專利名稱：雜交瘤細胞無血清培養基的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物技術領域，涉及一種無血清培養基，尤其涉及一種用于由骨髓瘤細胞和淋巴細胞融合的雜交瘤細胞培養的無血清培養基。
雜交瘤細胞是一種能分泌單一獨特抗體的無限傳代細胞。雜交瘤細胞技術首先由英國的Kohler和Mistein在1975年通過小鼠骨髓瘤細胞和小鼠脾細胞融合而建立的。雜交瘤細胞所分泌的單克隆抗體在診斷、免疫、純化、疫苗生產、治療和基礎研究等方面有著廣泛的應用，已成為生物工程方面的重要產品。
雜交瘤細胞的培養通常是在有血清培養基中進行的，雖然細胞密度和產物的濃度均較高，但由于血清中蛋白和其它大分子物質太復雜，影響了單克隆抗體的分離和純化，使單克隆抗體的收率和純度降低，限制了單克隆抗體的體內應用；同時，由于血清的添加也使生產成本大大提高。因此，許多科研工作者致力于開發無血清或低血清培養基。
Darfler等開發的CITTL無血清培養基以DMEM/F12(1∶1)為基礎培養基，添加了5mg/L的過氧化氫酶，1.5mg/L的胰島素，1.5～3.0mg/L轉鐵蛋白，2nmol/L睪酮，0.5mg/L的二亞油酰磷脂膽堿和1.5mg/L的β-甘油磷酸。這一培養基可支持s49細胞的克隆化生長，也可用于雜交瘤細胞的培養；文獻“Chang TH,Steplewski Z and Koprowski H.Production of Mabin SFM.J.Immunol.Methods.1980,39:369”所報導的無血清培養基成功地培養了幾株雜交瘤細胞，其基本培養基是MEM或RPMI 1640，并添加了0.6mg/L的谷氨酰胺，1％MEM的非必需氨基酸，5mg/L的胰島素和5mg/L轉鐵蛋白；Murakami等開發的無血清培養基以DMEM/F12為基礎，添加了5mg/L的胰島素，2～35mg/L轉鐵蛋白，20μmol/L乙醇胺和1nmol/L亞硒酸鈉等物質，這就是現在被廣泛使用的DMEM/F12-ITES配方，可培養多種雜交瘤細胞。
Kover和Frank開發的無血清培養基以RPMI 1640為基礎培養基，并添加了10mg/L胰島素，5mg/L轉鐵蛋白，20μmol/L乙醇胺，5mg/L亞油酸，1g/L牛血清蛋白；3mg/L抗壞血酸，2μg/L氫化可的松和12種微量元素，這一培養基也可使多種骨髓瘤細胞和雜交瘤細胞得以生長。
美國專利U.S.P.4927762公開了一種含有抗氧化劑的培養基，闡明了細胞在還原性介質中能更好地生長，同時指出了N-乙酰半胱氨酸、硫乳酸、巰基乙醇等物質的添加可以起到抗氧化作用。
美國專利U.S.P.4767704公開的培養基就微量元素的添加進行了研究，開發了一種無蛋白培養基，該專利最主要的貢獻在于使人們認識到微量元素的作用。
上述的培養基都具有各自的特點，但是各個培養基均只適合于一種或一類細胞的生長，而且蛋白含量仍較高，一般可達每升幾十毫克至幾克，不利于產物的分離純化，生產成本也較高。
為了滿足人們的需要，研究開發新的低蛋白無血清培養基將是很有意義的。
本發明的目的在于公開一種低蛋白無血清培養基，用于培養鼠-鼠雜交細胞瘤，特別是由骨髓瘤細胞NS1和經免疫的Balb/c小鼠脾細胞融合而成的WuT3雜交瘤細胞，分泌抗人T淋巴細胞CD3抗原的單克隆抗體，該培養基具有蛋白含量低，分離純化容易，易于工業化生產的特點。
本發明的構思是一個培養基，除了無機鹽、糖、氨基酸和維生素外，還需添加結合蛋白、激素、生長因子、低分子量營養物質等，故本發明在配方中加入了(1)轉鐵蛋白，結合鐵的糖蛋白，與細胞表面專一受體作用，傳遞鐵離子，協助鐵的吸收，可絡合有害離子，起解毒作用，同時還有生長因子的作用。
(2)甾體激素，如地塞米松，對細胞的生理代謝有復雜的調節作用(3)微量元素，如Cu、Fe、Zn、Se、Co、Mo、Sn、Si等，主要起細胞生理過程調節和控制作用，例如Fe酶和血紅素的輔基，是線粒體中呼吸鏈的組成部分。
Cu超氧化物歧化酶的輔基。
Mg對ATP酶、激酶等起活化作用。
Zn酶的輔基。
Co:B12的組成部分。
Se是谷胱甘肽氧化酶的組成部分，具有抗氧化作用。
(4)維生素在細胞生長代謝過程中，維生素不作為能源，它是細胞組成成分，細胞的各種代謝活動，離開了維生素都無法進行，因此它是必需的。
(5)乙醇胺是無血清培養基的重要組成部分，與磷脂的合成有關。
(6)β-巰基乙醇促進胱氨酸的吸收，還可使谷胱甘肽處于還原狀態，從而保護免受過氧化氫的損害。
(7)對羥基苯甲酸是氨基酸和糖代謝的中間體，有利于細胞生長代謝。
此外，脂肪酸等對細胞的生長均有一定的促進作用，因此，本發明在培養基RPMI 1640的基礎上添加了上述物質，使雜交瘤細胞可以旺盛地生長，細胞密度和單抗生產可與有血清培養基相媲美。
本發明所說的培養基為一個組合物，是由培養基RPMI 1640和下例添加物所組成，添加量均為mg/LL-精氨酸100～300 CuSO4·5H2O 0.0005～0.005L-天門冬酰胺25～75MnCl2·4H2O 0.00005～0.0005L-天門冬氨酸10～30Na2MoO4·2H2O 0.00002～0.0002L-谷氨酸10～30Ni(NO3)2·6H2O 0.00002～0.0002L-谷氨酰胺 0～500ZnSO4·7H2O 0.06～0.6甘氨酸 5～15 CoCl2·6H2O 0.001～0.008L-組氨酸10～30NaSiO3·9H2O0.001～0.01L-異亮氨酸 25～75Na3VO4·12H2O 0.0005～0.005L-賴氨酸鹽酸20～60SnCl2·2H2O 0.00001～0.0001L-蛋氨酸10～30Na2SeO30.002～0.01L-苯丙氨酸 10～30FeSO4·7H2O 0.2～1.6L-脯氨酸10～30葡萄糖1000～4000L-絲氨酸15～45維生素C 0.176～0.704L-蘇氨酸10～30對羥基苯甲酸 0.5～1.5L-色氨酸5～15 丙酮酸鈉 55～550L-纈氨酸10～30亞油酸0.01～0.05L-亮氨酸25～75β-巰基乙醇 0.8～4.0二水L-酪氨酸二鈉144～432 乙醇胺1～5L-胱氨酸二鹽酸25～75地塞米松0.001～0.005人轉鐵蛋白5～50以下將通過實施例對本發明的有關內容作進一步的說明。
實施例1在500ml細胞培養瓶中，加入20ml如下所示的培養基，然后再加入在該培養基中適應的WuT3雜交瘤細胞，接種密度為1.5×105cells/ml，培養時間為4天，細胞密度(▲)最大為1.5×106cells/ml，單抗濃度(Δ)為65mg/L。L-精氨酸400Ca(NO3)·4H2O 100L-天門冬酰胺100CoCl2·6H2O 0.00238L-天門冬氨酸40 CuSO4·5H2O 0.0025L-胱氨酸二鹽酸 100FeSO4·7H2O 0.834L-谷氨酸40 KCl 400L-谷氨酰胺 600MgSO448.84L-組氨酸30 MnCl2·4H2O 0.0001甘氨酸 20 Na2HPO4800L-異亮氨酸 100Na2MoO4·2H2O0.00012L-亮氨酸100Na2SeO30.00864L-賴氨酸鹽酸80 Na3VO4·12H2O0.001L-蛋氨酸30 NaCl 6000L-苯丙氨酸 30 NaHCO32000L-脯氨酸40 NaSiO3·9H2O 0.0522L-絲氨酸60 Ni(NO3)2·6H2O 0.00007L-蘇氨酸40 SnCl2·2H2O 0.000056L-色氨酸10 ZnSO4·7H2O 0.2875二水L-酪氨酸二鈉576地塞米松 0.002L-纈氨酸40 葡萄糖 4000β-巰基乙醇 1.58 乙醇胺 3人轉鐵蛋白 10 還原型谷胱甘肽 1.0亞油酸 0.028丙酮酸鈉110酚紅5.0 對羥基苯甲酸1.0維生素C 0.352生物素(Biotin) 0.20泛酸鈣 0.25 氯化膽堿3.0葉酸1.0 肌醇35.0煙酰胺 1.0 對氨基苯甲酸1.0鹽酸吡哆醇 1.0 核黃素 0.20硫胺素 1.0 維生素B120.005對比例采用與實施例1相同的培養方法，所用的培養基為添加了5％(wt％)血清的RPMI 1640，其細胞密度(■)最大為1.1×106cells/ml，單抗濃度(口)為52mg/l。
由上述實施例和對比例可見，本發明所說的培養基無論在細胞密度和單抗濃度上都優于有血清的培養基，因此完全可以替代有血清的培養基用于WuT3雜交瘤細胞的培養。
圖1為本發明所說的無血清培養基還可以用于其它鼠-鼠雜交瘤細胞的培養，是一種低蛋白、低成本的無血清培養基。
圖1為實施例1和對比例的試驗結果示意圖。圖中
——采用無血清培養基的細胞密度1×105cells/ml
——采用有血清培養基的細胞密度1×105cells/ml
——采用無血清培養基的單抗濃度mg/l
——采用有血清培養基的單抗濃度mg/l
權利要求
1．一種雜交瘤細胞無血清培育基，其特征在于所說的培養基為一個組合物，是由培養基RPMI 1640和下例添加物所組成，添加量均為mg/LL-精氨酸100～300 CuSO4·5H2O 0.0005～0.005L-天門冬酰胺25～75MnCl2·4H2O 0.00005～0.0005L-天門冬氨酸10～30Na2MoO4·2H2O 0.00002～0.0002L-谷氨酸10～30Ni(NO3)2·6H2O 0.00002～0.0002L-谷氨酰胺 0～500ZnSO4·7H2O 0.06～0.6甘氨酸 5～15 CoCl2·6H2O 0.001～0.008L-組氨酸10～30NaSiO3·9H2O 0.001～0.01L-異亮氨酸 25～75Na3VO4·12H2O 0.0005～0.005L-賴氨酸鹽酸20～60SnCl2·2H2O 0.00001～0.0001L-蛋氨酸10～30Na2SeO30.002～0.01L-苯丙氨酸 10～30FeSO4·7H2O 0.2～1.6L-脯氨酸10～30葡萄糖 1000～4000L-絲氨酸15～45維生素C0.176～0.704L-蘇氨酸10～30對羥基苯甲酸 0.5～1.5L-色氨酸5～15 丙酮酸鈉 55～550L-纈氨酸10～30亞油酸 0.01～0.05L-亮氨酸25～75β-巰基乙醇0.8～4.0二水L-酪氨酸二鈉144～432 醇胺 1～5L-胱氨酸二鹽酸25～75 地塞米松 0.001～0.005人轉鐵蛋白5～50。
全文摘要
本發明屬于生物技術領域,公開了一種雜交瘤細胞無血清培養基。所說的培養基是以培養基RPMI 1640為基礎,添加了轉鐵蛋白、甾體激素、微量元素、維生素、乙醇胺、β－巰基乙醇和對羥基苯甲酸等物質所組成的一種新的能使雜交瘤細胞可以旺盛地生長、細胞密度和單抗生產可與有血清培養基相媲美的低蛋白無血清培養基,完全可以替代有血清的培養基用于WuT3雜交瘤細胞的培養。
文檔編號C12N5/18GK1229851SQ99113498
公開日1999年9月29日 申請日期1999年3月2日 優先權日1999年3月2日
發明者張元興, 張立, 魏明旺 申請人:華東理工大學