，3′端引物采用Oligo-dT，在腎上腺總RNA庫中進(jìn)行擴增。然后對產(chǎn)物進(jìn)行克隆、測序。最后拼接并獲得全長。
通過組合使用上述3種方法，獲得了候選的人hRab18蛋白的全長編碼序列。在拼接得到全長(至少包含完整的開放讀框)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步設(shè)計引物“R15′-TCAGGATGGACGAGGACGT-3′(SEQ ID NO.4)為正向引物，寡核苷酸R25′-GCAAGGTCCCTAAAATAGCAGT-3′(SEQ ID NO.5)為反向引物，以腎上腺組織的總RNA為模板，進(jìn)行RT-PCR擴增，R1/R2的PCR條件為94℃5分鐘，隨之以94℃30秒、55℃30秒和72℃1分鐘進(jìn)行35個循環(huán)，最后以72℃延伸5分鐘。電泳檢測PCR擴增產(chǎn)物，獲得目的片段長度為716bp。然后按常規(guī)方法以PCR擴增產(chǎn)物進(jìn)行克隆、測序，獲得如SEQ ID NO.6所示的序列。
實施例2hRab18基因的序列信息與同源性分析本發(fā)明新的人hRab18全長cDNA(GenBank Accession No.AF136974。因申請保密，故在本申請之前未對公眾公開)的長度為716bp，詳細(xì)序列見SEQ ID NO.6，其中開放讀框位于6-623位核苷酸。根據(jù)全長cDNA推導(dǎo)出hRab18的氨基酸序列，共206個氨基酸殘基，分子量22977.07，pI為5.11。詳細(xì)序列見SEQ ID NO.7。
將hRab18的全長cDNA序列及其編碼蛋白質(zhì)，用BLAST程序在Non-redundant GenBank+EMBL+DDBJ+PDB和Non-redundant GenBank CDStranslations+PDB+SwissProt+Superdate+PIR數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行核苷酸和蛋白質(zhì)同源性檢索，結(jié)果發(fā)現(xiàn)它與人、大鼠、小鼠、線蟲乃至果蠅中的Rab基因都存在較高的同源性。在核苷酸水平上，它與小鼠Rab18基因的mRNA全編碼序列(GenBankAccession No.X80333)的1-618位堿基有94.0％的相同性(圖1)。在氨基酸水平上，它與Ras家族蛋白都具有較高的同源性(圖2)，與小鼠Rab18蛋白有99％相同性。因而可以確定本發(fā)明的hRab18是一種人的膜轉(zhuǎn)移蛋白，屬于Rab家族。
本發(fā)明的人hRab18除了可作為該家族一員用于進(jìn)一步的功能研究，還可用于與其他蛋白一起產(chǎn)生融合蛋白，比如與免疫球蛋白一起產(chǎn)生融合蛋白。此外，本發(fā)明人hRab18還可以與該家族的其他成員進(jìn)行融合或交換片段，以產(chǎn)生新的蛋白。例如將本發(fā)明人hRab18的N端與鼠的Rab18的N端進(jìn)行交換，以產(chǎn)生新的活性更高或具有新特性的蛋白。
針對本發(fā)明人hRab18的抗體，用于篩選該家族的其他成員，或者用于親和純化相關(guān)蛋白(如該家族的其他成員)。
此外，本發(fā)明人hRab18核酸(編碼序列或反義序列)可以被引入細(xì)胞，以提高人hRab18的表達(dá)水平或者抑制人hRab18的過度表達(dá)。本發(fā)明的人hRab18蛋白或其活性多肽片段可以施用于病人，以治療或減輕因人hRab18缺失、無功能或異常而導(dǎo)致的有關(guān)病癥。此外，還可以用基于本發(fā)明的核酸序列或抗體進(jìn)行有關(guān)的診斷或預(yù)后判斷。
實施例3hRab18蛋白的結(jié)構(gòu)和功能研究1．根據(jù)序列比較分析得到以下結(jié)果1 MDEDVLTTLK ILIIGESGVG KSSLLLRFTD DTFDPELAAT IGVDFKVKTI51 SVDGNKAKLA IWDTAGQERF RTLTPSYYRG AQGVILVYDV TRRDTFVKLD101 NWLNELETYC TRNDIVNMLV GNKIDKENRE VDRNEGLKFA RKHSMLFIEA151 SAKTCDGVQC AFEELVEKII QTPGLWESEN QNKGVKLSHR EEGQGGGACG201 GYCSVL在氨基酸序列中存在以下保守的氨基酸殘基(1)下劃線處(62，79，162)為Ras超家族的高度保守的氨基酸殘基(2)粗體(45，102)為Rab家族特有的保守的氨基酸殘基(Gene 1993 132，273-278)2．將hRab18蛋白的氨基酸序列在PROSITE數(shù)據(jù)庫(網(wǎng)址為http//www.motif.genome.ad.jp/motif-bin/)中檢索基序(motif)，得到以下結(jié)果1 MDEDVLTTLK ILIIGESGVG KSSLLLRFTD DTFDPELAAT IGVDFKVKTI51 SVDGNKAKLA IWDTAGQERF RTLTPSYYRG AQGVILVYDV TRRDTFVKLD101 NWLNELETYC TRNDIVNMLV GNKIDKENRE VDRNEGLKFA RKHSMLFIEA151 SAKTCDGVQC AFEELVEKII QTPGLWESEN QNKGVKLSHR EEGQGGGACG201 GYCSVL(1)在氨基酸序列中，存在以下功能基序(ⅰ)下劃線區(qū)(92-95，141-144)cAMP-和cGMP-依賴的蛋白激酶磷酸化位點(cAMP-and cGMP-dependent protein kinase phosphorylation site)(ⅱ)粗體區(qū)(8-10，91-93，151-153，188-190)蛋白激酶C磷酸化位點(Proteinkinase C phosphorylation site)(ⅲ)波浪線區(qū)(135-138)酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點(Casein kinaseⅡphosphorylation site)(ⅳ)斜體區(qū)(18-23，136-141，157-162，174-179，184-189，193-198，195-200，196-201，197-202，200-205)N-豆蔻?；稽c(N-myristoylation site)(ⅴ)雙下劃線區(qū)(18-25)ATP/GTP-結(jié)合位點基序A(ATP/GTP-binding site motifA(P-loop))(ⅵ)粗斜體區(qū)(7-10，111-114)N-糖基化位點(N-glycosylation site)(2)功能分析N端糖基化位點，酪蛋白激酶Ⅱ型磷酸化位點，N-糖基化位點，N-豆蔻酰化位點，蛋白激酶C磷酸化位點與翻譯后修飾(post-translational modifications)有關(guān)。ATP/GTP-結(jié)合位點基序?qū)abs家族的功能具有重要意義，Rabs蛋白具有GTP水解酶的活性，它們與GTP、GDP的結(jié)合就依賴與蛋白上的這一位點。
3．將hRab18蛋白的氨基酸序列在Blocks數(shù)據(jù)庫(網(wǎng)址為http://blocks.fhcrc.org)中檢索結(jié)構(gòu)模塊，得到以下結(jié)果1 MATAPYNYSY IFKYIIIGDM GVGKSCLLHQ FTEKKFMADC PHTIGVEFGT51 RIIEVSGQKI KLQIWDTAGQ ERFRAVTRSY YRGAAGALMV YDITRRSTYN101 HLSSWLTDAR NLTNPNTVII LIGNKADLEA QRDVTYEEAK QFAEENGLLF151 LEASAKTGEN VEDAFLEAAK KIYQNIQDGS LDLNAAESGV QHKPSAPQGG201 RLTSEPQPQR EGCGC(1)在氨基酸序列中，存在以下結(jié)構(gòu)模塊區(qū)(ⅰ)下劃線區(qū)域(12-33，35-51，53-75，29-51，115-128，150-172)轉(zhuǎn)化蛋白P21(TRANSFORMING PROTEIN P21)，屬于Ras超家族的標(biāo)記。
(ⅱ)粗體區(qū)域(46-85)ADP-核糖基化因子(ADP-ribosylation factors)，該結(jié)構(gòu)域中包含有一個保守的GTP結(jié)合區(qū)域。
(2)結(jié)構(gòu)分析以上結(jié)果表明，hRab18屬于Ras超家族的成員之一，而且在其結(jié)構(gòu)中包含有與GTP結(jié)合的區(qū)域，提示其與GTP的結(jié)合與水解有密切的聯(lián)系。
綜上所述，從hRab18蛋白的結(jié)構(gòu)和理化特性進(jìn)一步證實了該基因是Rab基因家族的成員。由于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)決定了功能特異性的生物化學(xué)原理，因此本發(fā)明的人hRab18基因具有與Rab基因家族成員相似或相同的功能。該基因在膜泡運輸中發(fā)揮重要作用。
實施例4hRab18基因的組織表達(dá)譜1．電子Northern表達(dá)譜。按Ton C.等人的方法(Ton C et al.，Biochem BiophysRes Commun 1997 Dec 18；241(2)589-594；Hwang DM，et al.，Circulation 1997 Dec16；96(12)4146-4203)，將hRab18 cDNA序列在GCG軟件包中的dbEST數(shù)據(jù)庫中做BLAST檢索，在得到的人類EST中，概率值＜10e-10、相同性＞95％的EST有21個，可視為該基因在組織中的轉(zhuǎn)錄表達(dá)本，由此得出表達(dá)該基因的組織譜，發(fā)現(xiàn)其在腦、胸腺、心臟、肝、肺、骨髓、胰腺、前列腺和脾臟細(xì)胞中均有表達(dá)。這表明這種蛋白在人體許多組織中都發(fā)揮著重要作用。
實施例5hRab18多肽的制備和提純在該實施例中，將全長的hRab18編碼序列或片段構(gòu)建入商品化的蛋白質(zhì)融合表達(dá)載體之中，以表達(dá)和提純重組蛋白。
hRab18蛋白或多肽可以以GST融合蛋白的形式在大腸桿菌中進(jìn)行原核表達(dá)。
(a)原核表達(dá)載體的構(gòu)建，以及轉(zhuǎn)化大腸桿菌根據(jù)人hRab18的全長編碼序列(SEQ ID NO.ID No.6)，設(shè)計擴增出完整編碼閱讀框的引物(分別對應(yīng)于編碼序列5′和3′端的約20個以上核苷酸)，并在正反引物上分別引入限制性內(nèi)切酶位點(這可視選用的載體而定)，以便構(gòu)建表達(dá)載體。以實施例1中獲得的擴增產(chǎn)物為模板，經(jīng)PCR擴增后，將hRab18基因在保證閱讀框正確的前提下克隆至pGEX-2T載體(Pharmacia，Piscataway，NJ)。鑒定好的表達(dá)載體利用CaCl2方法轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α，篩選鑒定得到含有pGEX-2T-hRab18表達(dá)載體的工程菌DH5α-pGEX-2T-hRab18。
(b)表達(dá)GST-hRab18重組蛋白的工程菌的分離鑒定挑取單菌落的DH5α-pGEX-2T-hRab18工程菌于3ml含100μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中振搖培養(yǎng)過夜，按1∶100的濃度吸取培養(yǎng)液于新的LB培養(yǎng)基(含100μg/ml氨芐青霉素)中培養(yǎng)約3小時，至OD600達(dá)0.5后，加入IPTG至終濃度1mmol/L繼續(xù)于37℃分別培養(yǎng)0，1，2，3小時。取培養(yǎng)時間不同的1ml菌液離心，在細(xì)菌沉淀物中加入裂解液(2×SDS上樣緩沖液50μl，蒸餾水45μl，二巰基乙醇5μl)，混懸細(xì)菌沉淀，沸水浴中煮5分鐘，10000轉(zhuǎn)離心1分鐘，上清加入12％SDS-PAGE膠中電泳。染色后觀察預(yù)期分子量大小的蛋白量隨IPTG誘導(dǎo)時間增加而增加的菌株即為表達(dá)GST-hRabl8融合蛋白的工程菌。
(c)GST-hRab18融合蛋白的提取純化按上述方法誘導(dǎo)表達(dá)GST-hRab18融合表達(dá)蛋白的工程菌DH5α-pGEX-2T-hRab18。誘導(dǎo)后的細(xì)菌離心沉淀，按每400ml菌加入20ml PBS重懸細(xì)菌，超聲破碎細(xì)菌。破菌完全的超聲液按每毫升加入20微升的量加入PBS飽和的50％谷胱苷肽Sepharose4B，37℃振搖結(jié)合30分鐘，10000rpm/min離心10分鐘沉淀結(jié)合了GST-hRabl8的谷胱苷肽Sepharose4B，棄上清。按每毫升超聲液所得沉淀加入100μl PBS的量清洗兩次，而后按每毫升超聲液所得沉淀加入10μl還原型谷胱苷肽洗脫液，室溫置10分鐘，10000rpm/min離心10分鐘，上清即為洗脫的融合蛋白。重復(fù)洗脫兩次。洗脫的上清保存于-80℃，并進(jìn)行SDS-PAGE電泳，檢測純化效果。在約22kDa處的條帶即為hRab18蛋白。
實施例6hRab18蛋白或多肽在昆蟲細(xì)胞中進(jìn)行真核細(xì)胞表達(dá)1．hRab18桿狀病毒表達(dá)載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)染Sf9昆蟲細(xì)胞株根據(jù)人hRab18的全長編碼序列(SEQ ID NO.6)，設(shè)計擴增出完整編碼閱讀框的引物，并在正反引物上分別引入限制性內(nèi)切酶位點(這可視選用的載體而定)，以便構(gòu)建表達(dá)載體。以實施例1中獲得的擴增產(chǎn)物為模板，經(jīng)PCR擴增后，將hRab18 cDNA在保證閱讀框架的前提下克隆至pVL1392載體(Invitrogen，Carlsbad，CA)。鑒定好的表達(dá)載體3μg，野生型線性桿狀病毒DNA(BaculoGoldTMACMNPV DNA，Pharmingen，San Diego，CA)1μg和Lipofection(Gibco-BRL，NY)25μl，加入1ml無血清的昆蟲培養(yǎng)基中，振蕩15秒混勻，室溫孵育15分鐘備用。取1ml(2×106)Sf9昆蟲細(xì)胞懸液于60mm組織培養(yǎng)板中，貼壁1小時后換轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基，室溫孵育15分鐘后棄培養(yǎng)基，加入前面制備好的DNA載體轉(zhuǎn)染混合物，Parafilm密封培養(yǎng)板，于室溫27℃振搖培養(yǎng)4小時，而后換完全培養(yǎng)基培養(yǎng)3天，收集上清備用。
(2)轉(zhuǎn)入重組表達(dá)載體的昆蟲細(xì)胞株的篩選鑒定轉(zhuǎn)染3天后的昆蟲細(xì)胞用新鮮培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液(2×106/1ml)，取1ml細(xì)胞懸液置于60mm組織培養(yǎng)皿中，加入3ml培養(yǎng)基，100μl收集的培養(yǎng)上清，貼壁1小時，棄2ml培養(yǎng)基，繼續(xù)室溫培養(yǎng)1小時，棄去所有的培養(yǎng)基，加入預(yù)熱的含20μl 4％X-gal的3ml半固體培養(yǎng)基，培養(yǎng)5-7天后挑取白色細(xì)胞克隆于96孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)3-5天，而后吸取上清感染Sf9昆蟲細(xì)胞。
收集感染的細(xì)胞進(jìn)行Western鑒定。將細(xì)胞裂解后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電泳后的膠于Pharmacia的MultiphorⅡ半干電轉(zhuǎn)移儀中將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印到硝酸纖維膜上，將硝酸纖維膜置于封閉液中封閉1小時，而后于抗hRab18的抗體溶液中封閉1小時，TBS液振搖清洗5分鐘共2次，而后將膜置于生物素標(biāo)記的抗hRab18一抗的第二抗體溶液中振搖1小時，TBS清洗，加入親和素-堿性磷酸酶復(fù)合物反應(yīng)30分鐘，TBS清洗2次，加入新鮮配制的顯色液顯色觀察蛋白條帶。
挑取高表達(dá)hRab18的Sf9細(xì)胞克隆。
(3)hRab18蛋白的提取純化用高表達(dá)hRab18的Sf9細(xì)胞克隆的上清大量感染Sf9細(xì)胞，感染48小時后收集細(xì)胞，PBS洗滌。每2×108細(xì)胞加入20ml細(xì)胞裂解液(0.5％Triton X-100，20mM Na3PO4(磷酸鈉，pH7.8)，500mM NaCl，1mM Na3VO4(釩酸鈉)，1mMPefabloc，1μg/ml胃蛋白酶抑制劑，亮抑蛋白酶肽和抑蛋白酶肽)破細(xì)胞，12000×g離心20min去除細(xì)胞碎片，上清按每2×108的細(xì)胞加入2ml NTA-瓊脂糖(Qiagen，Germany)，4℃吸附1小時。而后用含100nM咪唑的His緩沖液洗滌兩次，用含20mM N，N′-二哌嗪，500mM NaCl，300mM咪唑的緩沖液洗脫以得到純化的蛋白。洗脫液保存于4℃，并進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測提取的hRab18蛋白的純度。在約22kDa處的條帶即為hRab18蛋白。
實施例7抗人hRab18抗體的制備1．免疫小鼠和脾細(xì)胞的制備將實施例5和6中獲得的人hRab18重組蛋白分子用層析法進(jìn)行分離后備用，也可以用SDS-PAGE凝膠電泳法進(jìn)行分離，將電泳條帶從凝膠中割下，并用等體積的完全Freund′s佐劑乳化。取6-8周齡Balb/C雌鼠，用50-100μg/0.2ml乳化過的蛋白，對小鼠進(jìn)行腹膜內(nèi)注射。14天后，用非完全Freund′s佐劑乳化的同樣抗原對小鼠以50-100μg/0.2ml的劑量再加強免疫一次，3-5天后用于融合。其中，脾細(xì)胞制備見鄂征主編，《組織培養(yǎng)和分子細(xì)胞學(xué)技術(shù)》，北京出版社，第210頁。
2．按《組織培養(yǎng)和分子細(xì)胞學(xué)技術(shù)》(同上)，第211頁中的方法，制備飼養(yǎng)細(xì)胞。
3．按《組織培養(yǎng)和分子細(xì)胞學(xué)技術(shù)》(同上)，第213頁中的方法，進(jìn)行細(xì)胞融合。
4．抗體的檢測在細(xì)胞融合10-15天后，需逐孔進(jìn)行檢查，一旦發(fā)現(xiàn)旺盛的雜交細(xì)胞集落生長，就應(yīng)用hRab18蛋白做抗體活性的初步篩選，常用的方法有免疫熒光試驗、發(fā)射免疫試驗(RIA)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)。檢查出抗體活性的孔后，立刻進(jìn)行克隆培養(yǎng)，并分離出抗體。
在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
序列表(1)一般信息(ⅰ)申請人國家人類基因組南方研究中心(ⅱ)發(fā)明名稱一種新的人膜轉(zhuǎn)移蛋白及其編碼序列(ⅲ)序列數(shù)目7(2)SEQ ID NO.1的信息(ⅰ)序列特征(A)長度50bp(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型寡核苷酸(ⅸ)序列描述SEQ ID NO.1GAGAGAGAGAGAGAGAGAGAACTAGTCTCGAGTTTTTTTTTTTTTTTTTT 50(2)SEQ ID NO.2的信息(ⅰ)序列特征(A)長度13bp(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型寡核苷酸(ⅸ)序列描述SEQ ID NO.2AATTCGGCAC GAG 13(2)SEQ ID NO.3的信息(ⅰ)序列特征(A)長度9bp(B)類型核苷酸
(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型寡核苷酸(ⅸ)序列描述SEQ ID NO.3GCCGTGCTC 9(2)SEQ ID NO.4的信息(ⅰ)序列特征(A)長度22bp(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型寡核苷酸(ⅸ)序列描述SEQ ID NO.4TCAGGATGGACGAGGACGT 19(2)SEQ ID NO.5的信息(ⅰ)序列特征(A)長度19bp(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型寡核苷酸(ⅸ)序列描述SEQ ID NO.5GCAAGGTCCCTAAAATAGCAGT 22(2)SEQ ID NO.6的信息(ⅰ)序列特征(A)長度716bp(B)類型核苷酸(C)鏈性雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型核苷酸(ⅸ)序列描述SEQ ID NO.61TCAGGATGGA CGAGGACGTG CTAACCACCC TGAAGATCCT CATCATCGGC51GAGAGTGGGG TGGGCAAGTC CAGCCTGCTC TTGAGGTTCA CAGATGATAC101GTTTGATCCA GAACTTGCAG CAACAATAGG TGTTGACTTT AAGGTGAAAA151CAATTTCAGT GGATGGAAAT AAGGCTAAAC TTGCAATATG GGATACTGCT201GGTCAAGAGA GGTTTAGAAC ATTAACTCCC AGCTATTATA GAGGTGCACA251GGGTGTTATA TTAGTTTATG ATGTCACAAG AAGAGATACA TTTGTTAAAC301TGGATAATTG GTTAAATGAA TTGGAAACAT ACTGTACAAG AAATGACATA351GTAAACATGC TAGTTGGAAA TAAAATCGAT AAGGAAAATC GTGAAGTCGA401TAGAAATGAA GGCCTGAAAT TTGCACGAAA GCATTCCATG TTATTTATAG451AGGCAAGTGC AAAAACCTGT GATGGTGTAC AATGTGCCTT TGAAGAACTT501GTTGAAAAGA TCATTCAGAC CCCTGGACTG TGGGAAAGTG AGAACCAGAA551TAAAGGAGTC AAACTGTCAC ACAGGGAAGA AGGCCAAGGA GGAGGAGCCT601GTGGTGGTTA TTGCTCTGTG TTATAAACTC TGGGAAATTC CATCTCTTGC651ATATTTGATC AGATAGTGAC ATCTTTCTGT ATATAAACTC TTTAACTGCT701ATTTTAGGGA CCTTGC(2)SEQ ID NO.7的信息(ⅰ)序列特征(A)長度206氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型多肽(ⅸ)序列描述SEQ ID NO.71MDEDVLTTLK ILIIGESGVG KSSLLLRFTD DTFDPELAAT IGVDFKVKTI51SVDGNKAKLA IWDTAGQERF RTLTPSYYRG AQGVILVYDV TRRDTFVKLD101NWLNELETYC TRNDIVNMLV GNKIDKENRE VDRNEGLKFA RKHSMLFIEA151SAKTCDGVQC AFEELVEKII QTPGLWESEN QNKGVKLSHR EEGQGGGACG201GYCSVL
權(quán)利要求
1．一種分離出的DNA分子，其特征在于，它包括編碼具有人hRab18蛋白質(zhì)活性的多肽的核苷酸序列，而且，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.6中從核苷酸第6-623位DNA分子的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度嚴(yán)緊條件下與SEQ ID NO.6中從核苷酸第6-623位的核苷酸序列雜交。
2．如權(quán)利要求1所述的DNA分子，其特征在于，所述的序列編碼具有SEQ IDNO.7所示序列的多肽。
3．如權(quán)利要求1所述的DNA分子，其特征在于，該序列具有SEQ ID NO.6中從核苷酸第6-623位的核苷酸序列。
4．一種分離出的人hRab18蛋白多肽，其特征在于，它包括具有SEQ ID NO.7氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。
5．如權(quán)利要求4所述的多肽，其特征在于，該多肽是具有SEQ ID NO.7序列的多肽。
6．一種載體，其特征在于，它包含權(quán)利要求1所述的DNA。
7．一種用權(quán)利要求6所述載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
8．一種產(chǎn)生具有人hRab18蛋白質(zhì)活性的多肽的方法，其特征在于，該方法包括(1)將編碼具有人hRab18蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地連于表達(dá)調(diào)控序列，形成人hRab18蛋白表達(dá)載體，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.6中從核苷酸第6-623位的核苷酸序列有至少70％的同源性；(2)將步驟(1)中的表達(dá)載體轉(zhuǎn)人宿主細(xì)胞，形成人hRab18蛋白的重組細(xì)胞；(3)在適合表達(dá)人hRab18蛋白多肽的條件下，培養(yǎng)步驟(2)中的重組細(xì)胞；(4)分離出具有人hRab18蛋白活性的多肽。
9．一種能與權(quán)利要求7所述的人hRab18蛋白多肽特異性結(jié)合的抗體。
10．一種探針分子，其特征在于，它包含權(quán)利要求1所述的DNA分子中8-100個連續(xù)核苷酸。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種在人體正常腎上腺組織中表達(dá)的新的Ras相關(guān)蛋白hRab18,及其編碼序列,本發(fā)明還提供了該蛋白和核酸序列的制備方法,以及在樣品中檢測hRab18核酸序列和多肽的方法。
文檔編號C12P21/02GK1286305SQ99118608
公開日2001年3月7日 申請日期1999年9月1日 優(yōu)先權(quán)日1999年9月1日
發(fā)明者顧彥杰, 任雙喜, 吳堂明, 李明, 付剛, 陳竺 申請人:國家人類基因組南方研究中心