專利名稱：高產率生產博安霉素的發酵法的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種高產率生產博安霉素的方法。
博安霉素為一已知抗生素，屬于博萊霉素(Bleomycin,BLM)族，即博萊霉素A6(Bleomycin A6)，其具有下式所示的結構 博萊霉素族的抗生素多數都具有抗腫瘤活性，首先在臨床上應用的是博萊霉素(A2+B2為主)，主要用于治療鱗狀上皮癌，但其突出的缺點是肺毒性大，能夠導致不可逆的肺纖維化。隨后相繼用于臨床的有匹萊霉素(Pepleomycin,PEP)和平陽霉素(BLM A5)，但其品種還不多，就其活性和毒性來說，臨床上仍然缺乏對某些腫瘤具有特異性抑制作用且毒副作用小，尤其肺毒性小的優良品種。臨床研究證明博安霉素具有良好的抗腫瘤作用，對頭頸部癌、惡性淋巴瘤、乳腺癌、食道癌都有較好的療效，尤其對肝癌也有滿意的療效，而且肺毒性極低，也沒有發現其對心肝腎的毒性，臨床應用前景很好。由于博萊霉素族抗生素具有十分相似的結構，在微生物發酵中，多種博萊霉素族抗生素往往同時產生，博安霉素在其中所占的比例不高。許鴻章等(藥學學報，V23(9):667-671,1988)報道了經發酵培養輪枝鏈霉菌平陽變種(Streptomyces verticillus var.pingyangensis n.var.)72所產生的一系列博萊霉素族抗生素，其中博安霉素按重量計僅占博萊霉素族抗生素總量的約10％。為了降低生產成本，獲得更高的博安霉素產率，迫切需要一種高產率地生產博安霉素的方法。
本發明的目的是提供一種高產率地生產博安霉素的方法。
為此，發明人通過深入研究，發現了一種高產率生產博安霉素的方法，該方法包括向發酵培養基中加入博安霉素的末端胺體，然后發酵培養能夠產生博安霉素的屬于輪枝鏈霉菌(Streptomyces verticillus)的微生物，并從培養液中回收博安霉素。該方法的發酵培養液中博安霉素的含量比例按重量計占博萊霉素族抗生素總量的20-70％。
所有能夠產生博安霉素的屬于輪枝鏈霉菌的微生物都在本發明之列。用于本發明的較好的微生物是輪枝鏈霉菌平陽變種(Streptomycesverticillus var.pingyangensis n.var.)，其中優選的菌株是輪枝鏈霉菌平陽變種(Streptomyces verticillus var.pingyangensis n.var)72，輪枝鏈霉菌平陽變種Q835。輪枝鏈霉菌平陽變種72為已知菌株，有關其形態特征、培養特征、生理特性、碳源利用和抗菌譜等已有文獻記載(趙儀英等，微生物學報，19(4):361364,1979)。
用于培養上述微生物的培養基中，可采用能夠被其利用的營養源即碳源、氮源、無機鹽、有機鹽和能被其利用的痕量營養物，這些成分可予先一次性地加入培養基中，或者間歇或連續地加入培養基中。
培養方式可采用靜態培養、搖蕩培養、攪拌培養或其它方式，但對大量生產來說，優選的方式為浸沒培養。
培養條件(時間、溫度、pH等)隨菌種不同而異，也隨培養基成分的變化有所不同，本領域技術人員能夠根據具體情況選擇。
在發酵培養基中加入的末端胺體是指精胺鹽(如精胺鹽酸鹽，精胺硫酸鹽)或其粗品，或者含精胺鹽的物質(這些物質可以是植物來源的，如玉米漿，所采用的玉米漿可以是經各種方法處理提高了精胺鹽含量的玉米漿)。末端胺體的加入量為每1000升培養基加0.1-1千克(按精胺鹽酸鹽計)，優選的加入量為每1000升培養基加0.4-0.6千克(按精胺鹽酸鹽計)。
當博安霉素在培養基中積累達到最大濃度時終止培養，根據其性質采用本領域公知的方法進行分離純化。博安霉素可以游離的形式得到分離，也可以藥學上可接受的鹽的形式(如鹽酸鹽、硫酸鹽或有機酸鹽，尤其是鹽酸鹽的形式)得到分離，如果需要，可以用常規方法將博安霉素的鹽形式轉化成游離形式。
任何能夠從培養物中分離純化博安霉素的方法均在本發明之列。一般可使用吸附、洗脫、柱層析、冷干等方法，這些方法在每一分離步驟中可以單獨使用，也可以結合使用，在整個分離過程中還可以重復使用。
吸附方法包括以活性炭吸附，大孔樹脂吸附或離子交換樹脂吸附等。大孔吸附樹脂可以是非極性大孔吸附樹脂，也可以是中等極性的大孔吸附樹脂，還可以是高極性的大孔吸附樹脂。離子交換樹脂可采用弱酸性陽離子交換樹脂或強酸性陽離子交換樹脂。
洗脫方法包括用酸性溶液洗脫、不同濃度的中性鹽溶液洗脫、單一溶劑洗脫、混合溶劑洗脫或溶劑與無機鹽的混合溶劑洗脫等。
柱層析包括吸附柱層析、離子交換柱層析、離子排斥柱層析、親合柱層析、分子排阻柱層析和反相柱層析等。
下列實施例用來進一步說明本發明的方法。
實施例1以葡萄糖1.0％、蛋白胨0.5％、淀粉1.0％、NaCl0.5％和瓊脂2.0％(pH7.2-7.5)為斜面培養基，120℃下滅菌30分鐘，制成斜面，置于37℃恒溫室中3天至表面水分稍干，無雜菌生長時，接種輪枝鏈霉菌平陽變種72菌種孢子，于28℃培養8天。在多個500ml錐形瓶中分別裝入100ml培養基(培養基組成淀粉2.5％、葡萄糖0.5％、豆餅粉3.5％、KH2PO40.1％、ZnSO40.05％、CuSO40.01％、pH6.0-6.5)。于120℃滅菌30分鐘后，進行接種，28℃振蕩培養48小時，將該培養物作為種子。準備500L發酵罐，投料體積200L，培養基組成與種子培養基相同，120℃滅菌30分鐘，接種量為0.5％，在1∶1通氣量，29℃，以及180～200轉/分攪拌培養48小時，轉種至2噸發酵罐，培養基的投料體積為1000L，加入0.6千克精胺鹽酸鹽。其培養基組成為淀粉2.5％、葡萄糖0.5％、玉米粉2.0％、豆餅粉3.2％、玉米漿3.0％、NaCl0.5％、KH2PO40.015％、ZnSO40.05％、CuSO40.01％、玉米油0.3％、pH6.0-6.5，在130℃-150℃連續滅菌后接種，接種量為15-20％。在罐溫29℃，通氣量1∶1至1∶1.5，攪拌速度145轉/分培養7天，至pH7.5以上，效價達到高峰時終止培養。經高效液相色譜檢測(色譜柱YWG C1810μ3.9×300mm；流動相A甲醇，B 5mM己烷磺酸鈉加0.5％冰醋酸，用濃氨水調pH至4.3,A∶B=32∶68；流速1ml/min)，發酵培養液中博安霉素的含量按重量計占博萊霉素族抗生素總量的70％。
發酵培養液800升用草酸調pH至3.0，再用5NNaOH調pH至6.5。加入陽離子交換樹脂122(H+型)13升，攪拌3小時。收集樹脂，用無鹽水沖洗后將樹脂裝入柱中用0.3N HCl洗脫，收集活性部份。用5N氫氧化鈉調pH至6.5，將活性溶液通過大孔吸附樹脂4006柱(柱床10升)脫鹽，用10％丙酮(含0.01 N HCl)洗脫。收集活性部份，減壓濃縮。濃縮液用氨水調pH至6.5，將其通過CM-Sephadex-C-25(NH4+型)柱(柱床2.5升)，先用0.05N的NH4Cl沖洗后，再用0.1-1.0 N NH4Cl梯度洗脫，洗脫液總體積約相當于柱體積的15倍。按峰位收集，合并，經大孔吸附樹脂4006柱進行脫鹽操作后，冷凍干燥。得到10.5克藍色博安霉素鹽酸鹽(含銅品)。
實施例2以葡萄糖1.0％、蛋白胨0.5％、淀粉1.0％、NaCl0.5％和瓊脂2.0％(pH7.2-7.5)為斜面培養基，120℃滅菌30分鐘，制成斜面，置于37℃恒溫室中3天至表面水分稍干，無雜菌生長時，接種輪枝鏈霉菌平陽變種Q835菌種孢子，于28℃培養8天。在多個500ml錐形瓶中分別裝入100ml培養基(培養基組成淀粉2.5％、葡萄糖0.5％、豆餅粉3.5％、KH2PO40.1％、ZnSO40.05％、CuSO40.01％、pH6.0-6.5)。于120℃滅菌30分鐘后，進行接種，28℃振蕩培養48小時，將該培養物作為種子。準備500L發酵罐，投料體積200L，培養基組成與種子培養基相同，120℃滅菌30分鐘，接種量為0.5％，在1∶1通氣量，29℃，以及180～200轉/分攪拌培養48小時，轉種至2噸發酵罐，培養基投料體積為1000L，加入0.4千克精胺鹽酸鹽。其培養基組成為淀粉2.5％、葡萄糖0.5％、玉米粉2.0％、豆餅粉3.2％、玉米漿3.0％、NaCl0.5％、KH2PO40.015％、ZnSO40.05％、CuSO40.01％、玉米油0.3％、pH6.0-6.5，在130℃-150℃連續滅菌后接種，接種量為15-20％。在罐溫29℃，通氣量1∶1至1∶1.5，攪拌速度145轉/分培養7天，至pH7.5以上，效價達到高峰時終止培養。經高效液相色譜檢測(色譜柱YWG C1810μ3.9×300mm；流動相A甲醇，B 5mM己烷磺酸鈉加0.5％冰醋酸，用濃氨水調pH至4.3,A∶B=32∶68；流速1ml/min)，發酵培養液中博安霉素的含量按重量計占博萊霉素族抗生素總量的60％。
將發酵培養液用草酸調pH至3.0，再用5NNaOH調pH至6.5，過濾。將800升濾液通過離子交換樹脂D151(H+型)柱(柱床10升)，用無鹽水沖洗，再用0.3N HCl洗脫，收集活性部份，調PH至6.5，將其通過大孔吸附樹脂4006柱脫鹽(柱床10升)。用10％丙酮(含0.01NHCl)洗脫樹脂柱。收集活性部份，減壓濃縮至小體積，濃縮液用氨水調pH至6.5，上CM-Sephadex-C-25(NH4+型)柱(柱床2.5升)。用無鹽水沖洗后用0.1-1.0N NH4Cl梯度洗脫，洗脫液總體積約相當于柱體積的15倍。按峰位收集，合并。經大孔吸附樹脂4006柱脫鹽后，冷凍干燥。得10克博安霉素鹽酸鹽(含銅品)。
實施例3以葡萄糖1.0％、蛋白胨0.5％、淀粉1.0％、NaCl0.5％和瓊脂2.0％(pH7.2-7.5)為斜面培養基，120℃滅菌30分鐘，制成斜面，置于37℃恒溫室中3天至表面水分稍干，無雜菌生長時，接種輪枝鏈霉菌平陽變種72菌種孢子，于28℃培養8天。在多個500ml錐形瓶中分別裝入100ml培養基(培養基組成淀粉2.5％、葡萄糖0.5％、豆餅粉3.5％、KH2PO40.1％、ZnSO40.05％、CuSO40.01％、pH6.0-6.5)。于120℃滅菌30分鐘后，進行接種，28℃振蕩培養48小時，將該培養物作為種子。準備500L發酵罐，投料體積200L，培養基組成與種子培養基相同，120℃滅菌30分鐘，接種量為0.5％，在1∶1通氣量，29℃，以及1 80～200轉/分攪拌培養48小時，轉種至2噸發酵罐，培養基的投料體積為1000L，加入玉米漿20千克。培養基組成為淀粉2.5％、葡萄糖0.5％、玉米粉2.0％、豆餅粉3.2％、玉米漿3.0％、NaCl0.5％、KH2PO40.015％、ZnSO40.05％、CuSO40.01％、玉米油0.3％、pH6.0-6.5，在130℃-150℃連續滅菌后接種，接種量為15-20％。在罐溫29℃，通氣量1∶1至1∶1.5，攪拌速度145轉/分培養7天，在培養過程中，每隔8小時添加一次玉米漿，添加量為20千克，共添加14次(與投料時所加入的玉米漿的總合為300千克，相當于加入0.15千克精胺鹽酸鹽)，至pH7.5以上，效價達到高峰時終止培養。經高效液相色譜檢測(色譜柱YWG C1810μ3.9×300mm；流動相A甲醇，B 5mM己烷磺酸鈉加0.5％冰醋酸，用濃氨水調pH至4.3,A∶B=32∶68；流速1ml/min)，發酵培養液中博安霉素的含量按重量計占博萊霉素族抗生素總量的20％。
發酵培養液800升用草酸調pH至3.0，再用5N NaOH調pH至6.5。加入陽離子交換樹脂122H+20升，攪拌3小時。收集樹脂，用無鹽水沖洗后將樹脂裝入柱中用0.3N HCl洗脫，收集活性部份。用5N氫氧化鈉調pH至6.5，通過大孔吸附樹脂4006柱(柱床10升)脫鹽，用10％丙酮(含0.01N HCl)洗脫。收集活性部份，減壓濃縮。濃縮液用氨水調pH至6.5，將其通過CM-Sephadex-C-25(NH4+型)柱(柱床2.5升)，先用0.05N的NH4Cl沖洗后，用0.1-1.0N NH4Cl梯度洗脫，洗脫液總體積約相當于柱體積的15倍。按峰位收集，合并，經大孔吸附樹脂4006柱進行脫鹽操作后，濃縮，冷凍干燥。得到3.1克藍色博安霉素鹽酸鹽(含銅品)。
實施例4以葡萄糖1.0％、蛋白胨0.5％、淀粉1.0％、NaCl0.5％和瓊脂2.0％(pH7.2-7.5)為斜面培養基，120℃滅菌30分鐘，制成斜面，置于37℃恒溫室中3天至表面水分稍干，無雜菌生長時，接種輪枝鏈霉菌平陽變種Q835菌種孢子，于28℃培養8天。在多個500ml錐形瓶中分別裝入100ml培養基(培養基組成淀粉2.5％、葡萄糖0.5％、豆餅粉3.5％、KH2PO40.1％、ZnSO40.05％、CuSO40.01％、pH6.0-6.5)。于120℃滅菌30分鐘后，進行接種，28℃振蕩培養48小時，將該培養物作為種子。準備500L發酵罐，投料體積200L，培養基組成與種子培養基相同，120℃滅菌30分鐘，接種量為0.5％，在1∶1通氣量，29℃，以及180～200轉/分攪拌培養48小時，轉種至2噸發酵罐，培養基投料體積為1000L，加入0.4千克精胺硫酸鹽。其培養基組成為淀粉2.5％、葡萄糖0.5％、玉米粉2.0％、豆餅粉3.2％、玉米漿3.0％、NaCl0.5％、KH2PO40.015％、ZnSO40.05％、CuSO40.01％、玉米油0.3％、pH6.0-6.5，在130℃-150℃連續滅菌后接種，接種量為15-20％。在罐溫29℃，通氣量1∶1至1∶1.5，攪拌速度145轉/分培養7天，至pH7.5以上，效價達到高峰時終止培養。經高效液相色譜檢測(色譜柱YWG C1810μ3.9×300mm；流動相A甲醇，B 5mM己烷磺酸鈉加0.5％冰醋酸，用濃氨水調pH至4.3,A∶B=32∶68；流速1ml/min)，發酵培養液中博安霉素的含量按重量計占博萊霉素族抗生素總量的50％。
將發酵培養液用草酸調pH至3.0，再用5NNaOH調pH至6.5，過濾。將800升濾液通過離子交換樹脂D151(H+型)柱(柱床10升)，用無鹽水沖洗，再用0.3N HCl洗脫，收集活性部份，調PH至6.5，將其通過大孔吸附樹脂4006柱脫鹽(柱床10升)。用10％丙酮(含0.01NHCl)洗脫樹脂柱。收集活性部份，減壓濃縮至小體積，濃縮液用氨水調pH至6.5，進行CM-Sephadex-C-25(NH4+型)柱層析(柱床2.5升)。用無鹽水沖洗后用0.1-1.0N NH4Cl梯度洗脫，洗脫液總體積約相當于柱體積的15倍。按峰位收集，合并。經大孔吸附樹脂4006柱脫鹽后，冷凍干燥。得9.1克藍色博安霉素鹽酸鹽(含銅品)。
實施例5-8發酵條件和提取方法同實施例1，只是采用其它菌株，所加入的末端胺體有所不同，如下表
實施例9(對照實施例)以葡萄糖1.0％、蛋白胨0.5％、淀粉1.0％、 NaCl0.5％和瓊脂2.0％(pH7.2-7.5)為斜面培養基，120℃下滅菌30分鐘，制成斜面，置于37℃恒溫室中3天至表面水分稍干，無雜菌生長時，接種輪枝鏈霉菌平陽變種72菌種孢子，于28℃培養8天。在多個500ml錐形瓶中分別裝入100ml培養基(培養基組成淀粉2.5％、葡萄糖0.5％、豆餅粉3.5％、KH2PO40.1％、ZnSO40.05％、CuSO40.01％、pH6.0-6.5)。于120℃滅菌30分鐘后，進行接種，28℃振蕩培養48小時，將該培養物作為種子。準備500L發酵罐，投料體積200L，培養基組成與種子培養基相同，120℃滅菌30分鐘，接種量為0.5％，在1∶1通氣量，29℃，以及180～200轉/分攪拌培養48小時，轉種至2噸發酵罐，培養基的投料體積為1000L。其培養基組成為淀粉2.5％、葡萄糖0.5％、玉米粉2.0％、豆餅粉3.2％、玉米漿3.0％、NaCl0.5％、KH2PO40.015％、ZnSO40.05％、CuSO40.01％、玉米油0.3％、pH6.0-6.5，在130℃-150℃連續滅菌后接種，接種量為15-20％。在罐溫29℃，通氣量1∶1至1∶1.5，攪拌速度145轉/分培養7天，至pH7.5以上，效價達到高峰時終止培養。經高效液相色譜檢測(色譜柱YWG C1810μ3.9×300mm；流動相A甲醇，B 5mM己烷磺酸鈉加0.5％冰醋酸，用濃氨水調pH至4.3,A∶B=32∶68；流速1ml/min)，發酵培養液中博安霉素的含量按重量計占博萊霉素族抗生素總量的10.1％。
發酵培養液800升用草酸調pH至3.0，再用5N NaOH調pH至6.5。加入陽離子交換樹脂122(H+型) 13升，攪拌3小時。收集樹脂，用無鹽水沖洗后將樹脂裝入柱中用0.3N HCl洗脫，收集活性部份。用5N氫氧化鈉調pH至6.5，將活性溶液通過大孔吸附樹脂4006柱(柱床10升)脫鹽，用10％丙酮(含0.01 N HCl)洗脫。收集活性部份，減壓濃縮。濃縮液用氨水調pH至6.5，將其通過CM-Sephadex-C-25(NH4+型)柱(柱床2.5升)，先用0.05N的NH4Cl沖洗后，再用0.1-1.0 N NH4Cl梯度洗脫，洗脫液總體積約相當于柱體積的15倍。按峰位收集，合并，經大孔吸附樹脂4006柱進行脫鹽操作后，冷凍干燥。得到1.6克藍色博安霉素鹽酸鹽(含銅品)。
實施例10(對照實施例)以葡萄糖1.0％、蛋白胨0.5％、淀粉1.0％、NaCl0.5％和瓊脂2.0％(pH7.2-7.5)為斜面培養基，120℃下滅菌30分鐘，制成斜面，置于37℃恒溫室中3天至表面水分稍干，無雜菌生長時，接種輪枝鏈霉菌平陽變種Q835菌種孢子，于28℃培養8天。在多個500ml錐形瓶中分別裝入100ml培養基(培養基組成淀粉2.5％、葡萄糖0.5％、豆餅粉3.5％、KH2PO40.1％、ZnSO40.05％、CuSO40.01％、pH6.0-6.5)。于120℃滅菌30分鐘后，進行接種，28℃振蕩培養48小時，將該培養物作為種子。準備500L發酵罐，投料體積200L，培養基組成與種子培養基相同，120℃滅菌30分鐘，接種量為0.5％，在1∶1通氣量，29℃，以及180～200轉/分攪拌培養48小時，轉種至2噸發酵罐，培養基的投料體積為1000L。其培養基組成為淀粉2.5％、葡萄糖0.5％、玉米粉2.0％、豆餅粉3.2％、玉米漿3.0％、NaCl0.5％、KH2PO40.015％、ZnSO40.05％、CuSO40.01％、玉米油0.3％、pH6.0-6.5，在130℃-150℃連續滅菌后接種，接種量為15-20％。在罐溫29℃，通氣量1∶1至1∶1.5，攪拌速度145轉/分培養7天，至pH7.5以上，效價達到高峰時終止培養。經高效液相色譜檢測(色譜柱YWG C1810μ3.9×300mm；流動相A甲醇，B 5mM己烷磺酸鈉加0.5％冰醋酸，用濃氨水調pH至4.3,A∶B=32∶68；流速1ml/min)，發酵培養液中博安霉素的含量按重量計占博萊霉素族抗生素總量的9.8％。
發酵培養液800升用草酸調pH至3.0，再用5N NaOH調pH至6.5。加入陽離子交換樹脂122(H+型)13升，攪拌3小時。收集樹脂，用無鹽水沖洗后將樹脂裝入柱中用0.3N HCl洗脫，收集活性部份。用5N氫氧化鈉調pH至6.5，將活性溶液通過大孔吸附樹脂4006柱(柱床10升)脫鹽，用10％丙酮(含0.01N HCl)洗脫。收集活性部份，減壓濃縮。濃縮液用氨水調pH至6.5，將其通過CM-Sephadex-C-25(NH4+型)柱(柱床2.5升)，先用0.05N的NH4Cl沖洗后，再用0.1-1.0N NH4Cl梯度洗脫，洗脫液總體積約相當于柱體積的15倍。按峰位收集，合并，經大孔吸附樹脂4006柱進行脫鹽操作后，冷凍干燥。得到1.5克藍色博安霉素鹽酸鹽(含銅品)。
權利要求
1．一種高產率生產博安霉素(博萊霉素A6)的方法，該方法包括向發酵培養基中加入博安霉素的末端胺體，然后發酵培養能夠產生博安霉素的屬于輪枝鏈霉菌(Streptomyces verticillus)的微生物，并從培養液中回收所說的博安霉素。
2．按照權利要求1的方法，其中所說的輪枝鏈霉菌是輪枝鏈霉菌平陽變種(Streptomvces verticillus var.pingyangensis n.var)。
3．按照權利要求2的方法，其中所說的輪枝鏈霉菌平陽變種是輪枝鏈霉菌平陽變種(Streptomyces verticillus var.pingyangensis n.var)72。
4．按照權利要求2的方法，其中所說的輪枝鏈霉菌平陽變種是輪枝鏈霉菌平陽變種(Streptomyces verticillus var.pingyangensis n.var)Q835。
5．按照權利要求1的方法，其中所說的末端胺體是精胺鹽。
6．按照權利要求5的方法，其中所說的精胺鹽是精胺鹽酸鹽或精胺硫酸鹽。
7．按照權利要求5或6的方法，其中所說的精胺鹽是精胺鹽的粗品。
8．按照權利要求1的方法，其中所說的末端胺體是含精胺鹽的物質。
9．按照權利要求8的方法，其中所說的含精胺鹽的物質是玉米漿。
10．按照權利要求1的方法，其中所說的末端胺體的加入量為每1000升培養基加0.1-1千克(按精胺鹽酸鹽計)。
11．按照權利要求10的方法，其中所說的末端胺體的加入量為每1000升培養基加0.4-0.6千克(按精胺鹽酸鹽計)。
全文摘要
本發明涉及一種高產率生產博安霉素(博萊霉素A6)的方法,該方法包括向發酵培養基中加入博安霉素的末端胺體,然后發酵培養能夠產生博安霉素的輪枝鏈霉菌(Streptomyces verticillus),并從培養液中回收博安霉素。與現有方法相比,該方法的發酵產物中博安霉素的含量比例可提高2－7倍。
文檔編號C12P19/58GK1303949SQ9911105
公開日2001年7月18日 申請日期1999年7月29日 優先權日1999年7月29日
發明者許鴻章, 張瑞, 戴敦華, 陳汝賢, 石蓮英, 魯敏, 王麗菲 申請人:中國醫學科學院醫藥生物技術研究所