用重組生物體生產(chǎn)甘油的方法
                            
            
                            
            文檔序號(hào)：453018閱讀：1431來源：國(guó)知局
            
                            
                        
            
                        
            
                        
            
                            專利名稱：用重組生物體生產(chǎn)甘油的方法
            
技術(shù)領(lǐng)域：
            本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域和采用重組生物體生產(chǎn)甘油和由甘油生物合成途徑衍生的化合物。更具體地講，本發(fā)明描述了用于生產(chǎn)甘油和由碳底物衍生的化合物的重組細(xì)胞的構(gòu)建、含其編碼的蛋白具有甘油-3-磷酸脫氫酶(G3PDH)和甘油-3-磷酸酶(G3P磷酸酶)活性的外源基因的細(xì)胞，在所述細(xì)胞中編碼轉(zhuǎn)化甘油的甘油激酶活性和甘油脫氫酶活性的內(nèi)源基因已經(jīng)缺失。
            
背景甘油是一種工業(yè)上大量需要的化合物，用于化妝品、液體皂、食品、藥物、潤(rùn)滑劑、防凍液以及無數(shù)其它用途。甘油酯在油脂工業(yè)中是重要的。歷史上，已經(jīng)從動(dòng)物脂肪和相似來源中分離出甘油；然而，所述方法耗費(fèi)勞力并且無效率。最好是由微生物生產(chǎn)甘油。
            
不是所有生物體都具有合成甘油的天然能力。然而，已知一些細(xì)菌、藻類和酵母的物種可生物產(chǎn)生甘油。細(xì)菌地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)和蕃茄乳桿菌(Lactobacillus lycopersica)合成甘油。發(fā)現(xiàn)耐鹽藻杜氏藻屬物種(Dunaliella sp.)和Asteromonas gracilis產(chǎn)生甘油以保護(hù)性抗外界高鹽濃度(Ben-Amotz等，(1982)Experientia 3849-52)。同樣，各種耐滲透酵母合成甘油作為保護(hù)性措施。大多數(shù)酵母屬(Saccharomyces)菌株在乙醇發(fā)酵期間產(chǎn)生一些甘油，并且施加滲透脅迫可以增強(qiáng)合成甘油(Albertyn等，(1994)Mol.Cell．Biol.14，4135-4144)。本世紀(jì)初，工業(yè)上用加入諸如亞硫酸鹽或堿的導(dǎo)向劑(steeringreagent)的酵母屬培養(yǎng)物生產(chǎn)甘油。所述導(dǎo)向劑通過形成無活性復(fù)合物阻斷或抑制乙醛轉(zhuǎn)化為乙醇；因此，可利用過量的還原性相當(dāng)物(NADH)或“導(dǎo)向”二羥丙酮磷酸還原，以產(chǎn)生甘油。該方法受限于亞硫酸鹽引起的對(duì)酵母生長(zhǎng)的部分抑制。該限制可以通過采用堿得到部分克服，所述堿通過不同的機(jī)理形成過量NADH相當(dāng)物。在該實(shí)踐中，所述堿啟動(dòng)Cannizarro歧化反應(yīng)以由兩個(gè)當(dāng)量的乙醛產(chǎn)生乙醇和乙酸。因此，盡管由天然存在的生物體生成甘油是可能的，但是生產(chǎn)常常需要控制培養(yǎng)物的滲透脅迫和亞硫酸鹽的產(chǎn)生。需要沒有這些限制的方法。對(duì)于這樣的方法，由含編碼甘油生物合成途徑重要步驟的外源基因的重組生物體生產(chǎn)甘油是一種可能途徑。
            
已經(jīng)分離了許多參與甘油生物合成途徑的基因。例如，已經(jīng)從糖化酵母(Saccharomyces diastaticus)克隆并測(cè)序了編碼甘油-3-磷酸脫氫酶的基因(DAR1，GPD1)(Wang等，(1994)，J．Bact.1767091-7095)。將DAR1基因克隆入穿梭載體并用來轉(zhuǎn)化大腸桿菌，該基因在大腸桿菌中的表達(dá)產(chǎn)生活性酶。Wang等(同上)認(rèn)識(shí)到，DAR1受細(xì)胞滲透環(huán)境的調(diào)節(jié)，但是并未提示該基因在重組生物體中可以如何用來提高甘油產(chǎn)量。
            
已經(jīng)分離了其它甘油-3-磷酸脫氫酶。例如已經(jīng)從釀酒酵母(S．cerevisiae)克隆并測(cè)序分析了sn-甘油-3-磷酸脫氫酶(Larason等，(1993)Mol.Microbiol.，101101)。Albertyn等((1994)Mol.Cell.Biol.，144135)指出，從釀酒酵母克隆編碼甘油-3-磷酸脫氫酶的GPD1。如同Wang等一樣，Albertyn等和Larason等均認(rèn)識(shí)到該基因是滲透敏感性調(diào)節(jié)的，但是并未提示該基因可以如何用于重組生物體生產(chǎn)甘油。
            
正如G3DPH一樣，已經(jīng)從釀酒酵母分離甘油-3-磷酸酶，并鑒定該蛋白由GPP1和GPP2基因編碼(Norbeck等，(1996)J.Biol.Chem.，27113875)。像G3DPH編碼基因一樣，似乎GPP2是滲透誘導(dǎo)的。
            
雖然已經(jīng)分離出G3PDH和G3P磷酸酶的編碼基因，但是本領(lǐng)域仍沒有已知的技術(shù)指出由一起表達(dá)或分別表達(dá)G3PDH/G3P磷酸酶的重組生物體生產(chǎn)甘油。也沒有已知的技術(shù)提出由具有這兩種酶活性的任何野生型生物體生產(chǎn)甘油，所述酶活性不需要對(duì)所述細(xì)胞施與某種脅迫(鹽或滲壓劑(osmolyte))。事實(shí)上，所述技術(shù)提出G3PDH活性可能不影響甘油生產(chǎn)。例如，Eustace((1987)，Can.J．Microbiol.，33112-117))指出雜交酵母菌株產(chǎn)生甘油的水平高于親代株。然而，Eustace也指出與野生型相反，在雜交的酵母菌株中G3PDH活性保持不變或略微降低。
            
甘油是工業(yè)上有用的物質(zhì)。然而，其它在工業(yè)上具有重要性的化合物也可以得自甘油生物途徑。例如，可以將生產(chǎn)甘油的生物體工程改造來生產(chǎn)一種在聚酯纖維生產(chǎn)中和聚氨基甲酸酯以及環(huán)狀化合物生產(chǎn)中具有潛在用途的單體1，3-丙二醇(U.S.5686276)。已知例如，在某些生物體中，分別通過脫水酶和氧化還原酶的作用將甘油轉(zhuǎn)化為3-羥基丙醛，然后轉(zhuǎn)化為1，3-丙二醇。例如在種群檸檬酸桿菌屬(Citrobacter)、梭菌屬(Clostridium)、腸桿菌屬(Ehterobacter)、泥桿菌屬(Ilyobacter)、克雷伯氏菌屬(Klebsiella)、乳桿菌屬(Lactobacillus)和暗桿菌屬(Pelobacter)中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)能夠產(chǎn)生1，3-丙二醇的菌株。甘油脫水酶系統(tǒng)和二醇脫水酶系統(tǒng)分別描述于Seyfried等，(1996)J．Bacteriol.1785793-5796和Tobimatsu等，(1995)J．Bilo．Chem.2707142-7148。能夠產(chǎn)生1，3-丙二醇的含有外源脫水酶的重組生物體已有描述(U.S.5686276)。盡管這些生物體產(chǎn)生1，3-丙二醇，但是清楚的是，它們得益于使甘油轉(zhuǎn)化最小化的系統(tǒng)。
            
在甘油轉(zhuǎn)化最小化時(shí)，對(duì)用于生產(chǎn)1，3-丙二醇的產(chǎn)甘油生物體工程改造具有許多優(yōu)點(diǎn)。工業(yè)上需要能夠在生理?xiàng)l件下有效產(chǎn)生甘油的微生物，尤其是當(dāng)甘油本身作為更為復(fù)雜的可以通過滲透脅迫或加入導(dǎo)向劑進(jìn)行干擾的分解代謝或生物合成途徑(例如產(chǎn)生1，3-丙二醇)的部分用作體內(nèi)底物時(shí)。在產(chǎn)生甘油激酶和甘油脫氫酶突變體方面已經(jīng)進(jìn)行了某些努力。例如，De Koning等((1900)Appl.MicrobiolBiotechnol.32693-698)報(bào)道，用二羥基丙酮激酶和甘油激酶阻斷的甲基營(yíng)養(yǎng)型酵母多形漢母遜酵母(Hansenula polymorpha)突變體來依賴甲醇生產(chǎn)二羥基丙酮和甘油。補(bǔ)充同化反應(yīng)的木酮糖-5-磷酸共底物需要的甲醇和另一底物用來生產(chǎn)甘油；然而也需要二羥基丙酮還原酶(甘油脫氫酶)。同樣，Shaw和Cameron(Book of Abstracts，第211屆ACS國(guó)家會(huì)議，New Orleans，LA，1996年3月24-28目，BIOT-154PublisherAmerican Chemical Society，Washington，D.C.)研究通過缺失ldhA(乳酸脫氫酶)、glpK(甘油激酶)和tpiA(丙糖磷酸異構(gòu)酶)來優(yōu)化1，3-丙二醇生產(chǎn)。他們沒有提出表達(dá)G3PDH或G3P磷酸酶克隆基因來生產(chǎn)甘油或1，3-丙二醇，他們也未討論甘油脫氫酶的影響。
            
所以，上述待解決的問題是缺乏通過加入或增強(qiáng)一些酶活性引導(dǎo)碳流向甘油生產(chǎn)，特別是分別催化二羥丙酮磷酸(DHAP)轉(zhuǎn)化為甘油-3-磷酸(G3P)、然后轉(zhuǎn)化為甘油的G3PDH和G3P磷酸酶。該問題的復(fù)雜性在于需要通過缺失或降低某些酶活性尤其是分別催化甘油加ATP轉(zhuǎn)化為G3P和甘油轉(zhuǎn)化為二羥丙酮(或甘油醛)的甘油激酶和甘油脫氫酶活性，從而控制碳流脫離甘油。
            
發(fā)明概述本發(fā)明提供由重組生物體生產(chǎn)甘油的方法，包括用包含以下以下一個(gè)或兩個(gè)基因的表達(dá)盒轉(zhuǎn)化合適的宿主細(xì)胞，所述基因?yàn)?a)編碼具有甘油-3-磷酸脫氫酶活性的蛋白的基因和(b)編碼具有甘油-3-磷酸磷酸酶活性的蛋白的基因；其中所述合適的宿主細(xì)胞在以下一個(gè)或兩個(gè)基因中有破壞，所述基因是(a)內(nèi)源性甘油激酶編碼基因和(b)內(nèi)源性甘油脫氫酶編碼基因；其中所述破壞阻止活性基因產(chǎn)物的表達(dá)；在存在至少一種選自單糖、寡糖、多糖和一碳底物的碳源的情況下，培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，由此生產(chǎn)甘油；以及回收所產(chǎn)生的甘油。
            
本發(fā)明還提供由重組生物體生產(chǎn)1，3-丙二醇的方法，包括用包含以下一個(gè)或兩個(gè)基因的表達(dá)盒轉(zhuǎn)化合適的宿主細(xì)胞，所述基因?yàn)?a)編碼具有甘油-3-磷酸脫氫酶活性的蛋白的基因和(b)編碼具有甘油-3-磷酸磷酸酶活性的蛋白的基因；所述合適的宿主細(xì)胞含有至少一種具脫水酶活性蛋白的編碼基因且在以下一個(gè)或兩個(gè)基因中有破壞，所述基因是(a)內(nèi)源性甘油激酶編碼基因和(b)內(nèi)源性甘油脫氫酶編碼基因，其中基因(a)或(b)中的破壞阻止活性基因產(chǎn)物的表達(dá)；在存在至少一種選自單糖、寡糖、多糖和一碳底物的碳源的情況下，培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，由此生產(chǎn)1，3-丙二醇；以及回收所產(chǎn)生的1，3-丙二醇。
            
此外，本發(fā)明提供由引入多拷貝內(nèi)源性基因的重組生物體生產(chǎn)1，3-丙二醇的方法。
            
本發(fā)明的另一實(shí)施方案包括用甘油途徑的異源基因轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞以及含有甘油途徑內(nèi)源基因的宿主細(xì)胞。
            
另外，本發(fā)明提供適合生產(chǎn)甘油或1，3-丙二醇的重組細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞具有表達(dá)甘油-3-磷酸脫氫酶活性和甘油-3-磷酸磷酸酶活性中的一種或兩種的基因，其中所述細(xì)胞也在內(nèi)源性甘油激酶編碼基因和內(nèi)源性甘油脫氫酶編碼基因中的一個(gè)或兩個(gè)基因中有破壞，其中所述基因的破壞阻止活性基因產(chǎn)物的表達(dá)。
            
附圖、生物保藏和序列表簡(jiǎn)述
            

            
圖1圖示涉及甘油代謝的典型酶途徑。
            
申請(qǐng)人根據(jù)國(guó)際承認(rèn)用于專利程序的微生物保存布達(dá)佩斯條約的條款進(jìn)行了下列生物保藏保藏人鑒定參考   國(guó)際保藏名稱   保藏日期大腸桿菌pAH21/DH5α   ATCC 98187   1996年9月26日(含有GPP2基因)大腸桿菌(pDAR1A/AA200)   ATCC 98248   1996年11月6日(含有DAR1基因)FM5大腸桿菌RJF10mATCC 98597   1997年11月25日(含有g(shù)lpK破壞)FM5大腸桿菌MSP33.6   ATCC 98598   1997年11月25日(含有g(shù)ldA破壞)
            
“ATCC”是指國(guó)際保藏機(jī)構(gòu)美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，位于12301 Parklawn Drive，Rockville，MD 20852 U.S.A.。所述名稱是所保藏材料的保藏號(hào)。
            
根據(jù)專利申請(qǐng)中核苷酸序列和氨基酸序列標(biāo)準(zhǔn)表示規(guī)則(EPO局長(zhǎng)的決定(Decision of the President of the EPO)的附錄Ⅰ和附錄Ⅱ，發(fā)表于OJ EPO的增刊第2期，12/1992)和37 C.F.R.1.821-1.825以及附錄A和B(對(duì)包含核苷酸和/或氨基酸序列的申請(qǐng)說明書的要求)，申請(qǐng)人提供了43種序列。
            
發(fā)明詳述本發(fā)明通過提供在重組生物體中由可發(fā)酵碳源生物生產(chǎn)甘油的方法來解決上述問題。所述方法提供可用于化妝品和制藥工業(yè)的快速、便宜和環(huán)保的甘油源。所述方法采用含有克隆的同源或異源甘油-3-磷酸脫氫酶(G3PDH)和/或甘油-3-磷酸酶(G3P磷酸酶)編碼基因的微生物。這些基因在內(nèi)源甘油激酶和/或甘油脫氫酶編碼基因已破壞的重組宿主中表達(dá)。該方法可用于生產(chǎn)甘油以及甘油為中間體的任何終末產(chǎn)物。將所述重組微生物與碳源接觸并培養(yǎng)，然后從條件培養(yǎng)基分離由其衍生的甘油或任何終末產(chǎn)物。所述基因可以分別或同時(shí)摻入宿主微生物以生產(chǎn)甘油。
            
申請(qǐng)人的方法先前沒有關(guān)于重組生物體的描述，并且該方法需要分離編碼所述兩種酶的基因以及所述基因隨后在內(nèi)源性激酶和脫氫酶基因已破壞的宿主細(xì)胞中表達(dá)。熟悉該領(lǐng)域的人員會(huì)知道，本申請(qǐng)人的方法一般可用于生產(chǎn)甘油是重要中間體的化合物如1，3-丙二醇。
            
用于本文的下列術(shù)語可以用來解釋權(quán)利要求書和說明書。
            
術(shù)語“甘油-3-磷酸脫氫酶”和“G3PDH”指的是負(fù)責(zé)催化二羥丙酮磷酸(DHAP)轉(zhuǎn)化為甘油-3-磷酸(G3P)的酶活性的一種多肽。在體內(nèi)G3PDH可以是NADH、NADPH或FAD依賴性的。NADH依賴酶(EC 1.1.1.8)例如由幾種基因編碼，包括GPD1(GenBank Z74071x2)、或GPD2(GenBank Z35169x1)、或GPD3(GenBank G984182)或DAR1(GenBank Z74071x2)。NADPH依賴酶(EC 1.1.1.94)由gpsA(GenBankU321643、(cds 197911-196892)G466764和L45246)編碼。FDA依賴酶(EC 1.1.99.5)由GUT2(GenBank Z47047x23)、或glpD(GenBankG147838)或glpABC(GenBank M20938)編碼。
            
術(shù)語“甘油-3-磷酸酶”、“sn-甘油-3-磷酸酶”、或“d，1-甘油磷酸酶”和“G3P磷酸酶”是指一種負(fù)責(zé)催化甘油-3-磷酸轉(zhuǎn)化為甘油和無機(jī)磷酸的酶活性的多肽。G3P磷酸酶例如由GPP1(GenBankZ47047x125)或GPP2(GenBank U18813x11)編碼。
            
術(shù)語“甘油激酶”是一種負(fù)責(zé)催化甘油和ATP轉(zhuǎn)化為甘油-3-磷酸和ADP的酶活性的多肽。高能磷酸供體ATP可以用生理取代物(例如磷酸烯醇丙酮酸)替代。甘油激酶例如由GUT1(GenBank U11583x19)和glpK(GenBank L19201)編碼。
            
術(shù)語“甘油脫氫酶”是指負(fù)責(zé)催化甘油轉(zhuǎn)化為二羥丙酮(E.C.1.1.1.6)或甘油轉(zhuǎn)化為甘油醛(E.C.1.1.1.72)的酶活性的多肽。負(fù)責(zé)催化甘油轉(zhuǎn)化為二羥丙酮的酶活性的多肽也稱為“二羥丙酮還原酶”。甘油脫氫酶可能依賴于NADH(E.C.1.1.1.6)、NADPH(E.C.1.1.1.72)或其它輔因子(例如E.C.1.1.99.22)。NADH依賴性甘油脫氫酶由例如gldA(GenBand U00006)編碼。
            
術(shù)語“脫水酶”將指能夠異構(gòu)化或轉(zhuǎn)化甘油分子為產(chǎn)物3-羥基丙醛的任何酶。為了本發(fā)明的目的，脫水酶包括分別優(yōu)選甘油和1，2-丙二醇作底物的甘油脫水酶(E.C.4.2.1.30)和二醇脫水酶(E.C.4.2.1.28)。在弗氏檸檬酸桿菌(Citrobacter freundii)中，例如，甘油脫水酶由其基因序列表示為dhaB，dhaC和dhaE(GenBank U09771堿基對(duì)分別為8556-10223，10235-10819和10822-11250)的三種多肽編碼。在產(chǎn)酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)中，二醇脫水酶由其基因序列表示為pddA、pddB和pddC(GenBank D45071堿基對(duì)分別為121-1785、1796-2407和2485-3006)的三種多肽編碼。
            
術(shù)語“GPD1”、“DAR1”、“OSG1”、“D2830”和“YDL022W”彼此通用，是指編碼胞質(zhì)甘油-3-磷酸脫氫酶的基因，其特征為SEQ IDNO1所示堿基序列。
            
術(shù)語“GPD2”是指編碼胞質(zhì)甘油-3-磷酸脫氫酶的基因，其特征為SEQ ID NO2所示堿基序列。
            
術(shù)語“GUT2”和“YIL155C”彼此通用，指的是編碼線粒體甘油-3-磷酸脫氫酶的基因，其特征為SEQ ID NO3所示堿基序列。
            
術(shù)語“GPP1”、“RHR2”和“YIL053W”彼此通用，指的是編碼胞質(zhì)甘油-3-磷酸酶的基因，其特征為SEQ ID NO4所示堿基序列。
            
術(shù)語“GPP2”、“HOR2”和“YER062C”彼此通用，指的是編碼胞質(zhì)甘油-3-磷酸酶的基因，其特征為SEQ ID NO5所示堿基序列。
            
術(shù)語“GUT1”是指編碼胞質(zhì)甘油激酶的基因，且特征為SEQ IDNO6所示的堿基序列。術(shù)語“glpK”是指另一個(gè)編碼甘油激酶的基因，其特征為GeneBank L19201堿基對(duì)77347-78855所示堿基序列。
            
術(shù)語“gldA”是指編碼甘油脫氫酶的基因，其特征為GeneBankU00006堿基對(duì)3174-4316所示堿基序列。術(shù)語“dhaD”是指另一個(gè)編碼甘油脫氫酶的基因，其特征為GeneBank U09771堿基對(duì)2557-3654所示堿基序列。
            
本文所用的術(shù)語“功能”和“酶功能”是指進(jìn)行特定化學(xué)反應(yīng)需要改變能量的酶的催化活性。這種活性可以用于平衡反應(yīng)，在所述平衡反應(yīng)中在合適條件下可以完成產(chǎn)物和底物兩者的生成。
            
術(shù)語“多肽”和“蛋白”彼此通用。
            
術(shù)語“碳底物”和“碳源”指能被本發(fā)明宿主生物體代謝的碳源，特別是選自單糖、寡糖、多糖和一碳底物或它們的混合物的常用碳源。
            
“轉(zhuǎn)化”是指通過化學(xué)反應(yīng)降解或改變化學(xué)化合物或底物的復(fù)雜性的生物體或細(xì)胞的代謝過程。
            
術(shù)語“宿主細(xì)胞”和“宿主生物體”是指能夠接受外源或異源基因以及額外拷貝的內(nèi)源基因并表達(dá)這些基因以產(chǎn)生活性基因產(chǎn)物的微生物。
            
術(shù)語“生產(chǎn)細(xì)胞”和“生產(chǎn)生物體”是指工程改造來生產(chǎn)甘油或可以衍生自甘油生物合成途徑的化合物的細(xì)胞。所述生產(chǎn)細(xì)胞將是重組的，并含具有甘油-3-磷酸脫氫酶活性蛋白的編碼基因和具甘油-3-磷酸酶活性蛋白的編碼基因中的一個(gè)或兩個(gè)。除了G3PDH和G3P磷酸酶基因外，所述宿主細(xì)胞將在內(nèi)源性甘油激酶編碼基因和內(nèi)源性甘油脫氫酶編碼基因中的一個(gè)或兩個(gè)基因中有破壞。在所述生產(chǎn)細(xì)胞設(shè)計(jì)用來生產(chǎn)1，3-丙二醇時(shí)，它另外含有具脫水酶活性蛋白的編碼基因。
            
術(shù)語“外源基因”、“外源DNA”、“異源基因”和“異源DNA”全都是指已經(jīng)置于不同宿主生物體內(nèi)的某種生物體的天然遺傳物質(zhì)。
            
關(guān)于基因或基因表達(dá)的多肽的本文所用術(shù)語“內(nèi)源性”，是指生產(chǎn)細(xì)胞天然的、而不是得自另一種生物體的基因或多肽。因此“內(nèi)源性甘油激酶”和“內(nèi)源性甘油脫氫酶”是指生產(chǎn)細(xì)胞的天然基因編碼的多肽的術(shù)語。
            
術(shù)語“重組生物體”和“轉(zhuǎn)化宿主”是指用異源或外源基因轉(zhuǎn)化的任何生物體。本發(fā)明的重組生物體表達(dá)編碼G3PDH和G3P磷酸酶的外源基因，以由合適碳底物生產(chǎn)甘油。另外，術(shù)語“重組生物體”和“轉(zhuǎn)化宿主”是指用內(nèi)源性(或同源性)基因轉(zhuǎn)化的任何生物體，以便增加基因拷貝數(shù)。
            
“基因”是指表達(dá)特定蛋白的核酸片段，包括編碼區(qū)域之前(5’非編碼區(qū))和之后(3’非編碼區(qū))的調(diào)節(jié)序列。術(shù)語“天然”和“野生型”基因是指發(fā)現(xiàn)于自然界、具有其自身調(diào)節(jié)序列的基因。
            
術(shù)語“編碼(encoding)”和“編碼(coding)”是指基因通過其轉(zhuǎn)錄和翻譯機(jī)制產(chǎn)生氨基酸序列的過程。編碼特定氨基酸序列的方法是指包括可能涉及不引起編碼的氨基酸變化的堿基改變的DNA序列、或涉及可能改變一個(gè)或一個(gè)以上氨基酸的堿基變化但是不影響該DNA序列所編碼蛋白的功能特性的DNA序列。所以本發(fā)明包括特定典型序列以外的其它序列。也設(shè)想了基本上不影響所產(chǎn)生蛋白分子功能特性的序列修飾，諸如導(dǎo)致沉默變化的缺失、插入或取代。例如設(shè)想了反映遺傳密碼簡(jiǎn)并性、或?qū)е略谥付ú课划a(chǎn)生化學(xué)上相當(dāng)氨基酸的基因序列中的變化；因此，疏水氨基酸丙氨酸的密碼子可以由編碼另一疏水性較低的殘基(諸如甘氨酸)或疏水性較高的殘基(諸如纈氨酸、亮氨酸或異亮氨酸)的密碼子取代。同樣，也可以預(yù)期導(dǎo)致一種負(fù)電荷殘基取代另一負(fù)電荷殘基(諸如天冬氨酸取代谷氨酸)或者一種正電荷殘基取代另一種正電荷殘基(諸如賴氨酸取代精氨酸)的變化產(chǎn)生生物學(xué)相當(dāng)?shù)漠a(chǎn)物。也可以預(yù)期，導(dǎo)致該蛋白分子N-末端和C-末端部分改變的核苷酸變化將不改變?cè)摰鞍谆钚?。?shí)際上在某些情況下，為了研究改變對(duì)該蛋白生物活性的影響，可能最好是制備該序列的突變體。以上提出的各種改變與確定所編碼產(chǎn)物生物活性的保留一樣，完全是本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)。此外，該領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)認(rèn)識(shí)到，本發(fā)明包括的序列也根據(jù)其與本文所列舉的序列在嚴(yán)格雜交條件(0.1XSSC，0.1％SDS，65℃)下的雜交能力進(jìn)行定義。
            
術(shù)語“表達(dá)”是指由編碼該基因產(chǎn)物序列的基因轉(zhuǎn)錄以及翻譯成為基因產(chǎn)物。
            
本文所用的術(shù)語“質(zhì)?！?、“載體”和“盒”是指常常攜帶的基因不是該細(xì)胞重要代謝的部分、并且通常是環(huán)狀雙鏈DNA分子形式的染色體外元件。這類元件可以是得自任何來源的自主復(fù)制序列、基因組整合序列、噬菌體或核苷酸序列，可以是線性或環(huán)形結(jié)構(gòu)的單鏈或雙鏈DNA或RNA，其中許多核苷酸序列已經(jīng)結(jié)合或重組為一種獨(dú)特結(jié)構(gòu)，該獨(dú)特結(jié)構(gòu)能夠?qū)?dòng)子片段和選定基因產(chǎn)物的DNA序列以及合適的3’非翻譯序列導(dǎo)入細(xì)胞?！稗D(zhuǎn)化盒”是指含有外源基因和除了該外源基因外還含有促進(jìn)特定宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)化的元件的特定載體?！氨磉_(dá)盒”是指含有外源基因和除了該外源基因外還含有允許所述基因在外源宿主中表達(dá)提高的元件的特定載體。
            
術(shù)語“轉(zhuǎn)化”和“轉(zhuǎn)染”指在摻入核酸后細(xì)胞中獲得新基因。所獲得的基因可以整合到染色體DNA中或作為染色體外復(fù)制序列導(dǎo)入。術(shù)語“轉(zhuǎn)化體”是指轉(zhuǎn)化產(chǎn)生的細(xì)胞。
            
術(shù)語“遺傳性改變”指通過轉(zhuǎn)化或突變改變遺傳物質(zhì)的方法。用于基因的術(shù)語“破壞”和“基因斷裂”是指通過在基因中加入或缺失該基因的重要部分使得該基因編碼的蛋白不表達(dá)或不以活性形式表達(dá)而遺傳性改變生物體的方法。甘油生物合成途徑設(shè)想了通過操作發(fā)現(xiàn)于大多數(shù)微生物中的甘油生物合成途徑，可以在重組生物體中生產(chǎn)甘油。通常在ATP存在下通過己糖激酶使諸如葡萄糖的碳底物轉(zhuǎn)化為葡萄糖-6-磷酸。葡萄糖-磷酸異構(gòu)酶催化葡萄糖-6磷酸轉(zhuǎn)化為果糖-6磷酸，然后通過6-磷酸果糖激酶的作用轉(zhuǎn)化為果糖-1，6-二磷酸。之后醛縮酶使該二磷酸變?yōu)槎u丙酮磷酸(DHAP)。最后NADH依賴性G3PDH將DHAP轉(zhuǎn)化為甘油-3-磷酸，再后甘油-3-磷酸通過G3P磷酸酶脫磷酸為甘油(Agarwal(1990)，Adv.Biochem.Engrg.41114)。G3PDH、甘油脫氫酶、G3P磷酸酶和甘油激酶的編碼基因本發(fā)明提供適合在宿主細(xì)胞中表達(dá)G3PDH和G3P磷酸酶活性的基因。
            
已知編碼G3PDH的基因。例如，GPD1已經(jīng)從酵母屬分離并且具有SEQ ID NO1所示的堿基序列，該堿基序列編碼SEQ ID NO7所示的氨基酸序列(Wang等，同上)。同樣，也已經(jīng)從酵母屬分離出由GPD2編碼的G3PDH活性，GPD2具有SEQ ID NO2所示的堿基序列，編碼SEQ ID NO8所示的氨基酸序列(Eriksson等，(1995)Mol.Microbiol.，1795)。
            
為了本發(fā)明目的，設(shè)想編碼負(fù)責(zé)G3PDH活性的多肽的任何基因都是合適的，其中所述活性能夠催化二羥丙酮磷酸(DHAP)轉(zhuǎn)化為甘油-3-磷酸(G3P)。此外，設(shè)想編碼分別對(duì)應(yīng)于基因GPD1、GPD2、GUT2、gpsA、glpD和glpABC的α亞單位的SEQ ID NO7、8、9、10、11和12所示的G3PDH氨基酸序列的任何基因在本發(fā)明中都是有功能的，其中所述氨基酸序列可以包含不改變?cè)撁腹δ艿陌被崛〈?、缺失或加入。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)理解，從其它來源分離的G3PDH的編碼基因也將適用于本發(fā)明。例如從原核生物分離的基因包括GenBank登記號(hào)M34393、M20938、L06231、U12567、L45246、L45323、L45324、L45325、U32164、U32689和U39682。從真菌分離的基因包括GenBank登記號(hào)U30625、U30876和X56162；從昆蟲分離的基因包括GenBank登記號(hào)X61223和X14179；以及從哺乳動(dòng)物源分離的基因包括GenBank登記號(hào)U12424、M25558和X78593。
            
已知G3P磷酸酶的編碼基因。例如GPP2已經(jīng)從釀酒酵母分離并具有SEQ ID NO5所示的堿基序列，所述堿基序列編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO13所示(Norbeck等，(1996)，J．Biol．Chem.，27113875)。
            
為了本發(fā)明目的，編碼G3P磷酸酶活性的任何基因均適用于本發(fā)明方法，其中所述活性能夠催化甘油-3-磷酸和水轉(zhuǎn)化為甘油和無機(jī)磷酸。此外，編碼分別對(duì)應(yīng)于基因GPP2和GPP1的SEQ ID NO13和14所示的G3P磷酸酶氨基酸序列的任何基因在本發(fā)明中都是有功能的，其中所述氨基酸序列包括包含不改變G3P磷酸酶酶功能的氨基酸取代、缺失或加入的任何氨基酸序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)理解，從其它來源分離的G3P磷酸酶編碼基因也將適用于本發(fā)明。例如用一種或多種以下一般或特定的磷酸酶可以實(shí)現(xiàn)甘油-3-磷酸脫磷酸產(chǎn)生甘油，所述磷酸酶如下堿性磷酸酶(EC 3.1.3.1)[GenBank M19159、M29663、U02550或M33965]；酸性磷酸酶(EC 3.1.3.2)[GenBankU51210、U19789、U28658或L20566]；甘油-3-磷酸酶(EC 3.1.3.-)[GenBank Z38060或U18813x11]；葡萄糖-1-磷酸酶(EC 3.1.3.10)[GenBank M33807]；葡萄糖-6-磷酸酶(EC 3.1.3.9)[GenBank U00445]；果糖-1，6-二磷酸酶(EC 3.1.3.11)[GenBank X12545或J03207]或磷脂酰(phosphotidyl)甘油磷酸磷酸酶(EC 3.1.3.27)[GenBank M23546和M23628]。
            
已知甘油激酶的編碼基因。例如來自酵母的甘油激酶編碼基因GUT1已經(jīng)分離并測(cè)序(Pavlik等(1993)，Curr.Genet.，2421)，其堿基序列如SEQ ID NO6所示，該序列編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO15所示。另一方面，得自大腸桿菌的glpK編碼甘油激酶，其特征為GeneBankL9201，堿基對(duì)77347-78855所示的堿基序列。
            
已知編碼甘油脫氫酶的基因。例如得自大腸桿菌的gldA編碼甘油脫氫酶，其特征為GeneBank U00006，堿基對(duì)3174-4316所示的堿基序列。另一方面，dhaD是得自弗氏檸檬酸桿菌的另一個(gè)甘油脫氫酶編碼基因，其特征為GeneBank U09771，堿基對(duì)2557-3654所示的堿基序列。宿主細(xì)胞通過表達(dá)G3PDH和G3P磷酸酶重組生產(chǎn)甘油的合適宿主細(xì)胞可以是或者原核生物細(xì)胞或者真核生物細(xì)胞，并且只受其表達(dá)活性酶的能力的限制。優(yōu)選的宿主細(xì)胞是那些通常用于生產(chǎn)甘油的細(xì)菌、酵母和絲狀真菌，例如檸檬酸桿菌屬、腸桿菌屬、梭菌屬、克雷伯氏菌屬、氣桿菌屬(Aerobacter)、乳桿菌屬、曲霉屬(Aspergillus)、酵母屬、裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)、接合酵母屬(Zygosaccharomyces)、畢赤酵母屬(Pichia)、克魯維酵母屬(Kluyveromyces)、念珠菌屬(Candida)、漢遜酵母屬(Hansenula)、德巴利酵母屬(Debaryomyces)、毛霉屬(Mucor)、球擬酵母屬(Torulopsis)、甲基細(xì)菌屬(Methylobacter)、埃希氏菌屬(Escherichia)、沙門氏菌屬(Salmonella)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、鏈霉菌屬(Streptomyces)和假單胞菌屬(Pseudomonas)。在本發(fā)明中優(yōu)選宿主細(xì)胞是大腸桿菌和酵母屬。
            
當(dāng)甘油在1，3-丙二醇生產(chǎn)中是重要中間體時(shí)，所述宿主細(xì)胞將含有或者具脫水酶活性蛋白的內(nèi)源性編碼基因或者通過轉(zhuǎn)化獲得了這種基因。特別適于生產(chǎn)1，3-丙二醇的宿主細(xì)胞是含有編碼脫水酶的內(nèi)源性基因的檸檬酸桿菌屬、腸桿菌屬、梭菌屬、克雷伯氏菌屬、氣桿菌屬、乳桿菌屬和沙門氏菌屬。此外，缺乏這種內(nèi)源性基因的宿主細(xì)胞包括大腸桿菌。載體和表達(dá)盒本發(fā)明提供適合將G3PDH和G3P磷酸酶克隆、轉(zhuǎn)化入合適宿主細(xì)胞并在其中表達(dá)的各種載體和轉(zhuǎn)化盒以及表達(dá)盒。合適的載體是那些與所用細(xì)菌相容的載體。合適的載體可以得自于例如細(xì)菌、病毒(諸如噬菌體T7或M-13衍生噬菌體)、粘粒、酵母或植物。獲得和使用這類載體的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的(Sambrook等，Molecular CloningA Laboratory Manual-第1、2、3卷(Cold SpringHarbor LaboratoryCold Spring Harbor，NY，1989))。
            
通常，上述載體或盒含有指導(dǎo)合適基因轉(zhuǎn)錄和翻譯的序列、選擇標(biāo)記以及允許自主復(fù)制和染色體整合的序列。合適的載體包含帶有轉(zhuǎn)錄起始控制的該基因的5’區(qū)，以及包含控制轉(zhuǎn)錄終止的該DNA片段的3’區(qū)。最優(yōu)選的是，這兩種控制區(qū)均得自與轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞同源的基因。這類控制區(qū)不必得自選作生產(chǎn)宿主的特定物種的天然基因。
            
可用來在所需宿主細(xì)胞中驅(qū)動(dòng)G3PDH和G3P磷酸酶基因表達(dá)的起始控制區(qū)或啟動(dòng)子種類繁多，并是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉的。實(shí)際上能夠驅(qū)動(dòng)這些基因的任何啟動(dòng)子均適合于本發(fā)明，所述啟動(dòng)子包括但不限于CYC1、HIS3、GAL1、GAL1O、ADH1、PGK、PHO5、GAPDH、ADC1、TRP1、URA3、LEU2、ENO和TPI(可用于在酵母屬中表達(dá))；AOX1(用于在畢赤酵母屬中表達(dá))；以及l(fā)ac、trp、λPL、λPR、T7、tac和trc(用于在大腸桿菌中表達(dá))。
            
終止控制區(qū)也可以得自所述優(yōu)選宿主的各種天然基因。任選的是，終止位點(diǎn)可以是非必需的；然而假如包括其中則是最優(yōu)選的。
            
為了有效表達(dá)上述例舉的(instant)酶，編碼該類酶的DNA可通過起始密碼子操作性連接至選定的表達(dá)控制區(qū)，這樣表達(dá)導(dǎo)致形成合適的信使RNA。轉(zhuǎn)化合適宿主并表達(dá)用于生產(chǎn)甘油的G3PDH和G3P磷酸酶一旦構(gòu)建了合適的盒后，將其用來轉(zhuǎn)化合適的宿主細(xì)胞。通過諸如轉(zhuǎn)化(例如用鈣透化細(xì)胞、電穿孔)或通過采用重組噬菌體病毒的轉(zhuǎn)染的已知方法(Sanbrook等，同上)，可以將含有G3PDH和/或G3P磷酸酶的編碼基因的盒導(dǎo)入所述宿主細(xì)胞。
            
正如在一般方法和實(shí)施例中全面敘述的一樣，在本發(fā)明中AH21和DAR1盒用來轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α。
            
另一方面，設(shè)想了可以操作含有內(nèi)源性G3PDH和/或G3P磷酸酶基因的合適宿主細(xì)胞，使得向上調(diào)節(jié)相關(guān)基因以生產(chǎn)甘油。
            
向上調(diào)節(jié)內(nèi)源性基因的方法是本領(lǐng)域眾所周知的。例如，為了向上調(diào)節(jié)所需要的基因，一般將結(jié)構(gòu)基因置于受體微生物識(shí)別的DNA啟動(dòng)子區(qū)的下游。除了啟動(dòng)子外，可以包括增強(qiáng)或控制異源基因表達(dá)的其它調(diào)節(jié)序列。此外，人們可以通過用于相同目的的任何已知遺傳操作來改變內(nèi)源性基因的調(diào)節(jié)序列。表達(dá)可以通過誘導(dǎo)物或阻抑物控制，以便所述微生物同步表達(dá)完成需要的代謝途徑必需的基因。
            
在本發(fā)明中，含有內(nèi)源性G3PDH和/或G3P磷酸酶活性編碼基因的宿主細(xì)胞可以置于調(diào)節(jié)型啟動(dòng)子(例如lac或osmy)或組成型啟動(dòng)子控制之下。例如，可以構(gòu)建一種盒以含有特定的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子或組成型啟動(dòng)子，其側(cè)翼為足夠長(zhǎng)度并同源于天然基因的DNA以便可以尋靶。在合適的生長(zhǎng)條件下導(dǎo)入所述盒將引起所述盒和基因的靶部分之間發(fā)生同源重組，并用調(diào)節(jié)型啟動(dòng)子取代相關(guān)的天然啟動(dòng)子。這類方法可以用來實(shí)現(xiàn)向上調(diào)節(jié)內(nèi)源性G3PDH和/或G3P磷酸酶活性編碼基因以生產(chǎn)甘油。破壞酶活性的隨機(jī)誘變和位點(diǎn)專一誘變生物體代謝甘油的酶途徑是本領(lǐng)域已知的，見圖1。甘油通過ATP依賴性甘油激酶轉(zhuǎn)化為甘油-3-磷酸(G3P)；然后G3P可以通過G3PDH氧化為DHAP。在第二個(gè)途徑中，甘油通過甘油脫氫酶氧化為二羥丙酮(DHA)；然后DHA通過ATP依賴性DHA激酶轉(zhuǎn)化為DHAP。在第三個(gè)途徑中，甘油通過甘油脫氫酶氧化為甘油醛；甘油醛可以通過ATP依賴性激酶磷酸化為甘油醛-3-磷酸。通過丙糖磷酸異構(gòu)酶的作用相互轉(zhuǎn)化的DHAP和甘油醛-3-磷酸可以進(jìn)一步通過中心代謝途徑代謝。這些途徑因引入副產(chǎn)物對(duì)甘油生產(chǎn)是有害的。
            
本發(fā)明的一個(gè)方面是能夠提供其中轉(zhuǎn)化甘油的甘油激酶活性和甘油脫氫酶活性已經(jīng)缺失、用于生產(chǎn)甘油的生產(chǎn)生物體。產(chǎn)生缺失突變體的方法是常見的并且是本領(lǐng)域眾所周知的。例如，將野生型細(xì)胞暴露于各種因子如輻射或化學(xué)誘變劑，然后篩選所需要的表型。當(dāng)通過輻射產(chǎn)生突變時(shí)，可以使用紫外(UV)或離子輻射。適用于基因突變的短波UV波長(zhǎng)范圍為200nm-300nm，其中優(yōu)選254nm。在該波長(zhǎng)內(nèi)的UV輻射主要引起核酸序列中的胍和胞嘧啶變?yōu)橄汆堰屎拖佘?。因?yàn)樗屑?xì)胞都具有修復(fù)大多數(shù)UV誘導(dǎo)的突變的DNA修復(fù)機(jī)制，所以可以加入因子如咖啡因和其它抑制劑中斷所述修復(fù)過程并最大化有效突變數(shù)。應(yīng)用300nm-400nm范圍的光的長(zhǎng)波UV突變也可以，但是一般不如短波UV光有效，除非結(jié)合使用各種與所述DNA相互作用的激活劑如補(bǔ)骨脂素染料。
            
用化學(xué)劑的誘變也有效產(chǎn)生突變體，常規(guī)使用的物質(zhì)包括影響非復(fù)制DNA的化學(xué)藥品如HNO2和NH2OH以及影響復(fù)制DNA的因子如吖啶染料，后者值得注意的是引起移碼突變。采用輻射或化學(xué)試劑產(chǎn)生突變的具體方法在本領(lǐng)域中已有充分文獻(xiàn)論述。參見例如Thoma D.Brock載于BiotechnologyA Textbook of IndustrislMicrobiology，第二版(1989)Sinauer Associates，Inc.，Sunderland，MA.，或Deshpande，Mukund V.，Appl.Biochem.Biotechnol.，36，227，(1992)，所述文獻(xiàn)通過引用結(jié)合到本文。
            
誘變發(fā)生后，可以用各種方法選擇具有需要表型的突變體。在根據(jù)產(chǎn)生所需產(chǎn)物或中間體的能力篩選變細(xì)胞的情況下，隨機(jī)篩選是最常見的。另一方面，在只有抗性菌落可以產(chǎn)生的情況下，通過在選擇性培養(yǎng)基中使誘變的群體生長(zhǎng)可以進(jìn)行突變體的選擇性分離。突變體選擇方法獲得了高度發(fā)展并是工業(yè)微生物領(lǐng)域周知的。參見Brock，同上，DeMancilha等，F(xiàn)ood Chem.，14，313，(1984)。
            
隨機(jī)靶向基因的生物誘變劑是本領(lǐng)域眾所周知的。參見例如DeBruijn和Rossbach載于Methods for General and Molecular Bacteriology(1994)American Society for Microbiology，Washington，D.C.。另一方面，如果已知基因序列，則通過與合適質(zhì)粒同源重組實(shí)現(xiàn)基因特定缺失或取代的染色體基因的破壞。參見例如Hamilton等，(1989)J.Bacteriol.17146174622，Balbas等，(1993)Gene 136211-213，Gueldener等，(1996)Nucleic Acids Res．242519-2524，和Smith等，(1996)Methods Mol.Cell Biol.5270-277。
            
預(yù)期任何上述方法均可以用來在優(yōu)選的生產(chǎn)生物體中缺失或失活甘油激酶和甘油脫氫酶。培養(yǎng)基和碳底物本發(fā)明中的發(fā)酵培養(yǎng)基必須含有合適的碳底物。合適的碳底物可以包括但不限于單糖諸如葡萄糖和果糖、寡糖諸如乳糖或蔗糖、多糖諸如淀粉或纖維素、或它們的混合物、和可再生原料的非純化混合物諸如干酪乳清滲透物、玉米漿、甜菜糖蜜和大麥芽。此外，所述碳底物也可以是已經(jīng)證實(shí)代謝轉(zhuǎn)化為關(guān)鍵的生化中間體的一碳底物諸如二氧化碳或甲醇。
            
已有報(bào)道，在甲基營(yíng)養(yǎng)酵母中(Yamada等(1989)，Agric.Biol.Chem.，53(2)541-543)和在細(xì)菌中(Hunter等(1985)，Biochemistry，244148-4155)由一碳源(例如甲醇、甲醛或甲酸鹽)生產(chǎn)甘油。這些生物體可以同化氧化狀態(tài)的從甲烷到甲酸鹽范圍的一碳化合物，并且生產(chǎn)甘油。該碳同化途徑可以通過核酮糖一磷酸、通過絲氨酸或通過木酮糖一磷酸(Gottschalk，Bacterial Metabolism，第二版，Springer-Verlag紐約(1986))。所述核酮糖一磷酸途徑涉及甲酸與核酮糖-5-磷酸縮合形成6碳糖，6碳糖變?yōu)楣牵罱K形成三碳產(chǎn)物一甘油醛-3-磷酸。同樣，所述絲氨酸途徑通過亞甲四氫葉酸將一碳化合物同化入糖酵解途徑。
            
除了一碳和二碳底物外，也已知甲基營(yíng)養(yǎng)生物體利用諸如甲胺、葡糖胺的許多其它含碳化合物和各種氨基酸用于代謝活動(dòng)。例如，已知甲基營(yíng)養(yǎng)酵母利用甲胺碳形成海藻糖或甘油(Bellion等(1993)，Microb.Growth Cl Compd.，[Int.Symp.]，第7期，415-32，編輯Murrell，J.Collin；Kelly，Don P.。出版商Intercept，Andover，英國(guó))。同樣，各種念珠菌屬菌種可以代謝丙氨酸或油酸(Sulter等(1990)，Arch.Microbiol.，153(5)485-9)。因此，在本發(fā)明中所用的碳源可以包括種類繁多的含碳底物，并且只受生物體選擇的限制。
            
盡管上述所有碳底物和它們的混合物均適用于本發(fā)明，但是優(yōu)選的碳底物為單糖、寡糖、多糖、一碳底物或它們的混合物。更優(yōu)選的糖諸如葡萄糖、果糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、以及諸如甲醇和二氧化碳的一碳底物。作為碳底物最優(yōu)選葡萄糖。
            
除了合適的碳源外，發(fā)酵培養(yǎng)基必須含有合適的礦物質(zhì)、鹽、輔因子、緩沖劑以及其它組分，這些是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知、適合培養(yǎng)物生長(zhǎng)和促進(jìn)生產(chǎn)甘油所必需的酶途徑的。培養(yǎng)條件通常，細(xì)胞在合適培養(yǎng)基中于30℃生長(zhǎng)。優(yōu)選的生長(zhǎng)培養(yǎng)基為普通工業(yè)制備的培養(yǎng)基，諸如Luria Bertani(LB)肉湯、SabouraudDextrose(SD)肉湯或酵母培養(yǎng)基(YM)肉湯。也可以采用其它確定成分或合成的生長(zhǎng)培養(yǎng)基，用于特定微生物生長(zhǎng)的合適培養(yǎng)基是微生物學(xué)或發(fā)酵學(xué)領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。使用已知直接或間接調(diào)節(jié)分解代謝物阻抑的物質(zhì)(例如環(huán)3’∶5’腺苷酸)也可以加入到該反應(yīng)培養(yǎng)基中。同樣，也可以與基因操作結(jié)合或作為基因操作的替代方法，使用提高甘油產(chǎn)量的已知酶活性調(diào)節(jié)物質(zhì)(例如亞硫酸鹽、亞硫酸氫鹽和堿)。
            
發(fā)酵的合適pH范圍是pH 5.0-9.0，其中初始狀態(tài)優(yōu)選pH范圍為6.0-8.0。
            
在有氧或無氧的條件下進(jìn)行反應(yīng)，其中優(yōu)選無氧或微需氧的條件。鑒定G3PDH、甘油脫氫酶、G3P磷酸酶和甘油激酶活性通過酶檢測(cè)法測(cè)量蛋白G3PDH、G3P磷酸酶、甘油脫氫酶和甘油激酶的表達(dá)水平。一般來說，G3PDH活性和甘油脫氫酶活性檢測(cè)在DHAP轉(zhuǎn)化為G-3-P和DHA轉(zhuǎn)化為甘油的過程中分別依賴于的共底物NADH的光譜性質(zhì)。NADH具有固有的紫外/可見光吸收，可以于340nm下用分光光度法監(jiān)測(cè)其消耗。G3P磷酸酶活性可以通過檢測(cè)該反應(yīng)中釋放出的無機(jī)磷酸鹽的任何方法進(jìn)行檢測(cè)。最普遍使用的檢測(cè)方法采用可見光譜測(cè)定藍(lán)色磷鉬酸銨復(fù)合物。甘油激酶活性可以通過檢測(cè)得自甘油和ATP的G3P進(jìn)行檢測(cè)，例如采用NMR檢測(cè)。必要時(shí)，可以例如采用替代輔因子對(duì)各個(gè)酶的更具體的特性進(jìn)行分析。鑒定和回收甘油以及其它產(chǎn)物(例如1，3-丙二醇)甘油和其它產(chǎn)物(例如1，3-丙二醇)可以通過對(duì)無細(xì)胞提取物進(jìn)行高效液相層析(HPLC)和氣相層析/質(zhì)譜(GC/MS)分析法分析鑒定和定量。優(yōu)選的方法是采用無梯度的0.01N硫酸流動(dòng)相，在分析性離子交換柱上分析發(fā)酵培養(yǎng)基。
            
從發(fā)酵培養(yǎng)基回收甘油的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。例如，對(duì)所述反應(yīng)混合物進(jìn)行以下序貫步驟可以從細(xì)胞培養(yǎng)基獲得甘油，所述步驟是過濾、脫水、有機(jī)溶劑提取和分級(jí)蒸餾(美國(guó)專利第2，986，495號(hào))。
            
盡管最適甘油生產(chǎn)的生物體含有上述基因破壞，但是在缺乏這種基因破壞的情況下，用含有中外源性G3PDG和G3P磷酸酶基因的一個(gè)或兩個(gè)的宿主細(xì)胞生產(chǎn)甘油是可能的。例如攜帶DAR1基因的重組大腸桿菌菌株AA200(實(shí)施例1)根據(jù)發(fā)酵參數(shù)能夠生產(chǎn)甘油0.38g／L-0.48g/L同樣，攜帶并可表達(dá)GPP2基因的大腸桿菌DH5α(實(shí)施例2)能夠產(chǎn)生甘油0.2g/L。當(dāng)兩種基因均存在的情況下(實(shí)施例3和4)，甘油產(chǎn)量達(dá)到約40g/L。在兩種基因均存在并去除了內(nèi)源性甘油激酶活性的情況下可見甘油轉(zhuǎn)化減少(實(shí)施例8)。而且，甘油脫氫酶活性的存在與在葡萄糖有限的情況下的甘油轉(zhuǎn)化有關(guān)；因此，預(yù)期去除甘油脫氫酶活性將導(dǎo)致甘油轉(zhuǎn)化減少(實(shí)施例8)。l，3-丙二醇的生產(chǎn)本發(fā)明也可以適用于通過采用表達(dá)外源G3PDH和/或G3P磷酸酶基因且內(nèi)源性甘油激酶和/或甘油脫氫酶活性已破壞的重組生物體來生產(chǎn)l，3-丙二醇。另外，本發(fā)明提供由其中導(dǎo)入多拷貝內(nèi)源性基因的重組生物體生產(chǎn)1，3-丙二醇的方法。除了這些遺傳改變外，所述生產(chǎn)細(xì)胞還需要存在活性脫水酶的編碼基因。所述脫水酶活性可以是甘油脫水酶或二醇脫水酶活性。所述脫水酶活性可以產(chǎn)生自內(nèi)源性基因的表達(dá)或轉(zhuǎn)染入宿主生物體的外源基因的表達(dá)。編碼合適脫水酶的基因的分離和表達(dá)是本領(lǐng)域眾所周知的，并在1996年11月5日提交的PCT/US96/06705和U.S.5686276以及U.S.5633362中由申請(qǐng)人指出，所述專利文獻(xiàn)通過引用結(jié)合到本文中。應(yīng)該認(rèn)識(shí)到，因?yàn)楦视褪?，3-丙二醇生產(chǎn)中的重要中間體，所以所述宿主細(xì)胞含有脫水酶活性和表達(dá)的外源性G3PDH和/或G3P磷酸酶基因和不存在轉(zhuǎn)化甘油的甘油激酶或甘油脫氫酶活性的情況下，該細(xì)胞將特別適于生產(chǎn)1，3-丙二醇。
            
在以下實(shí)施例中進(jìn)一步詳細(xì)說明本發(fā)明。應(yīng)該理解的是，這些實(shí)施例盡管指出本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案，但僅僅是為了說明。從上述討論和這些實(shí)施例中，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠明確本發(fā)明的基本特征，并可在不偏離本發(fā)明的精神和范疇內(nèi)對(duì)其進(jìn)行各種改變和改進(jìn)以將其用于各種用途和情況。
            
實(shí)施例一般方法磷酸化、連接和轉(zhuǎn)化的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。適合用于以下實(shí)施例的技術(shù)可以發(fā)現(xiàn)于Sambrook等，Molecular CloningALaboratory Manual，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)。
            
適合細(xì)菌培養(yǎng)物的保持和生長(zhǎng)的材料和方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。適合用于以下實(shí)施例的技術(shù)可以發(fā)現(xiàn)于Manual of Methods forGeneral Bacteriology(Phillipp Gerhardt，R.G.E.Murray，Ralph N.Costilow，Eugene W.Nester，Willis A.Wood，Noel R.Krieg和G.BriggsPhillips，編輯)，美國(guó)微生物協(xié)會(huì)，華盛頓(1994)，或發(fā)現(xiàn)于BiotechnologyA Textbook of Industrial Microbiology(Thomas D.Brock，第二版(1989)，Sinauer Associates，Inc.，Sunderland，MA)。所有用于細(xì)菌細(xì)胞生長(zhǎng)和保持的試劑和材料均從Aldrich Chemicals(Milwaukee，WI)、DIFCO Laboratories(Detroit，MI)、GIBCO/BRL(Gaithersburg，MD)或Sigma化學(xué)公司(St.Louis，MO)獲得，除非另外具體說明。
            
縮寫的意義如下“h”指小時(shí)，“min”指分鐘，“sec”指秒，“d”指天，“mL”指毫升，“L”指升。
            
細(xì)胞株以下大腸桿菌菌株用于轉(zhuǎn)化和表達(dá)G3PDH和G3P磷酸酶。從大腸桿菌遺傳保藏中心、ATCC或由Life Technologies(Gaithersburg，MD)獲得菌株。
            
AA200(garB10 fhuA22 ompF627 fadL701 relAl pit-10 spoT1 tpi-1phoM510 mcrB1)(Anderson等，(1970)，J．Gen Microbiol.，62329)。
            
BB20(tonA22ΔphoA8 fadL701 relA1 glpR2 glpD3 pit-10 gpsA20spoT1 T2R)(Cronan等，J．Bact.，118598)。
            
DH5α(deoR end-A1 gyrA96 hsdR17 recA1 relA1 supE44 thi-1Δ(lacZYA-argFV169)phi80lacZΔM15F)(Woodcock等，(1989)，Nucl.Acids Res.，173469)。
            
FM5大腸桿菌(ATCC 53911)。
            
甘油的鑒定通過HPLC和/或GC監(jiān)測(cè)葡萄糖轉(zhuǎn)化為甘油。采用層析領(lǐng)域技術(shù)人員可獲得的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)和材料進(jìn)行分析。一種合適方法采用使用UV(210nm)和RI檢測(cè)的Waters Maxima 820 HPLC系統(tǒng)。將樣品注射入裝備有Shodex SH-1011P前置柱(6mm×50mm)的Shodex SH-1011柱(8mm×300mm；Waters，Milfotd，MA)，溫度控制于50℃，采用0.01NH2SO4作流速為0.69mL/分鐘的流動(dòng)相。當(dāng)需要定量分析時(shí)，用已知量三甲基乙酸作外標(biāo)制備樣品。通常，1，3-丙二醇(RI檢測(cè))、甘油(RI檢測(cè))和葡萄糖(RI檢測(cè))的保留時(shí)間分別是21.39分鐘、17.03分鐘和12.66分鐘。
            
也通過GC/MS分析甘油。采用DB-WAX柱(30m，0.32mm I.D.，0.25um薄膜厚度，J & W Scientific，F(xiàn)olsom，CA)，用氣相層析和質(zhì)譜分析法檢測(cè)甘油的分離和定量，按以下條件進(jìn)行注射器∶分流注射器，1∶15；樣品體積1uL；溫度分布型初始溫度150℃保持30秒，40℃/min至180℃，20℃/min至240℃，保持2.5分鐘。檢測(cè)EI質(zhì)譜分析法(Hewlett Packard 5971，San Femando，CA)，定量SIM采用離子61m/z和64m/z作為甘油和甘油-d8的靶離子，以及用離子43m/z作甘油的鑒定離子(qualifier ion)。甘油-d8用作內(nèi)標(biāo)。檢測(cè)甘油-3-磷酸酶即G3P磷酸酶通過在pH 6.5的bis-Tris或MES和鎂緩沖液中溫育所述提取物和有機(jī)磷酸鹽底物，進(jìn)行酶活性檢測(cè)。所用底物不是1-α-甘油磷酸，就是d，1-α-甘油磷酸。在該檢測(cè)中所述試劑的終濃度是緩沖液(20mM，bis-Tris或50mM MES)；MgCl2(10Mm)；以及底物(20mM)。如果樣品中的總蛋白低并且用酸猝滅不發(fā)生可見的沉淀，則方便地在比色杯中檢測(cè)樣品。該方法包括在含有20mM底物(50μl，200mM)、50mMMES、10mM MgCl2、pH 6.5緩沖液的比色杯中溫育酶樣品。該最終磷酸酶檢測(cè)體積為0.5mL。將該含酶樣品加入到上述反應(yīng)混合物中；混合比色杯中的內(nèi)容物，然后將比色杯置于循環(huán)的水浴中，于37℃保持5-120分鐘，時(shí)間長(zhǎng)度取決于酶樣品中的磷酸酶活性是否在范圍2-0.02U/mL內(nèi)。通過加入酸性鉬酸鹽試劑(0.4mL)猝滅該酶反應(yīng)。在加入Fiske SubbaRaw試劑(0.1mL)和蒸餾水(1.5mL)后，混合上述溶液，并讓其顯色。10分鐘后，讓其發(fā)生完全顯色，采用Cary 219 UV/可見光分光光度計(jì)于660nm讀樣品的吸光度。將釋放的有機(jī)磷酸鹽的量與標(biāo)準(zhǔn)曲線相比，該標(biāo)準(zhǔn)曲線是通過采用無機(jī)磷原液(0.65mM)和制備無機(jī)磷酸鹽終濃度范圍為0.026-0.130μmol/mL的6個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品制作的。分光光度檢測(cè)法檢測(cè)甘油-3-磷酸脫氫酶(G3PDH)活性使用如下改良Bell等發(fā)表方法((1975)，J.Biol.Chem.，2507153-8)的下列方法。該方法包括溫育比色杯中的酶樣品，比色杯中含有0.2mMNADH、2.0mM二羥丙酮磷酸(DHAP)和酶的具有5mM DTT的pH 7.5的0.1M Tris/HCl緩沖液，總體積為1.0mL，溫度為30℃。設(shè)定分光光度計(jì)以于340nm固定波長(zhǎng)監(jiān)測(cè)吸光度變化。以只含緩沖液的比色杯作為該儀器的空白。在將所述酶加到比色杯中后，進(jìn)行吸光度讀數(shù)。加入第一種底物NADH(50uL 4mM NADH；吸光度應(yīng)增加大約1.25AU)以確定本底速率。應(yīng)觀測(cè)該本底速率至少3分鐘。然后加入第二種底物DHAP(50uL 40mM DHAP)，監(jiān)測(cè)吸光度隨時(shí)間的變化至少3分鐘以確定總速率。從總速率減去本底速率確定G3PDH活性。13C-NMR檢測(cè)甘油激酶活性將適量的通常為無細(xì)胞粗提取物的酶加入到反應(yīng)混合物中，于25℃反應(yīng)75分鐘，所述反應(yīng)混合物含有40mM ATP、20mM MgSO4、21mM均一13C標(biāo)記的甘油(99％，Cambridge Isotope Laboratories)和0.1MTris-HCl，pH 9。用13C-NMR(125MHz)檢測(cè)甘油轉(zhuǎn)化為甘油3-磷酸甘油(63.11ppm，d，J=41Hz和72.66ppm，t，J=41Hz)；甘油3-磷酸(62.93ppm，d，J=41Hz；65.31ppm，br d，J=43Hz；和72.66mmp，dt，J=6，41Hz)。NADH聯(lián)動(dòng)甘油脫氫酶檢測(cè)在通過非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白后，檢測(cè)大腸桿菌菌株(gldA)中的NADH聯(lián)動(dòng)甘油脫氫酶活性。采用吩嗪硫酸二甲酯(PMS)作中間體，將甘油加NAD+轉(zhuǎn)化為二羥丙酮加NADH的轉(zhuǎn)化與溴化3-[4，5-二甲基噻唑-2-基]-2，5-二苯基四唑鎓轉(zhuǎn)化為深色的甲_的轉(zhuǎn)化偶聯(lián)起來(Tang等，(1997)J.Bacteriol.140182)。
            
采用天然凝膠(8-16％TG，1.5mm，得自Novex，San Diego，CA的15種泳道凝膠)，用標(biāo)準(zhǔn)方法復(fù)份進(jìn)行電泳。通過用50mM Tris或碳酸鉀緩沖液pH 9洗滌3次，每次10分鐘，從所述凝膠去除殘留的甘油。在15mL含有50mM Tris或碳酸鉀pH 9、60mg硫酸銨、75mg NAD+、1.5mg MTT和0.5mg PMS、含有或不含有甘油(終濃度約0.16M)的檢測(cè)液中對(duì)復(fù)份凝膠進(jìn)行顯色。
            
此外，在聚丙烯酰胺凝膠電泳后，通過與針對(duì)純化的肺炎克雷伯氏茵(K．pneumoniae)甘油脫氫酶(dhaD)的多克隆抗體反應(yīng)，，檢測(cè)在大腸桿菌菌株(gldA)中是否存在NADH聯(lián)動(dòng)的甘油脫氫酶活性。質(zhì)粒構(gòu)建和菌株構(gòu)建克隆和表達(dá)甘油-3-磷酸酶以提高大腸桿菌DH5α和FM5中的甘油生產(chǎn)由ATCC獲得釀酒酵母染色體Vλ克隆6592(GenBank，登記號(hào)U18813x11)。通過用于5’端摻入BamHⅠ-RBS-XbaⅠ位點(diǎn)和于3’端摻入SamⅠ位點(diǎn)的合成引物(SEQ ID NO16和SEQ ID NO17)，從靶DNAλ克隆進(jìn)行克隆，從而克隆甘油-3-磷酸磷酸酶(GPP2)基因。將所述產(chǎn)物在SrfⅠ位點(diǎn)亞克隆到pCR-Script(Stratagene，Madison，WI)中，以產(chǎn)生含有GPP2的質(zhì)粒pAH15。為了從pCR-Script SK+中的lac啟動(dòng)子表達(dá)，質(zhì)粒pAHl5含有無活性取向的GPP2基因。將得自pAH15、含有GPP2基因的BamHⅠ-SmaⅠ片段插入到pBlueScriptⅡ SK+中，以產(chǎn)生質(zhì)粒pAHl9。為了從所述lac啟動(dòng)子表達(dá)，pAHl9含有正確取向的GPP2基因。將得自pAH19、含有GPP2基因的XbaI-PstI片段插入到pPHOX2中，以產(chǎn)生質(zhì)粒pAH21。pAH21/DH5α是表達(dá)質(zhì)粒。用于在大腸桿菌中超量表達(dá)DAR1的質(zhì)粒采用合成引物(SEQ ID NO18和SEQ ID NO19)，通過由釀酒酵母基因組DNA PCR克隆而分離DAR1。成功的PCR克隆使NcoⅠ位點(diǎn)置于DAR1的5’端，其中在NcoⅠ中的ATG是DAR1起始密碼子蛋氨酸。在DAR1的3’端，在翻譯終止子之后導(dǎo)入BamHⅠ位點(diǎn)。用NcoⅠ+BamHⅠ消化所述PCR片段，并克隆到表達(dá)質(zhì)粒這pTrc99A(Pharmacia，Piscataway，NJ)中的相同位點(diǎn)，以產(chǎn)生pDAR1A。
            
為了在DAR1的5’端產(chǎn)生更好的核塘體結(jié)合位點(diǎn)，將通過退火合成引物(SEQ ID NO20和SEQ ID NO21)獲得的SpeⅠ-RBS-NcoⅠ接頭插入到pDAR1A的NcoⅠ位點(diǎn)，以產(chǎn)生pAH40。為了從pTrc99A(Pharmacia，Piscataway，NJ)的trc啟動(dòng)子表達(dá)，質(zhì)粒pAH40含有正確取向的新的RBS和DAR1基因。將得自pDAR1A的NcoⅠ-BamHⅠ片段和通過退火合成引物(SEQ ID NO22和SEQ ID NO23)獲得的第二組SpeⅠ-RBS-NcoⅠ接頭插入到pBC-SK+(Stratagene，Madison，WI)的SpeⅠ-BamHⅠ位點(diǎn)，以產(chǎn)生質(zhì)粒pAH42。質(zhì)粒pAH42含有氯霉素抗性基因。構(gòu)建用于DAR1和GPP2的表達(dá)盒采用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)方法，由上述各個(gè)DAR1和GPP2亞克隆裝配用于DAR1和GPP2的表達(dá)盒。將得自pAH19、含有核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS)和GPP2基因的BamHⅠ-PstⅠ片段插入到pAH40中，以產(chǎn)生pAH43。將得自pAH19、含有RBS和GPP2基因的BamHⅠ-PstⅠ片段插入至pAH42中，以產(chǎn)生pAH45。
            
對(duì)GPP2的5’端的核糖體結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行如下修飾。通過將合成引物GATCCAGGAAACAGA(SEQ ID NO24)和CTAGTCTGTTTCCTG(SEQ ID NO25)退火到得自pAH19、含GGP2基因的XbaⅠ-PstⅠ片段而獲得的BamHⅠ-RBS-SpeⅠ接頭插入到pAH40的BamHⅠ-PstⅠ位點(diǎn)，以產(chǎn)生pAH48。質(zhì)粒pAH48為了從pTrc99A(Pharmacia，Piscataway，NJ)的trc啟動(dòng)子表達(dá)而正確取向的含有DAR1基因、修飾的RBS、和GPP2基因。轉(zhuǎn)化大腸桿菌采用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)將本文所述的所有質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α或FM5中。通過其DNA RFLP圖型驗(yàn)證轉(zhuǎn)化體。
            
實(shí)施例1由用G3PDH基因轉(zhuǎn)化的大腸桿菌生產(chǎn)甘油培養(yǎng)基采用用pDAR1A轉(zhuǎn)化的大腸桿菌細(xì)胞，用合成培養(yǎng)基無氧或有氧生產(chǎn)甘油。該培養(yǎng)基每升含有6.0g Na2HPO4、3.0g KH2PO4、1.0gNH4Cl、0.5g NaCl、1mL 20％MgSO4·7H2O、8.0g葡萄糖、40mg水解酪蛋白氨基酸、0.5ml 1％鹽酸硫胺素、100mg氨芐青霉素。生長(zhǎng)條件帶有pDAR1A或pTrc99A載體的菌株AA200生長(zhǎng)于有氧條件下的50mL培養(yǎng)基中，于37℃在250mL培養(yǎng)瓶中以250rpm震蕩培養(yǎng)。在A600為0.2-0.3時(shí)，加入異丙基硫代-β-D-半乳糖苷使其終濃度為1mM，并繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)。對(duì)于無氧生長(zhǎng)，用誘導(dǎo)細(xì)胞樣品填裝帶蓋的Falcon#2054管，并于37℃旋轉(zhuǎn)輕輕混合48小時(shí)。通過HPLC分析培養(yǎng)物上清液確定甘油產(chǎn)量。菌株pDAR1A/AA200在無氧條件下培養(yǎng)48小時(shí)后產(chǎn)生甘油0.38g/L，在有氧條件下產(chǎn)生甘油0.48g/L。
            
實(shí)施例2由用G3P磷酸酶基因(GPP2)轉(zhuǎn)化的大腸桿菌生產(chǎn)甘油培養(yǎng)基在搖瓶中采用合成phoA培養(yǎng)基以證實(shí)在大腸桿菌中因GPP2表達(dá)使甘油增加。每升phoA培養(yǎng)基含有Amisoy 12g；硫酸銨0.62g；MOPS10.5g；檸檬酸鈉1.2g；NaOH(1M)10mL；1M MgSO412mL；100X微量元素12mL；50％葡萄糖，10mL；1％硫胺素，10mL；100mg/mL L-脯氨酸，10mL；2.5mM FeCl3，5mL；混合磷酸緩沖液，2mL(5mL 0.2MNaH2PO4+9mL 0.2M KH2PO4)，pH 7.0。對(duì)于每升pho培養(yǎng)基，上述100X微量元素含有ZnSO4·7H2O，0.58g；MnSO4·H2O，0.34g；CuSO4·5H2O，0．49g；CoCl2·6H2O，0．47g；H3BO3，0.12g；NaMoO4·2H2O，0.48g。搖瓶實(shí)驗(yàn)菌株pAH21/DH5α(含有GPP2基因)和pPHOX2/DH5α(對(duì)照)于37℃在250mL搖瓶中的45mL培養(yǎng)基(phoA培養(yǎng)基，50ug/mL羧芐青霉素和1ug/mL維生素B12)中生長(zhǎng)。所述培養(yǎng)物在有氧條件(250rpm震搖)下生長(zhǎng)24小時(shí)。通過HPLC分析培養(yǎng)物上清液確定甘油產(chǎn)量。24小時(shí)后pAH21/DH5α的甘油產(chǎn)量為0.2g/L。
            
實(shí)施例3采用含GPP2和DAR1的重組大腸桿菌由D-葡萄糖生產(chǎn)甘油于37℃在搖瓶培養(yǎng)物(錐形瓶，液體體積是總體積的1/5)中進(jìn)行有氧生長(zhǎng)，以證實(shí)含pAH43的大腸桿菌DH5α產(chǎn)生的甘油增加。
            
通過用抗生素選擇的過夜LB/1％葡萄糖培養(yǎng)物接種，在基本培養(yǎng)基/1％葡萄糖搖瓶中開始培養(yǎng)。基本培養(yǎng)基是過濾除菌的已知成分培養(yǎng)基，終pH為6.8(HCl)，每升含有12.6g(NH4)2SO4、13.7gK2HPO4、0.2g酵母提取物(Difco)、1g NaHCO3、5mg維生素B12、5mL改良Balch微量元素液(其組成可以發(fā)現(xiàn)于一般和分子細(xì)菌學(xué)方法(P.Gerhardt等編輯，第158頁，美國(guó)微生物協(xié)會(huì)，Washington，DC(1994))。搖瓶于37℃劇烈震搖過夜培養(yǎng)，之后取樣用于上清液的GC分析。24小時(shí)后pAH43/DH5α顯示的甘油產(chǎn)量為3.8g/L。
            
實(shí)施例4采用含GPP2和DAR1的重組大腸桿菌由D-葡萄糖生產(chǎn)甘油實(shí)施例4說明由含GPP2和DAR1的重組大腸桿菌DH5α/pAH48生產(chǎn)葡萄糖。
            
按上述一般方法中所述，構(gòu)建菌株DH5α/pAH48。預(yù)培養(yǎng)為了接種到發(fā)酵運(yùn)行(fermentation run)中，進(jìn)行DH5α/pAH48預(yù)培養(yǎng)。預(yù)培養(yǎng)的組分和方案列表如下。
            
預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基KH2PO430.0g/L檸檬酸  2.0g/LMgSO4·7H2O   2.0g/L98％H2SO42.0mL/L檸檬酸鐵銨  0.3g/LCaCl2·2H2O   0.2g/L酵母提取物  5.0g/L微量金屬5.0mL/L葡萄糖  10.0g/L羧芐青霉素  100.0mg/L將上述培養(yǎng)基組分一起混合，并用NH4OH將其pH調(diào)節(jié)到6.8。之后將培養(yǎng)基過濾除菌。
            
按照以下配方使用微量金屬檸檬酸一水合物 4.0g／LMgSO4·7H2O 3.0g／LMnSO4·H2O  0.5g／LNaCl  1.0g／LFeSO4·7H2O 0.1g／LCoCl2·6H2O 0.1g／LCaCl20.1g/LZnSO4·7H2O 0.1g/LCuSO4·5H2O 10mg/LAlK(SO4)2·12H2O   10mg/LH3BO310mg/LNa2MoO4·2H2O  10mg/LNiSO4·6H2O 10mg/LNa2SeO310mg/LNa2WO4·2H2O   10mg/L培養(yǎng)物開始自從50μl凍藏原液(15％甘油用作冷凍保護(hù)劑)接種到2L錐形瓶中的600mL培養(yǎng)基的種子培養(yǎng)物。培養(yǎng)物于30℃在250rpm的搖床中生長(zhǎng)大約12小時(shí)，然后用來接種發(fā)酵罐。發(fā)酵生長(zhǎng)容器15L攪拌釜發(fā)酵罐培養(yǎng)基KH2PO46.8g/L檸檬酸  2.0g/LMgSO4·7H2O  2.0g/L98％H2SO42.0mL/L檸檬酸鐵銨  0.3g/LCaCl2·2H2O  0.2g/L
            
Mazu DF204消泡劑1.0mL/L上述組分在發(fā)酵罐容器中一并滅菌。用NH4OH將其pH調(diào)升到6.7。酵母提取物(5g/L)和微量金屬液(5mL/L)由過濾除菌的原液無菌性加入。由60％進(jìn)料加入葡萄糖使其終濃度為10g/L。以100mg/L加入羧芐青霉素。接種后體積為6L。發(fā)酵的環(huán)境條件所述溫度控制在36℃，空氣流率控制在每分鐘6標(biāo)準(zhǔn)升。托持壓力控制在0.5巴。攪拌器設(shè)定為350rpm。氨水用來控制pH于6.7。控制葡萄糖進(jìn)料(60％葡萄糖一水合物)速率以保持過量葡萄糖。結(jié)果發(fā)酵運(yùn)行的結(jié)果見表1。
            
表1EFTOD550[葡萄糖][甘油]  進(jìn)料的總  產(chǎn)生的總(hr)(AU) (g/L)  (g/L)   葡萄糖(g) 甘油量(g)0   0.8   9.3 256   4.7   4.0   2.0   49 148   5.403.6   71 2510  6.7   0.0   4.7  116 3312  7.4   2.1   7.0  157 4914.2   10.4   0.3  10.0  230 7016.2   18.1   9.7  15.5  25910618.2   12.4  14.530520.2   11.8  17.4  17.7  35311922.2   11.0  12.638224.2   10.8   6.5  26.6  40417826.2   10.9   6.844228.2   10.4  10.3  31.5  46321630.2   10.2  13.1  30.4  49321332.2   10.1   8.1  28.2  51219634.2   10.2   3.5  33.4  53022336.2   10.1   5.854838.29.8   5.1  36.1  512233實(shí)施例5工程改造大腸桿菌FM5的甘油激酶突變體以由葡萄糖生產(chǎn)甘油構(gòu)建用于大腸桿菌FM5中的甘油激酶基因置換的整合質(zhì)粒用Puregene DNA分離試劑盒(Gentra Sytems，Minneapolis，MN)制備大腸桿菌FM5基因組DNA。采用引物SEQ ID NO26和SEQ INNO27，通過PCR(Mullis和Faloona，Meethods Enzymol.，155335-350，1987)從FM5基因組DNA擴(kuò)增含部分glpF和甘油激酶(glpK)基因的1.0kb DNA片段。采用引物SEQ ID NO28和SEQ IN NO29，通過PCR從FM5基因組DNA擴(kuò)增含部分glpK和glpX基因的1.1 kb DNA片段。將MunⅠ位點(diǎn)加入引物SEQ ID NO28中。引物SEQ ID NO28的5’端是引物SEQ ID NO27的反向互補(bǔ)物，以便能夠進(jìn)行隨后的重疊延伸PCR。采用重疊延伸技術(shù)的基因剪接(Horton等，BioTechniques，8528-535，1990)用來采用上述兩種PCR片段作模板和采用引物SEQ IDNO26和SEQ ID NO29，通過PCR產(chǎn)生2.1kb片段。該片段在1.5kbglpK基因的中心區(qū)缺失0.8kb?？偠灾撈卧贛unⅠ克隆位點(diǎn)(在部分glpK中)的兩側(cè)具有1.0 kb和1.1 kb側(cè)翼區(qū)，從而使得可以通過同源重組進(jìn)行染色體基因置換。
            
將上述2.1 kb PCR片段平端化(采用菜豆核酸酶)，并采用0平端PCR克隆試劑盒(Zero Blunt PCR Cloning Kit)(Invitrogen，San Diego，CA)克隆入pCR-Blunt載體，產(chǎn)生含有卡那霉素和Zeocin抗性基因的5.6kb質(zhì)粒pRN100。得自pLoxCatl(結(jié)果未公開)、含有氯霉素抗性基因、側(cè)翼為噬菌體P1 loxP位點(diǎn)(Snaith等，Gene，166173-174，1995)的1.2kbHincⅡ片段用來通過將其連接至MunⅠ消化的(并平端化)質(zhì)粒pRN100，從而間斷質(zhì)粒pRN100中的glpK片段，產(chǎn)生6.9kb質(zhì)粒pRN101-1。采用引物SEQ ID NO30和SEQ ID NO31通過PCR從載體pGP704(Miller和Mekalanos，J.Bacteriol.，1702575-2583，1988)擴(kuò)增含有R6K起點(diǎn)的376 bp片段，將其平端化并連接至得自pRN101-1的5.3kb Asp718-AatⅡ片段(它是平端的)，產(chǎn)生含有卡那霉素和氯霉素抗性基因的5.7kb質(zhì)粒pRN102-1。用R6K起點(diǎn)置換pRN101-1中的Co1E1起點(diǎn)區(qū)，產(chǎn)生也包括缺失大部分Zeocin抗性基因的pRN102-1。用于pRN102-1復(fù)制的宿主為含有R6K起點(diǎn)功能必需的pir基因的大腸桿菌SY327(Miller和Mekalanos，J.Bacteriol.，1702575-2583，1988)。
            
工程改造具有氯霉素抗性基因間斷的甘油激酶突變體RJF10m大腸桿菌FM5用非復(fù)制型整合質(zhì)粒pRN102-1電轉(zhuǎn)化，并進(jìn)一步在含有1mM甘油的M9基本培養(yǎng)基上篩選不利用甘油的氯霉素抗性(12.5μg/mL)和卡那霉素敏感性(30μg/mL)的轉(zhuǎn)化體。這種突變體RJF10m的EcoRⅠ消化物當(dāng)用完整的glpK基因通過Southern分析(Southern，J．Mol.Biol.，98503-517，1975)探測(cè)時(shí)，表明它是雙交換整合體(glpK基因置換體)，因?yàn)橛^察到由于在氯霉素抗性基因中存在另一EcoRⅠ位點(diǎn)而預(yù)期的7.9kb和2.0kb兩個(gè)帶。野生型對(duì)照產(chǎn)生預(yù)期的單個(gè)9.4 bk帶。13C NMR分析突變體RJF10m證實(shí)，它不能將13C標(biāo)記的甘油和ATP轉(zhuǎn)化為甘油-3-磷酸。采用引物組合SEQ ID NO32和SEQ IDNO33、SEQ ID NO34和SEQ ID NO35以及SEQ ID NO32和SEQ IDNO35，通過基因組PCR進(jìn)一步分析該glpK突變體，該突變體分別產(chǎn)生預(yù)期的2.3kb、2.4kb和4.0kb PCR片段。所述野生型對(duì)照用引物SEQID NO32和SEQ ID NO35產(chǎn)生預(yù)期的3.5 bk帶。glpK突變體RJF10m用質(zhì)粒pAH48電轉(zhuǎn)化，使得可以由葡萄糖產(chǎn)生甘油。glpK突變體大腸桿菌RJF10m已經(jīng)根據(jù)布達(dá)佩斯條約在1997年11月24日保藏于ATCC。工程改造除去氯霉素抗性基因間斷的甘油激酶突變體RJF10在YENB培養(yǎng)基(0.75％酵母提取物、0.8％營(yíng)養(yǎng)肉湯)于37℃過夜生長(zhǎng)后，大腸桿菌RJF10m的水懸浮物用質(zhì)粒pJW168(結(jié)果未公開)電轉(zhuǎn)化，所述質(zhì)粒含有IPTG誘導(dǎo)型lacUV5啟動(dòng)子控制下的噬菌體P1 Cre重組酶基因、溫度敏感型pSC101復(fù)制子和氨芐青霉素抗性基因。在轉(zhuǎn)化體于30℃在SOC培養(yǎng)基上長(zhǎng)出生長(zhǎng)暈(outgrowth)時(shí)，于30℃(pWJ168復(fù)制許可溫度)在補(bǔ)充羧芐青霉素(50μg/mL)和IPTG(1mM)的LB瓊脂培養(yǎng)基上選擇轉(zhuǎn)化體。于30℃在補(bǔ)充羧芐青霉素和IPTG的新鮮LB瓊脂培養(yǎng)基上進(jìn)行合并菌落的連續(xù)兩次過夜轉(zhuǎn)移，以便使得可以通過在Cre重組酶介導(dǎo)的loxP位點(diǎn)上的重組，切除染色體氯霉素抗性基因(Hoess和Abremski，J.Mol.Biol.，181351-362，1985)。所產(chǎn)生的菌落平板影印接種到補(bǔ)充羧芐青霉素和IPTG的LB瓊脂培養(yǎng)基和補(bǔ)充氯霉素(12.5μg/mL)的LB瓊脂上，以鑒定表示標(biāo)記基因去除的羧芐青霉素抗性和氯霉素敏感性的菌落。用一個(gè)這樣菌落的30℃過夜培養(yǎng)物接種10mL LB培養(yǎng)基。在于30℃生長(zhǎng)到OD(600nm)為0.6時(shí)，將該培養(yǎng)物于37℃培養(yǎng)過夜。將數(shù)個(gè)稀釋物平板接種到預(yù)溫?zé)岬腖B瓊脂培養(yǎng)基上，該平板于42℃(pWJ168復(fù)制的非許可溫度)培養(yǎng)過夜。將所產(chǎn)生的菌落平板影印接種到補(bǔ)充羧芐青霉素(75μg/mL)的LB瓊脂培養(yǎng)基和LB瓊脂培養(yǎng)基上，以鑒定表示質(zhì)粒pWJ168缺失的羧芐青霉素敏感性菌落。采用引物SEQ ID NO32和SEQ ID NO35通過基因組PCR進(jìn)一步分析一種這樣的glpK突變體RJP10，產(chǎn)生證實(shí)標(biāo)記基因切除的預(yù)期的3.0kb條帶。突變體RJF10在含1mM甘油的M9基本培養(yǎng)基上不生長(zhǎng)證實(shí)它不利用甘油。用質(zhì)粒pAH48電轉(zhuǎn)化glpK突變體RJF10，以使得可以由葡萄糖產(chǎn)生甘油。
            
實(shí)施例6構(gòu)建gldA基因失效的大腸桿菌菌株采用分別摻入到末端Sph1和Xba1位點(diǎn)的引物SEQ ID NO36和SEQ ID NO37通過PCR(K.B.Mullis和F.A．Faloona(1987)Meth.Enzymol.155335-350)從大腸桿菌分離gldA基因，并在pUC18中的Sph1和Xba1位點(diǎn)之間克隆(T.Maniatis 1982 Molecular Cloning.ALaboratory Manual.Cold Spring Harbor，Cold Spring Harbor，NY)產(chǎn)生pKP8。在gldA基因中的唯一的Sal1和Nco1位點(diǎn)切割pKP8，其末端用Klenow使其平端化并重新連接，使得在gldA的中間產(chǎn)生109 bp的缺失并重新產(chǎn)生唯一的Sal1位點(diǎn)，從而產(chǎn)生pKP9。含有賦予卡那霉素抗性的基因(kan)并包括翻譯起始密碼子上游的約400 bp DNA和翻譯終止密碼子下游的約100 bp DNA的1.4kb DNA片段，用摻入末端Sal1位點(diǎn)的引物SEQ ID NO38和SEQ ID NO39通過PCR從pET-28a(+)(Novagen，Madison，Wis)分離，并亞克隆入pKP9的獨(dú)特的Sal1位點(diǎn)產(chǎn)生pKP13。開始于gldA翻譯起始密碼子下游204 bp并終止于gldA翻譯終止密碼子上游178 bp并含有kan插入的2.1kbDNA片段，采用分別摻入末端Sph1和Xba1位點(diǎn)的引物SEQ ID NO40和SEQ ID NO41通過PCR從pKP13分離，并亞克隆入在pMAK705(Genencor International，Palo Alto，Calif.)中的Sph1和Xba1位點(diǎn)之間產(chǎn)生pMP33。用pMP33轉(zhuǎn)化大腸桿菌FM5，并在20μg/mL kan上于30℃(pMAK705復(fù)制的允許溫度)進(jìn)行選擇。將一個(gè)茵落在補(bǔ)充20μg/mL kan的液體培養(yǎng)基中于30℃擴(kuò)增過夜。約32，00O細(xì)胞平板接種于20μg/mL kan上，并于44℃(pMAK705復(fù)制的限制性溫度)培養(yǎng)16小時(shí)。生長(zhǎng)于44℃的轉(zhuǎn)化體具有整合入染色體的質(zhì)粒，其發(fā)生頻率約O.0001。PCR和DNA印跡(E.M.Southern 1975 J.Mol.Biol.98503-517)分析用來檢測(cè)在所述轉(zhuǎn)化體中染色體整合事件的性質(zhì)。蛋白質(zhì)印跡分析(H.Towbin等，(1979)Proc.Natl.Acad．Sci.764350)用來檢測(cè)gldA的產(chǎn)物甘油脫氫酶蛋白是否在轉(zhuǎn)化體中產(chǎn)生。活性分析用來確定在所述轉(zhuǎn)化體中是否保留甘油脫氫酶活性。用吩嗪硫酸二甲酯作中間體，將甘油+NAD(+)→二羥丙酮+NADH的轉(zhuǎn)化與四唑鎓染料MTT[溴化3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑鎓]至深色的甲_的轉(zhuǎn)化偶聯(lián)起來，從而檢測(cè)在天然凝膠上的甘油脫氫酶帶的活性。甘油脫氫酶活性也需要存在30mM硫酸銨和100mM Tris，pH 9(C.-T.Tang等，(1997)J.Bacteriol.140182)。在所分析的8種轉(zhuǎn)化體中，其中6種確定是gldA失效的。大腸桿菌MSP33.6已經(jīng)于1997年11月24日根據(jù)布達(dá)佩斯條約保藏于ATCC。
            
實(shí)施例7構(gòu)建glpK和gldA基因失效的大腸桿菌茵株采用分別摻入末端Sph1和Xba1位點(diǎn)的引物SEQ ID NO42和SEQID NO43，通過PCR從大腸桿菌分離包含gldA基因并包括翻譯起始密碼子上游的約228 bp DNA和翻譯終止密碼子下游的220 bp DNA的1.6kb DNA片段，并在pUCl8中的Sph1和Xba1位點(diǎn)之間克隆產(chǎn)生pQN2。在gldA基因中的唯一的Sal1和Nco1位點(diǎn)切割pQN2，其末端用Klenow使其平端化并重新連接，使得在gldA的中間產(chǎn)生109bp的缺失并重新產(chǎn)生唯一的Sal1位點(diǎn)，從而產(chǎn)生pQN4。從作為Stu1/Xho1片段的pLoxKan2(Genencor International，Palo Alto，Calif.)分離含有賦予卡那霉素抗性的基因(kna)、側(cè)翼為loxP位點(diǎn)的1.2kb DNA片段，用Klenow平端化并在用Klenow平端化末端后在Sal1位點(diǎn)亞克隆入pQN4產(chǎn)生pQN8。采用分別摻入末端Sph1和Xba1位點(diǎn)的引物SEQ ID NO44和SEQ ID NO45，通過PCR從pGP704(Miller和Mekalanos，JBacteriol.，1702575-2583，1988)分離含有R6K復(fù)制起點(diǎn)的0.4kb DNA片段，并連接至得自pQN8含有g(shù)ldAkan盒的2.8kb Sph1/Xba1 DNA片段產(chǎn)生pKP22。含有賦予氯霉素抗性的基因(cam)、側(cè)翼為loxP位點(diǎn)的1.0kbDNA片段，從作為Xba1片段的pLoxCat2(Genencor International，PaloAlto，Calif.)分離，并在Xba1位點(diǎn)亞克隆入pKP22產(chǎn)生pKP23。)))用pKP23轉(zhuǎn)化為glpK-的大腸桿菌菌株RJF10(參見實(shí)施例5)，并分離具有表型kanRcamS的轉(zhuǎn)化體，通過DNA印跡分析證實(shí)表明它是雙交換整合的轉(zhuǎn)化體。甘油脫氫酶凝膠活性分析(如實(shí)施例6中所述)表明活性甘油脫氫酶不存在于這些轉(zhuǎn)化體中。如實(shí)施例5所述，采用產(chǎn)生Cre的質(zhì)粒pJW168從染色體去除kan標(biāo)記以產(chǎn)生菌株KLP23。數(shù)個(gè)具有表型kanS的分離物表明無甘油脫氫酶活性，而且DNA印跡分析證實(shí)缺乏kan標(biāo)記。SEQ ID NO44CACGCATGCAGTTCAACCTGTTGATAGTACSEQ OD NO45GCGTCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATG實(shí)施例8含有GPP2和DAR1、具有和不具有甘油激酶(GLPK)活性的重組體大腸桿菌由D-葡萄糖產(chǎn)生的甘油的消耗實(shí)施例8闡明重組體大腸桿菌FM5/pAH48和RJF10/pAH48的甘油消耗。菌株FM5/pAH48和RJF10/pAH48按上述通用方法中所述構(gòu)建。
            
預(yù)培養(yǎng)將FM5/AH48和RJF10/pAH48預(yù)培養(yǎng)以接種發(fā)酵罐的用于發(fā)酵的相同培養(yǎng)基或補(bǔ)充1％葡萄糖的LB。使用羧芐青霉素或氨芐青霉素(100mg/L)以用于質(zhì)粒維持。發(fā)酵培養(yǎng)基如實(shí)施例4所述。
            
培養(yǎng)物開始于2L錐形瓶中的600mL培養(yǎng)基中的凍藏原液(15％甘油用作冷凍保護(hù)劑)，于30℃在250rpm的搖床中生長(zhǎng)大約12小時(shí)，然后用來接種發(fā)酵罐。發(fā)酵生長(zhǎng)按實(shí)施例4中所述制備裝有5-7L初始體積物的15L攪拌釜發(fā)酵罐。使用羧芐青霉素或氨芐青霉素(100mg/L)以用于質(zhì)粒維持。評(píng)價(jià)甘油激酶(GlpK)活性的環(huán)境條件溫度控制于36℃，空氣流率控制在每分鐘6標(biāo)準(zhǔn)升。托持壓力控制在0.5巴。溶解氧張力通過攪拌控制于10％。氨水用來控制pH于6.7。控制葡萄糖進(jìn)料(60％葡萄糖)速率以保持過量葡萄糖直到甘油累積至至少25g/L為止。然后耗竭葡萄糖使得產(chǎn)生甘油凈代謝。表2顯示甘油的轉(zhuǎn)化結(jié)果。
            
表2FM5/pAH48(wt)和RJF10/pAH48(glpK)的甘油轉(zhuǎn)化甘油消耗率菌株 實(shí)例數(shù)  g/OD/hrFM5/pAH48  2 0.095±0.015RJF10/pAH483 0.021±0.011根據(jù)表2數(shù)據(jù)可看出，在內(nèi)源性甘油激酶活性消除后甘油消耗率下降約4-5倍。評(píng)價(jià)甘油脫氫酶(GldA)活性的環(huán)境條件溫度控制于30℃而空氣流率控制在每分鐘6標(biāo)準(zhǔn)升。托持壓力控制在0.5巴。溶解氧張力通過攪拌控制于10％。氨水用來控制pH于6.7。在第一次發(fā)酵中，發(fā)酵期間保持葡萄糖過量。操作第二次發(fā)酵使其在初始24小時(shí)后無葡萄糖殘留。在兩次發(fā)酵期間隨時(shí)間采集樣品用于評(píng)價(jià)GlpK和GldA活性分析。表3概述了RJF10/pAH48發(fā)酵，表明GldA對(duì)甘油選擇性的影響。
            
表3兩次RJF10/pAH48發(fā)酵的GldA和GlpK活性時(shí)間  總體選擇性發(fā)酵(hrs)  GldA GlpK(g/g)1   25 --   42％46 --   49％61 +-   54％2   25 +-   41％46++-   14％61++-   12％根據(jù)表3數(shù)據(jù)可看見，甘油脫氫酶(GldA)活性的存在與甘油在限制葡萄糖的條件下的轉(zhuǎn)化有關(guān)；因此，推測(cè)消除甘油脫氫酶活性將減少甘油轉(zhuǎn)化。
            
實(shí)施例9采用含有GPP2和DAR1的重組蟑螂埃希氏菌由D-葡萄糖生產(chǎn)甘油實(shí)施例9闡述由含有GPP2和DAR1基因的重組蟑螂埃希氏菌從D-葡萄糖生產(chǎn)甘油。
            
得自ATCC而ATCC保藏號(hào)為33429的蟑螂埃希氏菌(E.blattae)于30℃生長(zhǎng)直至培養(yǎng)物在600nm的OD約0.6 AU為止。然后采用電穿孔技術(shù)，用含有GPP2和DAR1基因(描述于WO 98/21341)的質(zhì)粒pAH48轉(zhuǎn)化所述培養(yǎng)物。用DNA RFLP分布型和抗生素抗性(200μg/mL羧芐青霉素)證實(shí)轉(zhuǎn)化體。
            
轉(zhuǎn)化的蟑螂埃希氏菌于35℃在搖瓶培養(yǎng)物中有氧生長(zhǎng)。該培養(yǎng)物在加2％葡萄糖的已知成分培養(yǎng)基中在抗生素選擇下生長(zhǎng)，通過由在加1％葡萄糖的LB上生長(zhǎng)過夜的培養(yǎng)物接種開始，同時(shí)進(jìn)行抗生素選擇。每升所述已知成分培養(yǎng)基含有27.2g KH2PO4、2g檸檬酸、2gMgSO4·7H2O、1.2ml 98％H2SO4、0.3g檸檬酸鐵銨、0.2gCaCl2·2H2O、10g酵母提取物(Difco)、5mL改良的Balch微量元素溶液(其組分可見于一般以及分子細(xì)菌學(xué)方法(P.Gerhardt等編輯，第158頁，美國(guó)微生物學(xué)協(xié)會(huì)，華盛頓，(1994))。該已知成分培養(yǎng)基過濾除菌并用NH4OH調(diào)節(jié)至終pH6.8。所述搖瓶在充分振搖下于35℃培養(yǎng)過夜，然后將上清液經(jīng)HPLC分析甘油的存在。過夜培養(yǎng)后，含有pAH48的蟑螂埃希氏菌產(chǎn)生甘油7.63g/L。生長(zhǎng)于相同條件下的野生型蟑螂埃希氏菌(ATCC 33429)對(duì)照產(chǎn)生甘油=0.2g/L。
            
實(shí)施例10用gldA和glpK缺陷而含有整合入染色體的GPP2和DAR1的重組大腸桿菌由D-葡萄糖產(chǎn)生甘油該實(shí)施例說明gldA和glpK基因失效且含有整合入宿主細(xì)胞染色體的GPP2和DAR1編碼基因的重組大腸桿菌由D葡萄糖生產(chǎn)甘油。
            
按實(shí)施例7制備的大腸桿菌菌株KLP23缺乏甘油激酶(glpK產(chǎn)物)和甘油脫氫酶(gldA產(chǎn)物)活性。制備含有側(cè)翼為在ampC位點(diǎn)整合入染色體的氯霉素抗性基因的DAR1、GPP2和loxP的KLP23并稱為AH76RIcm。
            
在cre-lox整合系統(tǒng)(Hoess，同上)的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)和構(gòu)建整合質(zhì)粒。為了產(chǎn)生所述整合質(zhì)粒，將pLoxCatl的Hind Ⅲ-SmaⅠ片段插入HindⅢ和SmaⅠ線性化的pAH48產(chǎn)生，pAH48cm2。pAH48質(zhì)粒含有在trc啟動(dòng)子控制下表達(dá)的DAR1和GPP2基因。pAH48cm2的3.5kb ApaLⅠ片段用T4 DNA聚合酶(Boehringer Mannheim Biochemical)和dNTP平端化，并采用大腸桿菌SY327(Miller等，J.Bacteriol.1702575-2583，1998)作為宿主，將其插入NruⅠ線性化的pInt-ampC(GenencorInternational，CA)產(chǎn)生pAH76和pAH76R?！癛”是指反向的整合盒。質(zhì)粒pAH76和pAH76R均含有R6K復(fù)制起點(diǎn)且不能在KLP24中復(fù)制。質(zhì)粒pAH76和pAH76R用來轉(zhuǎn)化KLP23，以在大腸桿菌染色體的ampC部位整合。所述轉(zhuǎn)化體在10μg/ml氯霉素上進(jìn)行選擇并是卡那霉素敏感性的，因此產(chǎn)生雙交換的整合。這些大腸桿菌轉(zhuǎn)化體命名為AH76cm和AH76IRIcm。
            
AH76RIcm培養(yǎng)物始自由具有1％葡萄糖和抗生素選擇的過夜LB培養(yǎng)物接種，生長(zhǎng)于已知成分培養(yǎng)基(描述于實(shí)施例9)加2.5％葡萄糖的搖瓶中。所述搖瓶(錐形瓶，液體體積為搖瓶體積的1/5)充分振搖下于37℃培養(yǎng)過夜，之后取樣上清液樣品用于在Monarch 2000儀器(Instrumentation Laboratory Co.，Lexington，MA)上采用比色酶分析法(Sigma，第337號(hào)方法)分析甘油。25小時(shí)后，AH77RIcm顯示甘油產(chǎn)量為6.7g/L。
            
大腸桿菌pAH76RI具有AH76RIcm缺失的氯霉素基因。按實(shí)施例5所述，采用產(chǎn)Cre的質(zhì)粒pJW168使氯霉素基因從染色體缺失。于30℃在1mM IPTG誘導(dǎo)下選擇羧芐青霉素抗性而氯霉素敏感型的轉(zhuǎn)化體。在去除所述氯霉素基因后，AH76RI生長(zhǎng)于不含任何抗生素的LB培養(yǎng)基上以消除PJW168。最后形式的AH76RI不能于氯霉素或羧芐青霉素選擇下生長(zhǎng)。
            
AH76RI培養(yǎng)物始自由LB/1％葡萄糖過夜培養(yǎng)物接種，生長(zhǎng)于已知成分培養(yǎng)基加2％葡萄糖的搖瓶中。所述搖瓶充分振搖下于35℃培養(yǎng)過夜，之后取上清液樣品用于在Monarch 2000儀器(InstrumentationLaboratory Co.，Lexington，MA)上采用比色酶分析法(Sigma，第337號(hào)方法)分析甘油。24小時(shí)后，AH77RI顯示甘油產(chǎn)量為4.6g/L。
            
該實(shí)施例中描述的所有質(zhì)粒均用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)轉(zhuǎn)化入大腸桿菌KLP23。所述轉(zhuǎn)化體通過DNA RFLP型、抗生素抗性、PCR擴(kuò)增或G3P磷酸酶分析證實(shí)。
            
序列表(1)一般資料(ⅰ)申請(qǐng)人(A)姓名E.I.DU PONT DE NEMOURS AND COMPANY(B)街道1007 MARKET STREET(C)城市WILMINGTON(D)州DELAWARE(E)國(guó)家美國(guó)(F)郵政編碼19898(G)電話302-892-8112(H)傳真302-773-0164(I)用戶電報(bào)6717325(ⅱ)發(fā)明名稱用重組生物體生產(chǎn)甘油的方法(ⅲ)序列數(shù)43(ⅳ)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)媒體類型軟盤，3.5英寸(B)計(jì)算機(jī)IBM PC兼容機(jī)(C)操作系統(tǒng)MICROSOFT WINDOWS 95(D)軟件MICROSOFT WORD VERSION 7.0A(ⅴ)當(dāng)前申請(qǐng)數(shù)據(jù)(A)申請(qǐng)?zhí)?B)申請(qǐng)日(C)分類(ⅵ)在先申請(qǐng)數(shù)據(jù)(A)申請(qǐng)?zhí)?8/982，783(B)申請(qǐng)日1997年12月2日(C)分類(ⅶ)代理律師/代理人資料(A)姓名FLORD，LINDA AXAMETHY(B)注冊(cè)號(hào)33，692(C)參考/檔案號(hào)CR-9981-C(2)SEQ ID NO1的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度1380個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO1CTTTAATTTT CTTTTATCTT ACTCTCCTAC ATAAGACATC AAGAAACAAT TGTATATTGT60ACACCCCCCC CCTCCACAAA CACAAATATT GATAATATAA AGATGTCTGC TGCTGCTGAT   120AGATTAAACT TAACTTCCGG CCACTTGAAT GCTGGTAGAA AGAGAAGTTC CTCTTCTGTT   180TCTTTGAAGG CTGCCGAAAA GCCTTTCAAG GTTACTGTGA TTGGATCTGG TAACTGGGGT   240ACTACTATTG CCAAGGTGGT TGCCGAAAAT TGTAAGGGAT ACCCAGAAGT TTTCGCTCCA   300ATAGTACAAA TGTGGGTGTT CGAAGAAGAG ATCAATGGTG AAAAATTGAC TGAAATCATA   360AATACTAGAC ATCAAAACGT GAAATACTTG CCTGGCATCA CTCTACCCGA CAATTTGGTT   420GCTAATCCAG ACTTGATTGA TTCAGTCAAG GATGTCGACA TCATCGTTTT CAACATTCCA   480CATCAATTTT TGCCCCGTAT CTGTAGCCAA TTGAAAGGTC ATGTTGATTC ACACGTCAGA   540GCTATCTCCT GTCTAAAGGG TTTTGAAGTT GGTGCTAAAG GTGTCCAATT GCTATCCTCT   600TACATCACTG AGGAACTAGG TATTCAATGT GGTGCTCTAT CTGGTGCTAA CATTGCCACC   660GAAGTCGCTC AAGAACACTG GTCTGAAACA ACAGTTGCTT ACCACATTCC AAAGGATTTC   720AGAGGCGAGG GCAAGGACGT CGACCATAAG GTTCTAAAGG CCTTGTTCCA CAGACCTTAC   780TTCCACGTTA GTGTCATCGA AGATGTTGCT GGTATCTCCA TCTGTGGTGC TTTGAAGAAC   840GTTGTTGCCT TAGGTTGTGG TTTCGTCGAA GGTCTAGGCT GGGGTAACAA CGCTTCTGCT   900GCCATCCAAA GAGTCGGTTT GGGTGAGATC ATCAGATTCG GTCAAATGTT TTTCCCAGAA   960TCTAGAGAAG AAACATACTA CCAAGAGTCT GCTGGTGTTG CTGATTTGAT CACCACCTGC  1020GCTGGTGGTA GAAACGTCAA GGTTGCTAGG CTAATGGCTA CTTCTGGTAA GGACGCCTGG  1080GAATGTGAAA 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(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度391個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型未知(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)未知(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO7Met Ser Ala Ala Ala Asp Arg Leu Asn Leu Thr Ser Gly His Leu Asn1   5   10  15Ala Gly Arg Lys Arg Ser Ser Ser Ser Val Ser Leu Lys Ala Ala Glu20  25  30Lys Pro Phe Lys Val Thr Val Ile Gly Ser Gly Asn Trp Gly Thr Thr35  40  45Ile Ala Lys Val Val Ala Glu Asn Cys Lys Gly Tyr Pro Glu Val Phe50  55  60Ala Pro Ile Val Gln Met Trp Val Phe Glu Glu Glu Ile Asn Gly Glu65  70  75  80Lys Leu Thr Glu Ile Ile Asn Thr Arg His Gln Asn Val Lys Tyr Leu85  90  95Pro Gly Ile Thr Leu Pro Asp Asn Leu Val Ala Asn Pro Asp Leu Ile100 105 110Asp Ser Val Lys Asp Val Asp Ile Ile Val Phe Asn Ile Pro His Gln115 l20 125Phe Leu Pro Arg Ile Cys Ser Gln Leu Lys Gly His Val Asp Ser His130 135 140Val Arg Ala Ile Ser Cys Leu Lys Gly Phe Glu Val Gly Ala Lys Gly145 150 155 160Val Gln Leu Leu Ser Ser Tyr Ile Thr Glu Glu Leu Gly Ile Gln Cys165 170 175Gly Ala Leu Ser Gly Ala Asn Ile Ala Thr Glu Val Ala Gln Glu His180 185 190Trp 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NO8的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度384個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型未知(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)未知(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO8Met Thr Ala His Thr Asn Ile Lys Gln His Lys His Cys His Glu Asp1   5   10  15His Pro Ile Arg Arg Ser Asp Ser Ala Val Ser Ile Val His Leu Lys20  25  30Arg Ala Pro Phe Lys Val Thr Val Ile Gly Ser Gly Asn Trp Gly Thr35  40  45Thr Ile Ala Lys Val Ile Ala Glu Asn Thr Glu Leu His Ser His Ile50  55  60Phe Glu Pro Glu Val Arg Met Trp Val Phe Asp Glu Lys Ile Gly Asp65  70  75  80Glu Asn Leu Thr Asp Ile Ile Asn Thr Arg His Gln Asn Val Lys Tyr85  90  95Leu Pro Asn Ile Asp Leu Pro His Asn Leu Val Ala Asp Pro Asp Leu100 105 110Leu His Ser Ile Lys Gly Ala Asp Ile Leu Val Phe Asn Ile Pro His115 120 125Gln Phe Leu Pro Asn Ile Val Lys Gln Leu Gln Gly His Val Ala Pro130 135 140His Val Arg Ala Ile Ser Cys Leu Lys Gly Phe Glu Leu Gly Ser Lys145 150 155 160Gly Val Gln Leu Leu Ser Ser Tyr Val Thr Asp Glu Leu Gly Ile Gln165 170 175Cys Gly Ala Leu Ser Gly Ala Asn Leu Ala Pro Glu Val Ala Lys Glu180 185 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NO10的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度339個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型未知(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)未知(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO10Met Asn Gln Arg Asn Ala Ser Met Thr Val Ile Gly Ala Gly Ser Tyr1   5   10  15Gly Thr Ala Leu Ala Ile Thr Leu Ala Arg Asn Gly His Glu Val Val20  25  30Leu Trp Gly His Asp Pro Glu His Ile Ala Thr Leu Glu Arg Asp Arg35  40  45Cys Asn Ala Ala Phe Leu Pro Asp Val Pro Phe Pro Asp Thr Leu His50  55  60Leu Glu Ser Asp Leu Ala Thr Ala Leu Ala Ala Ser Arg Asn Ile Leu65  70  75  80Val Val Val Pro Ser His Val Phe Gly Glu Val Leu Arg Gln Ile Lys85  90  95Pro Leu Met Arg Pro Asp Ala Arg Leu Val Trp Ala Thr Lys Gly Leu100 105 110Glu Ala Glu Thr Gly Arg Leu Leu Gln Asp Val Ala Arg Glu Ala Leu115 120 125Gly Asp Gln Ile Pro Leu Ala Val Ile Ser Gly Pro Thr Phe Ala Lys130 135 140Glu Leu Ala Ala Gly Leu Pro Thr Ala Ile Ser Leu Ala Ser Thr Asp145 150 155 160Gln Thr Phe Ala Asp Asp Leu Gln Gln Leu Leu His Cys Gly Lys Ser165 170 175Phe Arg Val Tyr Ser Asn Pro Asp Phe Ile Gly Val Gln Leu Gly Gly180 185 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300Asp Val Thr Asn Ala Ser Arg Thr Gly Phe Met Asn Leu Ser Thr Leu305 310 315 320Lys Tyr Asp Asn Glu Leu Leu Glu Phe Trp Gly Ile Asp Lys Asn Leu325 330 335Ile His Met Pro Glu Ile Val Ser Ser Ser Gln Tyr Tyr Gly Asp Phe340 345 350Gly Ile Pro Asp Trp Ile Met Glu Lys Leu His Asp Ser Pro Lys Thr355 360 365Val Leu Arg Asp Leu Val Lys Arg Asn Leu Pro Ile Gln Gly Cys Leu370 375 380Gly Asp Gin Ser Ala Ser Met Val Gly Gln Leu Ala Tyr Lys Pro Gly385 390 395 400Ala Ala Lys Cys Thr Tyr Gly Thr Gly Cys Phe Leu Leu Tyr Asn Thr405 410 415Gly Thr Lys Lys Leu Ile Ser Gln His Gly Ala Leu Thr Thr Leu Ala420 425 430Phe Trp Phe Pro His Leu Gln Glu Tyr Gly Gly Gln Lys Pro Glu Leu435 440 445Ser Lys Pro His Phe Ala Leu Glu Gly Ser Val Ala Val Ala Gly Ala450 455 460Val Val Gln Trp Leu Arg Asp Asn Leu Arg Leu Ile Asp Lys Ser Glu465 470 475 480Asp Val Gly Pro Ile Ala Ser Thr Val Pro Asp Ser Gly Gly Val Val485 490 495Phe Val Pro Ala Phe Ser Gly Leu Phe Ala Pro Tyr Trp Asp Pro Asp500 505 510Ala Arg Ala Thr Ile Met Gly Met Ser Gln Phe Thr Thr Ala Ser His515 520 525Ile Ala Arg Ala Ala Val Glu Gly Val Cys Phe Gln Ala Arg Ala Ile530 535 540Leu Lys Ala Met Ser Ser Asp Ala Phe Gly Glu Gly Ser Lys Asp Arg545 550 555 560Asp Phe Leu Glu Glu Ile Ser Asp Val Thr Tyr Glu Lys Ser Pro Leu565 570 575Ser Val Leu Ala Val Asp Gly Gly Met Ser Arg Ser Asn Glu Val Met580 585 590Gln Ile Gln Ala Asp Ile Leu Gly Pro Cys Val Lys Val Arg Arg Ser595 600 605Pro Thr Ala Glu Cys Thr Ala Leu Gly Ala Ala Ile Ala Ala Asn Met610 615 620Ala Phe Lys Asp Val Asn Glu Arg Pro Leu Trp Lys Asp Leu His Asp625 630 635 640Val Lys Lys Trp Val Phe Tyr Asn Gly Met Glu Lys Asn Glu Gln Ile645 650 655Ser Pro Glu Ala His Pro Asn Leu Lys Ile Phe Arg Ser Glu Ser Asp660 665 670Asp Ala Glu Arg Arg Lys His Trp Lys Tyr Trp Glu Val Ala Val Glu675 680 685Arg Ser Lys Gly Trp Leu Lys Asp Ile Glu Gly Glu His Glu Gln Val690 695 700Leu Glu Asn Phe Gln705(2)SEQ ID NO16的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度51個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO16GCGCGGATCC AGGAGTCTAG AATTATGGGA TTGACTACTA AACCTCTATC T51(2)SEQ ID NO17的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度36個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO17GATACGCCCG GGTTACCATT TCAACAGATC GTCCTT 36(2)SEQ ID NO18的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度34個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO18TTGATAATAT AACCATGGCT GCTGCTGCTG ATAG34(2)SEQ ID NO19的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度39個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO19GTATGATATG TTATCTTGGA TCCAATAAAT CTAATCTTC   39(2)SEQ ID NO20的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度24個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID N020CATGACTAGT AAGGAGGACA ATTC   24(2)SEQ ID NO21的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度24個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO21CATGGAATTG TCCTCCTTAC  TAGT  24(2)SEQ ID NO22的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度19個(gè)堿基時(shí)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO22CTAGTAAGGA GGACAATTC19(2)SEQ ID NO23的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度19個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO23CATGGAATTG TCCTCCTTA19(2)SEQ ID NO24的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度15個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型其它核酸(A)描述/desc=“引物”(ⅲ)假說否(ⅳ)反義否(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO24GATCCAGGAA ACAGA   15(2)SEQ ID NO25的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度15個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型其它核酸(A)描述/desc=“引物”(ⅲ)假說否(ⅳ)反義否(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO25CTAGTCTGTT TCCTG  15(2)SEQ ID NO26的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性
            
(ⅱ)分子類型其它核酸(A)描述/dese=“引物”(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO26GCTTTCTGTG  CTGCGGCTTT  AG 22(2)SEQ ID NO27的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度23個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型其它核酸(A)描述/dese=“引物”(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO27TGGTCGAGGA TCCACTTCAC TTT  23(2)SEQ ID NO28的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度51個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型其它核酸(A)描述/dese=“引物”(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO28AAAGTGAAGT GGATCCTCGA CCAATTGGAT GGTGGCGCAG TAGCAAACAA T   51(2)SEQ ID NO29的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度23個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型其它核酸(A)描述/desc=“引物”(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO29GGATCACCGC CGCAGAAACT ACG  23(2)SEQ ID NO30的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度25個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型其它核酸(A)描述/desc=“引物”
            
(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO30CTGTCAGCCG TTAAGTGTTC CTGTG25(2)SEQ ID NO3l的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度23個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型其它核酸(A)描述/desc=“引物”(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO3lCAGTTCAACC TGTTGATAGT ACG  23(2)SEQ ID NO32的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度20個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型其它核酸(A)描述/desc=“引物”(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO32ATGAGTCAAA CATCAACCTT  20(2)SEQ ID NO33的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度20個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型其它核酸(A)描述/desc=“引物”(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO33ATGGAGAAAA AAATCACTGG  20(2)SEQ ID NO34的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度20個(gè)堿基時(shí)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型其它核酸(A)描述/desc=“引物”(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO34TTACGCCCCG CCCTGCCACT  20(2)SEQ ID NO35的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度20個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型其它核酸(A)描述/dese=“引物”(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO35TCAGAGGATG TGCACCTGCA  20(2)SEQ ID NO36的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度26個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型其它核酸(A)描述/desc=“引物”(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO36CGAGCATGCC GCATTTGGCA CTACTC   26(2)SEQ ID NO37的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度29個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型其它核酸(A)描述/dese=“引物”(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO37GCGTCTAGAG TAGGTTATTC CCACTCTTG29(2)SEQ ID NO38的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度26個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型其它核酸(A)描述/desc=“引物”(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO38GAAGTCGACC GCTGCGCCTT ATCCGG   26(2)SEQ ID NO39的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度28個(gè)堿基時(shí)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型其它核酸(A)描述/desc=“引物”(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO39CGCGTCGACG TTTACAATTT CAGGTGGC28(2)SEQ ID NO40的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度23個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型其它核酸(A)描述/dese=“引物”(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO40GCAGCATGCT GGACTGGTAG TAG23(2)SEQ ID NO41的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度27個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型其它核酸(A)描述/desc=“引物”(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO41CAGTCTAGAG TTATTGGCAA ACCTACC27(2)SEQ ID NO42的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度25個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型其它核酸(A)描述/desc=“引物”(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO42GATGCATGCC CAGGGCGGAG ACGGC  25(2)SEQ ID NO43的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度29個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型其它核酸(A)描述/desc=“引物”(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO43CTAACGATTG TTCTCTAGAG AAAATGTCC  29(2)SEQ ID NO44的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度30個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型其它核酸(A)描述/dese=“引物”(ⅲ)假說否(ⅳ)反義否(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO44CACGCATGCA GTTCAACCTG TTGATAGTAC30(2)SEQ ID NO45的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度28個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型其它核酸(A)描述/desc=“引物”(ⅲ)假說否(ⅳ)反義否(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO45GCGTCTAGAT CCTTTTAAAT TAAAAATG 28
            
權(quán)利要求
            
1．一種由重組生物體生產(chǎn)甘油的方法，它包括(ⅰ)用含有以下一個(gè)或兩個(gè)基因的表達(dá)盒轉(zhuǎn)化合適的宿主細(xì)胞(a)編碼具有甘油-3-磷酸脫氫酶活性的蛋白的基因，和(b)編碼具有甘油-3-磷酸酶活性的蛋白的基因，所述合適的宿主細(xì)胞在以下一個(gè)或兩個(gè)基因中具有破壞(a)編碼具有甘油激酶活性的多肽的內(nèi)源性基因，和(b)編具有甘油脫氫酶活性的多肽的內(nèi)源性基因，其中所述破壞阻止活性基因產(chǎn)物的表達(dá)；(ⅱ)在存在至少一種選自單糖、寡糖、多糖和一碳底物的碳源的情況下培養(yǎng)(ⅰ)的轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，由此生產(chǎn)甘油；和(ⅲ)任選地回收在(ⅱ)中生產(chǎn)的甘油。
            
2．權(quán)利要求1的方法，其中所述表達(dá)盒包括甘油-3-磷酸脫氫酶的編碼基因。
            
3．權(quán)利要求1的方法，其中所述表達(dá)盒包括甘油-3-磷酸磷酸酶的編碼基因。
            
4．權(quán)利要求1的方法，其中所述表達(dá)盒包括編碼甘油-3-磷酸磷酸酶和甘油-3-磷酸脫氫酶的基因。
            
5．權(quán)利要求1的方法，其中所述宿主細(xì)胞在內(nèi)源性甘油激酶的編碼基因中含有一個(gè)破壞，其中所述破壞阻止活性基因產(chǎn)物表達(dá)。
            
6．權(quán)利要求1的方法，其中所述宿主細(xì)胞在內(nèi)源性甘油脫氫酶的編碼基因中含有一個(gè)破壞，其中所述破壞阻止活性基因產(chǎn)物表達(dá)。
            
7．權(quán)利要求1的方法，其中所述宿主細(xì)胞含有a)在編碼內(nèi)源性甘油激酶的基因中的一個(gè)破壞和b)在編碼內(nèi)源性甘油脫氫酶的基因中的一個(gè)破壞，其中相應(yīng)的基因中的破壞阻止由任何一個(gè)基因表達(dá)活性基因產(chǎn)物。
            
8．權(quán)利要求1的方法，其中所述合適的宿主細(xì)胞選自細(xì)菌、酵母和絲狀真菌。
            
9．權(quán)利要求8的方法，其中所述合適的宿主細(xì)胞選自檸檬酸桿菌屬、腸桿菌屬、梭菌屬、克雷伯氏菌屬、氣桿菌屬、乳桿菌屬、曲霉屬、酵母屬、裂殖酵母屬、接合酵母屬、畢赤酵母屬、克魯維酵母屬、念珠菌屬、漢遜酵母屬、德巴利酵母屬、毛霉屬、球擬酵母屬、甲基細(xì)菌屬、埃希氏菌屬、沙門氏菌屬、芽孢桿菌屬、鏈霉菌屬和假單胞菌屬。
            
10．權(quán)利要求9的方法，其中所述合的適宿主細(xì)胞是大腸桿菌或酵母屬菌種。
            
11．權(quán)利要求1的方法，其中所述碳源是葡萄糖。
            
12．權(quán)利要求1的方法，其中所述具有甘油-3-磷酸脫氫酶活性的蛋白對(duì)應(yīng)于選自SEQ ID NO7、SEQ ID NO8、SEQ ID NO9、SEQ IDNO10、SEQ ID NO11和SEQ ID NO12的氨基酸序列，而其中所述氨基酸序列包括不改變所述酶功能特性的氨基酸取代、缺失或插入。
            
13．權(quán)利要求1的方法，其中所述具有甘油-3-磷酸酶活性的蛋白對(duì)應(yīng)于選自SEQ ID NO13和SEQ ID NO14的氨基酸序列，而其中所述氨基酸序列包括不改變所述酶功能的氨基酸取代、缺失或插入。
            
14．一種轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，它包含(a)一個(gè)編碼具有甘油-3-磷酸脫氫酶活性的蛋白的基因；(b)一個(gè)編碼具有甘油-3-磷酸磷酸酶活性的蛋白的基因；(c)一個(gè)破壞的內(nèi)源性甘油激酶的編碼基因和；(d)一個(gè)破壞的內(nèi)源性甘油脫氫酶的編碼基因；其中在基因(c)和(d)中的破壞阻止表達(dá)活性基因產(chǎn)物，并且其中所述宿主細(xì)胞將至少一種選自單糖、寡糖、多糖和一碳底物的碳源轉(zhuǎn)化為甘油。
            
15．一種轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，它包含(a)一個(gè)編碼具有甘油-3-磷酸脫氫酶活性的蛋白的基因；(b)一個(gè)編碼具有甘油-3-磷酸磷酸酶活性的蛋白的基因；和(c)一個(gè)破壞的內(nèi)源性甘油脫氫酶的編碼基因；其中在基因(c)中的破壞阻止表達(dá)活性基因產(chǎn)物，并且其中所述宿主細(xì)胞將至少一種選自單糖、寡糖、多糖和一碳底物的碳源轉(zhuǎn)化為甘油。
            
16．一種轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，它包含(a)一個(gè)編碼具有甘油-3-磷酸脫氫酶活性的蛋白的基因；(b)一個(gè)編碼具有甘油-3-磷酸磷酸酶活性的蛋白的基因；和(c)一個(gè)破壞的內(nèi)源性甘油激酶的編碼基因；其中在基因(c)中的破壞阻止表達(dá)活性基因產(chǎn)物，并且其中所述宿主細(xì)胞將至少一種選自單糖、寡糖、多糖和一碳底物的碳源轉(zhuǎn)化為甘油。
            
17．一種由重組生物體生產(chǎn)1，3-丙二醇的方法，它包括(ⅰ)用含有以下一個(gè)或兩個(gè)基因的表達(dá)盒轉(zhuǎn)化合適的宿主細(xì)胞(a)編碼具有甘油-3-磷酸脫氫酶活性的蛋白的基因，和(b)編碼具有甘油-3-磷酸磷酸酶活性的蛋白的基因，所述合適的宿主細(xì)胞具有至少一個(gè)編碼具有脫水酶活性蛋白的基因且在以下一個(gè)或兩個(gè)基因中具有破壞(a)編碼具有甘油激酶活性的多肽的內(nèi)源性基因，和(b)編具有甘油脫氫酶活性的多肽的內(nèi)源性基因，其中所述在基因(a)或(b)中的破壞阻止活性基因產(chǎn)物的表達(dá)，(ⅱ)在存在至少一種選自單糖、寡糖、多糖和一碳底物的碳源的情況下培養(yǎng)(ⅰ)的轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，由此生產(chǎn)甘油；和(ⅲ)回收在(ⅱ)中生產(chǎn)的1，3-丙二醇。
            
18．權(quán)利要求17的方法，其中所述具有脫水酶活性的蛋白選自甘油脫水酶和二醇脫水酶。
            
19．權(quán)利要求18的方法，其中所述甘油脫水酶由分離自微生物的一個(gè)基因編碼，所述微生物選自克雷伯氏菌屬、乳桿菌屬、腸桿菌屬、檸檬酸桿菌屬、暗桿菌屬、泥桿菌屬和梭菌屬。
            
20．權(quán)利要求18的方法，其中所述二醇脫水酶由分離自微生物的一個(gè)基因編碼，所述微生物選自克雷伯氏菌屬和沙門氏菌屬。
            
全文摘要
            
提供含有編碼用于由各種碳底物生產(chǎn)甘油的甘油－3－磷酸脫氫酶和/或甘油－3－磷酸酶活性的基因的重組生物體。所述重組體在編碼具有甘油激酶和甘油脫氫酶活性蛋白的內(nèi)源性基因中還含有破壞。
            
文檔編號(hào)C12N9/04GK1284132SQ98813415 
            
公開日2001年2月14日 申請(qǐng)日期1998年12月2日 優(yōu)先權(quán)日1997年12月2日
            
發(fā)明者R·V·奈爾, M·S·佩恩, D·E·特里布爾, F·瓦爾 申請(qǐng)人:納幕爾杜邦公司, 曾尼科國(guó)際公司
            


                        
            
                        
            
                        
            
                            
                        
            

                        
                            
                    
            
                    
                    


                     
                        
                        
                    

                
            

                
                
            
                    
            
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