信號序列捕獲方法

專利名稱：信號序列捕獲方法
技術領域：
本發明屬于基因工程領域，涉及一種檢測和分離編碼具有分泌能力的肽的DNA的方法。
背景技術：
至今，已將編碼激素或生長因子的基因分離并用于生產許多商業上作為藥的重組蛋白。它們中大多數為分泌蛋白。因此，在開發新藥中分離編碼新型分泌蛋白的基因是一極其重要的步驟。因此，已開發出分離編碼分泌蛋白的基因的方法。例如，Honjo等人開發了一種方法(未經實質審查公開的日本專利申請JP-平6-315380)，該方法利用分泌蛋白具有允許胞內表達蛋白轉位到細胞表面的信號序列的特征。在該方法中，人體IL-2受體，一種分泌蛋白的α鏈的信號序列用相應于來自靶細胞或組織的mRNA的5′-末端序列的短cDNA片段替換以構建文庫，然后將它導入細胞中。在克隆中，IL-2受體在帶有信號序列的克隆的細胞表面上表達，但是不含信號序列的那些克隆卻不能。因此，該信號序列的存在可以通過抗-IL-2受體抗體檢測。
Genetics Institute，Inc.，(Cambridge，MA)開發了一種利用酵母代謝酶的更復雜的系統(US5536637)。轉化酶，一種酵母代謝酶，是一種在培養基中將蔗糖裂解成葡萄糖和果糖以傳遞能量的分泌酶。不分泌該酶的突變型菌株在沒有葡萄糖但含蔗糖作為唯一碳源的培養基中不能生長。在利用該現象的方法中，將轉化酶基因與cDNA連接以構建文庫，然后將其導入缺乏轉化酶基因的突變型酵母菌株中。將含該信號肽的克隆通過選擇能在僅含蔗糖作為碳源的培養基中生長的克隆進行分離。
然而，Honjo等人的方法的缺陷在于，由于使用抗體，因此在選擇陽性克隆中需要繁復的步驟。而且，檢測靈敏度非常低。Genetics Institute，Inc.的方法的問題還在于，不能將酵母中分泌效率差的克隆分離出來。此外，由于當報道基因與大的蛋白融合時抗原性或酶活性可能喪失，因此這些方法僅能檢測短DNA。而且，這些方法不能檢測N-末端在細胞內而C-末端在細胞外的Ⅱ型膜蛋白。
本發明的公開內容本發明提供了一種檢查所試驗的cDNA是否編碼具有分泌能力的肽的方法。本發明還提供了一種分離編碼具有分泌活性的肽的cDNA的方法，它能夠使用編碼長肽編碼區的cDNA。
如細胞因子受體的蛋白質轉位到細胞表面，在結合其配體時，其二聚化并誘導細胞增殖。已知蛋白質轉位到細胞表面的能力(分泌能力)依賴于信號序列的存在。本發明人認為，通過從蛋白質中去掉信號序列(或具有附加的胞外區)并用含所需肽的融合蛋白替換它，在細胞中表達融合蛋白，并檢測細胞的增殖能力，可以檢測所需肽是否具有分泌活性。如果肽具有分泌能力，融合蛋白則轉位到細胞表面、二聚化、并誘導細胞增殖。與此相反，如果肽不含分泌活性，融合蛋白則不能轉位到細胞表面和誘導細胞增殖。因此，可以通過僅檢測細胞增殖作為指標來檢測所融合的肽的分泌能力。而且，本發明人認為，可以通過選擇增殖的細胞對具有分泌能力的肽進行陽性篩選。因此，本發明人使用mpl(血小板生成素受體)作為通過轉位到細胞表面并二聚化以觸發細胞增殖的蛋白質，并開發出一種檢測和分離具有分泌能力的肽的方法。
特別地，我們通過從mpl的組成活性形式去掉分泌信號和大部分胞外域制備了編碼人體mpl但沒有分泌能力的DNA，這是本發明人發現的(在沒有配體的情況下通過轉導信號來改變mpl以給IL-3依賴型細胞系提供自主增殖能力；Blood 881399-1406(1996))。然后將該DNA與待檢測的cDNA、編碼已知分泌蛋白的DNA、或編碼分泌信號區被除去的分泌肽的DNA連接。所得嵌合基因在細胞中被表達，并檢測細胞的增殖能力。結果顯示，編碼用作測試cDNA的已知分泌蛋白的DNA誘導細胞增殖，然而對編碼分泌信號區被移去的分泌蛋白的DNA來說沒有檢測到細胞增殖。以這種方式，本發明人發現可以使用如此開發的系統使用細胞增殖作為指標容易地檢測并分離編碼具有分泌活性并含長肽編碼區的肽的DNA。事實上，他們進行了篩選并成功地檢測和分離了編碼包括Ⅰ型膜蛋白和Ⅱ型膜蛋白的分泌蛋白的DNA。
因此，本發明涉及(1)一種肽，其能夠在細胞表面通過二聚化誘導細胞增殖并且缺乏分泌能力；(2)(1)中所述的肽，其中該肽得自細胞因子受體；
(3)(1)中所述的肽，其中該肽得自mpl；(4)(2)或(3)中所述的肽，其中該肽為配體非依賴型；(5)(1)中所述的肽，其中該肽包括SEQ ID NO4的氨基酸序列；(6)編碼(1)-(5)中任意一項所述肽的DNA；(7)含(6)中所述DNA和cDNA在該DNA的5′-上游區的克隆位點的載體；(8)(7)中所述的載體，其中該載體得自逆轉錄病毒；(9)(7)或(8)中所述的載體，其中將cDNA插入(6)的DNA的5′-上游；(10)攜帶(9)中所述載體的細胞；(11)(10)中所述的細胞，其中細胞為哺乳動物的細胞；(12)一種檢測被待測試的cDNA編碼的肽是否含有分泌能力的方法，該方法包括(a)將測試cDNA與(7)的載體連接，(b)將(a)中制得的載體導入細胞中，和(c)培養(b)中制得的轉化體，并檢測細胞增殖能力；(13)一種分離編碼具有分泌能力的肽的cDNA的方法，該方法包括(a)將cDNA文庫與(7)的載體連接，(b)將(a)中制得的載體導入細胞中，(c)培養(b)中制得的轉化體，并檢測細胞增殖能力，和(d)選擇(c)中經鑒定具有細胞增殖能力的陽性細胞，并從所述細胞中分離該cDNA；(14)一種(12)或(13)中所述的方法，其中所述載體來自逆轉錄病毒，并且待導入載體的細胞是哺乳動物的細胞；(15)用(13)的方法分離編碼具有分泌能力的肽的cDNA；和(16)由(15)中所述的cDNA編碼的肽。
本發明涉及一種檢測編碼具有分泌能力的肽的DNA的方法。該檢測方法的特征是使用一種編碼能夠在細胞表面通過二聚化誘導細胞增殖并缺乏分泌能力的肽的DNA，來檢測具有分泌能力的肽。這里，“能夠在細胞表面通過二聚化誘導細胞增殖的肽”包括mpl(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，895640-5644(1992))，GM-CSF的α鏈或β鏈(Blood 832802(1994))，紅細胞生成素受體(Nature 348647(1990))，c-kit受體(Blood 85790(1995))和neu(Nature 339230(1989))，但不限于此。在本發明的方法中，構建一cDNA以編碼上面去除了分泌能力的肽。通常通過刪除含信號序列的區域除去分泌能力。例如，人體mpl的信號序列是相應于蛋白質氨基酸序列中1-25位置的區域(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，895640-5644(1992))，人體GM-CSF的β鏈的信號序列是相應于1-48位置的區域(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，879655-9659(1990))。優選地，也將胞外域從肽中刪除。
經構建的cDNA編碼的肽優選為配體非依賴型(如果肽為配體依賴型，它可能喪失配體結合能力并在創建融合蛋白之后失活)。例如，創建配體非依賴型肽的方法應在肽中引入突變。在mpl的情況下，將Ser 498取代為Asn可以去除對配體和血小板生成素的依賴性(Blood 881399-1406(1996))。本發明方法中所用的mpl優選包括SEQ ID NO4中所述的氨基酸序列。
將如上所述制備的DNA插入適宜的表達載體中。對該表達載體沒有限制，優選是逆轉錄病毒載體，能通過病毒感染高效地將其引入各種細胞中，并在細胞中穩定地表達插入載體中的DNA。逆轉錄病毒載體的例子包括加工為用于cDNA文庫構建體的載體，如pBabeX(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，929146-9150(1995))或pMX(Exp.Hematol.24324-329(1996))。同樣，可以使用例如腺病毒、EB病毒和乳頭瘤病毒的病毒載體，或例如pEF-BOS(Nucleic Acid Res.18(17))和pcD SRα296(Mol.Cell.Biol.Jan.466-472(1988))的質粒載體。該表達載體應在上面DNA插入體的5′-上游具有待測試其分泌能力的cDNA的克隆位點以表達融合蛋白。創建cDNA克隆位點的方法是本領域技術人員已知的。
接下來，將所制備的載體與待測試的cDNA連接。將該測試的cDNA連接到“編碼能夠在細胞表面通過二聚化誘導細胞增殖的肽的DNA”的5′-上游中，將其插入載體中。該測試cDNA可以是任意編碼具有待試驗分泌能力的肽的cDNA。該測試cDNA可以按照標準方法與載體連接。例如，使用T4 DNA連接酶經過銜接子或連接子的連接方法(Maniatis T.，MolecularCloning)。
然后將所制備的載體引入細胞中。對引入載體中的細胞沒有限制，包括細胞因子依賴型增殖細胞如Ba/F3、OTT-1、FDCP-1和TF-1細胞。使用標準方法可以將載體引入細胞中，這些標準方法包括脂質體轉染法、磷酸鈣法、DEAE-葡聚糖法和電穿孔法。在逆轉錄病毒感染-介導的引入法中，將載體引入包裝細胞并整合成病毒顆粒。可以使用例如磷酸鈣法和脂質體轉染法的標準方法引入載體。例如，可以使用如BOSC23、Bing(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 908392-8396(1993))、NX-E和NX-A細胞(Nolan G.P.Immunity 8461-471(1998))作為包裝細胞。
接下來，將這樣制得的轉化體培養并檢查其增殖能力。當由插入載體中的cDNA所編碼的蛋白質被表達成具有配體非依賴型活性細胞因子受體的融合蛋白時，在缺乏細胞所依賴的細胞因子(配體)的培養基中培養該轉化體。如果檢測到顯著細胞增殖，那么判斷該測試cDNA為編碼含有分泌能力的肽的“陽性克隆”。或者，如果沒有檢測到顯著細胞增殖，判斷該cDNA為編碼缺乏分泌能力的肽的“陰性克隆”。當由插入的cDNA所編碼的蛋白質被表達為具有配體依賴型細胞因子受體的融合蛋白時，在存在配體的情況下培養該轉化體。如果必要的話，在與沒有配體情況下的陰性對照比較之后，如果檢測到顯著的細胞增殖，則判斷該測試cDNA為“陽性克隆”。本領域技術人員可以根據載體所插入的細胞類型以及待表達的融合蛋白的性質適當選擇培養轉化體的其它條件。
本發明還涉及一種分離編碼含有分泌能力的肽的cDNA的方法。在該方法中，將cDNA文庫連接到載體中，而不是上面用于檢測編碼含分泌能力的肽的cDNA的測試cDNA。在本發明的一個具體實施方案中，將使用隨機引物制備的cDNA與BstXI銜接子連接并插在兩個BstXI位點之間；一個是載體的，另一個插在活性mpl的胞外切割位點中。cDNA文庫的來源不被限制在任意具體的一個上，但可以是能從其中分離出含分泌能力的所需肽的細胞或組織。可以使用許多標準方法來構建cDNA文庫。在本方法中，判斷能夠增殖的細胞選自引入cDNA文庫的細胞。在所選細胞中含有的cDNA被假定為編碼具有分泌能力的肽。例如，通過提取基因組DNA或RNA、通過PCR使用被設計成包含克隆位點的引物將感興趣的cDNA擴增(在為RNA的情況下，使用逆轉錄酶將其轉變成DNA之后進行)、以及回收該產物可以從其增殖已被檢測的細胞中分離出cDNA。
所回收的cDNA是否為全長還是片段，或者它是否為編碼新型分泌肽的cDNA，可以將該cDNA序列與數據庫中已知的那些蛋白質進行比較來進行分析。如果該cDNA不是全長，常常篩選二級cDNA文庫以分離全長cDNA。可以通過本領域技術人員已知的方法構建該二級cDNA文庫，例如文獻(Molecular Cloning，A Laboratory Manual，2nd edition.Sambrook J.等人，(1989)Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York)中所述的那些。
可以利用通過本發明的方法分離的編碼具有分泌能力的肽的cDNA生產用于醫藥或相關疾病的基因治療中的重組蛋白。可以通過本領域已知的方法生產來自該分離cDNA的重組蛋白。例如，將該cDNA插入到適宜載體中，這些載體例如有pED(Kaufman等人，Nucleic Acids Res.194484-4490(1991))、pEF-BOS(Mizushima等人，Nucleic Acids Res.185322(1990))、pXM、pJ13和pJL4(Gough等人，EMBO J.4645-653(1985))，將該載體引入宿主細胞，培養所得轉化體以使其表達重組蛋白，并純化該重組蛋白。
附圖簡述

圖1圖示了用于檢測分泌能力的肽和通過表達該肽檢測BAF/03細胞的細胞因子非依賴型增殖能力的結果。
下面參照實施例詳細描述本發明，但并不應解釋為將本發明限制其中。
實施例1.載體構建在小鼠骨髓增殖白血病病毒中，將env連接到包括由從跨膜結構域到N-末端的56個氨基酸組成的胞外域、跨膜結構域和胞內域的小鼠mpl上。進行PCR以獲得編碼人體mpl的相應區域的cDNA，該區域從Leu(449)到終止密碼子(636)，緊靠在該Leu(499)前面是NotI位點(單個核苷酸插入)以及緊靠在終止密碼子之后是SalI位點，以便為如下所示的GM-CSF cDNA框架中。將該″pBabeX MPLM″(Blood 881399-1406.(1996))，活性人體mplcDNA在其中克隆，用作模板。所用引物列于表1中。
表1Not v-mpl (SEQ ID NO1)(TGCGGCCGCCCTGGAGCTGCGCCCGCGATCCTGCTACCGTTTA)NotI mpl序列MPL Sal(SEQ ID NO2)(GTATGTCGACTCAAGGCTGCTGCCAATAG)SalI使用GeneAmpPCR系統(Perkin Elmer)在含10μg/ml模板DNA、1μM各種引物、50U/ml KOD DNA聚合酶(TOYOBO)、1mM MgCl2、0.2mMdNTPs、120mM Tris-HCl(pH8)、10mM KCl、6mM(NH4)2SO4、0.1％Triton X-100和10μg/ml BSA的反應混合物中在以下條件下進行PCR在98℃下變性60秒，接著在98℃下15秒、60℃下10秒和74℃下30秒循環25次。在瓊脂糖膠上電泳分析該PCR產物，切除含0.6kb感興趣的片段凝膠片提取DNA。然后在該DNA的5′-末端用T4多核苷酸激酶(TOYOBO)使其磷酸化，并使用T4 DNA連接酶(TOYOBO)將其與用SmaI(TaKaRaShuzo)和細菌堿性磷酸酶(BAP；TaKaRa Shuzo)預處理過的pBluescript SK(-)載體(Stratagene)連接。用ABI PRISM 310遺傳分析儀(Perkin Elmer)證實插在所得質粒中的活性mpl cDNA的核苷酸序列。該質粒用NotI(TaKaRa Shuzo)和SalI(TaKaRa Shuzo)消化并在瓊脂糖凝膠上電泳分離，分離出一條0.6kb片段。使用T4 DNA連接酶將該片段與pMX(Proc.Natl.Acad.Sci.USA929146-9150.(1995))連接以獲得pMX v-mplM，其中pMX也用NotI和SalI消化，用BAP處理，并通過瓊脂糖凝膠電泳純化過。該質粒pMX v-mplM含編碼缺乏分泌能力的活性mpl的cDNA。該cDNA插入體的核苷酸序列和由該cDNA編碼的肽的氨基酸序列分別顯示在SEQ ID NO3和NO4中。
接下來，為了獲得其中終止密碼子用NotI位點替換的人體GM-CSFcDNA，使用含人體GM-CSF cDNA的pcDSRα298 hGM-CSF(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 824360-4394(1985))作為模板進行PCR。所用引物示于表2中。
表2EcoGMss(SEQ ID NO5)(CGAATTCAAAGTTCTCTGGAGGATG)EcoRIEcoGM(SEQ ID NO6)(CGAATTCGCCGCCACCATGGCACCCGCCCGCTCGCCC)EcoRIGM Not(SEQ ID NO7)(AGCGGCCGCCTCCTGGACTGGCTCCCA)NotI將EcoGM設計成具有翻譯起始密碼子ATG代替Ser(17)，而且與在EcoGMss和EcoGM中一樣，EcoRI位點和Kozak共有序列(J.Cell Biol.10829.(1989))緊靠在ATG密碼子前面。將EcoGMss和GM Not的引物對用于PCR以擴增含信號序列的GM-CSF，將EcoGM和GM Not用于擴增缺乏信號序列的GM-CSF。除了使用55℃作為退火溫度外，如上所述進行PCR，將該產物克隆成pBluescript SK(-)。使用ABI PRISM 310遺傳分析儀(Perkin Elmer)證實DNA插入體的核苷酸序列。然后用EcoRI(TaKaRa)和NotI消化該質粒并將其插入如上所述的pMX v-mplM的EcoRI-NotI位點，獲得″pMX GM(+)v-mplM″和″pMX GM(-)v-mplM″。該″pMX GM(+)v-mplM″和″pMX GM(-)v-mplM″分別在從Leu(449)開始的活性mpl的C-末端部分和有信號序列或沒有信號序列的整個GM-CSF之間編碼融合蛋白。其cDNA插入體的核苷酸序列示作SEQ ID NO8和NO10，由該cDNAs編碼的蛋白質的氨基酸序列示作SEQ ID NO9和NO11。
實施例2.病毒感染使用LipofectAMINE(Life Technologies)將上面各種質粒引入包裝細胞系BOSC23(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 908392-8396.(1993))。將BOSC23細胞涂布在含10％胎牛血清(FCS；JRH Biosciences)的Dulbecco′s改良的Eagle培養基(DMEM；Nissui Pharmaceutical)的6-cm培養皿(CORNING)中。培養6小時之后，用減少了血清的OPTI-MEM I培養基(Life Technologies)洗滌細胞。分別地，將稀釋在200μl OPTI-MEM I中的LipofectAMINE(18μl)與3μg稀釋在200μl OPTI-MEM I中的每種質粒樣品混合。使所得混合物在室溫下靜置15分鐘，與1.6ml OPTI-MEM I混合，然后添加到細胞中。5小時之后，將含20％FCS的2ml DMEM添加到細胞中，將細胞再培養19小時。然后用含10％FCS的3ml DMEM替換培養基，24小時后回收培養基上清液。將小鼠白細胞介素-3(IL-3)和10μg/ml polybrene(1，5-二甲基-1，5二氮十一亞甲基聚甲溴化物，Sigma)加入含重組病毒的培養基上清液中，并且Ba/F3細胞也懸浮在其中以感染。感染24小時之后，在含10％FCS但沒有小鼠IL-3的RPMI1640(Nissui Pharmaceutical)中將該細胞洗滌兩次，在相同培養基中繼續培養。
在含信號序列的整個GM-CSF和活性mpl(得自pMX GM(+)v-mplM)之間含有融合蛋白的細胞以及那些含具有分泌能力的活性mpl的細胞在沒有IL-3的情況下生長。相反地，在沒有信號序列的GM-CSF和活性mpl(pMXGM(-)v-mplM)之間含有融合蛋白的細胞以及其中沒有引入融合蛋白表達載體的對照Ba/F3細胞沒有生長(圖1)。
實施例3.篩選合成以下的寡核苷酸(表3)，使用T4多核苷酸激酶使其5′-末端磷酸化。混合該寡核苷酸并在95℃下變性，然后通過漸漸將其冷卻到40℃退火以制備DNA序列盒。
表35′-GGCCCCAGCACAGTGGC-3′(SEQ ID NO12)5′-GGTCGTGTCACCGCCGG-3′(SEQ ID NO13)
用NotI(TaKaRa)消化并用BAP處理的pMX GM(-)v-mplM與該序列盒混合并使用T4 DNA連接酶連接。通過DNA測序證實所得質粒中該序列盒的方向為按BstXI和NotI(pMX GM(-)v-mplM2)的次序。使用TRIZOL試劑(GIBCO BRL)由大鼠成神經細胞系MNS70制備總RNA并通過寡脫氧胸苷酸柱(Pharmacia)以制備polyA(+)RNA。用SuperScript選擇系統(GIBCO BRL)中所含的隨機六聚體合成雙鏈cDNA。該cDNA為平端，與BstXI銜接子(Invitrogen)相連，使用SizeSep 400旋轉柱(Pharmacia)分級分離。然后混合該cDNA并使用T4 DNA連接酶將其與用BstXI(TaKaRa)消化并用BAP處理過的pMX GM(-)v-mplM2連接。使用基因脈沖發生器(BioRad)通過電穿孔將DNA引入DH10B大腸桿菌(GIBCO BRL)中以構建cDNA文庫。
從含cDNA文庫的重組大腸桿菌中提取質粒并使用JETstar柱(GENOMED)純化。使用如上所述的LipofectAMINE將文庫質粒引入BOSC23包裝細胞中。將小鼠IL-3(10 ng / ml)和10μg/ml polybrene(1，5-二甲基-1，5二氮十一亞甲基聚甲溴化物，Sigma)加入含重組病毒的培養物上清液中，并且將Ba/F3細胞懸浮在其中以進行感染。感染24小時之后，用磷酸鹽緩沖液將該細胞洗滌兩次，再在含10％FCS的RPMI1640中培養。由在沒有IL-3情況下生長的克隆制備基因組DNA，使用設計為包含cDNA插入位點的引物進行PCR以回收該cDNA片段。
表45′-GGGGGTGGACCATCCTCTA-3′(SEQ ID NO14)5′-CGCGCAGCTGTAAACGGTAG-3′(SEQ ID NO15)使用GeneAmpPCR系統2400在50μl含500ng基因組DNA、500pM各種引物、2.5U TaKaRa LA Taq(TaKaRa)、2.5mM MgCl2、0.3mM dNTPs和所附緩沖液的反應混合物中在以下條件下進行PCR在98℃下變性60秒，接著在98℃下20秒和68℃下120秒循環30次。在瓊脂糖凝膠上電泳分離該PCR產物，切下含擴增片段的凝膠片，并純化DNA。確定從所得190個克隆中純化的DNA片段的核苷酸序列，發現150個克隆是編碼已知分泌蛋白或膜蛋白的cDNA，或其部分。發現其它40個克隆編碼未知分泌蛋白。將如此獲得的已知分泌蛋白的一部分示于表5中，其中“長度”是指以氨基酸殘基數計所得cDNA片段ORF的長度。編碼已知分泌蛋白的克隆的平均長度為273個氨基酸殘基。“登錄號”是指在GenBank蛋白質數據庫中的登錄號。應注明的是，本方法的背景值，如檢測編碼除分泌蛋白外的蛋白質的cDNA或以反方向插入的cDNA為1％或更少。長度登錄號名稱221 1805299 淀粉樣前體288 416630淀粉樣蛋白1350 468563淀粉樣前體樣蛋白2561 112929淀粉樣A4蛋白同源物前體161 2494287 O-乙酰GD3神經節苷脂合酶176 2507439 多配體蛋白聚糖3(硫酸乙酰肝素蛋白聚糖核心蛋白)218 118115Cyr61蛋白(生長因子結合蛋白)382 3219172 膠原蛋白α1(Ⅴ)286 461671Ⅰ型膠原蛋白α1159 1082724 前列環素刺激因子259 1777354 SHPS-1.BIT254 205167120kDa唾液酸糖蛋白(肝溶酶體膜蛋白)482 1708023 K-磷脂酰肌醇蛋白聚糖224 1139548 與抽搐有關的基因產物6Ⅱ型前體105 135818G-蛋白偶合凝血酶受體482 129731蛋白質二硫鍵異構酶322 1172451 基底膜蛋白聚糖(基底膜硫酸乙酰肝素蛋白聚糖)165 1709256 神經蛋白聚糖(蛋白聚糖核心蛋白前體)264 2367641 神經纖維網-2(semaphorin Ⅲ受體)211 126638賴氨酰氧化酶308 2627143 神經鈣粘著蛋白459 3123675 Notch140 1718156 血管內皮細胞生長因子534 627989內皮縮血管肽轉化酶89 114393輸送鈉/鉀的腺苷三磷酸酶β-1鏈工業實用性本發明提供了一種檢測和分離編碼分泌肽的cDNA的方法，該方法使用了一種能夠在細胞表面通過其二聚化引發細胞增殖但缺乏分泌能力的肽。由于該方法利用細胞增殖作為檢測指標，因此它特別容易且靈敏。而且，與能夠檢測短DNA片段的傳統方法相比，該方法能夠檢測和分離含較長肽編碼區的cDNA，因此它從一級分離克隆中提供了更多的信息。此外，該方法能夠檢測和分離包括Ⅰ型和Ⅱ型膜蛋白的分泌蛋白。
序列表&#60110&#62中外制藥株式會社北村俊雄&#60120&#62信號序列捕獲方法&#60130&#62C1-902PCT&#60150&#62JP 1997-324912&#60151&#621997-11-26&#60160&#6215&#60210&#621&#60211&#6243&#60212&#62DNA&#60213&#62人工序列&#60220&#62&#60223&#62人工序列的描述人工合成的引物序列&#60400&#621tgcggccgcc ctggagctgc gcccgcgatc ctgctaccgt tta 43&#60210&#622&#60211&#6229&#60212&#62DNA&#60213&#62人工序列&#60220&#62&#60223&#62人工序列的描述人工合成的引物序列&#60400&#622gtatgtcgac tcaaggctgc tgccaatag 29&#60210&#623&#60211&#62579&#60212&#62DNA&#60213&#62人工序列&#60220&#62&#60223&#62人工序列的描述人工改造的人體mpl序列&#60220&#62&#60221&#62CDS&#60222&#62(1)..(573)&#60400&#62 3gcg gcc gcc ctg gag ctg cgc ccg cga tct cgc tac cgt tta cag ctg 48Ala Ala Ala Leu Glu Leu Arg Pro Arg Ser Arg Tyr Arg Leu Gln Leu1 5 10 15cgc gcc agg ctc aac ggc ccc acc tac caa ggt ccc tgg agc tcg tgg 96Arg Ala Arg Leu Asn Gly Pro Thr Tyr Gln Gly Pro Trp Ser Ser Trp20 25 30tcg gac cca act agg gtg gag acc gcc acc gag acc gcc tgg atc tcc 144Ser Asp Pro Thr Arg Val Glu Thr Ala Thr Glu Thr Ala Trp Ile Ser35 40 45ttg gtg acc gct ctg cat cta gtg ctg ggc ctc aac gcc gtc ctg ggc 192Leu Val Thr Ala Leu His Leu Val Leu Gly Leu Asn Ala Val Leu Gly50 55 60ctg ctg ctg ctg agg tgg cag ttt cct gca cac tac agg aga ctg agg 240Leu Leu Leu Leu Arg Trp Gln Phe Pro Ala His Tyr Arg Arg Leu Arg65 70 75 80cat gcc ctg tgg ccc tca ctt cca gac ctg cac cgg gtc cta ggc cag 288His Ala Leu Trp Pro Ser Leu Pro Asp Leu His Arg Val Leu Gly Gln85 90 95tac ctt agg gac act gca gcc ctg agc ccg ccc aag gcc aca gtc tca 336Tyr Leu Arg Asp Thr Ala Ala Leu Ser Pro Pro Lys Ala Thr Val Ser100 105 110gat acc tgt gaa gaa gtg gaa ccc agc ctc ctt gaa atc ctc ccc aag 384Asp Thr Cys Glu Glu Val Glu Pro Ser Leu Leu Glu Ile Leu Pro Lys115 120 125tcc tca gag agg act cct ttg ccc ctg tgt tcc tcc cag gcc cag atg 432Ser Ser Glu Arg Thr Pro Leu Pro Leu Cys Ser Ser Gln Ala Gln Met130 135 140gac tac cga aga ttg cag cct tct tgc ctg ggg acc atg ccc ctg tct 480Asp Tyr Arg Arg Leu Gln Pro Ser Cys Leu Gly Thr Met Pro Leu Ser145 150 155 160gtg tgc cca ccc atg gct gag tca ggg tcc tgc tgt acc acc cac att 528Val Cys Pro Pro Met Ala Glu Ser Gly Ser Cys Cys Thr Thr His Ile165 170 175gcc aac cat tcc tac cta cca cta agc tat tgg cag cag cct 570Ala Asn His Ser Tyr Leu Pro Leu Ser Tyr Trp Gln Gln Pro180 185 190tgagtcgac 579&#60210&#624&#60211&#62190&#60212&#62PRT&#60213&#62人工序列&#60220&#62&#60223&#62人工序列的描述人工改造的人體mpl序列&#60400&#624Ala Ala Ala Leu Glu Leu Arg Pro Arg Ser Arg Tyr Arg Leu Gln Leu1 5 10 15Arg Ala Arg Leu Asn Gly Pro Thr Tyr Gln Gly Pro Trp Ser Ser Trp20 25 30Ser Asp Pro Thr Arg Val Glu Thr Ala Thr Glu Thr Ala Trp Ile Ser35 4O 45Leu Val Thr Ala Leu His Leu Val Leu Gly Leu Asn Ala Val Leu Gly50 55 60Leu Leu Leu Leu Arg Trp Gln Phe Pro Ala His Tyr Arg Arg Leu Arg65 70 75 80His Ala Leu Trp Pro Ser Leu Pro Asp Leu His Arg Val Leu Gly Gln85 90 95Tyr Leu Arg Asp Thr Ala Ala Leu Ser Pro Pro Lys Ala Thr Val Ser100 105 110Asp Thr Cys Glu Glu Val Glu Pro Ser Leu Leu Glu Ile Leu Pro Lys115 120 125Ser Ser Glu Arg Thr Pro Leu Pro Leu Cys Ser Ser Gln Ala Gln Met130 135 140Asp Tyr Arg Arg Leu Gln Pro Ser Cys Leu Gly Thr Met Pro Leu Ser145 150 155 160Val Cys Pro Pro Met Ala Glu Ser Gly Ser Cys Cys Thr Thr His Ile165 170 175Ala Asn His Ser Tyr Leu Pro Leu Ser Tyr Trp Gln Gln Pro180 185 190&#60210&#62 5&#60211&#6225&#60212&#62DNA&#60213&#62人工序列&#60220&#62&#60223&#62人工序列的描述人工合成的引物序列&#60400&#625cgaattcaaa gttctctgga ggatg 25&#60210&#626&#60211&#6237&#60212&#62DNA&#60213&#62人工序列&#60220&#62&#60223&#62人工序列的描述人工合成的引物序列&#60400&#626cgaattcgcc gccaccatgg cacccgcccg ctcgccc 37&#60210&#627&#60211&#6227&#60212&#62DNA&#60213&#62人工序列&#60220&#62&#60223&#62人工序列的描述人工合成的引物序列&#60400&#627agcggccgcc tcctggactg gctccca 27&#60210&#628&#60211&#621032&#60212&#62DNA&#60213&#62人工序列&#60220&#62&#60223&#62人工序列的描述人工合成的人體GM-CSF-人體mpl融合基因序列&#60220&#62&#60221&#62信號肽&#60222&#62(22)..(72)&#60220&#62&#60221&#62CDS&#60222&#62(22)..(1026)&#60400&#628gaattcaaag ttctctggag g atg tgg ctg cag agc ctg ctg ctc ttg ggc 51Met Trp Leu Gln Ser Leu Leu Leu Leu Gly15 10act gtg gcc tgc agc atc tct gca 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771His Arg Val Leu Gly Gln Tyr Leu Arg Asp Thr Ala Ala Leu Ser Pro235 240 245 250ccc aag gcc aca gtc tca gat acc tgt gaa gaa gtg gaa ccc agc ctc 819Pro Lys Ala Thr Val Ser Asp Thr Cys Glu Glu Val Glu Pro Ser Leu255 260 265ctt gaa atc ctc ccc aag tcc tca gag agg act cot ttg ccc ctg tgt 867Leu Glu Ile Leu Pro Lys Ser Ser Glu Arg Thr Pro Leu Pro Leu Cys270 275 280tcc tcc cag gcc cag atg gac tac cga aga ttg cag cct tct tgc ctg 915Ser Ser Gln Ala Gln Met Asp Tyr Arg Arg Leu Gln Pro Ser Cys Leu285 290 295ggg acc atg ccc ctg tct gtg tgc cca ccc atg gct gag tca ggg tcc 963Gly Thr Met Pro Leu Ser Val Cys Pro Pro Met Ala Glu Ser Gly Ser300 305 31Otgc tgt acc acc cac att gcc aac cat tcc tac cta cca cta agc tat 1011Cys Cys Thr Thr His Ile Ala Asn His Ser Tyr Leu Pro Leu Ser Tyr315 320 325 330tgg cag cag cct tgagtcgac 1032Trp Gln Gln Pro&#60210&#629&#60211&#62334&#60212&#62PRT&#60213&#62人工序列&#60220&#62&#60223&#62人工序列的描述人工合成的人體GM-CSF-人體mpl融合蛋白序列&#60400&#629Met Trp Leu Gln Ser Leu Leu Leu Leu Gly
1 5 10Thr Val Ala Cys Ser Ile Ser Ala Pro Ala Arg Ser Pro Ser Pro Ser15 20 25Thr Gln Pro Trp Glu His Val Asn Ala Ile Gln Glu Ala Arg Arg Leu30 35 40Leu Asn Leu Ser Arg Asp Thr Ala Ala Glu Met Asn Glu Thr Val Glu45 50 55Val Ile Ser Glu Met Phe Asp Leu Gln Glu Pro Thr Cys Leu Gln Thr60 65 70Arg Leu Glu Leu Tyr Lys Gln Gly Leu Arg Gly Ser Leu Thr Lys Leu75 80 85 90Lys Gly Pro Leu Thr Met Met Ala Ser His Tyr Lys Gln His Cys Pro95 100 105Pro Thr Pro Glu Thr Ser Cys Ala Thr Gln Ile Ile Thr Phe Glu Ser110 115 120Phe Lys Glu Asn Leu Lys Asp Phe Leu Leu Val Ile Pro Phe Asp Cys125 130 135Trp Glu Pro Val Gln Glu Ala Ala Ala Leu Glu Leu Arg Pro Arg Ser140 145 150Arg Tyr Arg Leu Gln Leu Arg Ala Arg Leu Asn Gly Pro Thr Tyr Gln155 160 165 170Gly Pro Trp Ser Ser Trp Ser Asp Pro Thr Arg Val Glu Thr Ala Thr175 180 185Glu Thr Ala Trp Ile Ser Leu Val Thr Ala Leu His Leu Val Leu Gly190 195 200Leu Asn Ala Val Leu Gly Leu Leu Leu Leu Arg Trp Gln Phe Pro Ala205 210 215His Tyr Arg Arg Leu Arg His Ala Leu Trp Pro Ser Leu Pro Asp Leu220 225 230His Arg Val Leu Gly Gln Tyr Leu Arg Asp Thr Ala Ala Leu Ser Pro235 240 245 250Pro Lys Ala Thr Val Ser Asp Thr Cys Glu Glu Val Glu Pro Ser Leu255 260 265Leu Glu Ile Leu Pro Lys Ser Ser Glu Arg Thr Pro Leu Pro Leu Cys270 275 280Ser Ser Gln Ala Gln Met Asp Tyr Arg Arg Leu Gln Pro Ser Cys Leu285 290 295Gly Thr Met Pro Leu Ser Val Cys Pro Pro Met Ala Glu Ser Gly Ser300 305 310Cys Cys Thr Thr His Ile Ala Asn His Ser Tyr Leu Pro Leu Ser Tyr315 320 325 330Trp Gln Gln Pro&#60210&#6210&#6021l&#621032&#60212&#62DNA&#60213&#62人工序列&#60220&#62&#60223&#62人工序列的描述人工合成的人體GM-CSF-人體mpl融合基因序列&#60220&#62&#60221&#62CDS&#60222&#62(16)..(972)&#60400&#6210gaattcaaag ttctctggag g atg tgg ctg cag agc ctg ctg ctc ttg ggc 51Met Trp Leu Gln Ser Leu Leu Leu Leu Gly15 10act gtg gcc tgc agc atc tct gca ccc gcc cgc tcg ccc agc ccc agc 99Thr Val Ala Cys Ser Ile Ser Ala Pro Ala Arg Ser Pro Ser Pro Ser15 20 25acg cag ccc tgg gag cat gtg aat gcc atc cag gag gcc cgg cgt ctc 147Thr Gln Pro Trp Glu His Val Asn Ala Ile Gln Glu Ala Arg Arg Leu30 35 40ctg aac ctg agt aga gac act gct gct gag atg aat gaa aca gta gaa 195Leu Asn Leu Ser Arg Asp Thr Ala Ala Glu Met Asn Glu Thr Val Glu45 50 55gtc atc tca gaa atg ttt gac ctc cag gag ccg acc tgc cta cag acc 243Val Ile Ser Glu Met Phe Asp Leu Gln Glu Pro Thr Cys Leu Gln Thr6O 65 70cgc ctg gag ctg tac aag cag ggc ctg cgg ggc agc ctc acc aag ctc 291Arg Leu Glu Leu Tyr Lys Gln Gly Leu Arg Gly Ser Leu Thr Lys Leu75 80 85 90aag ggc ccc ttg acc atg atg gcc agc cac tac aag cag cac tgc cct 339Lys Gly Pro Leu Thr Met Met Ala Ser His Tyr Lys Gln His Cys Pro95 100 105cca acc ccg gaa act tcc tgt gca acc cag att atc acc ttt gaa agt 387Pro Thr Pro Glu Thr Ser Cys Ala Thr Gln Ile Ile Thr Phe Glu Ser110 115 120ttc aaa gag aac ctg aag gac ttt ctg ctt gtc atc ccc ttt gac tgc 435Phe Lys Glu Asn Leu Lys Asp Phe Leu Leu Val Ile Pro Phe Asp Cys125 130 135tgg gag cca gtc cag gag gcg gcc gcc ctg gag ctg cgc ccg cga tct 483Trp Glu Pro Val Gln Glu Ala Ala Ala 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Met Asn Glu Thr Val Glu45 50 55Val Ile Ser Glu Met Phe Asp Leu Gln Glu Pro Thr Cys Leu Gln Thr60 65 70Arg Leu Glu Leu Tyr Lys Gln Gly Leu Arg Gly Ser Leu Thr Lys Leu75 80 85 90Lys Gly Pro Leu Thr Met Met Ala Ser His Tyr Lys Gln His Cys Pro95 100 105Pro Thr Pro Glu Thr Ser Cys Ala Thr Gln Ile Ile Thr Phe Glu Ser110 115 120Phe Lys Glu Asn Leu Lys Asp Phe Leu Leu Val Ile Pro Phe Asp Cys125 130 135Trp Glu Pro Val Gln Glu Ala Ala Ala Leu Glu Leu Arg Pro Arg Ser140 145 150Arg Tyr Arg Leu Gln Leu Arg Ala Arg Leu Asn Gly Pro Thr Tyr Gln155 160 165 170Gly Pro Trp Ser Ser Trp Ser Asp Pro Thr Arg Val Glu Thr Ala Thr175 180 185Glu Thr Ala Trp Ile Ser Leu Val Thr Ala Leu His Leu Val Leu Gly190 195 200Leu Asn Ala Val Leu Gly Leu Leu Leu Leu Arg Trp Gln Phe Pro Ala205 210 215His Tyr Arg Arg Leu Arg His Ala Leu Trp Pro Ser Leu Pro Asp Leu220 225 230His Arg Val Leu Gly Gln Tyr Leu Arg Asp Thr Ala Ala Leu Ser Pro235 240 245 250Pro Lys Ala Thr Val Ser Asp Thr Cys Glu Glu Val Glu Pro Ser Leu255 260 265Leu 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權利要求
1．一種肽，它能夠在細胞表面通過二聚化誘導細胞增殖并且該肽缺乏分泌能力。
2．權利要求1的肽，其中該肽得自細胞因子受體。
3．權利要求1的肽，其中該肽得自mpl。
4．權利要求2或3的肽，其中該肽為配體非依賴型。
5．權利要求1的肽，其中該肽包括SEQ ID NO4的氨基酸序列。
6．編碼權利要求1-5中任意一項的肽的DNA。
7．一種載體，其含有權利要求6的DNA和cDNA在該DNA的5′-上游區的克隆位點。
8．權利要求7的載體，其中該載體得自逆轉錄病毒。
9．權利要求7或8的載體，其中將cDNA插入權利要求6的DNA的5′-上游。
10．一種細胞，其攜帶權利要求9中所述載體。
11．權利要求10的細胞，其中該細胞為哺乳動物的細胞。
12．一種檢測被待測試的cDNA編碼的肽是否含有分泌能力的方法，該方法包括(a)將測試cDNA與權利要求7的載體連接，(b)將(a)中制得的載體導入細胞中，和(c)培養(b)中制得的轉化體，并檢測細胞增殖能力。
13．一種分離編碼具有分泌能力的肽的cDNA的方法，該方法包括(a)將cDNA文庫與權利要求7的載體連接，(b)將(a)中制得的載體導入細胞中，(c)培養(b)中制得的轉化體，并檢測細胞增殖能力，和(d)選擇(c)中經鑒定具有細胞增殖能力的陽性細胞，并從所述細胞中分離該cDNA。
14．權利要求12或13的方法，其中載體得自逆轉錄病毒，并且將被導入載體的細胞是哺乳動物的細胞。
15．一種編碼具有分泌能力的肽的cDNA，其是用權利要求13的方法分離的。
16．一種肽，其是由權利要求15的cDNA編碼的。
全文摘要
一種編碼缺乏分泌能力的人體mp1的DNA,它是通過去除穩態活性mp1的分泌信號和其胞外域主要部分制得的。該DNA與測試cDNA、編碼已知分泌蛋白的cDNA和另一編碼除去了分泌信號區域的相同蛋白的cDNA連接,所得每一種嵌合基因在細胞中表達以檢查細胞增殖能力。在含作為測試cDNA的編碼已知分泌蛋白的cDNA的細胞中檢測到細胞增殖,然而對除去了分泌信號區域的編碼相同蛋白的cDNA沒有檢測到細胞增殖。因此,通過構建cDNA文庫并通過上面的方法篩選它,可以檢測和分離編碼包括Ⅰ型膜蛋白和Ⅱ型膜蛋白的分泌蛋白的cDNAs。
文檔編號C12N15/12GK1285847SQ98812969
公開日2001年2月28日 申請日期1998年11月26日 優先權日1997年11月26日
發明者北村俊雄, 小嶋哲郎 申請人:中外制藥株式會社, 北村俊雄