專利名稱：雞毒支原體克隆致弱株的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬微生物新菌株。
雞毒支原體(Mycoplasma gallisepticum，MG)是雞慢性呼吸道病(Chronic Respiratory Disease of Chicken，CRD)的主要病原，因其廣泛的致病性和嚴重的經(jīng)濟損失而引起重視。近年來，MG的研究從常規(guī)的病原分離，血清學(xué)試驗，免疫和藥物控制發(fā)展到分子生物學(xué)研究，使人們從本質(zhì)上更深入地了解了MG的屬性，并為MG感染的控制提供了新技術(shù)。從家禽中分離的支原體有20種之多，但危害雞群的主要有3種MG，滑液囊支原體(M.Synoviae.MS)、火雞支原體(M.Meleagritis MM)。MS不同分離株致病力差異較大，主要病變在滑液囊、腱鞘和關(guān)節(jié)，也有的引起產(chǎn)蛋減少。MM引起火雞傳染性竇炎和火雞氣囊炎。危害最大是MG感染，它引發(fā)的癥狀表現(xiàn)在呼吸系統(tǒng)，主要病變在氣囊。本病分布于世界各地，死亡率不高，少數(shù)可達20％-30％，發(fā)病率高達90％以上，使幼雞生長不良，產(chǎn)蛋減少，造成重大損失。國外許多重型種雞場均已消滅了本病。據(jù)1990年江蘇省7個市25個雞場調(diào)查，陽性率達48.5％，目前CRD在大型雞場已成為與馬立克氏病、法氏囊病、產(chǎn)蛋減少綜合癥(EDS-76)并列重要的威脅養(yǎng)雞的四大病害之一。
MG菌體細小，卵圓形，直徑約0.25-0.5微米，革蘭氏陰性，姬姆薩氏染色和瑞氏染色著色良好，能發(fā)酵葡萄糖，培養(yǎng)時營養(yǎng)要求較高，在固體培養(yǎng)基上5-6天形成光滑圓形半透明小菌落，直徑0.2-0.3毫米，中心稍有突起。
7日齡雞胚卵黃囊接種，部分于5-7天后死亡，并產(chǎn)生特征性病變呼吸道干酪樣滲出物，關(guān)節(jié)膿腫，肝脾腫大，心包炎，全身水腫，肝臟壞死，連續(xù)傳代死亡更加規(guī)律明顯，在胚中卵黃囊和絨毛膜中含毒量最高。
病原在感染雞上呼吸道存在較多，下呼吸道、氣囊、卵巢、輸卵管中也能分離到。能凝集雞紅細胞，感染雞有血凝抑制抗體，故可用HI診斷本病。
病原抵抗力不強，20℃雞糞中存活1-3天，卵黃中37℃可存活8周，對熱有一定抵抗力，45℃可存活1小時，低溫下在雞舍的塵埃、糞便、飼料或飲水中可長期生存。MG凍干組織4℃可存活14年。一般消毒藥均能將其迅速殺死，對青霉素、新霉素、多粘霉素、磺胺類藥物及低濃度的醋酸鉈(1∶4000)有抵抗力，對鏈霉素和其他許多廣譜抗生素如土霉素、金霉素、氯霉素、卡那霉素及紅霉素等敏感，陽性雞場使用泰樂菌素、強力霉素、利高霉素、林可霉素(Linco-spectin 100)、支原凈(泰妙靈Tiamulin)、高力米先(Gallimycin)及北里霉素等均有較好療效。
由于MG只有一個血清型，為防制CRD，國外研究了許多疫苗株，如日本的G250株，法國的CP株，美國的F株，澳大利亞的Ts株，但均存在一些問題。S6株是MG的一個中毒株，國內(nèi)免疫病理學(xué)試驗也證明其毒力不強，免疫原性較差。
本發(fā)明的目的是提供一株雞毒支原體克隆弱毒株，該株由S6株三次固體克隆后無細胞培養(yǎng)致弱至168代次以上，形成有免疫原性的弱毒菌株。該株安全，不返強，易檢測，有較強的免疫原性，能有效地預(yù)防雞慢性呼吸道病。
本發(fā)明的目的可以通過以下措施來達到支原體(Mycoplasma，M.亦稱支原體)，最早由Nocard和Roux(1898)由牛傳染性胸膜肺炎病例中分離到，第一種支原體即絲狀支原體牛型亞種(M.mycoidessubsp.bovi/M.mycoides subsp.mycoides)分離后由于其性質(zhì)難以界定，遂將這一大類微生物命名為類胸膜肺炎微生物(PPLOs)。五十年代中期，始用支原體這一名稱。1967年，Edward和Frundt建議將其由裂殖菌綱分出來，單獨成立一個新綱軟膜體綱(Mollicutes柔膜菌綱，軟皮體綱)，支原體因缺少光合色素(葉綠素)，有別于裂殖藻綱；缺少堅硬的細胞壁和細胞壁成份，有別于裂殖菌綱；可以進行無細胞培養(yǎng)而有別于濾過性病毒。它是最小的能夠自我復(fù)制的原核生物，基因組大小只有典型細菌的20-40％。國際細菌系統(tǒng)分類委員會軟膜體綱分類分會(ICSB-ISTM)將軟膜體綱分四個目目I支原體目(Order I，Mycoplasmatales)；目II昆蟲原體目(OrderII，Entomoplasmatales)；目III無膽甾原體目(OrderIII，Acholoplasmatales)；目IV厭氧原體目(OrderIV，Anaeroplasmatales)。支原體目下設(shè)一個科即支原體科(FamilyI，Mycoplasmataceae)，科內(nèi)置兩屬支原體屬(Mycoplasma)，屬內(nèi)有120種；尿原體屬(Ureaplasma)，屬內(nèi)有6種，常見的動物支原體屬此兩屬。
雞毒支原體克隆致弱株(以下簡稱JS99克隆株)的分類地位為原核生物界(Procaryotae)軟壁菌門(Teneribacteria)軟膜體綱(Mollicutes)支原體目(Order I，Mycoplasmatales)支原體科(FamilyI，Mycoplasmataceae)支原體屬(Mycoplasma)雞毒支原體(Mycoplasma gallisepticum)雞毒支原體迄今全世界只有一個種，其模式株為PG31(ATCC19610，NCTC10115)，S6，A5969.
雞毒支原體JS99克隆株經(jīng)系列生化試驗證明為支原體屬成員，生長抑制試驗檢測血清型證明與雞毒支原體S6株為同一種。
目前，該菌株保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號是CGMCC NO.0397。
下面對本發(fā)明的培養(yǎng)及鑒定作進一步描述一、無細胞培養(yǎng)常用培養(yǎng)基配方A。牛心湯 1000ml煙酰胺 30mg葡萄糖 10g滅能馬血清 200ml酚紅 25mg25％酵母浸出液 40mlPH 8.0*固體培養(yǎng)基1％瓊脂B牛心消化湯 1000ml乳蛋白水解物 5gNaCl 5g25％酵母浸出液 50-100mlNAD(COI) 0.02g酚紅 0.01-0.02g精氨酸 0.1-0.2gEagles最低需要培養(yǎng)液中維生素(100×) 10ml豬血清 150ml醋酸鉈 0.25g青霉素 1000u/mlPH7.2*固體培養(yǎng)基加1％瓊脂，NAD為MS培養(yǎng)所必需C.改良的Hayflick培養(yǎng)基PPLO肉湯(Difco) 70ml馬或豬血清 15-20ml20％酵母浸出液 5ml葡萄糖 1g精氨酸 0.2g1％酚紅 0.1-0.2ml醋酸鉈(1∶80)1ml青霉素 1000u/mlD.牛心浸汁 75ml滅能健豬血清 12.5ml新鮮酵母浸液 1.3ml1％酚紅0.2ml0.4％醋酸鉈1mlPH7.2*牛心浸汁含1％葡萄糖，0.5％NaCl，0.5％多聚蛋白胨(Polypeptone)，10磅10分鐘高壓滅菌后保存，固體培養(yǎng)基用pplo瓊脂3.5g加水75ml溶解，另加15ml豬血清，1.3ml新鮮酵母浸液。E Friis改進培養(yǎng)基取成年健兔凈肌肉和兔心肌125克，磨碎，煮沸30分鐘，冷卻過濾，上清1000毫升，加0.2％葡萄糖(A.R.)，20％滅能的健康豬血清，2.5％新鮮酵母浸出汁，所有材料低溫下用1N NaOH溶液校正其pH到7.8，Φ0.1μl minipore濾器過濾去除細菌和支原體后，分裝貯存于4℃冰箱內(nèi)備用。二 雞毒支原體JS99株鑒定方法A 瑞氏染色法鏡檢涂片、固定、干燥后，瑞氏染色，置顯微鏡下油鏡1600倍，可見分散的大量具有特定多形態(tài)的菌體。B 固體菌落雞毒支原體JS99克隆株培養(yǎng)物作106-1010稀釋后，接種子PPLO Agar固體平板中，7％CO237℃培養(yǎng)4-8天可見特異性固體菌落，臍狀明顯，并對雞紅細胞有較強的血凝性。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點1、毒力較弱有安全性，并具有較好的免疫原性；2、固體菌落臍狀明顯，血凝性強，易于檢測；3、連續(xù)在雞上7代回歸不返強，150-170代有免疫原性。
其試驗結(jié)果如下一、致弱和安全性試驗結(jié)果1.材料與方法1.1試驗材料1.1.1培養(yǎng)基按常規(guī)方法配制Friis、KM2、牛心湯培養(yǎng)基及PPLO固體培養(yǎng)基。1.1.2試驗菌種MG JS-99克隆株對照菌種MG W 3野毒株，本室由CRD病雞中分離，經(jīng)與標準血清作生長抑制、凝集抑制試驗鑒定證明為MG。1.1.3試驗雞由南京東郊種雞場提供，SPF旦由揚州大學(xué)農(nóng)學(xué)院提供。1.2菌種克隆MG JS-99克隆株在Friis培養(yǎng)基上復(fù)狀后，上清作10(6)～10(9)稀釋(含0～10(2)ccu/ml)，按0.5ml/皿接種固體平板，37℃厭氣培養(yǎng)36h-72h后，低倍鏡下挑出單菌落克隆，在液體培養(yǎng)基上增殖后，重復(fù)上述步驟。經(jīng)三次克隆后的培養(yǎng)物以標準血清鑒定為MG。1.3連續(xù)回歸試驗 將MG JS-99克隆株F108培養(yǎng)物按0.5ml/只點眼、滴鼻接種1日齡京白雛雞，到15日齡無菌采集試驗雞肺、氣管、氣囊樣進行MG分離，分離物鑒定后，同上法重復(fù)，完成三次MG本動物回歸。第三次分離物F126作10(3)稀釋，卵黃囊接種9日齡SPF胚，每只0.1ml。雞胚孵出后由雛雞氣管、肺、氣囊中分離支原體，分離物鑒定后再接種SPF胚，在雞胚中再實現(xiàn)連續(xù)三次回歸。最后獲得經(jīng)本動物六次回歸的MG JS-99克隆株F141培養(yǎng)物。1.4氣管環(huán)致病性試驗 無菌手術(shù)采取一日齡雛雞氣管，Hank′s液輕洗后剪成0.5mm寬的氣管環(huán)，隨機分裝于含pH7.5 MEM培養(yǎng)液的小瓶中，加入MG稀釋培養(yǎng)物0.1ml(10(4)ccu/ml)。37℃培養(yǎng)，每天鏡檢，記錄纖毛運動百分率，試驗分為四組，每組4瓶，每瓶5環(huán)。1.5肉雞致病性試驗 6日齡AA肉雞40只，抽樣檢測HA抗體陰性。隨機分為三組，分別按0.5ml/只點眼、滴鼻接種MG JS-99克隆株F150、MG JS-99克隆株F144(第六次回歸培養(yǎng)物)、W3野毒和MG培養(yǎng)基，14日后采血測HA抗體，同時檢查臨床癥狀和氣囊病變。1.6免疫反應(yīng)性試驗 7日齡HA檢測陰性的海賽克斯雛雞30只隨機分為3組，每組10只，第一組左胸氣囊注射MG JS-99克隆株F153培養(yǎng)物0.5ml，第二組點眼，滴鼻MG JS-99克隆株F153培養(yǎng)物0.5ml，第三組空白對照，45日齡檢查HA抗體，并觀察臨床癥狀和氣囊病變。2.結(jié)果2.1回歸試驗表一MG JS-99克隆株F108六次連續(xù)回歸試驗結(jié)果
注(1)一例氣管、肺、氣囊樣均污染，分離未果。
(2)分別有1、2枚SPF胚在孵化中死亡。
歷時兩年的六次連續(xù)回歸試驗獲得了不同回歸代次的六株MGF113、F121、F126、F134、F136、F141(結(jié)果如表一)，3次動物感染試驗，從雞體中均分離出MG，但并不引起氣囊病變，初步顯示MG JS-99克隆株F108，F(xiàn)113，F(xiàn)121對雛雞已安全。第六次回歸分離株F144經(jīng)肉雞致病性試驗也證明并無返強現(xiàn)象(見表三)。本試驗表明，MG JS-99克隆株F108以上代次培養(yǎng)物在雞群中自然感染時可排除其返強的可能性。2.2不同毒株氣管環(huán)培養(yǎng)致病性試驗由表二可見，氣管環(huán)在MEM培養(yǎng)基中纖毛運動保持9天，證明氣管環(huán)培養(yǎng)可靠。對纖毛運動的抑制作用，野毒株最強，弱毒三次回歸株次之，MG JS-99克隆株F137最小。后兩者差異不大，但與前者比較，差異明顯。2.3肉雞致病性試驗由表三可見，MG JS-99克隆株F150大劑量(10(8)～10(9)ccu)感染雛雞不引起臨床癥狀和氣囊病變，連續(xù)經(jīng)過本動物三次水平傳播和三次垂直傳播后的回歸毒株仍很安全，而野毒株不僅能引起輕微的臨床癥狀，還有明顯的氣囊病變。20日齡HA抗體檢測還表明MG JS-99克隆株F150有較強的免疫原性。表二 不同毒株對氣管環(huán)培養(yǎng)纖毛運動的影響
注(1))纖毛運動比例和運動天數(shù)之積的累計值。
(2)表示可連續(xù)5天觀察到平均每環(huán)(10環(huán)累計平均數(shù))有25％以上纖毛運動。
(3)3次回歸分離株表三 肉雞致病性試驗結(jié)果
注(1))氣囊病變的評分標準-，氣囊透明；+，輕度混濁；++，少數(shù)小米粒大黃白色厚斑+++，條塊狀黃白色干酪樣物。氣囊病變兩側(cè)有++或一側(cè)有+++以上的試驗雞判為致病雞。(2)六次回歸培養(yǎng)物2.4免疫原性試驗左胸氣囊接種和點眼、滴鼻感染雞，45日齡HA檢查均呈強陽性(10/10，10/10)，沒有明顯的臨床癥狀，氣囊病變均呈陰性。空白對照HA8/10陰性。結(jié)果表明MG JS-99F153有較強的免疫原性，同時也表明它為一安全、低毒株。
二、免疫原性試驗結(jié)果1材料與方法1.1試驗材料1.1.1試驗菌種JS-99克隆株F156，強毒株MG W3，強毒株MG HS2，NDV IV系弱毒和IBV H52弱毒。1.1.2透明塑料隔離器 北京農(nóng)業(yè)大學(xué)實驗動物中心研制，試驗時隔離器經(jīng)過氧乙酸消毒后置于恒溫、空氣過濾的紫外消毒房間中。1.1.3氨水 25～28％，AR級，南京化工公司化工建材廠產(chǎn)。1.1.4試驗雞與飼養(yǎng)條件 SPF來航雞，由山東農(nóng)科院家禽研究所提供種蛋，消毒蛋殼后，孵化20d，過氧乙酸再消毒蛋殼后移入隔離器中出雛；48h內(nèi)出殼且生長良好的雛雞作試驗雞，隔離器飼養(yǎng)，飼養(yǎng)條件溫度25～29℃，濕度60～75％；飼料為普通混合料分裝成小袋，每袋1～2kg，250md劑量的Co60輻照滅菌；飲水為蒸氣高壓滅菌的自來水。1.2誘導(dǎo)因子氨的濃度選擇試驗關(guān)閉隔離器風(fēng)機后，向隔離器內(nèi)滅菌平皿中分別加入2、4、6、8、10ml氨水，揮發(fā)15min后，加蓋取出平皿，測量揮發(fā)量，并計算隔離器內(nèi)氨濃度。隔離器內(nèi)氮濃度[1/1000000(質(zhì)量分數(shù))]＝氨水揮發(fā)量(ml)×100隔離器體積(m3)維持2h，觀察6只SPF雞的反應(yīng)。1.3 70/1000 000(質(zhì)量分數(shù))氨環(huán)境對雞毒支原體人工發(fā)病的影響20日齡試驗雞10只分為3組，第一組4只，測定MG攻毒后經(jīng)70/1000 000(質(zhì)量分數(shù))氨刺激后的致病性；第二組4只，測定MG直接攻毒后的致病性第三組2只，經(jīng)氨刺激不攻毒對照。
攻毒方法將MG W3F 11和HS2F524h培養(yǎng)物按1∶1混和，攻毒雞點眼、滴鼻0.2ml，左胸氣囊注射0.2ml。氨應(yīng)激試驗在攻毒后6h進行，吸6ml氨水溶液在平皿中揮發(fā)，15min后余5.6ml，隔離器內(nèi)氨濃度達到70/1000 000(質(zhì)量分數(shù))，維持2h，每日進行2次，連續(xù)4d。攻毒后12天，撲殺試驗雞，剖檢并記錄氣囊病變。1.4NDV、IBV弱毒誘導(dǎo)CRD人工發(fā)病試驗20日齡SPF雞10只，分為三組，第一組4只滴鼻接種10頭份NDV和IBV弱毒苗，10min后進行MG人工感染；第二組4只，儀作MG攻毒；第三組2只滴鼻接種10頭份NDV、IBV弱毒苗，作不攻毒對照，攻毒后第12d撲殺試驗雞，剖檢記錄氣囊病變。1.5NDV、IBV弱毒誘導(dǎo)和氨環(huán)境刺激的聯(lián)合作用對CRD人工發(fā)病影響試驗30日齡SPF雞13只分為三組，第一組7只進行NDV、IBV弱毒誘導(dǎo)(同1.4)及MG人工感染，并在70/1000,000(質(zhì)量分數(shù))氨環(huán)境下刺激；第二組4只，僅作MG攻毒；第三組2只進行NDV、IBV弱毒誘導(dǎo)及氨刺激，作不攻毒對照，發(fā)病檢驗同1.3。1.6 MG JS-99克隆株F156培養(yǎng)物免疫原性試驗MG JS-99克隆株F156 24h培養(yǎng)物(10(9)～10(11)ccu)按0.5ml/只點眼、滴鼻接種3日齡SPF雞，免疫后逐日觀察臨診表現(xiàn)，并于第10d、20d、30d抽血樣，按常規(guī)方法(9)對血清樣品作MG HA和HI檢測，采血后免疫雞、對照雞分別標記后分批轉(zhuǎn)入另一隔離器，按1.5第一組方法攻毒，攻毒后逐日觀察臨診癥狀，12d后迫殺，解剖記錄氣囊病變。2結(jié)果2.1不同氨濃度環(huán)境下SPF雞的反應(yīng)觀察結(jié)果見表l。由表1可見，30/1000 000～50/1000 000(質(zhì)量分數(shù))氨濃度不能引起持續(xù)明顯的應(yīng)激作用，而85/1000 000以上氨濃度會對雞造成嚴重的傷害，甚至休克、死亡，70/1000 000的氨濃度可作為較適宜的應(yīng)激條件。表1不同氨濃度下試驗雞的應(yīng)激反應(yīng)氨濃度(1/1000 000(質(zhì)量分數(shù))) 試驗雞反應(yīng)30 時有閉目，飲水、采食、活動正常50 時有閉目、啄籠，飲食基本正常70 羞明，常閉眼，偶有咳嗽，有時蹲伏，飲食減少85 羞明，甩頭，咳嗽，后期擠成一堆，掙扎不起100 眼瞼緊閉，呼吸困難，休克2.2 70/1000 000(質(zhì)量分數(shù))氨環(huán)境對MG人工發(fā)病的影響結(jié)果見表2。由表2可見，單純氨刺激不能引起試驗雞臨診癥狀和氣囊病變，單純用MG攻毒也僅引起輕度氣囊病變，而增加氨應(yīng)激作用后試驗雞大部分發(fā)病(3/4)，并表現(xiàn)一定癥狀。2.3NDV、IBV弱毒誘導(dǎo)CRD人工發(fā)病影響結(jié)果見表3。由表3可見，經(jīng)NDV、IBV弱毒誘導(dǎo)，MG人工感染的致病性明顯增強，2/4可判為發(fā)病雞，而單純攻毒僅見3/4試驗雞有輕度氣囊病變，未攻毒對照雞氣囊無病理變化表2 70/1000 000(質(zhì)量分數(shù))氨環(huán)境對MG人工發(fā)病的影響
氣囊病變的評判標準-氣囊透明；+輕度混濁；++少數(shù)芝麻大小黃白色厚斑；+++條塊狀黃白色干酪樣物氣囊病變兩側(cè)有++或一側(cè)有+++以上的試驗雞判為發(fā)病雞。2.4弱毒誘導(dǎo)和氨環(huán)境刺激聯(lián)合作用對MG人工感染的影響表3 NDV、IBV 弱毒誘導(dǎo)對CRD人工發(fā)病的膨響
表4兩種誘因?qū)G人工感染的影響
由表4可見，經(jīng)NDV、IBV弱毒誘導(dǎo)后，MG攻毒雞經(jīng)氨環(huán)境刺激，12d后完全發(fā)病(7/7)，從而建立了MG人工感染的動物模型。2.5MG JS-99克隆株免疫原性測定結(jié)果見表5。試驗組1.3、2.4、3.4不免疫不攻毒試驗對照雞在整個試驗過程中未表現(xiàn)可視的呼吸道癥狀，血清學(xué)檢查陰性及氣囊病變陰性結(jié)果證明本批SPF來航雞質(zhì)量可靠。SPF蛋孵化前提取其卵黃抗體作HA和HI檢測亦呈陰性。MG S6克隆致弱株通過回歸試驗、氣管環(huán)培養(yǎng)纖毛運動損傷試驗及動物試驗已證明了它的安全性。本試驗所有免疫雞均未表現(xiàn)任何呼吸困難，氣囊病變亦不明顯，進一步證明了這一結(jié)論。試驗雞血清HA、HI檢測結(jié)果除2.1組外均基本相符，試驗雞免疫接種20d后開始有抗體出現(xiàn)，30d后大部分(7/8)呈陽性。由1.2、2.2、3.2結(jié)果，利用NDV、IBV誘導(dǎo)，并在氨環(huán)境的刺激作用下進行MG強毒人工感染效果確實，這樣保證了免疫雞攻毒保護率的可靠性。免疫組及對照組攻毒后3～4d均有表現(xiàn)輕度呼吸困難，10d均恢復(fù)。而1.1、2.1、3.1分別與1.2、2.2、3.2組試驗雞病理解剖氣囊病變結(jié)果表現(xiàn)出明顯的差異，免疫雞氣囊多輕度變濁，免疫后10d、20d、30d攻毒保護率分別達80％、75％、87.5％，近期免疫效果證明，MG S6克隆致弱株有良好的免疫原性。表5.MG JS-99克隆株F156培養(yǎng)物免疫SPF來航雞10d、20d、30d攻毒保護率的測定
權(quán)利要求
1.雞毒支原體克隆致弱株，該菌株保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號是CGMCC NO.0397。
全文摘要
本發(fā)明提供一株雞毒支原體克隆弱毒株,該株由S6株三次固體克隆后無細胞培養(yǎng)致弱至168代次以上,形成有免疫原性的弱毒菌株。該株安全,不返強,易檢測,有較強的免疫原性,能有效地預(yù)防雞慢性呼吸道病。該菌株保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心,保藏編號是:CGMCCNo.0397。
文檔編號C12N1/20GK1244581SQ9911427
公開日2000年2月16日 申請日期1999年6月25日 優(yōu)先權(quán)日1999年6月25日
發(fā)明者邵國青, 錢建飛, 侯繼波, 何家惠, 還紅華, 王繼春, 倪艷秀 申請人:江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所