專利名稱：質粒dna快速提取試劑盒及其應用方法
技術領域：
本發明涉及分子生物學研究領域，是一種簡易快速提取質粒DNA的試劑盒及其應用方法。
質粒DNA的提取和純化是分子生物學研究領域中應用最為廣泛和最基本的技術。因此，國內外主要生物試劑公司都研制了與此技術有關的試劑盒，如Qiagen、Promega、華美、華順、晶美等生物工程公司。國外的試劑盒都是以純化柱為主體，因而成本高，價格昂貴。國內的試劑盒主要是在傳統的堿裂解、酚-氯仿抽提的基礎上所作的改良，其獲取的質粒DNA得量低，質量不高，不能滿足分子生物學實驗中連接、序列測定和轉染的要求，提取過程耗時長，且因酚和氯仿均為有毒物質，有異味，既污染環境，又危害實驗操作人員健康。
本發明的目的是提供一種快速、簡易、高效、高質、價廉、無害的提取質粒DNA的試劑盒及其應用方法。
在質粒DNA提取技術中，要獲取質量好、純度高的質粒DNA，關鍵技術在于菌體裂解、蛋白質和RNA的消除。本發明的核心部分是所用試劑采用不同pH和不同濃度的鹽，用分步沉淀法取代酚-氯仿抽提法去除蛋白質和RNA，所提取的質粒DNA純度能滿足分子生物學有關實驗的要求，包括克隆鑒定、酶切、連接、序列測定和轉染等。本發明包括6種試劑，即菌體重懸緩沖液(R1)；菌體裂解緩沖液(R2)；質粒沉淀緩沖液(R3)；異丙醇(R4)；蛋白沉淀緩沖液(R5)；DNA稀釋液(R6)。它們的組成及配比分別為試劑R1組分50mmol葡萄糖25mmol Tris-Hcl(pH8.0)10mmol EDTA(pH8.0)5mg/ml溶菌酶配比配制100ml R1取葡萄糖(COH12O6.H2O) 0.991克雙蒸水 80ml0.5mol EDTA(pH8.0) 2ml
1mol Tris-Hcl(pH8.0)2.5ml用雙蒸水定容至100ml,10Ibf/in2(6.895×104pa)高壓滅菌15分鐘，再加入500mg溶菌酶。按25次使用量分裝5.6ml于不透光塑料瓶，4℃保存。
試劑R2組分0.2mol NaOH1％SDS配比配制100ml R2取10mol NaOH2ml雙蒸水80ml10％SDS 10ml用雙蒸水定容至100ml，按25次使用量分裝11.2ml于不透光塑料瓶，室溫保存。
試劑R3組分5.0～6.0mol醋酸銨(或醋酸鈉)，最佳醋酸銨(或醋酸鈉)濃度為5.5mol。
配比配制100ml R3取醋酸銨42.4g雙蒸水 80ml攪拌溶解后，調至pH7.4～7.6，其優選pH值7.5，用雙蒸水定容到100ml，按25次使用量分裝8.4ml于不透光塑料瓶，室溫保存。
試劑R4異丙醇(分析純)為商品化試劑。
試劑R5組分1.2～1.6mol醋酸銨(或醋酸鈉)，最佳醋酸銨(或醋酸鈉)濃度為1.4mol。
配比配制100ml R5取醋酸銨10.8g雙蒸水 80ml攪拌溶解后，調至pH7.2～7.3，其優選pH值為7.25。用雙蒸水定容至100ml，按25次使用量分裝2.8ml于不透光塑料瓶，室溫保存。
試劑R6組分TE緩沖液(pH7.6)100mlRNase A 10mgRNase T10000萬單位配比配制100ml TE緩沖液取Tris鹽(分析純)1.58gEDTA(分析純)0.372g雙蒸水 80ml攪拌溶解后，調至pH7.6，用雙蒸水定容至100ml，加入RNase A 10mg和RNase T 10000萬單位，按25次使用量分裝0.56ml于不透光塑料瓶，4℃保存。
本發明主要的優點為操作簡便，結果穩定；耗時短，80分鐘左右可完成全部過程；得量高，對一高拷貝質粒，常規培養16小時，當細菌生長密度OD600約為3.5時，1.5ml菌液可獲得10μg～15μg DNA；純度好，無蛋白質和RNA污染，提取的質粒DNA可供內切酶酶切、連接、序列測定、真核細胞轉染等分子生物學實驗用；價廉，與國內外同類產品比較，價格降低20％～40％；由于不需用酚和氯仿，既消除了環境污染之慮，又對實驗操作人員身體無害。
應用本試劑盒提取質粒DNA可按下列方法操作1．按常規搖菌擴增質粒(詳見《分子克隆實驗指南》)；2．取常規培養16小時，細菌生長密度OD600約為3.5的菌液1.5ml于1.5ml離心管，室溫以12000rpm離心30秒鐘，棄上清；3．沉淀中加200μl R1，充分振蕩混勻；4．加入400μl R2，輕輕顛倒5次后置冰浴2分鐘；5．加入預冷的300μl R3，輕輕顛倒5次后置冰浴2分鐘；6．室溫以12000rpm離心5分鐘；7．收集上清，加入600μl R4混勻后置室溫2分鐘；8．室溫以12000rpm離心10分鐘；9．棄上清，立即加入100μl R5重懸沉淀后置冰浴2分鐘；10．室溫以12000rpm離心5分鐘；11．收集上清，加入100μl R4混勻；12．室溫以12000rpm離心5分鐘，棄上清，沉淀用75％乙醇洗，干燥后溶于20μl R6,37℃水浴15分鐘；13．加入10μl R3和30μl R4混勻，室溫2分鐘；14．室溫以12000rpm離心10分鐘，棄上清；15．沉淀用75％乙醇洗，干燥后溶于15μl TE緩沖液，-20℃保存備用；
所得質粒DNA可用0.8％瓊脂糖凝膠電泳加以驗證。
圖1顯示對含同一質粒DNA的菌體應用本試劑盒和應用Qiagen柱式純化試劑盒提取的質粒DNA電泳對照圖譜。圖中，M為λDNA/HindⅢ分子量標志物，1A、2A、3A為使用本試劑盒所提取的質粒DNA,1B、2B、3B為使用Qiagen柱式純化盒所提取的相應質粒DNA。從圖中看出用兩種試劑盒所得的質粒DNA，電泳條帶清晰，無RNA混雜。說明使用本發明提取的質粒DNA與使用Qiagen柱式純化試劑盒提取的同一質粒DNA比較，在純度和得量方面無明顯區別。
權利要求
1．一種提取質粒DNA的試劑盒，其特征在于包括菌體重懸緩沖液(R1)、菌體裂解緩沖液(R2)、質粒沉淀緩沖液(R3)、異丙醇(R4)、蛋白沉淀緩沖液(R5)和DNA稀釋液(R6)六種試劑，R1的組分為50mmol葡萄糖，25mmol Tris-Hcl(pH8.0),10mmol EDTA(pH8.0),5mg/ml溶菌酶；R2的組分為0.2mol NaOH,1％SDS；R3的組分為5.0～6.0mol醋酸銨(或醋酸鈉)，pH7.4～7.6；R4為分析純的異丙醇；R5的組分為1.2～1.6mol醋酸銨(或醋酸鈉)，pH7.2～7.3；R6的組分為TE緩沖液中加入終濃度為0.1mg/ml RNase A和100單位/mlRNase T。
2．按權利要求1所述的提取質粒DNA的試劑盒，其特征在于所述的試劑R3的最佳濃度為5.5mol醋酸銨(或醋酸鈉)。
3．按權利要求1所述的提取質粒DNA的試劑盒，其特征在于試劑R3的最佳pH值為7.5。
4．按權利要求1所述的提取質粒DNA的試劑盒，其特征在于試劑R5的最佳濃度為1.4mol醋酸銨(或醋酸鈉)。
5．按權利要求1所述的提取質粒DNA的試劑盒，其特征在于試劑R5最佳pH值為7.25。
6．權利要求1所述的提取質粒DNA試劑盒的應用方法，其特征在于按如下步驟操作(1)按常規搖菌擴增質粒(詳見《分子克隆實驗指南》)；(2)取經常規培養16小時，細菌生長密度OD600約3.5的菌液1.5ml于1.5ml離心管，室溫以12000rpm離心30秒鐘，棄上清；(3)沉淀中加200μl R1，充分振蕩混勻；(4)加入400μl R2，輕輕顛倒5次后置冰浴2分鐘；(5)加入預冷的300μl R3，輕輕顛倒5次后置冰浴2分鐘；(6)室溫以12000rpm離心5分鐘；(7)收集上清，加入600μl R4混勻后置室溫2分鐘；(8)室溫以12000rpm離心10分鐘；(9)棄上清，立即加入100μl R5重懸沉淀后置冰浴2分鐘；(10)室溫以12000rpm離心5分鐘；(11)收集上清，加入100μl R4混勻；(12)室溫以12000rpm離心5分鐘，棄上清，沉淀用75％乙醇洗，干燥后溶于20μl R6,37℃水浴15分鐘；(13)加入10μl R3和30μl R4混勻，室溫2分鐘；(14)室溫以12000rpm離心10分鐘，棄上清；(15)沉淀用75％乙醇洗，干燥后溶于15μl TE緩沖液，-20℃保存備用；
全文摘要
本發明涉及分子生物學研究領域,為一種簡易快速提取質粒DNA的試劑盒及其應用方法。本試劑盒包括菌體重懸緩沖液、菌體裂解緩沖液、質粒沉淀緩沖液、異丙醇、蛋白沉淀緩沖液和DNA稀釋液六種試劑。本發明與國內外相關的試劑盒相比,具有快速、簡易、高效、高質、價廉和無害的優點,提取的質粒DNA(1A、2A、3A)與應用Qiagen柱式純化試劑盒提取的相應質粒DNA(1B、2B、3B)的電泳圖譜比較,電泳條帶同樣清晰,無RNA混雜。
文檔編號C12N15/10GK1226600SQ99113448
公開日1999年8月25日 申請日期1999年1月29日 優先權日1999年1月29日
發明者朱明華 申請人:朱明華