多拷貝基因在霉菌中的定點整合方法

專利名稱：多拷貝基因在霉菌中的定點整合方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一個基因的多拷貝在霉菌中的定點整合方法，涉及通過本方法獲得的一種轉(zhuǎn)化霉菌及該轉(zhuǎn)化霉菌的培養(yǎng)方法，涉及通過培養(yǎng)這些轉(zhuǎn)化霉菌生產(chǎn)和可選可不選地分泌目的蛋白的方法。具體地，本發(fā)明提出一種通過轉(zhuǎn)化霉菌來制備蛋白的方法，所述霉菌轉(zhuǎn)化方法是在霉菌，尤其是屬于曲霉屬的霉菌的染色體上整合至少一個表達(dá)基因的多個拷貝，該表達(dá)基因中含有編碼目的蛋白的結(jié)構(gòu)基因。在本說明書中，“可表達(dá)的基因”是指編碼一種與宿主生物同源或者異源的蛋白的結(jié)構(gòu)基因，控制該外加結(jié)構(gòu)基因恰當(dāng)轉(zhuǎn)錄和翻譯的DNA序列，以及可選可不選地連接的分泌信號DNA序列，其中上述DNA序列在宿主霉菌中應(yīng)該是功能性的。另外，“霉菌”和“絲狀真菌”可認(rèn)為是同義詞的。
背景技術(shù)：
及現(xiàn)有技術(shù)1．絲狀真菌和某些菌種如泡盛曲霉(Aspergillus awamoir)，黑曲霉(Aspergillus niger)，青木霉(Trichoderma reesei)，禾谷鐮孢(Fusarium graminearum)，已經(jīng)顯示是很誘人的宿主，可用于大規(guī)模生產(chǎn)同源和異源的蛋白。這些菌株能夠分泌大量的蛋白到培養(yǎng)基中，大規(guī)模的發(fā)酵技術(shù)基本上建立起來，這些霉菌中大多數(shù)是GRAS(總體認(rèn)為是安全的)的，這使得在食品和食品加工業(yè)中應(yīng)用這些菌株成為可能。而且，在英國禾谷鐮孢A 3/5，QuornRmyco-protein真菌已經(jīng)作為商業(yè)性人類食物來源，有十年的歷史了(Royer等.；Bio/Technology13(1995)1479-1483)。
真菌的蛋白生產(chǎn)，無論同源或異源，用絲狀真菌來生產(chǎn)是非常有效的，產(chǎn)量已經(jīng)達(dá)到克/升的水平。然而，與哺乳動物、細(xì)菌或植物性異源蛋白在霉菌中的生產(chǎn)水平相比，產(chǎn)量相對低。為了提高同源和異源的蛋白產(chǎn)量，發(fā)展了幾種策略。霉菌中常用的使蛋白高水平表達(dá)的基本策略是引入編碼目的蛋白基因的多拷貝。
2．在過去的幾年間，雖然霉菌成功的在實驗室和商業(yè)規(guī)模上用于生產(chǎn)酶、抗體片段和多肽(木聚糖酶，果膠酶等)，但這些基因修飾生物生產(chǎn)的產(chǎn)品在市場中遇到了一些預(yù)想不到的困難。
(A)總的說來，人們越來越關(guān)注基因修飾生物中使用的抗生素抗性基因。關(guān)注的主要原因是這類基因可能會轉(zhuǎn)到腸道微生物并表達(dá)，從而使這些微生物對抗生素有抗性。由英國農(nóng)業(yè)、漁業(yè)和食品部新食品和方法指導(dǎo)委員會公布的“抗生素抗性標(biāo)記在基因修飾的食品生物中的應(yīng)用報告”，(1994)(B)再者，其它外源性DNA，如用于克隆的載體DNA的殘余也是不受歡迎的。
(C)另一個種關(guān)注的事實是，這些基因修飾菌株中通常包含隨機(jī)整合的基因物質(zhì)。按照一些消費組織的觀察，這將構(gòu)成一種難以預(yù)測的安全威脅，這可能是一種接受衍生產(chǎn)物的阻礙。
3．因此，為了在霉菌中以經(jīng)濟(jì)的誘人方式生產(chǎn)蛋白，同時又解決以上所述的對基因修飾生物的關(guān)注，理想的重組霉菌應(yīng)當(dāng)包含編碼目的蛋白基因的多拷貝，這些基因整合在基因組中唯一預(yù)定的基因座中，而且沒有其它的外源DNA。
能夠滿足這些標(biāo)準(zhǔn)的霉菌菌株還未見文獻(xiàn)報道。
常用的將單拷貝或多拷貝基因整合到霉菌基因組中的應(yīng)用系統(tǒng)，例如整合到曲霉屬，木霉屬，禾谷鐮孢屬，都是利用了除編碼目的蛋白的基因外，還含有編碼抗生素抗性的細(xì)菌標(biāo)志基因(如氨芐青霉素)和其它的載體序列的載體。因此，基因修飾霉茵通常含有抗生素抗性基因和其它的載體DNA。
單拷貝基因的定點整合已經(jīng)有常規(guī)描述(如Ｔimberlake，“真菌中更多的基因操作(第3章)51-85，選自《基因克隆和分析》一書Bennett和Lasure主編(1991)；Gouka等，Applied andEnvironmental Microbiology 62(1996)，1951-1957)，但卻難以用于獲得基因組中預(yù)定基因座中整合多基因拷貝的霉菌。Gouka等(Curr.Genet.27(1995)536-540)報道了在泡盛曲霉pyrG基因座中定點多拷貝整合的選擇，但轉(zhuǎn)化獲得的重組菌株中使用的DNA含有載體序列，而且在pyrG基因座中整合的基因拷貝數(shù)材料沒有顯示。已報道的在黑曲霉argB基因座中定點串聯(lián)整合，結(jié)果也類似。(Van denHondel and Punt，“基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)和載體開發(fā)”(第1章)，選自《應(yīng)用分子遺傳學(xué)》一書(1991)1-28，Peberdy主編。
盡管出于科學(xué)的和商業(yè)的目的需要，幾篇其它報道表明定點整合多拷貝基因不可能獲得(Kubicek-Pranz等。J.of Biotech.20(1991)83-94；Van den Hondel等。Antonie Van Leeuwenhoek 61(1992)153-160；Verdoes等。轉(zhuǎn)基因研究2(1993)84-92；Archer等.，Antonie Van Leeuwenhoek 65(1994)245-250；Van Gemeren等.，應(yīng)用微生物學(xué)和生物工程45(1996)755-763；Van Gemeren，“用泡盛曲霉表達(dá)和分泌限定的角質(zhì)素酶變體”(Chapter 5)ThesisUniversity of Utrecht(1997)ISBN 90-393-1229-X)。
4．以前，文獻(xiàn)報道了兩種方法，用該方法理論上能夠獲得包含一個基因多拷貝的霉菌菌株，這些基因多拷貝整合在基因組的預(yù)定基因座中，而且沒有其它外源性的DNA。
第一種方法描述了由轉(zhuǎn)化真菌制備蛋白，該真菌由表達(dá)載體定點整合多拷貝到基因組核糖體DNA基因座后轉(zhuǎn)化獲得，方法見國際PCT專利申請WO-A-91/00920；Unilever，公開于1991年1月24日。盡管在酵母中有成功的范例，可以設(shè)想該方法可以用于霉菌。因此，利用該方法有可能構(gòu)建一種霉菌菌株，該菌株中一個基因的多個拷貝整合在基因組的預(yù)定基因座位點，而且沒有其它的外源DNA序列。
然而霉菌轉(zhuǎn)化方式與酵母轉(zhuǎn)化方式有某種程度上的不同。在啤酒糖酵母中轉(zhuǎn)化DNA是通過同源重組在相應(yīng)的同源位點部位整合到細(xì)胞的基因組中，而在絲狀真菌中如曲霉的整合主要是通過非常規(guī)的重組在基因組的隨機(jī)位點整合(Finkelstein，在Finkelstein和Ball主編的“絲狀真菌的生物工程學(xué)’(1992)一書中113-156頁，第6章，‘轉(zhuǎn)化”)。比如，Gouka等分析了大量的泡盛曲霉重組子(Curr.Genet.27(1995)536-540)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有近10％的重組體的DNA整合是通過同源重組，而其余的90％的重組體是隨機(jī)重組。這意味著不得不對定點整合重組體進(jìn)行篩選。因此，WO-A-91/00920中所述的轉(zhuǎn)化霉菌的方法，需要較長的篩選過程，因為引入霉菌中的DNA不僅通過同源重組在預(yù)定位點整合，而且還存在隨機(jī)整合。
第二種方法描述了單拷貝基因的定點整合，通過該方法任何其它的用于克隆的異源性DNA和其它任何異源性霉菌選擇型標(biāo)記都可去除，方法參見歐洲專利申請EP-A1-0635574；Gist-Brocades NV，公開于1995年1月25日。
如果用第二種方法制備包含多拷貝基因的轉(zhuǎn)化霉菌，那么過程非常麻煩，因為對于隨后的每個需要引入的拷貝都需要重復(fù)整個過程。
雖然獲得多拷貝基因整合的第二種方法中的重復(fù)操作，在該特定方案中以簡單的敘述方式提及(3頁，22-23行，6頁21-25行，7頁29-30行，8頁，9-11，15-16行)，但在實際操作的例子中沒有顯示。事實上，“連續(xù)應(yīng)用同樣的技術(shù)”的聲明，在第8頁第9～11行中提及，表明了在預(yù)定基因座引入多拷貝基因的這種方法的操作煩瑣特點，這種特點在單位點和多位點兩種情況都存在。
該方法更進(jìn)一步的缺點是早期引入的目的外源DNA，在隨后的重復(fù)操作中有被去除的危險。
總的來說，上面所提及的1～4條表明在霉菌生物技術(shù)領(lǐng)域需要一種構(gòu)建含編碼目的蛋白基因的多拷貝的霉菌菌株方法，構(gòu)建的霉菌在基因組的預(yù)定基因座中整合目的基因而無細(xì)菌抗生素抗性基因或其它外源性的DNA，如用于克隆的載體DNA殘余。理想化的重組微生物應(yīng)當(dāng)僅含異源性的編碼目的蛋白的基因。
發(fā)明概述本發(fā)明可應(yīng)用于霉菌生物技術(shù)領(lǐng)域，而且提出了一個新的更先進(jìn)的方法，用于在霉菌中定點整合一個基因的多拷貝，而且無任何不想要的DNA，即轉(zhuǎn)化霉菌中沒有遺留下用于選擇重組體的選擇性標(biāo)記或用于克隆的其它DNA。本發(fā)明基于在霉菌細(xì)胞的染色體靶點中特定引入雙鏈斷裂，這種斷裂可明顯增加在該基因座中的定點整合。用與斷裂點兩側(cè)區(qū)域同源的修復(fù)DNA修復(fù)斷裂，該修復(fù)DNA中包括編碼至少一個目的蛋白基因的至少一個基因的多個拷貝，在修復(fù)的同時在斷裂位點中整合上述多拷貝。
本發(fā)明提出一種轉(zhuǎn)化霉菌的方法，其中(1)目的基因的多拷貝整合在所說霉菌的染色體中，(2)與通常的霉菌隨機(jī)整合相比，在霉菌染色體中的整合是通過同源重組的定點整合，(3)這種定點整合的發(fā)生，可以優(yōu)先從任何可能的隨機(jī)的發(fā)生整合事件中篩選出來，如通過缺陷標(biāo)記基因的恢復(fù)來選擇，(4)可避免外源DNA如抗生素抗性基因和來源于其它生物的DNA序列序列的殘留，而且(5)稀有切點內(nèi)切酶，如Ⅰ-SceⅠ被用于在霉菌染色體中引入雙鏈斷裂。
盡管強調(diào)使用Ⅰ-SceⅠ作為稀有切點內(nèi)切酶，但可以設(shè)想用其它稀有切點內(nèi)切酶，包括HO內(nèi)切酶和VDE，后者也被稱為PⅠ-SceⅠ。
附圖簡述

圖1．質(zhì)粒pUR5710，pUR5711，pUR5712的構(gòu)建示意圖，其中amp氨芐青霉素抗性基因，pyrG源自泡盛曲霉的pyrG基因，‘pyrG或pyrG’分別表示該基因在5’端和3’端被截短。
圖2．質(zhì)粒pUR5713(圖2A)，pUR5714(圖2B)的構(gòu)建示意圖，其中pBS-SK=pBluescriptR-SK。
圖3．質(zhì)粒pUR5716，pUR5718的構(gòu)建示意圖，其中COS=COS位點。
圖4．質(zhì)粒pUR5729的構(gòu)建示意圖，其中PexlA=泡盛曲霉1，4-β-內(nèi)源性木糖酶A基因啟動子序列Cut=腐皮鐮孢(F.solani pisi)角質(zhì)素酶基因的編碼區(qū)(合成的CDNA拷貝)，以及TexlA=泡盛曲霉1，4-β-內(nèi)源性木糖酶A基因的終止序列。
圖5．粘粒pUR5722，pUR5725的構(gòu)建示意圖。
圖6．質(zhì)粒pUR5736，pUR5737的構(gòu)建示意圖，其中Pgpd=構(gòu)巢曲霉gpd基因啟動子序列，hph=源自埃希氏大腸桿菌的潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因的編碼區(qū)，TtrpC=構(gòu)巢曲霉trpC基因終止子序列。
圖7．質(zhì)粒pUR5724的構(gòu)建示意圖，其中Ⅰ-SceⅠ=編碼啤酒糖酵母的Ⅰ-SceⅠ內(nèi)切酶的合成基因。
圖8．用Ⅰ-SceⅠ內(nèi)切酶在泡盛曲霉中定點整合一個基因多拷貝方法的實驗設(shè)計。圖的上半部分描繪了pyrG基因，該基因的編碼區(qū)用淺灰色陰影框表示，下面為泡盛曲霉AWCSCE株中含Ⅰ-SceⅠ切割位點的靶基因座的示意圖。在pyrG基因5’非功能區(qū)和染色體上pyrG基因座3’端側(cè)翼序列之間有Ⅰ-SceⅠ位點。引入AWCSCE株中的片段含有一段pyrG基因的3’端非功能區(qū)，一個或多個基因拷貝(深灰色陰影框1，2和n表示)及一段附加序列，所述的pyrG基因的3’端(部分)非功能區(qū)，這部分序列與染色體上靶基因座中突變pyrG基因部分同源，所述的多個基因拷貝包含編碼至少一個目的蛋白的結(jié)構(gòu)基因的至少一個基因，所述的附加序列來自pyrG基因座序列且與靶基因座中Ⅰ-SceⅠ位點緊鄰的下游序列同源。將Ⅰ-SceⅠ內(nèi)切酶或含Ⅰ-SceⅠ基因的表達(dá)質(zhì)粒同時共引入該細(xì)胞中。在Ⅰ-SceⅠ位點雙鏈斷裂介導(dǎo)的同源重組后，完整的pyrG被修復(fù)且多基因拷貝同時被整合在pyrG位點，這一點在圖的下半部分闡明。
圖9．泡盛曲霉基因組DNA的Southern印跡的放射自顯影結(jié)果圖，所用探針為帶有Ⅰ-SceⅠ限制性酶切位點的末端標(biāo)記的18bp寡核苷酸，基因組DNA用Sau3A消化。M代表1kb的DNA標(biāo)準(zhǔn)(BRL)，泳道1，2和3含用Hinf Ⅰ消化后的質(zhì)粒pSCM522樣品(含Ⅰ-SceⅠ限制性酶切位點的對照DNA，用Boehringer Mannheim公司的Ⅰ-SceⅠ內(nèi)切酶，產(chǎn)品號1497235)，其濃度分別相應(yīng)于200，20和單拷貝的Ⅰ-SceⅠ限制性酶切位點。泳道4和5含有用Sau3A消化后的泡盛曲霉基因組DNA(7.5μg)。泳道6和7含用質(zhì)粒pUR5712樣品，濃度分別對應(yīng)于泡盛曲霉中單拷貝，20和200拷貝的Ⅰ-SceⅠ限制性酶切位點。
圖10．兩個泡盛曲霉pyrG突變株基因組DNA的Southern印跡的放射自顯影結(jié)果圖?；蚪MDNA用BglⅡ和Ⅰ-SceⅠ消化，用來自質(zhì)粒PAW4.1長為2.4kb內(nèi)含泡盛曲霉pyrG基因的BamHⅠ和HindⅢ片段作探針對該基因組進(jìn)行探測。M代表1kb的DNA標(biāo)準(zhǔn)(BRL)，泳道1和2含泡盛曲霉pyrG突變株基因組DNA。帶3含源自非轉(zhuǎn)化的野生型泡盛曲霉菌的基因組DNA。
圖11．泡盛曲霉株AWCSCE的轉(zhuǎn)化后獲得的重組菌株的Southern分析(見實施例4)?；蚪MDNA用SalⅠ或BglⅡ消化，用不同的探針雜交(見實施例5)。用于圖12的Southern印跡的兩個探針是pyrG=來自含泡盛曲霉tprG基因的PAW4.1的2.4kb的BamHⅠ和HindⅢ酶切片粉，TexlA=來自含用exlA終止子的質(zhì)粒pUR5729的0.5kb的AflⅡ和SacIⅠ酶切的片段。
圖的上部分描述了野生型pyrG基因。SalIⅠ酶切消化將獲得3.3kb和3.8kb各一段片段，這些片段與pyrG探針雜交。BglⅡ消化將獲得9.0kb和2.7kb各一段片段，這些片段不能與TexlA探針雜交。
再下面是泡盛曲霉AWCSCE中含Ⅰ-SceⅠ限制性酶切位點的靶基因座示意圖。SalⅠ酶切消化將獲得3.3kb和3.0kb各一段片段，其中僅3.3kb片段與pyrG探針雜交。BglⅡ消化將獲得9.0kb和2.7kb各一段片段，這些片段不能與TexlA探針雜交。
圖的下部分恢復(fù)后的pyrG基因示意圖，其中不含或含有多個拷貝的角質(zhì)素酶基因。SalⅠ酶切消化將獲得3.3kb片段，含pUR5718的重組體將獲得一段3.7kb片段，含pUR5722的重組體將獲得一段9.6kb片段，含pUR5725的重組體將獲得一段17.1kb片段，所有這些片段都將與pyrG探針雜交。BglⅡ酶切消化將獲得9.0kb片段，含pUR5718的重組體將獲得一段2.6kb片段，含pUR5722或pUR5725的重組體將獲得一段1.7kb或1.9kb片段(根據(jù)角質(zhì)素酶基因與pyrG基因的方向不同而不同)和一個源自角質(zhì)素酶基因串聯(lián)重復(fù)單元的1.5kb片段，只有在角質(zhì)素酶表達(dá)盒中含有exlA終止子的片段與TexlA探針雜交。
圖的底部顯示了pyrG和TexlA探針的位置。
圖12.重組體的Southern印跡的放射自顯影結(jié)果。M代表1kb的分子量標(biāo)準(zhǔn)(BRL)，泳帶1AWC-pUR5718#S1重組體；泳帶2AWC-pUR5718#S2重組體；泳帶3AWC-pUR5718#1重組體；泳帶4非轉(zhuǎn)化的野生型泡盛曲霉菌株；泳帶5泡盛曲霉pyrG突變株AWCSCE；泳帶6AWC-pUR5725#1重組體；泳帶7AWC-pUR5725#2重組體；泳帶8AWC-pUR5722#A1重組體；泳帶9AWC-pUR5722#A2重組體；泳帶10AWC-pUR5722#B1重組體；泳帶11AWC-pUR5722#B2重組體；泳帶12AWC-pUR5722#B3重組體；A基因組DNA用SalⅠ酶切，用pyrG探針雜交(見圖11)B基因組DNA用BglⅡ酶切，用TexlA探針雜交。
發(fā)明詳述本發(fā)明提供了一種在霉菌中定點整合一個基因多拷貝的方法，該方法包括(ⅰ)提供一種染色體DNA中含稀有內(nèi)切酶限制性位點的霉菌細(xì)胞，(ⅱ)用一段DNA轉(zhuǎn)化該霉菌細(xì)胞，所說DNA由5’到3’方向順序含(a)第一段DNA片段，該片段與霉菌染色體DNA中所含的稀有切點的內(nèi)切酶限制性位點上游部分和相鄰的DNA同源，(b)至少一個表達(dá)性基因的多個拷貝，其中含有編碼目的蛋白的結(jié)構(gòu)基因，(c)第二段DNA片段，該片段與霉菌染色體DNA中所含的稀有切點的內(nèi)切酶限制性位點的下游部分和相鄰的DNA同源在霉菌轉(zhuǎn)化過程中，使用稀有切點的內(nèi)切酶，(ⅲ)篩選或檢出所說表達(dá)基因插入到霉菌染色體DNA中的霉菌細(xì)胞。
對于定點整合，需要在靶位點上用限制性內(nèi)切酶產(chǎn)生雙鏈斷裂，而在染色體的其它位置不形成斷裂，這樣的酶的一個例子是來源于啤酒糖酵母屬的Ⅰ-SceⅠ限制性內(nèi)切酶。編碼該內(nèi)切酶的核酸序列和該序列的一些應(yīng)用在國際專利申請WO96/14408中有描述，該申請由Pasteur研究所提交并于1996年5月17日公開。按照本發(fā)明的方法，其它的一些已知的稀有切點的內(nèi)切酶同樣可以應(yīng)用，如VDE又名PⅠ-SceⅠ(M.Jasin；遺傳學(xué)動態(tài)(TIG)12(1996年6月，第6期)224-228；帶有稀有切點內(nèi)切酶位點的基因組的基因操作，M.Brenneman等，美國國家科學(xué)院院刊93(1996)3608-3612；用位點特異性核酸內(nèi)切酶通過電穿孔刺激人細(xì)胞的染色使內(nèi)同源重組和HO內(nèi)切酶(M.Chiurazzi；植物細(xì)胞8(1996年11月)2057-2066；通過HO核酸內(nèi)切酶制激Arabidopsis中的使細(xì)胞染色體內(nèi)同源重組。進(jìn)一步講，如果特定的霉菌基因組中實際上并沒有很熟悉的限制性內(nèi)切酶的限制性位點，那么該內(nèi)切酶也可以應(yīng)用，可以考慮作為該特定霉菌基因組的稀有切點的內(nèi)切酶。
構(gòu)成表達(dá)性基因一部分的編碼目的蛋白的結(jié)構(gòu)基因，可以是與霉菌同源或異源的基因。
在某種情況下，在霉菌的染色體DNA中天然存在稀有切點內(nèi)切酶的限制性酶切位點。但如果霉菌沒有這些稀有切點內(nèi)切酶的限制性酶切位點的話，可將該位點引入到預(yù)定的基因座。
轉(zhuǎn)化霉菌的篩選可使用選擇性標(biāo)記。優(yōu)選那些天然存在的野生型霉菌菌株的特征性選擇標(biāo)記，在轉(zhuǎn)化前是突變型的菌株是選擇性標(biāo)記缺陷的，如乳清苷5’磷酸脫羧酶基因(pyrG基因)，而在野生型的泡盛曲霉菌株表達(dá)。另外其它含有營養(yǎng)缺陷標(biāo)記的座位，包括trpC，argB，和niaD基因的座位也可以應(yīng)用，其它可能的選擇性標(biāo)記包括可制備出易于檢測產(chǎn)物的基因。有時，引入到霉菌中的DNA本身就可以作為選擇性標(biāo)記。比如，當(dāng)引入的DNA表達(dá)產(chǎn)生非轉(zhuǎn)化霉菌不能產(chǎn)生的一種產(chǎn)物，而且易于或不難檢測時；或者DNA的存在與否可以使用PCR技術(shù)確定時。
優(yōu)選目的基因座位于選擇性標(biāo)記內(nèi)部或緊鄰選擇性標(biāo)記。為了修復(fù)任何破裂的或(部分)缺失的基因，轉(zhuǎn)化霉菌的DNA片段可包含第三段DNA，該片段可使染色體上任何破裂或(部分)缺失的基因完整。這將允許直接篩選含靶位點整合基因的多拷貝的霉菌。
霉菌染色體DNA中，與第一段DNA同源的、稀有切點內(nèi)切酶的限制性酶切位點上游的DNA部分，可以是選擇性標(biāo)記基因的一部分?；蛘?，霉菌染色體DNA中，與第二段DNA同源的、稀有切點內(nèi)切酶的限制性酶切位點下游的DNA部分，可以是選擇性基因的一部分?；蛘呱舷掠尾糠质峭贿x擇性標(biāo)記基因的部分。
如果存在兩個或多個稀有內(nèi)切酶限制性位點的話，整合的基因拷貝數(shù)量將增加，或幾個不同的基因在不同的位點引入，或兩種可能都存在。優(yōu)選的表達(dá)性基因包含(1)在所述霉菌中可操作的啟動子(2)可選可不選的編碼分泌信號肽的DNA片段，該片段利于目的蛋白從所述霉菌中分泌(3)編碼目的蛋白的結(jié)構(gòu)基因(4)可選可不選的在所述霉菌中可操作的終止子，其中啟動子和可選可不選的終止子控制結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)。更優(yōu)選地，所述啟動子，分泌信號肽和終止子與待轉(zhuǎn)化的霉菌同源。這種情況下，可將外源DNA數(shù)量控制在最低限度。
與選擇性酶切位點介導(dǎo)的整合相似，在霉菌的轉(zhuǎn)化中加入稀有切點的內(nèi)切酶。當(dāng)引入霉茵中的DNA的量盡可能低的時候，優(yōu)選這種方法。
在霉菌的轉(zhuǎn)化中，稀有切點內(nèi)切酶的提供可以象類似的限制性介導(dǎo)的整合那樣添加(REMI；Kuspa and Loomis，美國國家科學(xué)院院刊89(1992)8803-8807；Redman and Rodriguez，Exp.Mycol.18(1994)230-246)。優(yōu)選地，導(dǎo)入到霉菌中的外源DNA的量越低越好。
但由于其它的原因，用編碼稀有切點內(nèi)切酶的DNA共轉(zhuǎn)染霉菌，這樣可以方便地在原位形成稀有切點的內(nèi)切酶，上述片段可在轉(zhuǎn)化過程中或轉(zhuǎn)化后該DNA表達(dá)。優(yōu)選的DNA是構(gòu)成質(zhì)粒的一部分但不整合入基因組，這樣轉(zhuǎn)化體在進(jìn)一步培養(yǎng)一段時間后質(zhì)粒將丟失，而目的DNA還在基因組中存在?？梢酝ㄟ^進(jìn)一步的檢測來確定受體菌株的基因組DNA中稀有確定內(nèi)切酶的丟失。
優(yōu)選的霉菌屬屬于真菌門，更優(yōu)選屬于子囊菌亞門，擔(dān)子菌亞門，鞭毛菌亞門，接合菌亞門和半知菌亞門的霉菌，尤其優(yōu)選的是選自曲霉屬的霉菌，特別是泡盛曲霉。本發(fā)明還提出了一種轉(zhuǎn)化霉菌，該霉菌可按照本發(fā)明的霉菌中基因多拷貝定點整合的方法獲得。一旦獲得按照本發(fā)明轉(zhuǎn)化的霉菌，就可以按照本發(fā)明的方法進(jìn)一步的培養(yǎng)。
本發(fā)明還提出了生產(chǎn)和可選可不選地分泌目的蛋白的方法，所述方法通過在一定條件下培養(yǎng)上述方法得到的霉菌從而使編碼目的蛋白的結(jié)構(gòu)基因得以表達(dá)；以及可選可不選地分離或濃縮目的蛋白的方法。
引入基因多拷貝的一種方法，是如下面標(biāo)題為“構(gòu)建多拷貝載體”部分中所描述的引入完整表達(dá)盒的多個拷貝。另一種方法是引入結(jié)構(gòu)基因的幾個拷貝(多順反子)。編碼的多肽制備完成后，可被切割成單個肽，如用酶KEX2。
本發(fā)明通過下面的實施例進(jìn)行例示，這些例子中所用材料和方法都有描述。
實施例1A.在泡盛曲霉中用Ⅰ-SceⅠ限制性酶切位點定點整合一個基因多個拷貝的實驗設(shè)計。
實施例1B確定泡盛曲霉基因組中天然的Ⅰ-SceⅠ限制性酶切位點的存在。
實施例1C泡盛曲霉pyrG突變株AWCSCE的構(gòu)建，其中在突變的pyrG基因座中含Ⅰ-SceⅠ限制性酶切位點。
實施例1D通過Ⅰ-SceⅠ內(nèi)切酶的表達(dá)在pyrG基因座中引入定點整合。
實施例1E重組事件的Southern印跡分析。
材料與方法細(xì)菌及霉菌菌株使用DH5α埃希氏大腸桿菌(基因型F-，endA1，hsdR17(Rk-Mk+)，supE44，thi-1，lamda-，recA1，gyrA96，relA1，△(argF-lacIZYA)U169，deoR (phi80d(lacZ) △ M15)；Hanahan；J.Mol.Biol.166(1983)557-580)作標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)菌克隆。為了把基因的多拷貝克隆入粘粒載體中，而使用了大腸桿菌1046菌株，(Cami，B.and Kourilsky，p.；核酸研究5(1978)2381)。
用泡盛曲霉菌株#40(一種泡盛曲霉CBS115.52的衍生菌株，在WO93/12237第9頁第13行中提及)構(gòu)建pyrG衍生菌株，命名為AWCSCE，在pyrG基因座中含Ⅰ-SceⅠ限制性酶切位點。
泡盛曲霉菌株#40(也稱為黑曲霉泡盛變種#40(A.nigervar.awamori #40))的制備在WO91/19782中第13頁第29～39行有描述，具體如下黑曲霉泡盛變種轉(zhuǎn)化子的表達(dá)水平可以使用合適的黑曲霉泡盛變種突變株，如黑曲霉泡盛變種#40來提高，該變異株表達(dá)的木糖酶明顯比野生型菌株要高。該黑曲霉泡盛變種#40突變株是通過突變的黑曲霉泡盛變種孢子的突變和篩選木糖酶的產(chǎn)量而獲得的。在麥麩培養(yǎng)基中，黑曲霉泡盛變種#40“xylA”突變株產(chǎn)生190000U的木糖酶，明顯的高出黑曲霉泡盛變種突變株轉(zhuǎn)化體的最好產(chǎn)量。
在該特定方案中，使用了下列內(nèi)切酶位點
切出粘端的酶切出平端的酶AflⅡC↓TTAAGSmaⅠCCC↓GGGBamHⅠ G↓GATCCBglⅡA↓GATCTEcoRⅠ G↓AATTCHindⅢ A↓AGCTTHinfⅠ G↓ANTCNdeⅠCA↓TATGNotⅠGC↓GGCCGCPstⅠCTGCA↓GSacⅠGAGCT↓CSalⅠG↓TCGACSau3AⅠ ↓GATCScaⅠAGT↓ACT和來自啤酒糖酵母的稀有切點限制性內(nèi)切酶Ⅰ-SceⅠ 18bp5’-TAGGGATAACAGGGTAAT-3’(見SEQ ID NO1)質(zhì)粒構(gòu)建用標(biāo)準(zhǔn)的重組DNA技術(shù)進(jìn)行克隆(Sambrook等，分子克隆-實驗指南。冷泉港實驗室，冷泉港，紐約。(1989))。在所有的涉及DNA接頭或PCR片段的合成步驟中，接頭或PCR片段序列的正確性通過DNA序列分析來確證，儀器使用Pharmacia LKB的ALF熒光測序儀。
靶位點的構(gòu)建在質(zhì)粒PAW4.1中的(Gouka等.；Curr.Genet.27(1995)536-540)中所含的pyrG基因5’端部分的2.0kb片段，克隆入用BamHⅠ/SalⅠ消化過的通用克隆載體pIC20R(Marsh等.；Gene 32(1984)481-485)構(gòu)建了質(zhì)粒pUR5710(圖1)。隨后，將一個含18bp的Ⅰ-SceⅠ內(nèi)切酶識別的位點(5'TAGGGATAACAGGGTAAT-3'；見SEQ ID NO1)的合成DNA接頭，而且兩側(cè)有SalⅠ和HindⅢ位點，克隆入用SalⅠ和HindⅢ處理的pUR5710中。質(zhì)粒pUR5712的構(gòu)建方法是，將質(zhì)粒pAW4.4(Gouka等.；Curr.Genet.27(1995)536-540)中含pyrG編碼基因的下游序列的2.0kb的片段，用HindⅢ消化后克隆入用HindⅢ處理的質(zhì)粒pUR5711中。HindⅢ消化片段的方向與pyrG基因的編碼區(qū)與野生型的一致。該pUR5712質(zhì)粒用于構(gòu)建泡盛曲霉pyrG基因突變株AWCSCE。
修復(fù)構(gòu)建體的構(gòu)建為了構(gòu)建質(zhì)粒pUR5713(見圖2A)，先用HindⅢ消化pAW4.4，然后用Klenow酶補平，再用BamHⅠ處理該片段。分離得到的1.6kb片段，包含pyrG編碼區(qū)基因的下游序列。而且，用BamHⅠ和HindⅢ消化質(zhì)粒pAW4.20(Gouka等.；Curr.Genet.27(1995)536-540)，分離0.4kb的片段，該片段位于與上述1.6kb片段緊鄰的上游部分，該BamHⅠ和HindⅢ消化的0.4kb和BamHⅠ和HindⅢ消化并補平HindⅢ位點的1.6kb的片段同時克隆入用BamHⅠ和SmaⅠ酶切處理的通用的克隆載體pBluescriptKSK(Stratagene)中，獲得質(zhì)粒pUR5713。質(zhì)粒pUR5714(見圖2B)的構(gòu)建方法是將內(nèi)含質(zhì)粒pAW4.1中pyrG基因3’部分長為1.0kb的BglⅡ/HindⅢ酶切片段，克隆入用BamHⅠ和HindⅢ消化的pBluescriptRSK。粘粒pUR5716(見圖3)衍生自粘粒載體pJB8(Ish-Horowicz，D.and Burke，J.F.；核酸研究。9(1981)2989)方法是用合成的含EcoRⅠ和NotⅠ限制性位點的接頭替換EcoRⅠ和HindⅢ的多接頭片段，其中合成接頭中含有下列序列(5’-AATTC AT GCGGCCGC T-3’3’-G TACGCCGGCG ATCGA-5’，見SEQ ID NO2)在這一步的克隆過程中，HindⅢ酶切位點丟失。粘粒pUR5718(見圖3)的構(gòu)建方法是用NotⅠ和HindⅢ分別消化質(zhì)粒pUR5714和pUR5713，獲得1.0kb的NotⅠ/HindⅢ片段和2.0kb的HindⅢ/NotⅠ片段，然后同時克隆入用NotⅠ酶切的pUR5716中。因此，該載體攜帶一段序列，該序列與泡盛曲霉pyrG基因突變株AWCSCE菌中pyrG靶基因座中Ⅰ-SceⅠ位點的兩側(cè)序列同源。
多拷貝載體的構(gòu)建質(zhì)粒pUR579(見圖4)的構(gòu)建方法是將從質(zhì)粒pUR7385(VanGemeren等.；Applied Microbiology and Biotechnology 45，(1996)755-763)中獲得的1.5kb的PstⅠ/SacⅠ片段，克隆入用PstⅠ/SacⅠ消化的通用克隆載體pICl9H(Marsh等.；Gene 32(1984)481-485)中，所獲得的片段含有源自Solani Pisi木曲霉(cDNA的合成拷貝；Van Gemeren等.；Journal of Biotechnology 401995)155-162)的角質(zhì)素酶的開放閱讀框架，且該基因受到來自泡盛曲霉(Gouka等.；Applied Microbiology and Biotechnology 46，(1996)28-35)的啟動子和exlA基因的終止子的控制。在粘粒pUR5718的基礎(chǔ)上，又構(gòu)建了兩個粘粒，這兩個粘粒含有在exlA表達(dá)信號控制下的角質(zhì)素酶基因的多拷貝。單拷貝的表達(dá)盒分離自質(zhì)粒pUR5729的1.5kb的片段，連接至用HindⅢ消化的粘粒pUR5718中。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α埃希氏大腸桿菌，獲得粘粒pUR5722(見圖5)，該粘粒含串聯(lián)排列的表達(dá)盒的4個拷貝。在體外模型中(Amersham；code PRN1717)，用λDNA包裝連接混合物，包裝混合物轉(zhuǎn)化埃希氏大腸桿茵1046菌株(兩次包裝方法按照模型通過的程序進(jìn)行)。結(jié)果獲得含串聯(lián)排列的表達(dá)盒的9個拷貝的粘粒pUR5725。
Ⅰ-SceⅠ表達(dá)載體的構(gòu)建質(zhì)粒pUR5736(見圖6)的構(gòu)建方法是用ScaⅠ/BamHⅠ酶切消化質(zhì)粒pAN7.1(Punt等.；Gene 56(1987)117-124)，該片段含構(gòu)巢曲霉的gpd基因的啟動子部分與埃希氏大腸桿菌hph基因的編碼區(qū)融合的片段，被含有相同啟動子并融合至NdeⅠ和BamHⅠ限制性位點的PCR片段替換。為了獲得來自質(zhì)粒pAN7.1的載體片段，質(zhì)粒用ScaⅠ酶部分酶切，因為在pUC的骨干結(jié)構(gòu)中還有另外一個ScaⅠ酶切位點。PCR片段來自PCR反應(yīng)，反應(yīng)的模板是質(zhì)粒pAN7.1，引物為MGgpdl(5’GACAAGGTCG-TTGCGTCAGTC-3’；見SEQ ID NO3)和MGgpd2(5’CGGGATCCTT-CCATATGTGATGTCTGCTCAAGCGG-3’；見SEQ ID NO4)。隨后，源自pUR5736的、含構(gòu)巢曲霉的gpd基因的啟動子和構(gòu)巢曲霉的trpC基因終止子的BglⅡ/HindⅢ片段，被克隆入通用克隆載體pBluescriptRSK中，獲得pUR5737。然后，用BamHⅠ消化pUR5737，并用Klenow酶補平，再用第二個內(nèi)切酶NdeⅠ消化。含編碼Ⅰ-SceⅠ內(nèi)切酶的合成基因的質(zhì)粒pSCM525(由巴黎Pasteur研究所Dr.B.Dujon教授惠贈，美國專利號5，474，896，1992年11月5登記)，用ScaⅠ酶切，然后用Klenow酶補平，再用第二個內(nèi)切酶NdeⅠ消化。所獲得的片段插入到質(zhì)粒pUR5737(NdeⅠ/BamHⅠ片段如上述方法補平)獲得Ⅰ-SceⅠ表達(dá)載體pUR5724(見圖7)。
轉(zhuǎn)化實驗原生質(zhì)體的制備分生孢子的制備方法是在PDA平板(土豆葡萄糖瓊脂)上放置硝酸纖維素濾膜(Hybond-N，Amersham)，培養(yǎng)泡盛曲霉幾天，然后用生理鹽水洗滌濾膜。
原生質(zhì)體的制備方法如Punt和Van Den Hondel(酶學(xué)方法。216(1993)447-457)所述方法。在裝有200ml含0.5％的酵母提取物的MM培養(yǎng)基(0.4ml 1M MgSO4，2ml 100×孢子元素(每升60g EDTA.2 H2O，11g CaCl2·2 H2O，7.5g FeSO4·7H2O，2.8g MnSO4·H2O，2.7gZnSO4·7H2O，0.8g CuSO4·5 H2O，0.9g CoCl2·-6H2O，0.5g Na2MoO4·2 H2O，0.8gH3BO3，0.5g KI，用NaOH調(diào)pH至4.0)，10ml 20％葡萄糖，4ml 50X×AspA(3.5M NaNO3，0.35M KCl，0.55M KH2PO4，用NaOH調(diào)pH至6.5)的搖瓶中，按106泡盛曲霉分生孢子/ml接種，30℃200 rpm培養(yǎng)18小時。用無菌的MiroclothR收集菌絲體，用冰冷的0.6M的MgSO4洗滌。將菌絲體重懸于OM培養(yǎng)基(每升500ml 2.4M MgSO4，480ml H2O，16.8ml 0.5M Na2HPO4.，3.2ml 0.5 M NaH2PO4，pH5.8-5.9)中，濃度為5ml/克菌絲體。隨后，按每克菌絲體加入5mg Novozym234R和6mgBSA。原生質(zhì)體繼續(xù)在30℃80～100rpm培養(yǎng)1～2小時。用光學(xué)顯微鏡檢測原生質(zhì)體的形成。用無菌的MiraclothR收集原生質(zhì)體，用Falcon試管分成30ml/每份。加入STC(1.2M山梨糖醇，10mM Tris/HClpH7.5，50mM CaCl2·2H2O)至50ml，2000rpm 4℃離心10分鐘。再用50ml的STC洗滌，并重懸于STC中，終濃度接近108原生質(zhì)體/ml。
PEG轉(zhuǎn)化5～7.5微克單種或兩種質(zhì)粒加至100μl(107)的等分級分原生質(zhì)體中，混勻并冰浴25分鐘。按2×200μl和850μl加入PEG，室溫孵育20分鐘。最后，用10ml STC洗滌混合物，室溫2000rpm離心10分鐘。樣品鋪至MM平板，篩選轉(zhuǎn)化子。
pyrG突變的泡盛曲霉菌株AWCSCE的構(gòu)建野生型的泡盛曲霉用純化的含突變的pyrG基因的ECORⅠ片段(Qiagen gel extraction kit；Qiagen Cat.no.20021)轉(zhuǎn)化，該片段源自質(zhì)粒pUR5712，其中在缺失的位點中含有Ⅰ-SceⅠ限制性酶切位點。(見圖1和8)。每一轉(zhuǎn)化，用10μg的DNA轉(zhuǎn)化2×106的原生質(zhì)體。由于pyrG菌株對5-FOA(5-氟-乳清酸；Boeke等。Mol.Gen.Genet.197(1984)_345-346)抗性，pyrG轉(zhuǎn)化子可以直接從野生型菌株中篩選出來。轉(zhuǎn)化子用MM平板篩選，平板含10mM的尿苷，0.75mg/ml的5-FOA，10mM的脯氨酸作為氮源。獲得的突變表型的轉(zhuǎn)化子，可通過在不含尿苷的MM平板上培養(yǎng)來檢測。不能在無尿苷的MM平板(用AspA-N替換AspA；50×AspA-N 0.35M KCl，0.55M KH2PO4，用NaOH調(diào)pH至6.5)上生長的兩個轉(zhuǎn)化子可進(jìn)一步通過Southern印跡分析(圖9和見下面)。
DNA分離，PCR和Southern分析用Southern分析在分子水平上來確證，霉已經(jīng)轉(zhuǎn)化菌和目的DNA已被整合入基因組。為了獲得用于提取基因組DNA的菌絲體，在50ml的必需培養(yǎng)基中接種近108的分生孢子，培養(yǎng)基中添加0.5％的酵母提取物，培養(yǎng)22小時至3天，條件是30℃搖床培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為200rpm。通過MiraclothR(Calbiochem)收集菌絲體，液氮速凍。速凍的樣品用Mikro-DismembratorR(ex Braun Biotech International)1750rpm研磨1分鐘磨成細(xì)粉。然后用Qiagen公司的基因組試劑盒(產(chǎn)品號10223)提取霉菌基因組DNA。從絲狀真菌中提取基因組DNA的方法由供應(yīng)商提供。消化細(xì)胞壁的步驟省略。
用Pekin Elmer的DNA熱循環(huán)儀進(jìn)行PCR反應(yīng)，在100微升的總的反應(yīng)體系中，基因組DNA的量接近1微克，引物每條25pMol，dNTP每種10nMol，Taq DNA聚合酶1單位(Gibco-BRL)和10微升的10×Taq DNA聚合酶緩沖液。用石蠟油覆蓋反應(yīng)管。擴(kuò)增開始時，94℃變性5分鐘，然后是94℃1分鐘，55℃1分鐘，72℃1分鐘，循環(huán)30次。最后一個循環(huán)中的延伸步驟后，再加一個72℃5分鐘。使用的引物序列如下MGpyr15’-GCCAGTACACTACTTCTTCG-3’(見SEQ ID NO5)MGpyr25’-AGGAGATCGCGAGAAGGTTG-3’(見SEQ ID NO6)為作Southern印跡，近2.5微克的DNA用4單位/微克DNA的一種或多種限制性內(nèi)切酶消化16小時。消化所用的限制性內(nèi)切酶如下Sau3A Ⅰ，BglⅡ，I-SceⅠ和SalⅠ。用0.8％的TBE配制的瓊脂糖凝膠電泳分離DNA，然后毛細(xì)管轉(zhuǎn)移方法(過夜)轉(zhuǎn)移至Hybond N膜上。按照Hybond程序?qū)δみM(jìn)行(預(yù))雜交。
圖9所示的Southern雜交，染色體DNA(7.5微克)用Sau3A Ⅰ消化。所用探針為末端標(biāo)記的18bp的寡核苷酸，該探針帶有Ⅰ-SceⅠ限制性酶切位點。探針的標(biāo)記是用T4多聚核酸激酶和γ-32P-ATP。雜交條件是42℃4小時。用2×SSC42℃洗膜5分鐘，然后用2×SSC，0.1％SDS42℃洗膜5分鐘。
圖10所示的Southern印跡，染色體DNA用BglⅡ或BglⅡ與Ⅰ-SceⅠ限制性內(nèi)切酶消化。所用探針是來自質(zhì)粒pAW4.1的2.4kb的BamHⅠ和HindⅢ酶切片段。DNA探針的標(biāo)記使用Gibcol公司的RTSRadPrime DNA標(biāo)記系統(tǒng)，用α32P-dCTP標(biāo)記。電放射自顯影結(jié)果是用Instant Imager(Packard)獲得的。
實施例1A.實驗設(shè)計圖8顯示了在泡盛曲霉中，用Ⅰ-SceⅠ限制性酶切位點定點整合基因多拷貝的方法的實驗設(shè)計。本系統(tǒng)基于3種組份，靶序列中含Ⅰ-SceⅠ限制性酶切位點的真菌菌株，含與靶基因座序列同源的序列以及編碼一個或多個目的蛋白的基因的多個拷貝序列的修復(fù)構(gòu)建體，以及含編碼Ⅰ-SceⅠ限制性內(nèi)切酶基因的表達(dá)盒的質(zhì)粒。為特異的檢測同源重組介導(dǎo)的整合，我們用內(nèi)源性的pyrG基因作為選擇性的標(biāo)記基因(Gouka等.；Curr.Genet.27(1995)536-540)。首先，我們構(gòu)建了含缺陷型pyrG基因的質(zhì)粒。其中包括3’末端編碼區(qū)的和終止子序列兩側(cè)的0.8kb的區(qū)域，被Ⅰ-SceⅠ限制性酶切位點替換(pUR5712)。用該質(zhì)粒，通過在真菌中的基因替代的選擇性策略構(gòu)建了pyrG基因缺陷的泡盛曲霉突變株AWCSCE(參見材料與方法)。其次，修復(fù)構(gòu)建體中含與缺陷的pyrG基因互補的序列，其中編碼區(qū)的5’端的0.14kb的片段缺失，該修復(fù)構(gòu)建體含有與pyrG基因缺陷的泡盛曲霉突變株中pyrG靶基因座的Ⅰ-SceⅠ限制性酶切位點兩側(cè)同源的序列。該修復(fù)構(gòu)建體中含唯一的HindⅢ限制性酶切位點，可用于編碼一個或多個目的蛋白基因的多個拷貝的插入。完整的修復(fù)構(gòu)建體的插入片段兩側(cè)有NotⅠ酶切位點，這使得去除載體DNA序列，僅插入片段轉(zhuǎn)化泡盛曲霉成為可能。第三，Ⅰ-SceⅠ限制性內(nèi)切酶基因的表達(dá)盒由啟動子，人造Ⅰ-SceⅠ限制性內(nèi)切酶的ORF(美國專利號；5，474，896；1992年11月5日提交)以及終止子構(gòu)成，其中啟動子來自黑曲霉的高效表達(dá)的甘油醛-3-磷酸脫羥基酶(gpdA)(Punt等.；Gene 56(1987)117-124)，終止子是構(gòu)巢曲霉的trpC基因的終止子(Mullaney等.；Mol.Gen.Genet.199(1985)37-45)。當(dāng)表達(dá)質(zhì)粒與修復(fù)構(gòu)建體共同引入AWCSCE菌株的原生質(zhì)體時，Ⅰ-SceⅠ限制性內(nèi)切酶的暫時性表達(dá)可以在Ⅰ-SceⅠ限制性酶切位點引入雙鏈斷裂，因此增強了修復(fù)構(gòu)建體同源重組和多基因拷貝的整合?；蛘?，通過與限制性介導(dǎo)的整合類似的方法(REMI；Kuspa and Loomis，美國國家科學(xué)院院刊。89(1992)8803-8807；Redman and Rodriguez，Exp.Mycol.18(1994)230-246；Brenneman等美國國家科學(xué)院院。93(1996)3608-3612)將Ⅰ-SceⅠ限制性內(nèi)切酶直接引入細(xì)胞。由于同源重組將恢復(fù)完整的pyrG基因，因此重組可以通過在無尿苷的MM平板上培養(yǎng)轉(zhuǎn)化細(xì)胞直接篩選出來。
實施例1B確定泡盛曲霉中天然的Ⅰ-SceⅠ限制性酶切位點的存在事件在本發(fā)明的系統(tǒng)建立之前，我們確定了泡盛曲霉中是否天然存在Ⅰ-SceⅠ限制性酶切位點。Ⅰ-SceⅠ限制性內(nèi)切酶識別的酶切位點有18個堿基，統(tǒng)計分析中6.9×1010堿基中(418)或每18500個泡盛曲霉基因組中僅有一個這樣的排列，因此在泡盛曲霉基因組似乎不可能存在Ⅰ-SceⅠ限制性酶切位點。
為確定是否存在天然的Ⅰ-SceⅠ限制性酶切位點，采用Southern印跡分析泡盛曲霉基因組DNA。基因組DNA用不在Ⅰ-SceⅠ限制性酶切位點中作用的Sau3A Ⅰ消化，產(chǎn)生更適于進(jìn)行Southern印跡的較小的片段，然后用標(biāo)記的寡核苷酸探針雜交。包括作為對照的，用各含單拷貝的Ⅰ-SceⅠ限制性酶切位點并代表每個基因組合單拷貝，20和200拷貝的位點的質(zhì)粒pUR5712和pSCM522(含有Ⅰ-SceⅠ限制性酶切位點的對照DNA，使用Boehringer Mannheim公司的Ⅰ-SceⅠ限制性內(nèi)切酶)重構(gòu)的質(zhì)粒。用18bp代表Ⅰ-SceⅠ限制性酶切位點的、末端標(biāo)記的寡核苷酸探針雜交。放射自顯影結(jié)果見圖9，其中作為對照的單拷貝的重構(gòu)質(zhì)粒有一條清晰的雜交條帶(泳帶3和6)，而含泡盛曲霉基因組DNA的第四第五條泳道中無雜交條帶。該結(jié)果證實在泡盛曲霉基因組DNA中無天然的Ⅰ-SceⅠ限制性酶切位點。因此，通過特定的基因工程技術(shù)將獨特的Ⅰ-SceⅠ限制性酶切位點引入基因組中所選的基因座，然后通過在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)或引入Ⅰ-SceⅠ限制性內(nèi)切酶而在基因組的該位點引入了獨特的雙鏈斷裂。
實施例1C泡盛曲霉pyrG突變株AWCSCE的構(gòu)建，其中在突變的pyrG基因座中含Ⅰ-SceⅠ限制性酶切位點泡盛曲霉pyrG突變株AWCSCE獲得方法如下，用來自質(zhì)粒pUR5712的突變pyrG基因替換掉染色體上野生型的pyrG基因，突變基因的缺失位點含Ⅰ-SceⅠ限制性酶切位點。因此，用純化的含來自質(zhì)粒pUR5712的插入片段的EcoR Ⅰ片段轉(zhuǎn)化泡盛曲霉菌株。每次轉(zhuǎn)化，用10微克的DNA轉(zhuǎn)化2×106原生質(zhì)體。7次轉(zhuǎn)化共獲得11個5-FOA抗性的克隆。與pyrG顯型相比，所有這些轉(zhuǎn)化株，都不能在無尿苷的MM平板上生長。提取這些克隆的基因組DNA，作為模板，用MGyr1和MGyr2引物作PCR。這些引物與缺失部分的兩側(cè)區(qū)域退火，如果是野生型的pyrG基因，將擴(kuò)增出一條1.13kb長度的片段；如果是突變型的pyrG基因，將擴(kuò)增出一條0.36kb長度的片段。11個克隆中的兩株擴(kuò)增出突變型的pyrG基因特異的0.36kb的片段，進(jìn)一步的用Southern雜交分析。其余的9個5-FOA抗性的克隆很可能是自發(fā)的突變。DNA用BglⅡ和Ⅰ-SceⅠ限制性內(nèi)切酶消化，點樣，用來自質(zhì)粒pAW4.1的含泡盛曲霉pyrG基因的BamHⅠ和HindⅢ片段的探針雜交(見圖10)。兩株突變株和野生型菌株的DNA都含有9.0kb的BglⅡ酶切片段。另外一條2.7kb的BglⅡ酶切片段在野生型茵株中存在(泳帶3)，在突變株中不存在，代之以0.5kb的突變pyrG基因特征性的BglⅡⅩ Ⅰ-SceⅠ限制性酶切片段，該片段在缺失部分含Ⅰ-SceⅠ限制性酶切位點。這些結(jié)果證明，這些突變株是由于用來自質(zhì)粒pUR5712的pyrG突變基因替代了野生型的pyrG基因。因為泳道1的突變株中還有一條接近2.0kb的原因不明的雜交帶，所以對泳道2中的突變株作進(jìn)一步的實驗，并命名為AWCSCE。
實施例1D通過Ⅰ-SceⅠ內(nèi)切酶的表達(dá)在pyrG基因座中引入定點整合。
源自pyrG突變型的泡盛曲霉AWCSCE的原生質(zhì)體，用修復(fù)構(gòu)建體單獨轉(zhuǎn)化或與Ⅰ-SceⅠ表達(dá)質(zhì)粒pUR5724一起轉(zhuǎn)化。修復(fù)構(gòu)建體由突變互補的pyrG基因(pUR5718)和含角質(zhì)素酶表達(dá)盒的4個拷貝(pUR5722)或9個拷貝(pUR5725)的重復(fù)單元組成。轉(zhuǎn)化之前，用NotⅠ酶切DNA修復(fù)構(gòu)建體，從載體序列中釋放出插入片段，并由此產(chǎn)生出與靶基因座同源的末端。轉(zhuǎn)化實驗結(jié)果見表1。轉(zhuǎn)化率，通過用含野生型pyrG基因的陽性對照的pAW4.2的平行轉(zhuǎn)化來計算。
無Ⅰ-SceⅠ表達(dá)載體pUR5724的pUR5718轉(zhuǎn)化，獲得了16個重組子，相應(yīng)的基因打靶率為10.6％，而含Ⅰ-SceⅠ表達(dá)載體共轉(zhuǎn)化，獲得了63個重組子，相應(yīng)地的基因打靶率為41.7％。這些結(jié)果表明，通過在AWCSCE菌株pyrG基因中引入雙鏈斷裂后，用修復(fù)構(gòu)建體pUR5718的基因打靶率將提高近4倍。用含4個角質(zhì)素酶表達(dá)盒的重復(fù)單元pUR5722的轉(zhuǎn)化，在無Ⅰ-SceⅠ表達(dá)載體pUR5724時，沒有獲得重組子。這表明基因打靶率低于3.6％。相比之下，含Ⅰ-SceⅠ表達(dá)載體pUR5724時，pUR5722的轉(zhuǎn)化獲得5個重組子，相應(yīng)地基因打靶率為18％。結(jié)果表明，含有串聯(lián)排列的4個角質(zhì)素酶基因的修復(fù)構(gòu)建體的基因打靶，比僅含pyrG基因的修復(fù)構(gòu)建體的pUR5718基因打靶率低2～3倍。而且，這些結(jié)果表明，通過在AWCSCE菌株pyrG基因中引入雙鏈斷裂后，用修復(fù)構(gòu)建體pUR5722的基因打靶率提高至少5倍。
用含9個角質(zhì)素酶表達(dá)盒的重復(fù)片段pUR5725的轉(zhuǎn)化，在無Ⅰ-SceⅠ表達(dá)載體pUR5724時，也沒有獲得重組子。這表明在這種情況下，基因打靶率低于0.6％。相比之下，含Ⅰ-SceⅠ表達(dá)載體pUR57254時，pUR5725的轉(zhuǎn)化獲得2個重組子，相應(yīng)地基因打靶率僅為0.4％。結(jié)果表明，含有串聯(lián)排列的9個角質(zhì)素酶基因的修復(fù)構(gòu)建體的基因打靶，比僅含pyrG基因的修復(fù)構(gòu)建體的pUR5718基因打靶率低20～100倍。
總之，這些結(jié)果證明，通過在AWCSCE菌株pyrG基因中引入雙鏈斷裂后，用含外源基因的多拷貝的修復(fù)構(gòu)建體的基因打靶率僅是一種可能性。當(dāng)修復(fù)構(gòu)建體中所含基因拷貝數(shù)增加時，修復(fù)構(gòu)建體的基因打靶效率將很低。這進(jìn)一步的證實了在前面本發(fā)明的背景資料和相關(guān)領(lǐng)域資料中提出的多基因拷貝的定點整合問題。
實施例1E重組事件的Southern印跡分析通過在MM平板上劃線接種分生孢子，來確證幾個野生型表型的重組子。其中包括在Ⅰ-SceⅠ存在和不存在時，用pUR5718轉(zhuǎn)化分別獲得的9個和10個重組子，以及用pUR5722和pUR5725轉(zhuǎn)化獲得的全部克隆。這些克隆中的10個重組子，每個克隆的分生孢子在MM平板上劃線接種。分離分生孢子，然后接種培養(yǎng)以獲得提取基因組DNA的菌絲體。DNA分離與Southern印跡方法見材料與方法。基因組DNA用BglⅡ和SalⅠ消化，Southern印跡所用探針為源自pAW4.1的2.4kb的BamHⅠ和HindⅢ酶切pyrG基因片段，或者是包含源自木聚糖內(nèi)切酶基因終止子(pUR5729)的0.46kb的AflⅠ和SacⅠ的片段，或者是含Ⅰ-SceⅠ基因的0.72kb的BamHⅠ和SalⅠ的片段或pJB8載體。Southern雜交實驗設(shè)計見圖11，用pyrG基因和TexlA基因探針?biāo)鞯姆派渥燥@影結(jié)果分別在圖12A和12B中描述。Southern印跡中野生型泡盛曲霉基因組DNA用SalⅠ消化，獲得在2.4kb、3.3kb和3.8kb獲得雜交結(jié)果(見圖12A，第4泳道)。突變型泡盛曲霉AWCSCE株中，獲得雜交結(jié)果中的3.0kb的帶代替了3.8kb的帶(見圖12A，第5泳道)。用pUR5718獲得的轉(zhuǎn)化體中完整pyrG基因恢復(fù)，將導(dǎo)致用3.7kb雜交帶代替3kb的條帶(見圖12A，第1-3泳道)。后一條帶與野生型菌株相同片段在大小方面的小差異，是由于pUR5718修復(fù)構(gòu)建體中pyrG基因3’一側(cè)的0.15kb的標(biāo)記的缺失。由于在角質(zhì)素酶表達(dá)盒中無SalⅠ位點，用質(zhì)粒pUR5722(含4個角質(zhì)素酶基因拷貝)和pUR5725(含9個角質(zhì)素酶基因拷貝)預(yù)期將以9.6kb和17.1kb的條帶替代3kb的條帶。這種替換在pUR5725和pUR5722轉(zhuǎn)化的重組子中可見，這證明了在泡盛曲霉中成功地一步定點整合了多基因拷貝。意想不到的是，在其它的重組子中，在重組過程中，角質(zhì)素酶基因的一個或多個拷貝丟失。其余的pUR5722轉(zhuǎn)化的重組子中含2個拷貝(見圖12A，第9，11和12泳道)，或者僅含一個拷貝(見圖12A，第8泳道)。其它的pUR5722轉(zhuǎn)化的重組子(見圖12A，第6泳道)中含3個拷貝。
圖12B所述的是用BglⅡ消化的基因組DNA的Southern印跡結(jié)果，所用探針為TexlA探針。該探針與內(nèi)源性的exlA基因和引入的角質(zhì)素酶基因表達(dá)盒的多拷貝雜交。因此，野生型的菌株，突變型的AWCSCE菌株和用pUR5718轉(zhuǎn)化的重組子，僅獲得6kb的雜交帶，該帶代表內(nèi)源性的exlA基因(泳帶1-5)。由于角質(zhì)素酶基因表達(dá)盒中含有一個BglⅡ酶切位點，用該酶消化后，在含角質(zhì)素酶基因表達(dá)盒的多拷貝重組子中，將產(chǎn)生1.5kb的條帶。重復(fù)片段與內(nèi)源性exlA基因的相對密度反映了存在的角質(zhì)素酶基因的拷貝數(shù)。用pUR5725轉(zhuǎn)化的重組子(泳帶6，7)還含有一條1.5kb的條帶。該條帶的密度相應(yīng)與3個(帶6)或9個(帶7)角質(zhì)素酶基因拷貝數(shù)，同時還可以通過片段的大小來確定(圖12A)。用pUR5722轉(zhuǎn)化的重組子同樣證實了這一點。由于角質(zhì)素酶基因拷貝相應(yīng)于pyrG基因的方向的不同，BglⅡ酶切將產(chǎn)生1.5kb和2kb的條帶。條帶8重組子僅含重復(fù)片段，表明僅有單拷貝的角質(zhì)素酶基因。條帶9，11，12重組子含重復(fù)片段且密度一致，表明有2個拷貝的角質(zhì)素酶基因。條帶10重組子含重復(fù)片段且密度是BORDE片段的3倍多，表明有4個拷貝的角質(zhì)素酶基因。為了證實重組子中，是否有其它的DNA，如粘粒載體序列或含Ⅰ-SceⅠ表達(dá)盒的質(zhì)粒等共整合到基因組中，同樣用Southern雜交，所用探針為包括Ⅰ-SceⅠ基因的0.72kb的BamHⅠ和SalⅠ的片段或pJB8載體(SalⅠ酶切片段)。雜交結(jié)果證實除了pUR5725轉(zhuǎn)化的重組子中有9個拷貝的角質(zhì)素酶基因外，重組子全都沒有其它DNA的整合。(結(jié)果未顯示)。這表明有可能用于構(gòu)建食品級的菌株，該菌株含基因的多拷貝而無其它的外源DNA。應(yīng)當(dāng)注意的是這里所述的實驗中，pUR5722和pUR5725插入片段在轉(zhuǎn)化之前沒有進(jìn)行純化。而且，可能通過直接轉(zhuǎn)入內(nèi)切酶而不是應(yīng)用Ⅰ-SceⅠ表達(dá)載體。這些改進(jìn)將會進(jìn)一步的提高不含外源DNA菌株的篩選。
本實施例表明在霉菌中定點整合基因多拷貝的方法的優(yōu)點是-多基因拷貝能夠在基因組的預(yù)定基因座中引入-提高在霉茵細(xì)胞的靶染色體中引入特定的雙鏈斷裂能明顯的提高多基因拷貝的定點整合的可能性-本方法獲得的霉茵菌株中無細(xì)菌抗生素抗性標(biāo)記基因或類似復(fù)制啟動子一類的其它細(xì)菌序列，結(jié)果獲得的霉菌菌株或產(chǎn)生的產(chǎn)物被稱為食品級的產(chǎn)物。
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序列表(1)一般信息(ⅰ)申請人(除了美國之外)(A)姓名Unilever N.V.
(B)街道Weena 455(C)城市Rotterdam(E)國家荷蘭(F)郵編(ZIP)NL-3013(ⅰ)申請人(除了美國之外)(A)姓名Unilever PLC(B)街道Unilever House，BlackfriarsWeena 455(C)城市倫敦(E)國家英國(F)郵編(ZIP)EC4P 4BP(GB)(ⅰ)申請人(僅對美國)(A)姓名Marcellus Johnannes Augustinus DE GROOTc/o Unilever Reseach Vlaardingen(B)街道Olivier Van Noortlaan120(C)城市Vlaardingen(E)國家荷蘭(F)郵編(ZIP)NL-3013(ⅰ)申請人(僅對美國)(A)姓名Alida Godelieve Maria Beijersbsergenc/o Unilever Reseach Vlaardingen(B)街道Olivier Van Noortlaan120(C)城市Vlaardingen(E)國家荷蘭(F)郵編(ZIP)NL-3013(ⅰ)申請人(僅對美國)(A)姓名Wouter Mustersc/o Unilever Reseach Vlaardingen(B)街道Olivier Van Noortlaan120
(C)城市Vlaardingen(E)國家荷蘭(F)郵編(ZIP)NL-3013(ⅱ)發(fā)明題目霉菌中定點整合基因多拷貝的方法(ⅲ)序列數(shù)4(ⅳ)計算機(jī)可讀形式(A)介質(zhì)類型軟盤(B)計算機(jī)IBM PC兼容機(jī)(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件Patent In Release # 1.0VERSON # 1.30(EPO)(ⅴ)現(xiàn)有申請材料申請?zhí)?未知)(2)SEQ ID NO1的信息(ⅰ)序列特征(A)長度18堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型其它核酸(A)描述/DESC=‘合成DNA’(ⅶ)早期來源(B)克?、?SceⅠ限制性內(nèi)切酶位點來自啤酒糖酵母(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO1TAGGGATAAC AGGGTAAT 18(2)SEQ ID NO2的信息(ⅰ)序列特征(A)長度20堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型其它核酸
(A)描述/DESC=‘合成DNA’(ⅶ)早期來源(B)克隆含EcoR Ⅰ和Not Ⅰ位點的合成接頭替代EcoRⅠ/HindⅢ多聚接頭片段，破壞HindⅢ位點(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO2AATTCATGCG GCCGCTAGCT20(2)SEQ ID NO3的信息(ⅰ)序列特征(A)長度21堿基(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型其它核酸(A)描述/DESC=‘合成DNA’(ⅶ)早期來源(B)克隆引物MGGPD1(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO3GACAAGGTCG TTGCGTCAGT C21(2)SEQ ID NO4的信息(ⅰ)序列特征(A)長度35堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型其它核酸(A)描述/DESC=‘合成DNA’(ⅶ)早期來源(B)克隆引物MGgpd2(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO4CGGGATCCTT CCATATGTGA TGTCTGCTCA AGCGG 35(2)SEQ ID NO5的信息(ⅰ)序列特征
(A)長度20堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型其它核酸(A)描述/DESC=‘合成DNA’(ⅶ)早期來源(B)克隆引物MGPyr1(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO5GCCAGTACAC TACTTCTTCG 20(2)SEQ ID NO6的信息(ⅰ)序列特征(A)長度20堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型其它核酸(A)描述/DESC=‘合成DNA’(ⅶ)早期來源(B)克隆引物MGPyr2(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO6AGGAGATCGC GAGAAGGTTG 20
權(quán)利要求
1．一種在霉菌中定點整合基因多拷貝的方法，該方法包括(ⅰ)提供一種霉菌細(xì)胞，其中在其染色體DNA中含有稀有內(nèi)切酶的限制性位點，(ⅱ)用一種DNA轉(zhuǎn)化該霉菌細(xì)胞，所說DNA按照5’到3’方向順序含(a)第一段DNA片段，與霉菌染色體DNA中所含的稀有切點的內(nèi)切酶限制性位點的上游部分和相鄰的DNA同源，(b)至少一個表達(dá)性基因的多拷貝，其中含有編碼目的蛋白的結(jié)構(gòu)基因，(c)第二段DNA片段，與霉菌染色體DNA中所含的稀有切點的內(nèi)切酶限制性位點的下游部分和相鄰的DNA同源，在霉菌轉(zhuǎn)化過程中，提供了稀有切點的內(nèi)切酶，(ⅲ)篩選或檢出所說表達(dá)基因多拷貝被插入到霉菌染色體DNA中的霉菌細(xì)胞。
2．根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中稀有切點內(nèi)切酶是Ⅰ-SceⅠ。
3．根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中稀有切點內(nèi)切酶切點被引入預(yù)定的基因座。
4．根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中預(yù)定的基因座位于選擇性標(biāo)記基因內(nèi)部或與之相鄰。
5．根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中所述的DNA包含第三DNA片段，該片段能夠使染色體上的破壞或部分缺失的選擇性標(biāo)記基因完整。
6．根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中霉菌染色體DNA中稀有切點的限制性酶切位點的上游的DNA部分，與第一段DNA同源，是選擇性標(biāo)記基因的一部分。
7．根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中霉菌染色體DNA中稀有切點的限制性酶切位點的下游的DNA部分，與第二段DNA同源，是選擇性標(biāo)記基因的一部分。
8．根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中稀有切點內(nèi)切酶切點在霉菌染色體DNA天然存在。
9．根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中有兩個或多個稀有切點內(nèi)切酶切點存在。
10．根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中表達(dá)性基因包含(1)在所述霉菌中可操作的啟動子(2)可選可不選的編碼分泌信號肽的DNA片段，以利于目的蛋白從所述霉菌中分泌出來，(3)編碼目的蛋白的結(jié)構(gòu)基因(4)可選可不選的在所述霉菌中可操作的終止子，其中啟動子和可選可不選地的終止子控制了結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)。
11．根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中在轉(zhuǎn)化過程中通過加入所述內(nèi)切酶提供稀有切點的內(nèi)切酶，和/或通過與編碼稀有切點內(nèi)切酶的DNA共轉(zhuǎn)化霉菌在原位形成稀有切點的內(nèi)切酶，上述DNA可在轉(zhuǎn)化過程中或轉(zhuǎn)化后表達(dá)。
12．根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中霉菌選自真菌門，優(yōu)選選自子囊菌亞門，擔(dān)子菌亞門，鞭毛菌亞門，接合菌亞門和半知菌亞門。
13．根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其中霉菌選自曲霉屬的霉菌，優(yōu)選泡盛曲霉。
14．按照權(quán)利要求1中的方法獲得的轉(zhuǎn)化霉菌。
15．一種用于培養(yǎng)按照權(quán)利要求1中的方法或通過這類方法獲得轉(zhuǎn)化霉菌的培養(yǎng)方法。
16．一種生產(chǎn)和可選可不選地分泌目的蛋白的方法，該方法通過在一定條件下實施權(quán)利要求15的方法使編碼所述目的蛋白的結(jié)構(gòu)基因得以表達(dá)，和可選可不選地分離和濃縮目的蛋白方法。
全文摘要
提出一種在霉菌中定點整合一個基因多拷貝的方法,其中包括用一段包含至少是編碼目的蛋白的一個結(jié)構(gòu)基因的至少一個表達(dá)性基因的多個拷貝的DNA片段轉(zhuǎn)化一種霉菌細(xì)胞,該霉菌細(xì)胞的染色體DNA中含有稀有切點的內(nèi)切酶限制性切點,如I－SceI,優(yōu)選導(dǎo)入到預(yù)期位點,如在選擇性標(biāo)記基因內(nèi)部或與之相鄰,轉(zhuǎn)化所用的DNA片段位于兩段與所述限制性位點的上下游及相鄰序列同源的片段之間,在轉(zhuǎn)化過程中使用稀有切點的內(nèi)切酶,然后選擇或篩選霉菌染色體DNA中插入所述表達(dá)性多基因拷貝的霉菌細(xì)胞。所述DNA片段還包含第三段DNA,該DNA能夠使染色體上破裂或部分缺失的選擇性標(biāo)記基因完整。優(yōu)選的霉菌包括曲霉屬,尤其是泡盛曲霉。還提出一種通過本發(fā)明方法獲得的轉(zhuǎn)化霉菌及培養(yǎng)該轉(zhuǎn)化霉菌的方法,生產(chǎn)和可選可不選地分泌目的蛋白的方法,該方法是在一定條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)化霉菌使編碼目的蛋白的基因表達(dá),以及可選可不選地分離或濃縮目的蛋白的方法。
文檔編號C12N15/80GK1284998SQ98813762
公開日2001年2月21日 申請日期1998年10月6日 優(yōu)先權(quán)日1997年12月22日
發(fā)明者M·J·A·德格魯特, A·G·M·貝杰斯伯根, W·穆斯特斯 申請人:尤尼利弗公司