專利名稱：梔子細胞組織培養產生天然生根劑的方法
技術領域：
本發明提供了一種由梔子細胞培養生成的促進植物生根物質--梔子甙(Geniposide，Jasminoidin)的方法，利用植物細胞培養的方法，可以得到較高產率的植物細胞，進而提取促進植物生根作用的梔子甙。
梔子體內特別是梔子果實中都含有能促進植物生根的物質環烯醚萜甙類成分，如梔子甙(Geniposide，Jasminoidin)，羥異梔子甙(Gardenoside)及京尼平-1-0-龍膽雙糖甙(Genipin1-0-1-gentiobioisde)等。但無論是野生還是人工栽培均存在野生資源少，缺乏環境保護，栽培技術跟不上和勞力昂貴等問題。將其應用于大力提高現有土地面積上的農作物的產量和質量的農業技術中，還存在著嚴重的供不應求之勢。
本發明的目的在于提供一種梔子細胞組織培養天然生根劑的方法，其可以實現大規模地工業生產，不受季節和土地面積的限制。
本發明提供了一種梔子細胞組織培養生產天然生根劑的方法，所生產的生根劑中除含有部分色素和糖外，主要含有梔子甙1～9‰，羥異梔子甙1～9‰，京尼平-1-0-龍膽雙糖甙1～9‰，該方法包括梔子細胞組織的建立、培養及梔子甙提取步驟，其特征在于(1)采用的梔子細胞組織是由梔子葉誘導產生的愈傷組織；(2)所使用的培養基為改良的MS培養基，組分如下大量元素NH4NO31000～2000(mg/L)KNO31500～2500CaCl2·2H2O 300～500MgSO4·7H2O 150～200微量元素KI1.5～1.7H3BO35.5～7.0MnSO4·7H2O 20～25ZnSO4·7H2O 5～15Na2MoO4·2H2O 0.1～0.5
CuSO4·5H2O 0.01～0.03CoCl2·6H20.01～0.03Na2EDTA35～40FeSO4·7H2O 20～30生長調節物質肌醇80～120煙酸0.3～0.7鹽酸吡哆醇B10.3～0.7鹽酸硫胺素B60.05～0.2甘氨酸 1.0～3.0α-萘乙酸(NAA) 0.5～5激動素(KT) 0.05～0.5蔗糖1.0～5.0瓊脂0～5.0pH值5.0～6.5(3)梔子細胞的培養條件(a)固體培養改良的MS固體培養基，接種量1～5g/100ml，溫度20～30℃，濕度60～85％，光強1000～3000lx；(b)液體培養改良的MS液體培養基，接種量1～5g/100ml，溫度20～30℃，轉速50～150rpm，光強1000～3000lx。
本發明中梔子愈傷組織的誘導過程是取梔子植株上的葉片，清洗，消毒，切片，平鋪在改良的固體MS培養基上，溫度為20～30℃，濕度60～85％，光強1000～3000lx條件下培養20～40天，葉片切口部分隆起，長出的一團團淡黃色細胞團即為梔子愈傷組織。
本發明中梔子甙的提取為將梔子細胞用甲醇浸提。
本發明提供的梔子細胞組織培養的天然生根劑，在使用時需要稀釋100～1000倍，高于此濃度對植物生長有抑制作用，通常情況下浸種稀釋500～1000倍；拌種稀釋500～1000倍；葉面噴施稀釋300～600倍。
本發明由于采用細胞組織培養的方法生產梔子甙天然生根劑，因而不受季節限制(一年四季均可生產)，占地面積小，易于篩選優秀品種，所生產的梔子甙易溶于水，含量高，能促進植物生根，便于工業化生產，具有廣闊的市場前景。下面通過實施例詳述本發明。
附
圖1為梔子細胞優良株系的選育流程。
實施例11.梔子愈傷組織的誘導1)從梔子植株上取葉片用清水洗凈(以下步驟均在無菌室超凈工作臺上進行)；2)洗凈的葉片用8％NaClO3消毒10min后用無菌水沖洗3～5次，將水用無菌紙吸干；3)將葉片切成約1cm的小方塊，平鋪在改良的MS培養基上，在溫度為25℃，濕度為75％，光強2000lx的光照培養箱中培養4)培養一個月左右的葉片，其邊緣切口部分隆起，長出一團團淡黃色的細胞團，即為梔子愈傷組織。
2.改良的MS培養基大量元素NH4NO31650(mg/L)KNO31900CaCl2·2H2O 400MgSO4·7H2O 190KH2PO4170微量元素KI 1.66H3BO36.20MnSO4·7H2O 22.3ZnSO4·7H2O 8.60Na2MoO4·2H2O 0.25CuSO4·5H2O 0.025CoCl2·6H2O 0.025Na2EDTA 37.3FeSO4·7H2O 27.8肌醇100煙酸0.5鹽酸吡哆醇B10.5
鹽酸硫胺素B60.1甘氨酸 2.0α-萘乙酸(NAA) 1.0激動素(KT) 0.1蔗糖3.0(％)瓊脂0.8pH值5.83.梔子固體細胞及懸浮細胞培養的建立1)將以上生長旺盛的淡黃色細胞團取下，轉入新配制了的改良MS固體培養基中，接種量1g/100ml，在溫度為25℃，濕度為75％，光強為2000lx的光照培養箱中繼續培養。經多次重復，即可獲得性狀比較一致的細胞株系，即為細胞固體培養。
2)將繼代3～5次的固體培養細胞，壓碎轉接到改良MS液體培養基中，接種量2g/100ml，在溫度為25℃，轉速為80rpm，光強為2000lx的搖床上培養。
3)培養一個月左右后，將所培養的梔子細胞上清培養液濾去，加入新的液體改良MS培養基，繼續培養即為梔子懸浮培養。
4.梔子愈傷組織和懸浮細胞的生物量
植物組織培養的細胞生長速率一般固體培養為10g/L.d，懸浮培養為20g/L.d。
5.梔子細胞中粗梔子甙的制備方法1)梔子懸浮細胞離心，除去水分；2)沉淀的細胞加400ml甲醇冷浸48h后離心，上清待用；
3)沉淀后再加300ml甲醇冷浸2h后離心，此過程重復三次，上清待用；4)將離心所得全部上清液合并，用減壓蒸餾法濃縮，除去甲醇；5)濃縮后的干品加入1～3倍的蒸餾水溶解，即為梔子甙粗提取液，粗梔子甙液中除含有部分色素和糖外，其主要成分為梔子甙 0.297％環烯醚萜甙類羥異梔子甙 0.260％京尼平-1-0-龍膽雙糖甙 0.212％實施例2 梔子細胞改良MS培養基中激素對細胞生物量的影響
實施例3 不同培養方式所產生的粗梔子甙
實施例4 粗梔子甙用于小麥的生根作用
>本發明梔子甙可以用作為一般植物如糧食、蔬菜、水果等促進其根系生長的生根劑。應用浸種、沾根、拌種及葉面噴施等方法，均能促使植物根系發達，提高產量，使用濃度范圍為稀釋100～1000倍。
權利要求
1.一種梔子細胞組織培養生產天然生根劑的方法，所生產的生根劑中除含有部分色素和糖外，主要含有梔子甙1～9‰，羥異梔子甙1～9‰，京尼平-1-0-龍膽雙糖甙1～9‰，該方法包括梔子細胞組織的建立、培養及梔子甙提取步驟，其特征在于(1)采用的梔子細胞組織是由梔子葉誘導產生的愈傷組織；(2)所使用的培養基為改良的MS培養基，組分如下大量元素NH4NO31000～2000(mg/L)KNO31500～2500CaCl2·2H2O 300～500MgSO4·7H2O 150～200微量元素KI1.5～1.7H3BO35.5～7.0MnSO4·7H2O 20～25ZnSO4·7H2O 5～15Na2MoO4·2H2O 0.1～0.5CuSO4·5H2O 0.01～0.03CoCl2·6H20.01～0.03Na2EDTA 35～40FeSO4·7H2O 20～30生長調節物質肌醇 80～120煙酸0.3～0.7鹽酸吡哆醇B10.3～0.7鹽酸硫胺素Be0.05～0.2甘氨酸 1.0～3.0α-萘乙酸(NAA) 0.5～5激動素(KT) 0.05～0.5蔗糖1.0～5.0瓊脂0～5.0pH值 5.0～6.5(3)梔子細胞的培養條件(a)固體培養改良的MS固體培養基，接種量1～5g/100ml，溫度20～30℃，濕度60～85％，光強1000～3000lx；(b)液體培養改良的MS液體培養基，接種量1～5g/100ml，溫度20～30℃，轉速50～150rpm，光強1000～3000lx。
2.按照權利要求1所述梔子細胞組織培養生產天然生根劑的方法，其特征在于梔子愈傷組織的誘導過程是取梔子植株上的葉片，清洗，消毒，切片，平鋪在改良的固體MS培養基上，溫度為20～30℃，濕度60～85％，光強1000～3000lx條件下培養20～40天，葉片切口部分隆起，長出的一團團淡黃色細胞團即為梔子愈傷組織。
3.按照權利要求1所述梔子細胞組織培養生產天然生根劑的方法，其特征在于梔子甙的提取為將梔子細胞用甲醇浸提。
全文摘要
一種梔子細胞組織培養生產天然生根劑的方法,該方法包括梔子細胞組織的建立、培養及梔子甙提取步驟,其特征在于:(1)采用的梔子細胞組織是由梔子葉誘導產生的愈傷組織;(2)所使用的培養基為改良的MS培養基;(3)梔子細胞的培養條件:(a)固體培養:改良的MS固體培養基, 接種量1～5g/100ml,溫度20～30℃,濕度60～85%,光強1000～3000lx;(b)液體培養;改良的MS液體培養基,接種量1～5g/100ml,溫度20～30℃,轉速50～150rpm,光強1000～3000lx。本發明可以實現大規模地工業生產,不受季節和土地面積的限制。
文檔編號C12N5/04GK1276424SQ99112969
公開日2000年12月13日 申請日期1999年6月2日 優先權日1999年6月2日
發明者白雪芳, 杜昱光, 王靖楣, 王毓福, 朱亮 申請人:中國科學院大連化學物理研究所