專利名稱：GFP－TNF－α融合蛋白原核表達系統構建及產物和應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種自動發光蛋白基因表達載體的構建極其表達產物和該表達產物在生物活性因子免疫性檢測，特別是在檢測腫瘤壞死因子(TNF)受體含量、分布，和檢測體液、細胞培養上清中TNF-α水平及可溶性TNF受體(sTNFR)含量中的應用。
人體內許多生物活性因子(包括部分外源性病原)都是通過與靶細胞受體結合，進而發揮生物學效應的，以調節機體的各種生理功能。因此，檢測這些因子與相應受體的親和力，和這些受體在組織器官的分布，以及其在病理情況下的改變，對了解生理功能和病理變化機制都具有十分重要的意義。長期以來，人們使用同位素標記配體，來檢測受體的量，做配體與受體親和力檢測，一直沿用至今。盡管同位素法敏感，但同位素對喚境污染和對人體的損害，迫使人們尋找非同位素標記物(如地高新，生物素等)取代，但多用于檢測可溶性因子，而對于配體一受體結合實驗，由于受定量較難等各種因素的限制，仍保留原檢測方法。
綠色熒光蛋白(GFP)源自海洋生物水母，能夠發射最大波長為509nm，最大吸收波長為395nm，并在475nm還有一個肩峰。GFP具有下列優點分子量小，無細胞毒性，不干擾標記蛋白的功能和定位，是目前唯一能在異源細胞內表達并自發產生熒光的蛋白，無需輔助因子的參與，可進行活體檢測。由于上述原因，GFP被認為是一種理想的報道基因，是研究細胞基因表達和表達產物分布的最好工具。目前，含GFP真核表達載體已經商品化。
腫瘤壞死因子-α(TNF-α)是一個具有廣泛生物學效應的細胞因子，其參與免疫調節，炎癥反應，抗腫瘤，組織修復等生理和病理過程。大量TNF-α的產生，可引起內毒素樣休克，發熱，多器官功能衰竭等，慢性可引起惡液質。TNF-α發揮其功能需要首先與TNF受體結合，在內毒素性休克和一些炎癥疾病時，TNF-α及其可溶性受體明顯增高，并與某些疾病的預后有明顯關系。
本發明的目的是構建綠色熒光蛋白(GFP)基因與人分泌型腫瘤壞死因子-α(TNF-α)基因融合體，使該融合體在大腸桿菌中表達的融合蛋白質既有TNF-α的抗原，又能發射易于檢測的綠色熒光。
本發明的另一個目的是提供一種利用本發明重組載體表達的既有TNF-α的抗原，又能發射易于檢測的綠色熒光的融合蛋白，替代同位素檢測法，檢測腫瘤壞死因子(TNF)受體含量、分布，和用于檢測體液、細胞培養上清中TNF-α水平及可溶性TNF受體(sTNFR)含量，使其具有特異性強，靈敏度高，重復性好，操作簡便快速，利于環保，有利人體健康，成本低，費用少，有利于減輕患者經濟負擔等特點。
本發明提供的用于腫瘤壞死因子及其受體檢測的發光蛋白基因表達重組載體，是在原核表達載體pRSET中插入含有綠色熒光蛋白(GFP)基因與人分泌型腫瘤壞死因子-α(TNF-α)基因融合體而構建成的重組的pRSET-GFP-TNF表達質粒。它的構建方法是①用EcorR I和Hind III雙酶消化含GFP基因的質粒(pS95A)，回收約700bpGFP cDNA片段；用與上述相同的雙酶消化原核表達載體pRSET，并將GFP cDNA片段插入該載體中，構成pRSET-GFP重組體；②用BamH I和hind III雙酶消化含TNF基因的pBSK-17KDTNF質粒，回收約近500bpTNF cDNA片段，插入用相同酶切的pRSET-GFP質粒，構建成pRSET-GFP-TNF重組體。該重組載體所含有的綠色熒光蛋白(GFP)基因與人分泌型腫瘤壞死因于-α(TNF-α)基因融合體含有如下堿基序列ATG AGC ACT GAA AGC ATG ATC CGG GAC GTG GAG CTG GCC GAG GAG GCGCTC CCC AAG AAG ACA GGG GGG CCC CAG GGC TCC AGG CGG TGC TTG TTC CTCAGC CTC TTC TCC TTC CTG ATC GTG GCA GGC GCC ACC ACG CTC TTC TGC CTGCTG CAC TTT GGA GTG ATC GGC CCC CAG AGG GAA GAG TTC CCC AGG GAC CTCTCT CTA ATC AGC CCT CTG GCC CAG GCA GTC AGA TCA TCT TCT CGA ACC CCGAGT GAC AAG CCT GTA GCC CAT GTT GTA GCA AAC CCT CAA GCT GAG GGG CAGCTC CAG TGG CTG AAC CGC CGG GCC AAT GCC CTC CTG GCC AAT GGC GTG GAGCTG AGA GAT AAC CAG CTG GTG GTG CCA TCA GAG GGC CTG TAC CTC ATC TACTCC CAG GTC CTC TTC AAG GGC CAA GGC TGC CCC TCC ACC CAT GTG CTC CTCACC CAC ACC ATC AGC CGC ATC GCC GTC TCC TAC CAG ACC AAG GTC AAC CTCCTC TCT GCC ATC AAG AGC CCC TGC CAG AGG GAG ACC CCA GAG GGG GCTGAG GCC AAG CCC TGG TAT GAG CCC ATC TAT CTG GGA GGG GTC TTC CAG CTGGAG AAG GGT GAC CGA CTC AGC GCT GAG ATC AAT CGG CCC GAC TAT CTC GACTTT GCC GAG TCT GGG CAG GTC TAC TTT GGG ATC ATT GCC CTG AGT AAA GGAGAA GAA CTT TTC ACT GGA GTT GTC CCA ATT CTT GTT GAA TTA GAT GGT GATGTT AAT GGG CAC AAA TTT TCT GTC AGT GGA GAG GGT GAA GGT GAT GCA ACATAC GGA AAA CTT ACC CTT AAA TTT ATT TGC ACT ACT GGA AAA CTA CCT GTTCCA TGG CCA ACA CTT GTC ACT ACT TTC ACT TAT GCT GTT CAA TGC TTT TCAAGA TAC CCA GAT CAT ATG AAA CAG CAT GAC TTT TTC AAG AGT GCC ATG CCCGAA GGT TAT GTA CAG GAA AAA ACT ATA TTT TTC AAA GAT GAC GGG AAC TACAAG ACA CGT GCT GAA GTC AAG TTT GAA GGT GAT ACC CTT GTT AAT AGA ATCGAG TTA AAA GGT ATT GAT TTT AAA GAA GAT GGA AAC ATT CTT GGA CAC AAATTG GAA TAC AAC TAT AAC TCA CAC AAT GTA TAC ATC ATG GCA GAC AAA CAAAAG AAT GGA ATC AAA GTT AAC TTC AAA ATT AGA CAC AAC ATT GAA GATGGA AGC GTT CAA CTA GCA GAC CAT TAT CAA CAA AAT ACT CCA ATT GGC GATGGC CCT GTC CTT TTA CCA GAC AAC CAT TAC CTG TCC ACA CAA TCT GCC CTTTCG AAA GAT CCC AAC GAA AAG AGA GAC CAC ATG GTC CTT CTT GAG TTT GTAACA GCT GCT GGG ATT ACA CAT GGC ATG GAT GAA CTA TAC AAA TAA本發明提供的用于腫瘤壞死因子及其受體免疫性檢測的發光蛋白，是由上述重組載體在大腸桿菌中表達的，具有發射可觀察的綠色熒光和腫瘤壞死因子抗原的GFP-TNF融合蛋白，該蛋白具有由前述的DNA序列所編碼的氨基酸序列。本發明提供的GFP-TNF-α融合蛋白，可用于①替代同位素，通過TNF-α與TNF受體結合試驗，檢測TNF受體的含量；②檢測TNF受體在組織、細胞 的分布；③檢測體液、細胞培養上清中TNF-α水平；④檢測體液、細胞培養上清中可溶性TNF受體(sTNFR)的含量；其實用意義在于有利于對疾病的診斷和對病情的監控。
本發明產物及方法的優點在于因直接與配體融合表達，故其特異性強；因GFP可直接發光，不需再加任何輔助因子，所以操作簡便，且靈敏度高，重復性好；由于其有效替代了傳統的同位素檢測法，故有利于環保，對人體無損害；由于采用大腸桿菌生產本發明融合蛋白，其生產成本低廉，可減輕患者經濟負擔。
圖1為GFP-TNF原核表達載體構建流程圖；圖2為實施例2中GFP-TNF含量測定標準曲線；圖3為實施例2中L929細胞TNF受體與GFP-TNF結合飽和曲線。
以下結合具體實施例對本發明作進一步的說明。
實施例1本實施例用以說明GFP-TNF-α重組體構建過程和原核細胞表達；①用EcorR I和Hind III雙酶消化含GFP基因的質粒(pS95A)，回收約700bpGFP cDNA片段；用與上述相同的雙酶消化原核表達載體pRSET，并將GFP cDNA片段插入該載體中，構成pRSET-GFP重組體；②用BamH I和hind III雙酶消化含TNF基因的pBSK-17KDTNF質粒，回收約近500bpTNF cDNA片段，插入用相同酶切的pRSET-GFP質粒，構建成pRSET-GFP-TNF重組體；③將pRSET-GFP-TNF重組質粒轉入大腸桿菌BL-12，在IPTG誘導下，讓大腸桿菌表達GFP-TNF融合蛋白，將菌體裂解離心，取上清過Ni-NTA層析柱，純化蛋白，用SDS-PAGE檢測蛋、白，在52KD處可見GFP-TNF融合蛋白。
④用TNF生物活性檢測，發現GFP-TNF有相近的胞毒活性，而且該胞毒作用可被抗TNF抗體特異性阻斷。將GFP-TNF與靶細胞孵育，熒光顯微鏡下可見細胞表面有環狀綠色熒光，如加未標記TNF，可競爭性抑制熒光在細胞表面著色。
實施例2至5用以進一步說明本發明的具體應用。
實施例2TNF-α與TNF受體結合試驗一、原理GFP-TNF可與細胞表面TNF受體特異結合，在受體量一定的情況下，隨GFP-TNF含量的增加，與TNF受體結合量也增加。當達到一定量時，受體配體結合可達飽和。測定飽和狀態下，一定量細胞產生的熒光強度，通過標準曲線熒光測定結果，即可求得與TNF受體結合的GFP-TNF含量，即相當于受體的含量。
二、操作步驟1.標準曲線制備GFP-TNF用量(3.92fmol/μl)0μl，0.1μl，0.5μl，1.0μl，5.0μl，10μl，50μl，100μl，用0.01M PBS調體積到1000μl，熒光測定。
2.細胞TNF受體含量測定取1×106細胞，加入以下5個濃度的GFP-TNF作飽和分析，非特異結合組同時加入300倍TNF標準品。各樣品作復孔。在37℃搖床培養2h后，放4℃，10min終止反應，收集細胞，離心去上清，并用PBS洗細胞一次，以去除游離的GFP-TNF。加1mlPBS混懸細胞，用熒光分光光度計，在波長480nm/509nm測定吸光度。特異結合等于總結合減去非特異結合。
三、實驗結果
1.標準曲線GFP-TNF用量(3.92fmol/μl)0μl，0.1μl，0.5μl，1.0μl，5.0μl，10μl，50μl，100μl測定結果(OD)0.02，0.18，0.43，1.5，6.4，8.5，58，116回歸方程Y＝-0.32061461+1.162034315X，r＝0.999618(見圖2)2.飽和曲線以細胞與GFP-TNF結合量(fmol/1×106細胞)為Y軸，不同濃度GFP-TNF為X軸(fmol)作圖(見圖3)。
X(fmol)3.92，19.6，39.2，78.4，196測定結果(OD)0.01，0.02，0.17，0.25，0.27Y(fmol/1×106細胞)1.011，1.148，1.654，1.925，1.991由圖3可見，最后兩個點之間雖然GFP-TNF含量增加1.5倍，但其OD值不變，提示配體與受體結合已達飽和狀態。
3.單點分析受體分子數當受體基本達到飽和狀態時，由標準曲線得知，此時GFP-TNF用量為78.4fmol。
受體總數(RT)＝1.925fmol/1×106細胞＝1158受體分子數/細胞實施例3原位TNF受體檢測一、原理一定量GFP-TNF融合蛋白與組織切片孵育，其可與細胞表面TNF受體特異結合。由于GFP可發出綠色熒光，在熒光顯微鏡下可檢測細胞熒光著色。由此可觀察TNF受體存在于何種組織或細胞，并在不同情況下進行定性比較。
二、操作步驟切片或細胞涂片加20ul(78.4fmol)的GFP-TNF，陰性對照組同時加入100倍的TNF標準品，于37℃反應1h。用PBS沖洗熒光顯微鏡觀察結果。
三、實驗結果Raji細胞陰性對照組無熒光蛋白結合，而實驗組可見細胞表面呈環狀熒光發光，用100倍TNF標準品，可完全阻斷GFP-TNF與細胞表面受體的結合。
實施例4體液或細胞培養上清TNF-α水平檢測一、原理
GFP-TNF(標記物)和標準品(非標記TNF)或被測物對有限量的抗TNF抗體發生可逆性地特異性競爭結合反應，最終形成的熒光復合物含量與樣品中TNF含量呈負相關。
二、操作步驟1.抗體稀釋曲線的制作用1％BSA-0.01MPBS，倍比稀釋抗TNF單抗，取其效價為1∶50-1∶3200，調體積為100ul，再加100ul1％BSA-0.01MPBS，及GFP-TNF蛋白5ul*(熒光測定結果為6.4)震蕩混勻，37℃反應2h。加入6％PEG-抗(抗鼠1g抗體)100ul。37℃反應2h。2500rpm，15min，4℃離心。分離游離與結合的GFP-TNF，用熒光分光光度計測定總的熒光數值(T)及各管特異結合值(B)。橫坐標為抗體稀釋度，縱坐標為B/T，繪制抗體稀釋曲線，選用結合率(B/T)為30-50％時的抗體稀釋度為TNF抗原含量測定的最適抗體濃度，進行標準曲線及樣品測定。
2.標準曲線制備及樣品測定TNF標準品(曲線范圍0.050～320ng/ml)及樣品每管100ul，做雙管，GFP-TNF5ul，及100ul一抗(按已選好的稀釋度)，其它程序同上。每批樣品測定均做標準曲線，由標準曲線計算樣品中TNF含量。
實施例5體液或細胞培養上清可溶性TNF受體(sTNFR)檢測一、原理GFP-TNF可與sTNFR特異結合，足量的GFP-TNF存在時，測定不同含量的TNFR標準品的熒光值，做標準曲線，由待測樣品的熒光值，通過標準曲線便可得知其sTNFR的含量。
二、操作步驟sTNFR標準品(0.02-102.4ng/ml)和樣品，每管100ul，做雙管，GFP-TNF50ul，37℃反應2h。再加入6％PEG8000，離心分離，測沉淀部分的熒光值。每批樣品測定均做標準曲線，測定值由標準曲線計算樣品中sTNFR的含量。
權利要求
1.在原核表達載體pRSET中插入含有綠色熒光蛋白(GFP)基因與人分泌型腫瘤壞死因子-α(TNF-α)基因構建成的重組的pRSET-GFP-TNF表達質粒。
2.根據權利要求1所述的重組載體，其特征在于它的構建方法是①用EcorR I和Hind III雙酶消化含GFP基因的質粒(pS95A)，回收約700bpGFP cDNA片段；用與上述相同的雙酶消化原核表達載體pRSET，并將GFP cDNA片段插入該載體中，構成pRSET-GFP重組體；②用BamH I和hind III雙酶消化含TNF基因的pBSK-17KDTNF質粒，回收約近500bpTNF cDNA片段，插入用相同酶切的pRSET-GFP質粒，構建成pRSET-GFP-TNF重組體；
3.根據權利要求1或2所述的重組基因表達載體，其特征在于其所含有的綠色熒光蛋白(GFP)基因與人分泌型腫瘤壞死因子-α(TNF-α)基因融合體具有如下堿基序列ATG AGC ACT GAA AGC ATG ATC CGG GAC GTG GAG CTG GCC GAG GAG GCGCTC CCC AAG AAG ACA GGG GGG CCC CAG GGC TCC AGG CGG TGC TTG TTC CTCAGC CTC TTC TCC TTC CTG ATC GTG GCA GGC GCC ACC ACG CTC TTC TGC CTGCTG CAC TTT GGA GTG ATC GGC CCC CAG AGG GAA GAG TTC CCC AGG GAC CTCTCT CTA ATC AGC CCT CTG GCC CAG GCA GTC AGA TCA TCT TCT CGA ACC CCGAGT GAC AAG CCT GTA GCC CAT GTT GTA GCA AAC CCT CAA GCT GAG GGG CAGCTC CAG TGG CTG AAC CGC CGG GCC AAT GCC CTC CTG GCC AAT GGC GTG GAGCTG AGA GAT AAC CAG CTG GTG GTG CCA TCA GAG GGC CTG TAC CTC ATC TACTCC CAG GTC CTC TTC AAG GGC CAA GGC TGC CCC TCC ACC CAT GTG CTC CTCACC CAC ACC ATC AGC CGC ATC GCC GTC TCC TAC CAG ACC AAG GTC AAC CTCCTC TCT GCC ATG AAG AGC CCC TGC CAG AGG GAG ACC CCA GAG GGG GCTGAG GCC AAG CCC TGG TAT GAG CCC ATC TAT CTG GGA GGG GTC TTC CAG CTGGAG AAG GGT GAC CGA CTC AGC GCT GAG ATC AAT CGG CCC GAC TAT CTC GACTTT GCC GAG TCT GGG CAG GTC TAC TTT GGG ATC ATT GCC CTG AGT AAA GGAGAA GAA CTT TTC ACT GGA GTT GTC CCA ATT CTT GTT GAA TTA GAT GGT GATGTT AAT GGG CAC AAA TTT TCT GTC AGT GGA GAG GGT GAA GGT GAT GCA ACATAC GGA AAA CTT ACC CTT AAA TTT ATT TGC ACT ACT GGA AAA CTA CCT GTTCCA TGG CCA ACA CTT GTC ACT ACT TTC ACT TAT GCT GTT CAA TGC TTT TCAAGA TAC CCA GAT CAT ATG AAA CAG CAT GAC TTT TTC AAG AGT GCC ATG CCCGAA GGT TAT GTA CAG GAA AAA ACT ATA TTT TTC AAA GAT GAC GGG AAC TACAAG ACA CGT GCT GAA GTC AAG TTT GAA GGT GAT ACC CTT GTT AAT AGA ATCGAG TTA AAA GGT ATT GAT TTT AAA GAA GAT GGA AAC ATT CTT GGA CAC AAATTG GAA TAC AAC TAT AAC TCA CAC AAT GTA TAC ATC ATG GCA GAC AAA CAAAAG AAT GGA ATC AAA GTT AAC TTC AAA ATT AGA CAC AAC ATT GAA GATGGA AGC GTT CAA CTA GCA GAC CAT TAT CAA CAA AAT ACT CCA ATT GGC GATGGC CCT GTC CTT TTA CCA GAC AAC CAT TAC CTG TCC ACA CAA TCT GCC CTTTCG AAA GAT CCC AAC GAA AAG AGA GAC CAC ATG GTC CTT CTT GAG TTT GTAACA GCT GCT GGG ATT ACA CAT GGC ATG GAT GAA CTA TAC AAA TAA
4.根據權利要求1或2所述的重組載體在大腸桿菌中表達的具有發射可觀察的綠色熒光和腫瘤壞死因子生物活性的GFP-TNF融合蛋白。
5.根據權利要求3所述的重組載體在大腸桿菌中表達的具有發射可觀察的綠色熒光和腫瘤壞死因子生物活性的GFP-TNF融合蛋白。
6.根據權利要求4所述的融合蛋白，其特征在于它具有權利要求3所述的DNA序列所編碼的氨基酸序列。
7.根據權利要求5所述的融合蛋白，其特征在于它具有權利要求3所述的DNA序列所編碼的氨基酸序列。
8.根據權利要求4至7中任一項所述的融合蛋白，其特征在于它在腫瘤壞死因子(TNF)及其受體的免疫性檢測中的應用。
9.根據權利要求4至7中任一項所述的融合蛋白，其特征在于它在檢測腫瘤壞死因子(TNF)的含量、體液及細胞培養上清中TNF-α水平或可溶性TNF受體(sTNFR)含量，或在檢測TNF受體在組織、細胞分布中的應用。
全文摘要
本發明提供了在原核表達載體pRSET中插入含有綠色熒光蛋白(GFP)基因與人分泌型腫瘤壞死因子－α(TNF－α)基因融合體而構建成的重組的pRSET－GFP－TNF表達質粒,其在大腸桿菌中表達的融合蛋白質既有TNF－α的抗原,又能發射易于檢測的綠色熒光,可用于替代同位素法檢測腫瘤壞死因子(TNF)及其受體,具有特異性強,靈敏度高,重復性好,操作簡便快速、成本低,利于環保和人體健康等特點。
文檔編號C12N15/70GK1272549SQ99116458
公開日2000年11月8日 申請日期1999年5月4日 優先權日1999年5月4日
發明者李卓婭, 石文芳, 孫義敏, 龔非力, 姜曉丹 申請人:同濟醫科大學