專利名稱：人內皮細胞抑制素基因及其表達產物的生產和應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于基因工程技術領域，具體涉及人內皮細胞抑制素基因、含有該基因的載體以及用該載體轉化的菌株及其表達產物的生產和應用。
內皮細胞抑制素(Endostatin)是1997年Folkman實驗室從鼠血管內皮細胞瘤(Hemangioendothelioma)細胞中分離的一種蛋白質，是膠原蛋白ⅩⅧ(collagen ⅩⅧ)C端的20KD的片段。與血管生成抑制素一樣，它能抑制內皮細胞的增殖和新生血管的形成并抑制小鼠Lewis肺癌、T241纖維肉瘤，EOMA血管內皮細胞瘤，B16F10黑色素瘤的原發瘤和轉移瘤的生長。與現有的抗癌藥物不同，它的作用機理是通過抑制腫瘤新生血管的形成，切斷腫瘤的血液供應和營養供給從而抑制腫瘤的轉移和生長。由于正常組織的血管內皮細胞是不再分裂增殖的，不受該藥物的影響。因而這種抗癌蛋白具有高度的選擇性、特異性和極小的毒副作用。由于通過培養血管內皮細胞瘤細胞提取來源有限，成本高，應用基因工程技術生產重組人內皮細胞抑制素就顯得十分必要。
本發明的目的包括1)提供重組人內皮細胞抑制素基因；2)構建含有該基因的載體特別是表達載體；3)提供由該基因轉化的微生物菌株；4)提供由這些轉化菌株高效表達、生產重組人內皮細胞抑制素的方法；5)表達產物的應用。
本發明的人內皮細胞抑制素基因是以人膠原蛋白ⅩⅧcDNA為模板，經PCR方法擴增而得到的，它相當于人膠原蛋白ⅩⅧ cDNA3’端從終止密碼至其上游(5’端)184個密碼子共555bp(包括PCR中加的起始密碼ATG)的DNA片段，該基因的基本特征如下a．序列特征長度555bp類型核酸鏈數雙鏈b．分子類型DNAc．來源克隆自人膠原蛋白ⅩⅧcDNA為模板的PCR產物d．DNA序列及其編碼的氨基酸序列如序列表1(SEQ ID No:1)。
本發明所用作PCR模板的人膠原蛋白ⅩⅧcDNA的DNA序列已在以下文獻中公開Suk P.Oh et al,Cloning of cDNA and genomic DNA encoding human Type ⅩⅧ collagenand localization of the α1(ⅩⅧ)collagen gene to mouse chromosome 10 and humanchromosome 21,Genomics,(1994)19:494-499。
本發明還構建了含有上述人內皮細胞抑制素基因的載體，特別是含有該基因的大腸桿菌表達載體以及枯草桿菌、畢節酵母、假絲酵母和漢生酵母的表達載體。這些載體的構建方法是按常規方法，將通過PCR方法合成的人內皮細胞抑制素基因經酶切后接入相應載體的相應酶切位點之間，生成含人內皮細胞抑制素基因的表達載體。
上述含人內皮細胞抑制素基因的大腸桿菌表達載體優選由本發明合成的人內皮細胞抑制素基因與大腸桿菌表達載體pBV220構建成的重組表達載體，命名為pBVE20。其構建過程如
圖1所示。
本發明還用上述含有人內皮細胞抑制素基因的相應表達載體分別構建了能高效表達人內皮細胞抑制素的大腸桿菌重組株以及枯草桿菌、畢節酵母、假絲酵母和漢生酵母重組株。
本發明還提供了利用上述大腸桿菌重組株生產人內皮細胞抑制素的方法，該方法是將菌株進行培養發酵并經熱誘導使其高效表達人內皮細胞抑制素重組蛋白，再收集菌體，經分離純化得到重組人內皮細胞抑制素產品。
本發明的上述能表達人內皮細胞抑制素的大腸桿菌重組菌株優選由含有人內皮細胞抑制素基因的表達載體pBVE20轉化大腸桿菌DH5α而得到的菌株，命名為Escherichia coliDH5α(pBVE20)，簡稱E.coli DH5α(pBVE20)。
利用該大腸桿菌重組菌株E.coli DH5α(pBVE20)生產人內皮細胞抑制素的具體方法為(1)菌種的培養發酵將菌種接種在含有氨芐青霉素的LB液體培養基中28～30℃,150～200轉/分培養過夜，次日轉種于相同的培養基中，28～30℃,200～250轉/分培養1～4h，升溫至42℃繼續振搖培養3～4h后收菌；(2)表達產物的純化收集上述培養的菌體，將細胞破碎后離心收集包涵體沉淀，用含Triton X-100和2M尿素的STE溶液反復洗滌沉淀，然后將沉淀溶于8M尿素中，復性并經Heparin-Sepharose親和層析，經凍干即為純化的人內皮細胞抑制素。
上述方法中的菌種培養發酵步驟可采用15升發酵罐進行高密度發酵，以提高生產效率和產量。
上述方法制得的重組人內皮細胞抑制素在小鼠實驗中表現出對腫瘤生長和轉移的強抑制作用，可作為有效成份用于制備新一代的抗癌藥物。
本發明的大腸桿菌重組菌株E.coli DH5α(pBVE20)已保藏于中國典型培養物保藏中心(CCTCC，中國武漢大學校內)，保藏編號CCTCC M99003，保藏日1999年2月8日。
由該E.coli DH5α(pBVE20)菌株可擴增、提取得到本發明的重組表達載體pBVE20及人內皮細胞抑制素基因。方法是(1)取E.coli DH5α(pBVE20)單菌落接種于LB培養基中，30℃培養過夜，離心收集菌體，用常規的堿裂解法提取質粒pBVE20。
(2)用限制酶EcoRⅠ和BamHⅠ酶解質粒pBVE20產生兩條帶，分離提取約560bp的小帶即為人內皮細胞抑制素基因。
用上述方法得到的人內皮細胞抑制素基因與適當的載體連接，即可構建出所需的含人內皮細胞抑制素基因的載體。用所構建的表達載體即可轉化并構建出相應的能表達重組人內皮細胞抑制素的重組菌株。
本發明的人內皮細胞抑制素基因通過與適當的表達載體連接后可在相應的微生物菌株中高效表達，經分離純化即可獲得高純度的重組人內皮細胞抑制素。所以，通過本發明可方便地大量生產重組人內皮細胞抑制素，而且成本較低。這將為獲得來源穩定、成本便宜的重組人內皮細胞抑制素并用其制備高療效低毒副作用的新一代抗癌藥物提供一條切實可行的途徑。
以下通過實施例和附圖對本發明作進一步詳細說明。
圖1是重組表達載體pBVE20的構建過程示意圖，其中，PR、PL為噬菌體啟動子，T1、T2為rmB的轉錄終止序列。
圖2是重組人內皮細胞抑制素基因表達產物的SDS-PAGE凝膠電泳圖譜。其中，1是標準分子量對照，2是未經誘導的DH5α(pBVE20)菌體，3是42℃誘導的含空載體的DH5α(pBV220)菌體，4是42℃誘導表達的DH5α(pBVE20)菌體，N為表達蛋白。
圖3是重組人內皮細胞抑制素基因表達產物對小鼠黑色素瘤的抑制作用，其中，A是對照組小鼠，B是試驗組小鼠。
實施例1人內皮細胞抑制素基因的合成根據已發表的人膠原蛋白ⅩⅧcDNA序列，設計合成兩段引物5’端引物是CCGAATTCATGCACAGCCACCGCGACTTCCA
3’端引物是CCGGATCCGCGGCCGCTACTTGGAAGGCAGTCATGAAGC5’端引物在20個同源堿基前加EcoRⅠ限制酶切位點及起始密碼ATG,3’端引物除20個同源堿基外另加NotⅠ及BamHⅠ限制酶切位點。以人膠原蛋白ⅩⅧcDNA為模版，經PCR擴增合成約0.6kb的內皮細胞抑制素基因，反應條件為第一循環94℃變性4分鐘，55℃退火1分鐘，72℃延伸1分鐘；以后各循環94℃變性1分鐘，55℃退火1分鐘，72℃延伸1分鐘，共25個循環。將擴增產物克隆到載體pSP72的EcoRⅠ與BamHⅠ之間獲得重組質粒pSPE2，進行DNA序列測定，結果如序列表1。該序列與預期的人內皮細胞抑制素基因序列是一致的，表明PCR產物是人內皮細胞抑制素基因。
實施例2含人內皮細胞抑制素的大腸桿菌質粒pBVE20的構建用限制酶EcoRⅠ與BamHⅠ將人內皮細胞抑制素基因從質粒pSPE2上切下，分離后與經EcoRⅠ及BamHⅠ酶切的載體pBV220連接，轉化大腸桿菌，篩選具有氨芐青霉素抗性的轉化子，經質粒提取，酶切鑒定后證明人內皮細胞抑制素基因已克隆至pBV220中，將重組質粒命名為pBVE20。構建過程見圖1。
實施例3能高效表達人內皮細胞抑制素的大腸桿菌重組株E.coli DH5α(pBVE20)的構建用CaCl2法將pBVE20轉化E.coli DH5α，在含氨芐青霉素的LB平板上篩選轉化子，經質粒檢測和酶切分析獲得含pBVE20的重組轉化子E.coli DH5α(pBVE20)。
實施例4含人內皮細胞抑制素基因的假絲酵母表達載體pUAKE5的構建用EcoRⅠ,NotⅠ將人內皮細胞抑制素基因從質粒pBVE20上切下，分離純化后與經EcoRⅠ,NotⅠ酶切后的pUAK8混合，用T4 DNA連接酶連接，轉化大腸桿菌DH5α，篩選具有氨芐青霉素抗性的轉化子，以標準方法提取質粒，用限制酶EcoRⅠ,NotⅠ酶切重組質粒，得到兩個片段，其大小分別與pUAK8及人內皮細胞抑制素基因相同，證明人內皮細胞抑制素基因已克隆至pUAK8中，將重組質粒命名為pUAKE5。
實施例5能高效表達人內皮細胞抑制素基因的假絲酵母重組菌株Candida boidinii(pUAKE5)的構建用LiCl轉化法將pUAKE5引入波氏假絲酵母，用含不同濃度的G418的培養基篩選多拷貝整合的重組菌株，檢測其表達人內皮細胞抑制素的水平，獲得能高效表達人內皮細胞抑制素的的重組菌株Candida boidinii(pUAKE5)。
實施例6含內皮細胞抑制素基因的枯草桿菌工程菌DB1342(pURTQE4)的構建。
用限制酶EcoRⅠ和BamHⅠ酶切質粒pBVE20，電泳分離含人內皮細胞抑制素基因的小片段，接到枯草芽孢桿菌質粒pURTQ4的相應位點上，獲得含人內皮細胞抑制素基因的表達質粒pURTQE4。然后用感受態轉化法將pURTQE4轉入枯草桿菌DB1342，即獲得枯草桿菌工程菌DB1342(pURTQE4)。
實施例7含內皮細胞抑制素基因的漢生酵母工程菌的構建將人內皮細胞抑制素基因從質粒pSPE2上切下，重組進大腸桿菌-漢生酵母質粒pUMH32，獲得含內皮細胞抑制素基因的重組質粒pUMHE32，然后用電激轉化法將其引入漢生酵母Hansenula polymorpha A16，獲得漢生酵母工程菌Hansenula polymorpha A16(pUMHE32)。
實施例8含內皮細胞抑制素基因的畢節酵母工程菌的構建將人內皮細胞抑制素基因從質粒pSPE2上切下，重組進大腸桿菌-畢節酵母質粒pPU5的相應位點，轉化大腸桿菌DH5α，在氨芐青霉素平板上篩選轉化子，經質粒檢測和酶切鑒定無誤后，將重組質粒命名為pPUE5。用LiCl轉化法將pPUE5引入畢節酵母Pichia pastoris，獲得畢節酵母工程菌Pichia pastoris(pPUE5)。
實施例9利用大腸桿菌基因工程菌E.coli DH5α(pBVE20)生產重組人內皮細胞抑制素。
(1)菌種的培養發酵挑取大腸桿菌基因工程菌E.coli DH5α(pBVE20)單菌落接種在含100ug/ml氨芐青霉素的液體LB培養基中，30℃,200轉/分振蕩培養過夜，次日按10％接種量轉種于適當體積的相同培養基中，30℃,250轉/分振蕩培養1小時，待A600約為0.4時轉至45℃水浴中搖動5分鐘，使之迅速升溫至42℃誘導外源基因表達，在42℃條件下繼續振蕩培養4小時后收菌。
取少量細胞加2×上樣緩沖液，煮沸5分鐘后按標準方法走SDS-PAGE凝膠電泳。結果如圖2，經誘導的DH5α(pBVE20)在20kd的位置上出現一條新的蛋白帶，未誘導的DH5α(pBVE20)及DH5α(pBV220)不出現此帶，證明人內皮細胞抑制素已在DH5α(pBVE20)中誘導表達。
(2)表達的重組人內皮細胞抑制素的純化收集高效表達重組人內皮細胞抑制素的菌體，經超聲波破碎后離心收集包含體沉淀，用含TritonX-100的STE溶液和含2M尿素的STE溶液反復洗滌沉淀，除去細胞碎片，雜蛋白，核酸等雜質，按每10毫克包含體加2毫升含8M尿素的溶解緩沖液中，室溫放置1小時即可溶解。緩緩加入10倍體積的復性液復性。復性蛋白經肝素-Sepharose 4B親和層析和SP-Sepharose離子交換層析純化，凍干即為重組人內皮細胞抑制素純品。
實施例10利用假絲酵母重組菌株Candida boidinii(pUAKE5)生產重組人內皮細胞抑制素(1)菌種的培養發酵挑取工程菌Candida boidinii(pUAKE5)單菌落接種于MGM(1.34％YNB,1％甘油，4×10-5％生物素)培養基中30℃振蕩培養過夜，次日再轉接至新鮮的相同培養基中，30℃繼續培養，每隔24小時流加甲醇至終濃度為0.5％,120小時后離心收集上清，用液氮速凍后保存備用。
(2)表達的重組人內皮細胞抑制素的純化將冰凍的發酵上清液解凍后，用超濾法濃縮，濃縮液上肝素-Sepharose 4B親和層析和SP-Sepharose離子交換層析純化。
實施例11重組人內皮細胞抑制素抑(抗)癌試驗C57B16/J小鼠或裸鼠。20±2g，各20只，背部皮下接種B16黑色素瘤或人肺癌/肝癌細胞懸液(5×106個/mL)。接種10天后待瘤體積達100-200mm3時，試驗組分別注射5mg/kg/天人內皮細胞抑制素，對照組注射0.3mL PBS，每24小時給藥一次。兩周后觀察小鼠體重及瘤體積/重量的變化，結果如圖3。從結果可見，試驗組小鼠的瘤體積明顯小于對照組，說明重組人內皮細胞抑制素可高效抑制B16黑色素瘤和肺癌等的生長，可用于制備抗腫瘤藥物。
序列表1(SEQ ID No:1)ATG CAC AGC CAC CGC GAC TTC CAG CCG GTG CTC CAC CTG GTT GCG CTC 48Met His Ser His Arg Asp Phe Gln Pro Val Leu His Leu Val Ala LeuAAC AGC CCC CTG TCA GGC GGC ATG CGG GGC ATC CGC GGG GCC GAC TTC 96Asn Ser Pro Leu Ser Gly Gly Met Arg Gly Ile Arg Gly Ala Asp PheCAG TGC TTC CAG CAG GCG CGG GCC GTG GGG CTG GCG GGC ACC TTC CGC 144Gln Cys Phe Gln Gln Ala Arg Ala Val Gly Leu Ala Gly Thr Phe ArgGCC TTC CTG TCC TCG CGC CTG CAG GAC CTG TAC AGC ATC GTG CGC CGT 192Ala Phe Leu Ser Ser Arg Leu Gln Asp Leu Tyr Ser Ile Val Arg ArgGCC GAC CGC GCA GCC GTG CCC ATC GTC AAC CTC AAG GAC GAG CTG CTG 240Ala Asp Arg Ala Ala Val Pro Ile Val Asn Leu Lys Asp Glu Leu LeuTTT CCC AGC TGG GAG GCT CTG TTC TCA GGC TCT GAG GGT CCG CTG AAG 288Phe Pro Ser Trp Glu Ala Leu Phe Ser Gly Ser Glu Gly Pro Leu LysCCC GGG GCA CGC ATC TTC TCC TTT GAC GGC AAG GAC GTC CTG AGG CAC 336Pro Gly Ala Arg Ile Phe Ser Phe Asp Gly Lys Asp Val Leu Arg HisCCC ACC TGG CCC CAG AAG AGC GTG TGG CAT GGC TCG GAC CCC AAC GGG 384Pro Thr Trp Pro Gln Lys Ser Val Trp His Gly Ser Asp Pro Asn GlyCGC AGG CTG ACC GAG AGC TAC TGT GAG ACG TGG CGG ACG GAG GCT CCC 432Arg Arg Leu Thr Glu Ser Tyr Cys Glu Thr Trp Arg Thr Glu Ala ProTCG GCC ACG GGC CAG GCC TCC TCG CTG CTG GGG GGC AGG CTC CTG GGG 480Ser Ala Thr Gly Gln Ala Ser Ser Leu Leu Gly Gly Arg Leu Leu GlyCAG AGT GCC GCG AGC TGC CAT CAC GCC TAC ATC GTG CTC TGC ATT GAG 528Gln Ser Ala Ala Ser Cys His His Ala Tyr Ile Val Leu Cys Ile GluAAC AGC TTC ATG ACT GCC TCC AAG TAG 555Asn Ser Phe Met Thr Ala Ser Lys stop
權利要求
1．人內皮細胞抑制素基因，其特征是它是以人膠原蛋白ⅩⅧ cDNA為模板，經PCR方法擴增而得到的來源于人膠原蛋白ⅩⅧ cDNA的3’端所對應的基因片段，它是人膠原蛋白ⅩⅧ cDNA上從終止密碼算起至上游共184個密碼子的DNA序列，包括起始密碼ATG共555bp的片段，其DNA的核苷酸序列及其所編碼的氨基酸序列如下ATG CAC AGC CAC CGC GAC TTC CAG CCG GTG CTC CAC CTG GTT GCG CTC 48Met His Ser His Arg Asp Phe Gln Pro Val Leu His Leu Val Ala LeuAAC AGC CCC CTG TCA GGC GGC ATG CGG GGC ATC CGC GGG GCC GAC TTC 96Asn Ser Pro Leu Ser Gly Gly Met Arg Gly Ile Arg Gly Ala Asp PheCAG TGC TTC CAG CAG GCG CGG GCC GTG GGG CTG GCG GGC ACC TTC CGC 144Gln Cys Phe Gln Gln Ala Arg Ala Val Gly Leu Ala Gly Thr Phe ArgGCC TTC CTG TCC TCG CGC CTG CAG GAC CTG TAC AGC ATC GTG CGC CGT 192Ala Phe Leu Ser Ser Arg Leu Gln Asp Leu Tyr Ser Ile Val Arg ArgGCC GAC CGC GCA GCC GTG CCC ATC GTC AAC CTC AAG GAC GAG CTG CTG 240Ala Asp Arg Ala Ala Val Pro Ile Val Asn Leu Lys Asp Glu Leu LeuTTT CCC AGC TGG GAG GCT CTG TTC TCA GGC TCT GAG GGT CCG CTG AAG 288Phe Pro Ser Trp Glu Ala Leu Phe Ser Gly Ser Glu Gly Pro Leu LysCCC GGG GCA CGC ATC TTC TCC TTT GAC GGC AAG GAC GTC CTG AGG CAC 336Pro Gly Ala Arg Ile Phe Ser Phe Asp Gly Lys Asp Val Leu Arg HisCCC ACC TGG CCC CAG AAG AGC GTG TGG CAT GGC TCG GAC CCC AAC GGG 384Pro Thr Trp Pro Gln Lys Ser Val Trp His Gly Ser Asp Pro Ash GlyCGC AGG CTG ACC GAG AGC TAC TGT GAG ACG TGG CGG ACG GAG GCT CCC 432Arg Arg Leu Thr Glu Ser Tyr Cys Glu Thr Trp Arg Thr Glu Ala ProTCG GCC ACG GGC CAG GCC TCC TCG CTG CTG GGG GGC AGG CTC CTG GGG 480Ser Ala Thr Gly Gln Ala Ser Ser Leu Leu Gly Gly Arg Leu Leu GlyCAG AGT GCC GCG AGC TGC CAT CAC GCC TAC ATC GTG CTC TGC ATT GAG 528Gln Ser Ala Ala Ser Cys His His Ala Tyr Ile Val Leu Cys Ile GluAAC AGC TTC ATG ACT GCC TCC AAG TAG 555Asn Ser Phe Met Thr Ala Ser Lys stop
2．一種載體，其特征是該載體含有權利要求1所述的人內皮細胞抑制素基因。
3．按照權利要求2所述的載體，其特征是該載體為大腸桿菌表達載體。
4．按照權利要求3所述的載體，其特征是該載體為pBVE20。
5．按照權利要求2所述的載體，其特征是該載體為枯草桿菌、假絲酵母、畢節酵母或漢生酵母表達載體。
6．由權利要求3或4所述的表達載體轉化的能表達人內皮細胞抑制素的大腸桿菌。
7．按照權利要求6所述的大腸桿菌，其特征是它是由權利要求4的表達載體pBVE20轉入大腸桿菌DH5α中所形成的大腸桿菌重組株E.coli DH5α(pBVE20)即CCTCCM99003。
8．由權利要求5所述載體轉化的能表達人內皮細胞抑制素的枯草桿菌、假絲酵母、畢節酵母或漢生酵母。
9．利用權利要求6的大腸桿菌生產人內皮細胞抑制素的方法，經菌株培養、熱誘導使其高效表達人內皮細胞抑制素重組蛋白，再經分離純化得到重組人內皮細胞抑制素產品。
10．按照權利要求9所述的方法，其特征是所用的大腸桿菌為CCTCC M99003。
11．按照權利要求10所述的方法，其特征是具體步驟為(1)菌種的培養發酵將菌種接種在含有氨芐青霉素的LB液體培養基中，28～30℃,150～200轉/分培養過夜，次日轉種于相同培養基中，28～30℃,200-250轉/分培養1～4小時，升溫至42℃繼續振蕩培養3～4小時后收菌；(2)表達產物的純化收集上述培養的菌體，將細胞破碎后離心收集包含體沉淀，用含TritonX100和2M尿素的STE溶液反復洗滌沉淀，然后將沉淀溶于8M尿素中，復性并經肝素-Sepharose 4B親和層析和SP-Sepharose離子交換層析純化，經凍干即為純化的重組人內皮細胞抑制素。
12．按照權利要求11所述的方法，其特征是其中的菌種培養發酵是采用15升發酵罐進行高密度發酵。
13．將按照權利要求9至12之一所述的方法獲得的重組人內皮細胞抑制素用于制備抗腫瘤藥物。
全文摘要
本發明屬于基因工程技術領域。本發明以人膠原蛋白XⅧcDNA為模板,經PCR方法合成人內皮細胞抑制素基因,并構建了含有該基因的載體和重組菌株。特別是含有該基因的大腸桿菌表達載體pBVE20及其轉化的大腸桿菌DH5α(pBVE20)重組株和利用此菌株生產重組人內皮細胞抑制素的方法。此菌株具有表達量高,表達產物易純化等優點。本發明將為獲得來源穩定價格便宜的重組人內皮細菌抑制素并用其制備新一代抗癌藥物提供一條切實可行的途徑。
文檔編號C12N15/81GK1224759SQ9911606
公開日1999年8月4日 申請日期1999年2月11日 優先權日1999年2月11日
發明者羅學斌, 羅進賢, 張添元, 李文清 申請人:羅學斌