犬細小病毒的pcr檢測方法

專利名稱：犬細小病毒的pcr檢測方法
技術領域：
本發明屬于動物傳染病的診斷技術，涉及對犬的犬細小病毒的檢測方法。
犬細小病毒(CPV)是犬的一種烈性傳染病。臨床表現以急性出血性腸炎和非化膿性心肌炎為特征。對于犬細小病毒的檢測方法，目前主要有病毒分離培養、電鏡和免疫電鏡技術、熒光抗體技術、酶聯免疫吸試驗、血凝試驗和血凝抑制試驗等。但這些方法均存在一些缺點和不足。病毒分離培養費時費力，操作復雜，還需要必要的實驗室條件；電鏡和免疫電鏡技術需昂貴的儀器設備；熒光抗體技術僅局限于檢測病理組織或細胞培養物中的病毒；酶聯免疫吸附試驗除敏感性不高外，還易受干擾因素的影響；血凝試驗和血凝抑制試驗需隨時準備新鮮的敏感紅細胞，送檢糞樣稀釋倍數低時，含有非特異性凝集素，還需做血凝抑制試驗加以驗證。PCR是一種具有敏感性高、特異性強的靶DNA快速檢測方法，標本中含有痕量CPV-DNA就能檢出。目前雖已有對犬CPV的PCR檢測方法的報道，但未形成完整的試劑盒檢測技術，其樣品處理過程復雜且需要時間長，循環條件沒有得到最佳優化。
本發明的目的是提出一種以PCR試劑盒檢測技術為基礎的犬細小病毒的PCR檢測方法，以實現對犬細小病毒檢測的準確、快速的標準化。
本發明所建立的犬細小病毒的PCR檢測方法包括以下內容(一)設置PCR檢測試劑盒，該試劑盒包括(1)PCR試劑管，試劑管內含10×buffer，dNTP，引物1和引物2，MgCl2，所述的引物1和引物2分別是由DNA合成儀按堿基序列為5’TACCATGGTACAGATCCAG3’和5’CTCCTATATCACCAAAGTTA3’合成的DNA片段；(2)陽性對照，該對照為經CTAB消化，酚氯仿抽提的犬細小病毒DNA模板；(3)陰性對照，該對照為不含犬細小病毒并經熱處理的糞樣；(4)Taq酶；(5)普通瓊脂糖；(6)溴化乙錠溶液；(7)溴酚蘭上樣緩沖液；(二)按照以下操作規程進行檢測(1)樣品處理糞樣+滅菌生理鹽水或PBS(PH7.2)，充分振蕩后，離心去沉淀，取上清放入另一支滅菌離心管中，隔水煮沸使蛋白質變性，放入冰水降溫后離心去沉淀，吸取上清放入另一離心管中保存備用；(2)PCR在PCR試劑管中加入經稀釋的樣品，同時設陰陽性對照，稍離心，94～96℃變性，每管加入Taq酶不少于0.3μl，稍離心混勻，置PCR儀進行擴增，PCR反應循環條件采用降落(TD)PCR程序，一般操作不少于20循環；(3)擴增產物分析將瓊脂糖溶于電泳緩沖液，把溫熱凝膠倒入放好梳子的膠膜中，凝膠凝固后，移去梳子，將凝膠放入有電泳緩沖液的電泳槽，將樣品擴增產物與溴酚蘭上樣緩沖液混合，用微量移液器將樣品依次加入加樣孔內，蓋上電泳槽并通電60～100V恒壓電泳，使DNA向陽極方向移動，電泳完成后，切斷電源，取出凝膠，將此凝膠經溴化乙錠溶液浸泡后取出，放在透射紫外燈下觀察，將樣品孔出現的電泳帶比對陽性對照和陰性對照，以判定樣品為犬細小病毒陽性或陰性。
本發明所設置的PCR檢測試劑盒，一般可采用以下配置(1)PCR試劑管，試劑管內含10×buffer1.5～2.5μl，2.5mMdNTP1.5～3μl，0.2ug/ul的引物1和引物2各0.3～0.6μl，25mM MgCl20.6μl；(2)陽性對照，該對照為經CTAB消化，酚氯仿抽提的犬細小病毒DNA模板；(3)陰性對照，該對照為不含犬細小病毒并經熱處理的糞樣；(4)Taq酶7μl，3U/μl；(5)普通瓊脂糖0.8g；(6)10μg/μl溴化乙錠溶液1ml；(7)0.25％溴酚蘭上樣緩沖液100μl。
本發明在設計特異引物并成功建立犬細小病毒PCR檢測技術的基礎上，進一步研制成簡單快速敏感的PCR檢測試劑盒，簡化了試劑配制和樣品制備時間，并首次采用降落PCR程序進行反應，提高了本試劑盒的特異性和敏感性。本發明突出的優點是建立起一套標準方法，可快速、準確地檢測出供檢樣品中的CPV，可應用于對實驗動物犬的質量監測，也為寵物犬和軍犬、肉用犬等各種犬的疾病診斷提供簡單快速準確的方法。
以下對本發明的實施方式作進一步的詳細說明1、試劑盒的組成(1)PCR試劑管，試劑管內含10×buffer 2μl，2.5mMdNTP 3μl，0.2ug/ul的引物1和引物2各0.5μl，25mM MgCl20.6μl，用滅菌三蒸水補至15μl，其中引物1和引物2分別是由DNA合成儀按堿基序列為5’TACCATGGTACAGATCCAG3’和5’CTCCTATATCACCAAAGTTA3’合成的DNA片段；(2)陽性對照，該對照為經CTAB消化，酚氯仿抽提的犬細小病毒DNA模板；(3)陰性對照，該對照為不含犬細小病毒并經熱處理的糞樣；(4)Taq酶7μl，3U/μl；(5)普通瓊脂糖0.8g，可配成100ml；(6)10μg/μl溴化乙錠溶液1ml，可配成終濃度為0.5μg/ml；(7)0.25％溴酚蘭上樣緩沖液100μl。
2、試劑盒檢測操作規程取被測糞樣50μl放入滅菌離心管中，加50μl PBS(pH7.2)，充分振蕩后，3000轉/分離心10分鐘；取上清放入另一支滅菌離心管中，隔水煮沸10分鐘，放入冰水中5分鐘后，10000轉/分離心8分鐘，將上清按1/20稀釋后取2μl加入PCR試劑管中，同時取2μl陰陽對照分別加入另外兩支PCR試劑管中，每管再補3μl滅菌無離子水；稍離心后，96℃變性10分鐘，取出每管加入Taq酶0.3μl，稍離心混勻，置PCR儀進行擴增，PCR反應循環條件采用降落(TD)PCR程序94℃2分鐘，退火溫度從58℃開始，逐步降至48℃，每2個循環降低1℃，退火時間1分鐘，72℃30秒，如此進行22個循環，再94℃2分鐘，55℃1分鐘，72℃30秒進行10循環，最后72℃延伸10分鐘；將樣品擴增產物與上樣緩沖液混合，用微量移液器將樣品依次加入電泳槽中凝膠點樣孔內；100V恒壓電泳，電泳完成后，切斷電源，取出凝膠，將此凝膠浸泡在含溴化乙錠溶液中，5～7分鐘后取出，放在透射紫外燈下觀察，如果樣品孔出現和陽性對照同樣的電泳帶，而陰性對照無相同帶出現，則判此樣品為犬細小病毒陽性，否則為陰性。
權利要求
1．一種犬細小病毒的PCR檢測方法，其特征在于(一)設置PCR檢測試劑盒，該試劑盒包括(1)PCR試劑管，試劑管內含10×buffer，dNTP，引物1和引物2，MgCl2，所述的引物1和引物2分別是由DNA合成儀按堿基序列為5’TACCATGGTACAGATCCAG3’和5’CTCCTATATCACCAAAGTTA3’合成的DNA片段；(2)陽性對照，該對照為經CTAB消化，酚氯仿抽提的犬細小病毒DNA模板；(3)陰性對照，該對照為不含犬細小病毒并經熱處理的糞樣；(4)Taq酶；(5)普通瓊脂糖；(6)溴化乙錠溶液；(7)溴酚蘭上樣緩沖液；(二)按照以下操作規程進行檢測；(1)樣品處理糞樣+滅菌生理鹽水或PBS(PH7.2)，充分振蕩后，離心去沉淀，取上清放入另一支滅菌離心管中，隔水煮沸使蛋白質變性，放入冰水降溫后離心去沉淀，吸取上清放入另一離心管中保存備用；(2)PCR在PCR試劑管中加入經稀釋的樣品，同時設陰陽性對照，稍離心，94～96℃變性，每管加入Taq酶不少于0.3μl，稍離心混勻，置PCR儀進行擴增，PCR反應循環條件采用降落(TD)PCR程序；(3)擴增產物分析將瓊脂糖溶于電泳緩沖液，把溫熱凝膠倒入放好梳子的膠膜中，凝膠凝固后，移去梳子，將凝膠放入有電泳緩沖液的電泳槽，將樣品擴增產物與溴酚蘭上樣緩沖液混合，用微量移液器將樣品依次加入加樣孔內，蓋上電泳槽并通電60～100V恒壓電泳，使DNA向陽極方向移動，電泳完成后，切斷電源，取出凝膠，將此凝膠經溴化乙錠溶液浸泡后取出，放在透射紫外燈下觀察，將樣品孔出現的電泳帶比對陽性對照和陰性對照，以判定樣品為犬細小病毒陽性或陰性。
2．根據權利要求1所述的犬細小病毒的PCR檢測方法，其特征在于所述的PCR檢測試劑盒包括(1)PCR試劑管，試劑管內含10×buffer1.5～2.5μl，2.5mMdNTP1.5～3μl，0.2ug/ul的引物1和引物2各0.3～0.6μl，25mM MgCl20.6μl；(2)陽性對照，該對照為經CTAB消化，酚氯仿抽提的犬細小病毒DNA模板；(3)陰性對照，該對照為不含犬細小病毒并經熱處理的糞樣；(4)Taq酶7μl，3U/μl；(5)普通瓊脂糖0.8g；(6)10μg/μl溴化乙錠溶液1ml；(7)0.25％溴酚蘭上樣緩沖液100μl。
3．根據權利要求1所述的犬細小病毒的PCR檢測方法，其特征在于所說的PCR反應循環條件為采用降落(TD)PCR程序，不少于20循環。
全文摘要
本發明提供一種犬細小病毒的PCR檢測方法,本發明的內容包括一套由PCR試劑管、陽性對照、陰性對照、Taq酶、普通瓊脂糖、溴化乙錠溶液、溴酚蘭上樣緩沖液組成的PCR檢測試劑盒以及一套檢測操作程序。本發明突出的優點是建立起一套標準方法,可快速、準確地檢測出供檢樣品中的犬細小病毒,可應用于對實驗動物犬的質量監測,也為寵物犬和軍犬、肉用犬等各種犬的疾病診斷提供簡單快速準確的方法。
文檔編號C12Q1/68GK1298025SQ9911726
公開日2001年6月6日 申請日期1999年12月2日 優先權日1999年12月2日
發明者劉忠華, 鐘翎 申請人:廣東省昆蟲研究所