專利名稱：：修飾的維生素k依賴性多肽的制作方法
背景技術：
：維生素K依賴性蛋白氨基末端的45個殘基中含9至13個γ-羧基谷氨酸殘基(Gla)。Gla殘基是在肝內由酶用維生素K羧化蛋白質前體內谷氨酸殘基的側鏈而產生的。維生素K依賴性蛋白參與許多生物過程，其中描述得最清楚的是凝血過程(參見Furie，B.和Furie，B.C.，1988，Cell，53505-518)。維生素K依賴性蛋白包括Z蛋白，S蛋白，凝血酶原，Ⅹ因子，Ⅸ因子，C蛋白，Ⅶ因子和Gas6。蛋白Gsa6的功能在于調節細胞生長。Matsubara等，1996，Dev.Biol.，180499-510。Gla殘基為這些蛋白正確地結合鈣和發生膜相互作用所必需。Ⅹ因子的膜接觸位點被認為在氨基酸殘基1-37內。Evans和Nelsestuen，1996，ProteinScience5增刊1，163Abs。雖然血漿蛋白的含Gla區具有很高的序列同源性，可它們的膜親和力相差至少1000倍。McDonald，J.F.等，1997，Biochemistry，365120-5137。Ⅶ因子參與凝血早期階段，可能是形成血凝塊的重要因素。無活性前體即酶原的酶活性很低，經蛋白酶剪切形成Ⅶa因子后，活性大大提高。該活化作用可由Ⅹa因子和Ⅶa-組織因子催化，后者是存在于多種細胞內的一種膜內在蛋白。Fiore，M.M.等，1994，J.Biol.Chem.，269143-149。被Ⅶa-組織因子活化又稱自身活化。它既與活化(由Ⅶ因子形成Ⅶa因子)有關，又與所得Ⅶa因子活性有關。迄今，還不知道最重要的體內活化途徑。Ⅶa因子能活化凝血因子Ⅸ和Ⅹ。組織因子在某些腫瘤細胞表面高水平表達。組織因子和Ⅶa可能參與腫瘤的發展和組織入侵。Vrana，J.A.等，CancerRes.，565063-5070。組織因子的細胞表達和作用還是內毒素休克毒性應答中的主要因素。Dackiw，A.A.等，1996，Arch.Surg.，1311273-1278。C蛋白在內皮細胞膜內在蛋白，凝血調節蛋白存在下，由凝血酶活化。Esmon，N.L.等，1982，J.Biol.Chem.，257859-864。活性C蛋白(APC)與其輔因子S蛋白一起降解Ⅴa因子和Ⅷa因子。耐APC是遺傳性血凝疾病最常見的形式。Dahlback，B.1995，Blood，85607-614。常用給予維生素K抑制劑來預防血凝塊形成。維生素K依賴性蛋白常用于治療某些類型的血友病。血友病A的特征是缺乏Ⅷ因子，Ⅷa因子，或存在Ⅷ因子的抑制劑。血友病B的特征是缺乏活性Ⅸ因子，Ⅸa因子。Ⅶ因子缺乏癥，雖然少見，但對給予Ⅶ因子反應良好。Bauer，KA.，1996，Haemostasis，26155-158，增刊1。Ⅷ因子取代療法因為在某些患者中產生高效價的抑制性Ⅷ因子而受到限制。或者，可用Ⅶa因子治療血友病A和B。Ⅸa因子和Ⅷa因子活化Ⅹ因子。因為Ⅶa因子直接活化Ⅹ因子，所以不再需要因子Ⅸ和Ⅷ，能夠克服因子Ⅸ和Ⅷ缺乏問題而幾乎沒有免疫學后果。Hender等，1993，Transfus，Medi.Rev.，778-83；Nicolaisen，E.M.等，1996，Thromb.Haemost.，76200-204。給予Ⅶa因子的有效量一般很高(45-90μg/kg體重)，而且需要每隔數小時反復給予。Shulmav，S.等，1996，Thromb.Haemost.，75432-436。目前發現，不含膜接觸區的可溶形式組織因子(可溶性組織因子即sTF)在與Ⅶa因子聯合給予時可有效治療血友病。U.S.專利5，504，064。在狗中顯示，sTF減少治療血友病所需Ⅶa因子量。sTF-Ⅶa的膜結合作用完全依靠Ⅶ因子的膜接觸位點。這與通過組織因子和Ⅶa因子一起與膜結合的正常組織-Ⅶa因子復合物不同。發明概述已發現，維生素K依賴性多肽的γ-羧基谷氨酸殘基(GLA)區內的修飾增強其膜結合親和力。如此修飾后的維生素K依賴性多肽活性增強，可用作抗凝血藥，促凝血藥或利用維生素K依賴性蛋白的其他功能。例如，改進的Ⅶ因子分子可提供多個優點降低Ⅶa所需量及相對給予頻率和/或提供質量改進使治療缺乏癥更有效。本發明以維生素K依賴性多肽為特征，所述多肽具有修飾GLA區，相對于天然維生素K依賴性多肽，該修飾區增強所述多肽的膜結合親和力。修飾GLA區位于氨基酸1至氨基酸45，并包括至少1處氨基酸取代。例如，所述氨基酸取代可以在氨基酸11，12，29，33或34。以氨基酸11，33或34處的取代為佳。修飾GLA區可包括這樣一段氨基酸序列它在鈣飽和狀態下形成的三級結構為負電荷云包圍一個陽離子核心。維生素K依賴性多肽可以是例如C蛋白，活性C蛋白，Ⅸ因子，Ⅸa因子，Ⅶ因子，Ⅷa因子或活性位點被修飾的Ⅶa因子。蛋白C或活性蛋白C的修飾GLA區可有氨基酸33處的谷氨酸殘基，氨基酸34處的天冬氨酸殘基(SEQIDNO19)。蛋白C或活性蛋白C的修飾GLA區還可能在氨基酸11處具有一個谷胺酰胺殘基或谷氨酸殘基(分別為SEQIDNO20和SEQIDNO21)。此外，C蛋白或活性C蛋白(SEQIDNO24或SEQIDNO35)GLA區內氨基酸12可能被甘氨酸取代。Ⅶ因子，Ⅶa因子和活性位點被修飾的Ⅶa因子的修飾GLA區可能在氨基酸11和33處被取代。例如，可以谷胺酰胺殘基取代氨基酸11，谷氨酸殘基取代氨基酸33(SEQIDNO30)。本發明的另一特征是一種編碼維生素K依賴性多肽的分離的核酸。“分離的核酸”在此指對應于編碼維生素K依賴性多肽基因一部分或全部的序列，但不是哺乳動物基因組中該基因一側或兩側的游離序列。維生素K依賴性多肽含修飾GLA區，該修飾區增強其膜結合親和力，使之高于對應天然維生素K依賴性多肽。該修飾GLA區還包括至少一處氨基酸取代。本發明的另一特征是一種哺乳動物宿主細胞。該細胞包含編碼維生素K依賴性多肽的核酸載體。該維生素K依賴性多肽含修飾GLA區，該修飾區增強其膜結合親和力，使之高于對應天然維生素K依賴性多肽。該修飾GLA區還包括至少一處氨基酸取代，例如氨基酸11，12，29，33或34處的取代。該維生素K依賴性多肽可以是例如Ⅶ因子，Ⅶa因子，并包含氨基酸11和氨基酸33處的氨基酸取代。例如，這種氨基酸取代可以包括氨基酸11處的谷氨酰胺殘基和氨基酸33處的谷氨酸殘基(SEQIDNO30)。本發明還涉及一種藥物組合物，它包含藥學上認可的載體和有效量的維生素K依賴性多肽，以抑制哺乳動物中血凝塊的形成。該維生素K依賴性多肽含修飾GLA區，該修飾區增強其膜結合親和力，使之高于對應天然維生素K依賴性多肽。該修飾GLA區還包括至少一處氨基酸取代。該維生素K依賴性多肽可以是例如C蛋白，活化C蛋白，或活性位點被修飾的Ⅶa因子。C蛋白或活性C蛋白可包括，例如，氨基酸33處的谷氨酸殘基和氨基酸34處的天冬氨酸殘基(SEQIDNO19)。C蛋白或活性C蛋白還可包括，例如，氨基酸11處的谷氨酰胺(SEQIDNO20)或谷氨酸(SEQIDNO21)。氨基酸取代還可包括氨基酸12處的甘氨酸(SEQIDNO24或35)。活性位點被修飾的Ⅶa因子可包括，例如，氨基酸11處為谷氨酰胺和氨基酸33處為谷氨酸殘基(SEQIDNO30)。本發明的又一特征是一種藥物組合物，含藥學上認可的載體和有效量的維生素K依賴性多肽，以增加哺乳動物血凝塊形成。所述維生素K依賴性多肽具有修飾GLA區，該修飾區增強其膜結合親和力，使之高于對應天然維生素K依賴性多肽。所述修飾GLA區具有至少一處氨基酸取代。所述維生素K依賴性多肽可以是例如Ⅶ因子，Ⅶa因子，Ⅸ因子或Ⅸa因子。所述藥物組合物還可包含可溶性組織因子。Ⅶ因子或Ⅶa因子可具有氨基酸11和氨基酸33處的氨基酸取代。例如，可以谷胺酰胺殘基取代氨基酸11，谷氨酸殘基取代氨基酸33(SEQIDNO30)。本發明還描述了維生素K依賴性多肽治療血凝疾病的用途。所述維生素K依賴性多肽具有修飾GLA區，該修飾區增強其膜結合親和力，使之高于對應天然維生素K依賴性多肽。所述修飾GLA區具有至少一處氨基酸取代。有用的修飾維生素K依賴性多肽包括例如前文所述的C蛋白，活性C蛋白，Ⅶ因子，Ⅶa因子，活性位點被修飾的Ⅶa因子，Ⅸ因子和Ⅸa因子。本發明的特征還在于維生素K依賴性多肽在制造治療血凝塊病的藥物中的用途。所述維生素K依賴性多肽具有修飾GLA區，該修飾區增強其膜結合親和力，使之高于對應天然維生素K依賴性多肽。所述修飾GLA區具有至少一處氨基酸取代。有用的修飾維生素K依賴性多肽包括例如前文所述的C蛋白，活性C蛋白，Ⅶ因子，Ⅶa因子，活性位點被修飾的Ⅶa因子，Ⅸ因子和Ⅸa因子。本發明還描述了在哺乳動物內減少血栓形成的方法。所述方法包括給予有效量的維生素K依賴性多肽以減少哺乳動物血栓形成。所述維生素K依賴性多肽具有修飾GLA區，該修飾區增強其膜結合親和力，使之高于對應天然維生素K依賴性多肽。所述修飾GLA區具有至少一處氨基酸取代。所述維生素K依賴性多肽是例如C蛋白，活性C蛋白或活性位點被修飾的Ⅶa因子。C蛋白或活性C蛋白可具有氨基酸33處的谷氨酸殘基和氨基酸34處的天冬氨酸殘基(SEQIDNO19)。在C蛋白或活性C蛋白內可以還有一個谷胺酰胺或谷氨酸取代(SEQIDNO20或SEQIDNO21)。可以進一步以甘氨酸取代氨基酸12(SEQIDNO24或35)。活性位點被修飾的Ⅶa因子可具有氨基酸11處的一個谷胺酰胺殘基和氨基酸33處的一個谷氨酸殘基(SEQIDNO30)。本發明的還包括在哺乳動物內增加血凝塊形成的方法。該方法包括給予有效量的維生素K依賴性多肽以增加哺乳動物血凝塊形成。該維生素K依賴性多肽具有修飾GLA區，該修飾區增強其膜結合親和力，使之高于對應天然維生素K依賴性多肽。所述修飾GLA區具有至少一處氨基酸取代。該維生素K依賴性多肽可以是例如Ⅶ因子，Ⅶa因子，Ⅸ因子或Ⅸa因子。Ⅶ因子或Ⅶa因子可具有位于氨基酸11和氨基酸33處的氨基酸取代。例如，所述氨基酸取代可以是氨基酸11處的谷胺酰胺殘基和氨基酸33處的谷氨酸殘基(SEQIDNO30)。除非另作說明，本文所用科技術語的意義與本領域一般技術人員所理解的相同。雖然可以用與本文所述類似或相當的方法和材料來實施本發明，以下還是描述了合適的方法和材料。本文給出了提到的所有出版物、專利申請、專利和其他參考文獻的完整出處。如有沖突，以本發明的說明，包括定義，為準。此外，本文中的材料，方法和實施例只是說明性的，不是限定性的。以下詳細描述和權利要求將顯示本發明的其他特征和優點。附圖簡述SEQIDNO3和SEQIDNO30內分別是野生型Ⅶa和ⅦQ11E33的GLA區氨基酸序列。SEQIDNO18，SEQIDNO2，SEQIDNO1和SEQIDNO23內分別是牛Ⅹ因子，牛C蛋白，人C蛋白和牛C-H11蛋白的GLA區氨基酸序列。SEQIDNO19是CVQ33E，N34D的GLA區序列。圖1顯示野生型Ⅶa(空心圓)，ⅦQ11E33(實心圓)和牛Ⅹ因子(實心三角)與膜的結合，包括標準偏差。圖2顯示ⅦQ11E33的自身活化。虛線顯示的是無磷脂存在下的活性。圖3所示為Ⅹ因子被Ⅶa因子活化。給出的是濃度為0.06nM的野生型Ⅶa因子(空心圓)和ⅦaQ11E33(實心圓)的結果。圖4顯示Ⅶa和ⅦaQ11E33與可溶性組織因子引起的人血漿凝固。圖5顯示Ⅶ因子酶原和普通組織因子引起的血漿凝固。圖6顯示活性位點被修飾的ⅦaQ1IE33因子(DEGR-ⅦaQ11E33)抑制血凝塊形成。圖7顯示ⅦaQ11E33因子在大鼠體內的循環時間。圖8顯示普通蛋白和修飾蛋白與膜的相互作用。分圖A顯示野生型牛C蛋白(空心圓)和牛C-H11(實心圓)與囊泡的相互作用。分圖B顯示野生型人C蛋白(空心圓)和人C-P11(實心圓)與膜的相互作用。兩圖中，虛線所示都是假設所加蛋白全部與膜結合的結果。圖9顯示活性C蛋白對凝血時間的影響。分圖A中，顯示的是野生型牛APC(空心圓)和bAPC-H11(實心圓)3次人血漿凝固測定的平均值和標準偏差。分圖B中，顯示的是野生型人APC(空心圓)和人APC-P11(實心圓)3次人血漿凝固測定的平均值和標準偏差。圖10顯示Ⅴa因子被牛和人的APC滅活。分圖A顯示Ⅴa因子被野生型牛APC(空心圓)和牛APC-H11(實心圓)滅活。分圖B顯示在缺乏S蛋白的血漿中人Ⅴa因子被野生型人APC(空心圓)或人APC-H11(實心圓)滅活。圖11顯示Z蛋白的靜電分布。垂直線表示正電區，水平線表示負電區。圖12顯示多種C蛋白與膜的結合和活性。分圖A顯示野生型C蛋白(空心圓)，P11H突變C蛋白(實心方塊)，Q33E，N34D突變蛋白(實心圓)和牛凝血酶原(空心方塊)與膜的結合。分圖B顯示上述突變蛋白的凝血抑制。分圖C顯示Ⅴa因子的滅活。圖13比較突變人C蛋白與膜的結合和活性。分圖A比較野生型(空心圓)，E33(空心三角)和E33D34(實心圓)與膜的結合。分圖B比較野生型(空心三角)，E33(空心圓)和E33D34(實心圓)的凝血時間。圖14比較牛C蛋白的野生型(空心方塊)，H11(實心圓)，E33D34(空心三角)和H11E33D34三聯突變蛋白(空心圓)與膜的結合(分圖A)和凝血抑制(分圖B)。圖15顯示不同維生素K依賴性蛋白與膜相互作用的特性。分圖A比較人Ⅹ因子(實心圓)和牛Ⅹ因子(空心圓)與膜的相互作用。分圖B顯示普通牛凝血酶原片段1(空心圓)，無鈣時TNBS修飾的片段1(實心圓)和25mM鈣存在下TNBS修飾的片段1(實心方塊)與膜的相互作用。分圖C顯示pH9(實心圓)和pH7.5(空心圓)時Z蛋白與囊泡結合的速度。詳細描述本
發明內容之一是具有修飾GLA區的維生素K依賴性多肽，該多肽的膜結合親和力增強，高于對應的天然維生素K依賴性多肽。維生素K依賴性多肽是在生物合成路徑中用維生素K羧化蛋白質前體內谷氨酸殘基上側鏈的一組蛋白質。GLA區在多肽N末端區，含9-13個γ羧基谷氨酸殘基，通常是氨基酸1至45。維生素K依賴性多肽的例子有Z蛋白，S蛋白，Ⅹ因子，Ⅱ因子(凝血酶原)，Ⅸ因子，C蛋白，Ⅶ因子和Gas6。本文中多肽的氨基酸位置根據Ⅸ因子編號。S蛋白，C蛋白，Ⅹ因子，Ⅶ因子和人凝血酶原都少一個氨基酸(第4位)，所以必需進行調整。例如，牛C蛋白的10位其實是脯氨酸，但為了便于比較，在此都編為氨基酸11。本文中，“多肽”是各種氨基酸鏈，不考慮長度或翻譯后修飾。氨基酸在此用標準三字母或單字母縮寫表示。GLA區的修飾包括至少一處氨基酸取代。所述取代可以是保守性或非保守性的。保守性氨基酸取代以同類氨基酸進行取代，非保守性氨基酸取代則以不同類的氨基酸進行取代。非保守性取代可能造成多肽疏水性或殘基側鏈大小的本質性改變。此外，非保守性取代可能本質性改變多肽的電荷，例如減少正電荷或引入負電荷。非保守性取代的實例包括堿性氨基酸取代非極性氨基酸，或極性氨基酸取代酸性氨基酸。氨基酸取代可發生在第11，12，29，33或34位氨基酸。較好的是，氨基酸取代位于氨基酸11，33或34處。修飾GLA區可具有這樣一段氨基酸序列，在鈣飽和狀態下，促進形成被負電荷云包圍的陽離子核心的三級結構。除特定理論之外，與膜親和力的增強可能緣于正電核心被負電表面完全包圍而成的特殊靜電形式。許多維生素K依賴性多肽是膜結合酶的底物。既然維生素K依賴性多肽都沒有表現出GLA區的最大潛在膜結合親和力，則一定都具有旨在降低結合親和力的氨基酸。所以，許多維生素K依賴性多肽含有就最大親和力而言并非最適的氨基酸。這些殘基干擾結合位點，使酶反應更快轉換。降低膜親和力可能具有幾個目的。高親和力伴隨著低交換率，這將限制反應速度。例如，在膜上合成與底物具有高親和力的凝血酶原酶時，限速性的是從膜上交換出蛋白，而不是酶催化。Lu，Y.和Nelsestuen，G.L.，1996，Biochemistry，358201-8209。或者，用非最適氨基酸取代調整膜親和力能平衡促凝血(Ⅹ、Ⅸ、Ⅶ和凝血酶原)與抗凝血(C蛋白，S蛋白)的競爭。雖然天然蛋白的膜親和力就常態來說是最合適的，膜親和力的增強可能產生可用于體外研究的蛋白質，和在體內病理情況下調節凝血的改良藥物。以下描述了多種GLA區被修飾的維生素K依賴性多肽的實例。維生素K依賴性多肽可能是C蛋白或活性C蛋白(APC)。表1顯示了野生型人C蛋白(hC)和牛C蛋白(bC)GLA區的氨基酸序列。Ⅹ是Gla或Glu殘基。通常，第11，33和34位是中性(例如Q)或陽離子殘基(例如D，E)的蛋白具有較高的膜親和力。表1hCANS-FLXXLRH11SSLXRXCIXX21ICDFXXAKXI31FQNVDDTLAF41WSKH(SEQIDNO1)bCANS-FLXXLRP11GNVXRXCSXX21VCXFXXARXI31FQNTXDTMAF41WSFY(SEQIDNO2)例如，C蛋白或APC的修飾GLA區可具有氨基酸33處的谷氨酸殘基和氨基酸34處的天冬氨酸殘基(SEQIDNO19)。在體內，第33位的谷氨酸還可以進一步修飾成γ-羧基谷氨酸。為了獲得最大活性，修飾GLA區可另外包括氨基酸11處的取代。例如，可在氨基酸11處取代以谷胺酰胺殘基(SEQIDNO20)或谷氨酸殘基或天冬氨酸殘基(SEQIDNO21和SEQIDNO22)。可用組氨酸殘基取代牛C蛋白內的氨基酸11(SEQIDNO23)。進一步修飾可包括在氨基酸12處以甘氨酸取代絲氨酸(SEQIDNO24和SEQIDNO35)。在凝血酶原中以苯丙氨酸取代氨基酸29是另一種有用的修飾(SEQIDNO25)。增強了膜親和力的修飾C蛋白可用來代替諸如肝素等其他可注射抗凝血藥。大多數手術中都用到肝素，但它的缺點在于效果/毒性比低。此外，增強了膜親和力的修飾C蛋白可用來代替香豆素家族口服抗凝血藥，例如丙酮芐羥香豆素。還可以對活性位點被修飾的APC進行上述修飾。可以化學滅活APC的活性位點，例如用N-丹酰基-谷氨酰甘氨酰精氨酰氯甲基丙酮(DEGR)或進行活性位點的定點誘變。Sorensen，B.B.等，1997，J.Biol.Chem.，27211863-11868。活性位點修飾APC是凝血酶原酶復合物的抑制劑。活性位點修飾APC的膜親和力增強，使之成為療效更強的多肽。維生素K依賴性多肽可以是Ⅶ因子或Ⅶ因子的活性形式Ⅶa因子。天然Ⅶ因子多肽的膜親和力較低。表2顯示野生型人Ⅶ因子(hⅦ)和牛Ⅶ因子(bⅦ)的GLA區氨基酸序列。表2hVIIANA-FLXXLRP11GSLXRXCKXX21QCSFXXARXI31FKDAXRTKLF41WISY(SEQIDNO3)bVIIANG-FLXXLRP11GSLXRXCRXX21LCSFXXAHXI31FRNXXRTRQF41WVSY(SEQIDNO4)Ⅶ因子或Ⅶa因子的修飾GLA區可含有例如氨基酸11處的谷氨酸或天冬氨酸(SEQIDNO26和SEQIDNO27)，氨基酸29處的苯丙氨酸(SEQIDNO28)，或氨基酸33處的天冬氨酸(SEQIDNO29)。較好的是，Ⅶ因子或Ⅶa因子的修飾GLA區含有氨基酸11處的谷胺酰胺殘基和氨基酸33處的谷氨酸殘基(SEQIDNO30)。這樣修飾的維生素K依賴性多肽具有比天然或野生型多肽高得多的膜親和力。在Xa因子產生和幾個凝血試驗中，其自身活化的活性也高得多。尤其是例如低水平組織因子和/或磷脂等臨界血凝條件下的活性增強了。例如，在最適組織促凝血酶原激酶水平，修飾Ⅶ因子的活性是天然Ⅶa因子的4倍，在1％最適組織促凝血酶原激酶水平則是約20倍。在體內，臨界促凝血信號可能是最主要的。目前使用最適組織促凝血酶原激酶水平的凝血試驗無法測出正常血漿和血友病患者血漿之間的凝血時間差異。只有在凝血試驗中采用非最適組織促凝血酶原激酶水平或稀釋組織促凝血酶原激酶才能測出上述樣品之間的凝血差異。維生素K依賴性多肽的另一個例子是活性位點修飾Ⅶa因子。可對Ⅶa因子的活性位點進行化學修飾，例如用DEGR或活性位點定點誘變。DEGR修飾的Ⅶ因子通過數種途徑給予是有效的凝血抑制劑。Arnljots，B.等，1997，J.Vasc.Surq.，25341-346。GLA區修飾會使活性位點修飾的Ⅶa因子因為膜親和力增強而更有效。活性位點修飾Ⅶa因子的修飾GLA區可含有氨基酸11處的谷胺酰胺殘基和氨基酸33處的谷氨酸殘基(SEQIDNO30)。維生素K依賴性多肽還可以是Ⅸ因子或Ⅸ因子的活性形式Ⅸa因子。和活性位點修飾的Ⅶa因子一樣，活性位點修飾的Ⅸa因子和Ⅹa因子也是凝血抑制劑。表3顯示野生型人Ⅸ因子(hⅨ)和牛Ⅸ因子(bⅨ)的GLA區氨基酸序列。例如，可以天冬氨酸或谷氨酸取代氨基酸11(SEQIDNO31和SEQIDNO32)，苯丙氨酸取代氨基酸29(SEQIDNO33)，或天冬氨酸取代氨基酸34(SEQIDNO34)。表3hIXYNSGKLXXFVQ11GNLXRXCMXX21KCSFXXARXV31FXNTXRTTXF41WKQY(SEQIDNO5)bIXYNSGKLXXFVQ11GNLXRXCMXX21KCSFXXARXV31FXNTXKRTTXF41WKQY(SEQIDNO6)本發明還包括一種哺乳動物宿主細胞，其中含GLA區被修飾的維生素K依賴性多肽，所述修飾區增強多肽的膜結合親和力，使之高于對應的天然維生素K依賴性多肽。該修飾GLA區具有至少一處上述氨基酸取代。例如，哺乳動物宿主細胞含有修飾Ⅶ因子或修飾Ⅶa因子。修飾Ⅶ因子或修飾Ⅶa因子的修飾GLA區含氨基酸11和33處的氨基酸取代。較好的是，氨基酸取代包括氨基酸11處的谷胺酰胺殘基和氨基酸33處的谷氨酸殘基(SEQIDNO30)。合適的哺乳動物宿主細胞能夠將維生素K依賴性多肽的谷氨酯殘基修飾成γ羧基谷氨酸酯。特別有用的宿主細胞是來自腎和肝的哺乳動物細胞。本發明還包括藥物組合物，其中含藥學上認可的載體和抑制哺乳動物凝血有效量的維生素K依賴性多肽。維生素K依賴性多肽具有至少含一處氨基酸取代的修飾GLA區，它增強多肽的膜親和力，使之高于對應的天然維生素K依賴性多肽。藥物組合物中所用修飾維生素K依賴性多肽包括但不限于上述C蛋白或APC，活性位點修飾的APC，活性位點修飾的Ⅶa因子，活性位點修飾的Ⅸa因子和活性位點修飾的Ⅹa因子。在哺乳動物中，有效抑制凝血的維生素K依賴性多肽濃度取決于許多因素，包括化合物優選給予劑量，所用化合物的化學性質，化合物的賦形劑配方和給藥途徑。藥物組合物的最佳給予劑量還取決于患者總體健康狀況和所選化合物相對生物效力等變數。所述藥物組合物可用于調節體內凝血。例如，組合物可用于治療血凝塊形成。如上所述僅改變一個氨基酸殘基一般不顯著影響突變多肽的抗原性。可將具有修飾GLA區的維生素K依賴性多肽與藥學上認可的無毒賦形劑或載體混合，配制成藥物組合物。可將上述化合物和組合物用于胃腸外給藥，具體是以水性生理緩沖液配制的溶液或懸浮液形式；或用于口服，具體是以片劑或膠囊的形式；或用于鼻給藥，具體是以粉劑、滴鼻液或氣霧劑的形式。其他給予途徑的組合物可如本發明所述用標準方法來制備。胃腸外給予的方劑含常用賦形劑無菌水或鹽溶液，聚乙二醇等聚烷基二醇，植物油，氫化萘等。特別是，例如生物相容性、可生物降解的交酯聚合物，交酯/乙交酯共聚物，或聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物是用于本發明化合物體內控釋的賦形劑。其他合適的胃腸外傳遞系統包括乙烯乙酸乙烯酯共聚物顆粒，滲透泵，可植入浸潤系統和脂質體。吸服制劑如果需要可含乳糖之類賦形劑。吸服劑可以是以滴鼻液形式給予的含例如聚氧乙烯-9-月桂基醚，甘膽酸鹽和脫氧膽酸鹽的水溶液或油溶液。根據需要，可將化合物配制成鼻內使用的凝膠。胃腸外給予的制劑還包括用于頰給藥的甘膽酸鹽。在另一實施例中，本發明還包括含藥學上認可的載體和在哺乳動物內促進凝血有效量的維生素K依賴性多肽的藥物組合物。該維生素K依賴性多肽具有至少含一處氨基酸取代的修飾GLA區，該修飾區增強多肽的膜結合親和力，使之高于對應的天然維生素K依賴性多肽。所述藥物組合物可用于治療血友病A、血友病B等凝血疾病和肝病。在該實施例中，藥物組合物中所用維生素K依賴性多肽包括但不限于Ⅶ因子或Ⅶ因子的活性形式Ⅶa因子。Ⅶ因子或Ⅶa因子的修飾GLA區含氨基酸11和33處的氨基酸取代，例如氨基酸11處的谷胺酰胺和氨基酸33處的谷氨酸(SEQIDNO30)。該藥物組合物還可以包含可溶性組織因子。Ⅶ因子對于凝血尤其重要，因為它處于凝血級聯的引發階段，并能夠活化Ⅸ和Ⅹ因子兩種蛋白。直接由Ⅶa因子活化Ⅹ因子對于能夠治療主要的A型和B型血友病是很重要的，因為這完全繞過了所涉及的Ⅸ和Ⅷ因子步驟。已發現，給予患者Ⅶ因子能有效治療幾種形式的血友病。通過修飾GLA區提高Ⅶ因子或Ⅶa因子的膜親和力提供了使多肽對許多凝血條件反應性更強的可能性，降低了Ⅶ/Ⅶa的所需劑量，延長了給予Ⅶ/Ⅶa因子的間隔時間，并提供使治療更有效的其他質量改變。總之，改善Ⅶ因子的膜接觸位點既能提高其活化速度，又能提高Ⅶa因子對Ⅹ或Ⅸ因子的活化。上述步驟可能對所有體內凝血速度產生多重效應，產生特別適合治療多種凝血疾病的強效Ⅶa因子。其他用于增強血凝塊形成的維生素K依賴性多肽包括Ⅸ因子和Ⅸa因子。本發明還描述了減少哺乳動物內血凝形成的方法。該方法包括給予減少哺乳動物血凝塊形成有效量的維生素K依賴性多肽。所述維生素K依賴性多肽具有增強多肽膜結合親和力使之高于對應天然維生素K依賴性多肽的修飾GLA區。該修飾GLA區至少有一處氨基酸取代。該方法可使用修飾的C蛋白或APC，或修飾的活性位點被封閉的Ⅶa因子、Ⅸa因子、Ⅹa因子和APC。本發明還包括增加哺乳動物內血凝形成的方法，該方法包括給予增加哺乳動物內血凝形成有效量的維生素K依賴性多肽。該維生素K依賴性多肽具有增強其膜結合親和力使之高于對應天然維生素K依賴性多肽的修飾GLA區。該修飾GLA區至少有一處氨基酸取代。該方法可使用修飾的因子Ⅶ或Ⅶa，或修飾的Ⅸ或Ⅸa因子。以下將在實施例中進一步描述本發明，這些實施例不限定本發明的范圍，本發明范圍僅由權利要求來限定。實施例實施例1-增強了膜親和力和活性的Ⅶ因子已發現，定點誘變能提高人凝血因子Ⅶ的膜結合親和力。目前已經對P11Q，K33E突變體(本文稱ⅦQ11E33因子或突變Ⅶ因子(SEQIDNO30))進行了特征分析。其膜親和力比野生型蛋白提高了約20倍。突變體的自身活化作用比野生型Ⅶ因子增強了至少100倍。ⅦQ11E33的活性形式(即ⅦaQ11E33)表現出強10倍的對Ⅹ因子活性。ⅦaQ11E33與可溶性組織因子一起在正常血漿中的凝血活性比野生型Ⅶa強約10倍。酶原即ⅦQ11E33與正常組織因子(1∶100稀釋的組織促凝血酶原激酶-HS)一起的凝血活性比野生型Ⅶ因子強20倍。活性增強的程度取決于條件，ⅦQ11E33在低水平凝血刺激條件下特別活躍。通常用Bradford試驗測定蛋白質濃度，以牛血清白蛋白作為標準物。Bradford，M.M.，1976，Analyt.Biochem.248-254。根據Ⅶ因子的分子量為50，000，Ⅹ因子的分子量為55，000計算摩爾濃度。除非另作說明，所有活性測定都在標準緩沖液(0.05MTris，pH7.5，100mMNaCl)中進行。突變Ⅶ因子的產生突變Ⅶ因子是由野生型Ⅶ因子cDNA產生的(GenBank登錄號M13232，NIDg182799)。Petersen等，1990，Biochemistry293451-3457。以Vallette等，1989，NucleicAcidRes.17723-733中所述聚合酶鏈反應將P11Q突變(將第11位的脯氨酸殘基換成谷胺酰胺殘基)和K33E突變(將第33位的賴氨酸殘基換成谷氨酸殘基)引入野生型Ⅶ因子。該過程中，消除了突變診斷性XmaⅡ限制性酶位點。設計了4種PCR引物，用于引發M13232兩種突變片段的合成，它們是從MluⅠ至BglⅡ即221-301位，和從BglⅡ至SstⅡ即302-787位。在標準PCR循環條件下(GENEAMP，PerkinElmer)，以lng野生型Ⅶ因子cDNA為模板，用上述引物引發片段的合成。對所得片段進行凝膠純化，并用MluI和BglⅡ，或BglⅡ和SstⅡ消化。然后將純化后的兩片段連接到表達載體Zem219b中的Ⅷ因子cDNA內，載體事先已經去除了相應的野生型序列成為MluⅠ-SstⅡ片段。Petersen等，1990，同上。然后對突變片段完整測序以確認P11Q和K33E取代，同時消除PCR引入其他序列改變的可能性。轉染、挑選和純化將乳倉鼠腎(BHK)細胞培養于Dubeccos改進的Eagles培養基中，其中補充了10％胎牛血清和青霉素-鏈霉素。按照制造商說明，用lipofectAMINE(GibcoBRL)以Ⅶ因子表達質粒轉染半鋪滿時的細胞。轉染后2天，以胰蛋白酶處理細胞，稀釋在含1μM氨甲蝶呤(MTX)的選擇培養基中。然后將穩定轉染的BHK細胞培養在無血清Dubeccos改進的Eagles培養基中，其中補充了青霉素-鏈霉素，5μg/ml維生素K1和1μMMTX，收集條件培養基。對條件培養基進行兩次免疫親和柱層析，層析柱由鈣依賴性單克隆抗體(CaFⅦ22)與Affi-Gel10偶聯而成。Nakagaki等，1991，Biochemistry，3010819-10824。最后的純化ⅦQ11E33因子在SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳上走出單一條帶，無證據表明制劑中有Ⅶa因子。純Ⅶ突變體(P11Q，K33E)表現出1400-2800Ⅶ因子單位/mg。Ⅶ因子的活化牛Ⅹa因子剪切ⅦQ11E33形成活性因子ⅦaQ11E33(重量比1∶100，37℃培養1小時)。或者，通過含7μMⅦQ11E33，0.7μMsTF和磷脂(磷脂酰絲氨酸/磷脂酰膽堿(PS/PC)，25/75，0.1g/g蛋白)混合物中的自身活化獲得ⅦaQ11E33因子。野生型Ⅶa因子是一種均質重組蛋白(NOVONordisk)。兩種制劑分別是市售冷凍干燥產品和非冷凍干燥產品。后一種產品經FPLCmono-Q進一步純化，以GeorgeKingNPP標準物標定，表現出的特異性活性為80，000單位/mg。以ⅦQ11E33因子增強膜相互作用按照Nelsestuen和Lin，1977，Biochemistry，3010819-10824所述的方法進行磷脂制備、蛋白質-膜結合試驗及測定。以現有方法制備大單室囊泡(LUV)和小單室囊泡(SUV)。Hope，M.J.等，Biochem.Biophys，Acta.，81255-56；Huang，C.，1969，Biochemistry，8344-352。將高純度的磷脂酰絲氨酸(牛腦)和卵磷脂酰膽堿(SigmaChemicalCo.)混合在氯仿中。用氮氣流驅除溶劑。將干燥的磷脂懸浮在緩沖液中。通過超聲波處理和凝膠過濾制備成SVU，通過凍融和擠壓制備成LUV。通過有機磷酸酯試驗，假定磷磷脂重量比為25，測定磷脂濃度。制備PS/PC(25/75)或PS/PC(10/90)的SUV。在磷脂中加入圖1所示重量比的蛋白質。用Nelsestuen和lin，1977(同上)的方法，通過90°的光散射分析蛋白質-膜結合。簡而言之，測定單獨磷脂泡的光散射強度(I1)和加入蛋白質后的散射強度(I2)，并進行緩沖液背景和非結合蛋白校正。蛋白質-囊泡復合物分子量(M2)與單獨囊泡分子量(M1)之比可根據方程1中的關系來估算，其中，δn/δc是物質各自的折射指數。I2/I1=(M2/M1)2(δn/Sc2/δn/δc1)2(方程1)如果知道磷脂和蛋白質的濃度，可以估算被結合蛋白(P*PL)和游離蛋白(P)的濃度。用所述值，以及囊泡的最大蛋白結合能力(P*PLmax)(假定對所有蛋白均為1.0g/g)可由方程2得出蛋白質-膜相互作用的平衡常數，其中，所有濃度都以蛋白或蛋白結合位點摩爾數表示。KD=[P][P*PLma-P*PL]/[P*PL](方程2)評價5mM鈣時的結合情況，以M2/M1之比表示。圖1顯示野生型Ⅶa(空心圓)和ⅦQ11E33因子(實心圓)與PS/PC(25/75)膜，25μg/ml(分圖A)或PS/PC(10/90)膜，25μg/ml(分圖B)的結合。ⅦQ11E33的親和力比野生型蛋白高得多。與PS/PC(25/75)的結合是定量水平的，所以[蛋白質游離]基本為0。所以，無法從以上信息估算出Kd值。圖1中以牛Ⅹ因子的膜結合(實心三角)作為參照。牛Ⅹ因子是該家族中親和力最高的因子之一，2mM鈣時，與PS/PC(20/80)的Kd為40nM。McDonald等，1997，Biochemistry，365120-5127。根據蛋白質/磷脂之比0.55時(圖1)的結果所得牛Ⅹ因子的Kd是0.025μM。也測定了野生型和突變型Ⅶ因子與PS/PC(10/90)膜的結合(圖1B)。ⅦQ11E33的結合低于定量水平，這樣，可由方程3估算結合常數Kd=[蛋白質游離][結合位點游離]/[蛋白質結合](方程3)由方程4估算結合位點游離，假設最大M2/M1是1.0(即[結合位點總數]=[磷脂重量濃度/蛋白質分子量])。該家族內數種蛋白質的該值是相同的。參見McDonald等，1997，同上。=[結合位點總數]-[蛋白質結合](方程4)采用以上假設和蛋白質比磷脂0.37時的數據，牛Ⅹ因子的Kd是0.7μM，野生型Ⅶ因子的是5.5μM，ⅦQ11E33的是0.23μM。這樣，顯然，與野生型Ⅶ因子相比，ⅦQ11E33因子的膜結合親和力大大增強，為維生素K依賴性蛋白中的最高膜結合親和力之一。ⅦQ11E33因子的增強活化凝血的第一步涉及Ⅶ因子的活化。在含100nMsTF(得自Dr.WalterKisiel的高度純化的重組產品，Fiore等，1994，J.Biol.Chem.，269143-149)，36nMⅦQ11E33和PS/PC(25/75，22μg/ml)的溶液中進行Ⅶ自身活化。在不同時刻，加入0.15mg底物S-2288(Kabi)，通過405nm處的吸光度變化測定對硝基苯磷酸酯產物釋放速度，估計ⅦaQ11E33的活性。ⅦQ11E33制劑的最初活性低于完全活化ⅦaQ11E33活性的4％。已發現，作為活化底物，ⅦQ11E33比野生型Ⅶ因子好得多。圖2顯示ⅦQ11E33因子的自身活化。用方程5中的關系分析數據(即Fiore等，1994，同上的方程7)．ln[Ⅶa]t=ln[Ⅶa]0+kcat*y*t(方程5)ln[Ⅶa]t是t時刻的Ⅶa因子濃度，kcat是Ⅶa因子作用于Ⅶ的催化速度常數，y是Ⅶa位點的飽和分數。就野生型Ⅶa而言，以上關系和1μMsTF得到的kcat是0.0045/s，kcat/Km之比是7×103M-1s-1。參見Fiore等，1994，同上)。就酶VIIQ11E33而言，自身活化很快(圖2)，只能估計出kcat的下限。這是根據VIIa倍增時間25秒得出的(kcat=(ln2)/t1/2)。根據所得值(kcatmin=0.03/s)，該反應底物濃度(3.6×10-8M)，以及假設y=1.0，得出kcat/[S]值=8×105M-1s-1。這比VIIQ11E33的實際kcat/Km低得多，但比Fiore等，1994(同上)所估計的野生型VIIa因子/STF的kcat/Km高約100倍。因此，在凝血作用的活化步驟中，酶ⅦaQ11E33與底物ⅦQ11E33因子的組合優于野生型蛋白質組合。這提示在最低凝血條件下，ⅦQ11E33優于野生型酶。增強的ⅦaQ11E33活性Ⅶa因子一旦生成就活化Ⅹ因子或Ⅸ因子。Ⅶa因子活化牛Ⅹ因子(0.1μM)是在25℃，50mMTris-HCl緩沖液，pH7.5，含100mMNaCl，50mM鈣，不同量磷脂(PS/PC，25/75)和1mg/ml牛血清白蛋白中進行的。在0時加入Ⅶa因子(0.06nMⅦaQⅡE33或0.6nM野生型Ⅶa)，并在1，3和5分鐘時測定Ⅹa活性。將等份混合物(0.2ml)與含10mMEDTA和0.4mMS-2222(Kabi)(一種Ⅹa因子的產色底物)緩沖液混合。在BeckmanDV8分光光度計上測定405nm吸光度變化。由磷酸硝基苯反應產物的消光系數(1×104M-1cm-1)和該試驗條件下純化牛Ⅹa因子水解底物的速度33/秒計算產生的Ⅹa因子量。圖3比較了純化系統中野生型Ⅶa因子(空心圓)和ⅦaQ11E33(實心圓)活化Ⅹ因子的能力。同樣在此反應中，ⅦaQ11E33遠優于野生型Ⅶa因子。上述差異在低磷脂濃度下最大。在200μg/ml磷脂濃度下減少了兩倍。這可從膜濃度高引起野生型Ⅶa因子更大部分結合于膜的事實中預計到。還有，在接觸低磷脂條件下，ⅦaQ11E33功能的增強最大。ⅦaQ11E33的超級血凝作用用手動傾斜法在37℃進行凝血試驗，檢測血凝塊形成。人血漿(0.1ml)在37℃平衡1分鐘。在0.1ml緩沖液體積中加入各種試劑。在血漿中加入可溶性組織因子(50nM)和磷脂(PS/PC，10/90，75μg/ml)，加入圖4所示濃度(0.1-32nM)的Ⅶa因子。最后，加入0.1ml25mMCaCl2開始反應。測定血凝塊形成時間。大多數情況下，記錄重復樣品的平均值和標準偏差。圖4顯示野生型Ⅶa與ⅦaQ11E33在正常人血漿中的凝血時間。由sTF和加入磷脂泡支持凝血。內源性野生型Ⅶ因子的濃度約為10nM，對凝血時間幾乎沒有影響。有或沒有sTF時的背景凝血時間為120秒。在上述試驗條件下，ⅦaQ11E33的活性比野生型Ⅶa高約8倍。用缺乏Ⅷ因子的血漿得出類似結果，說明該系統中的主要凝血途徑與Ⅶa因子直接活化Ⅹ因子有關。總之，在膜囊泡和可溶性組織因子支持的促凝血活性方面，ⅦaQ11E33因子優于野生型Ⅶa。加或不加sTF的背景凝血時間都是2分鐘，說明野生型酶原在上述條件下幾乎沒有活性。與正常組織因子一起的促凝血活性測定正常人血漿中Ⅶa和/或ⅦQ11E33與sTF一起時的活性。該試驗中，內源性Ⅶ因子對凝血時間似乎沒有影響；有或沒有可溶性組織因子血漿的背景凝血時間都是2分鐘。在血漿中先加入可溶性組織因子(50nM最終濃度)和Ⅶa，然后加入鈣溶液。測定含不同水平Ⅶa或ⅦaQ11E33樣品的凝血時間。檢測了兩種人血漿制劑，即正常血漿和缺乏Ⅷ因子的血漿。用標準兔腦含鈣組織促凝血酶原激酶-HS(HS=高靈敏度)(SigmaChemicalCo.)分析正常組織因子支持的凝血作用。混合物含磷脂和膜-結合組織因子。兔腦促凝血酶原激酶-HS以緩沖液1∶100稀釋，用于Ⅶ(以正常人血漿形式加入，內含10nMⅦ因子)試驗和ⅦQ11E33(以純蛋白形式加入)試驗。將促凝血酶原激酶(0.2ml)加入血漿(0.1ml)開始反應，測定形成血凝塊所需時間。如生產商所述，還用全長促凝血酶原激酶進行了試驗。在最適人促凝血酶原激酶水平，野生型Ⅶ表現出正常水平的活性，約1500單位/mg。這比野生型Ⅶa因子(80，000單位/mg)低約25倍。ⅦQ11E33在標準試驗條件下的活性約為1500-3000單位/mg，只比野生型Ⅶ高2倍。當凝血條件亞最適時，野生型Ⅶ與ⅦQ11E33之間的差異明顯增大。圖5顯示含0.01倍正常促凝血酶原激酶水平的試驗中的凝血時間和酶原濃度。在所述條件下，ⅦQ11E33活性約為野生型Ⅶ因子的20倍。所以，在與許多體內情況相關的限制性凝血條件下，突變ⅦQ11E33效力更高尤其明顯。DEGR-ⅦaQ11E33的抗凝血活性用正常血漿和以緩沖液1∶10稀釋的人促凝血酶原激酶進行標準凝血試驗。如Sorenson，B.B.等，1997(同上)所述，以DEGR修飾ⅦaQ11E33因子的活性位點。圖6顯示在鈣緩沖液中，在加入血漿前與促凝血酶原激酶一起培養了15秒的DEGR-ⅦaQ11E33(0-4nm)的凝血時間。用手動傾斜法測定形式血凝塊所需時間。1nmDEGR-ⅦaQ11E33的凝血時間約為45秒。實施例2-ⅦQ11E33因子在大鼠體內的循環時間開始時，給2只巴比妥鈉麻醉的SpragueDawley大鼠(325-350g)注射36μgⅦQ11E33因子。通過事先插入了套管的頸靜脈進行注射。在圖7所示時刻，從事先手術插入了套管的頸動脈抽血。在缺乏Ⅶ因子的人血漿中加入1μl1∶10稀釋的大鼠血漿，根據該血漿的凝血時間估算循環血中的ⅦQ11E33因子量。用的是兔腦促凝血酶原激酶-HS(SigmaChemicalCo.)1∶100稀釋液。用實施例1所述的手動試管傾斜法評價凝血情況。測定ⅦQ11E33注射前血漿內的Ⅶ因子活性水平，將其作為空白扣除。以lognM表示循環血中的ⅦQ11E33因子濃度。在一個假設試驗中，第三只鼠接受手術和套管，但不接受ⅦQ11E33因子。在試驗過程(100分鐘)中，動物體內的Ⅶ因子活性水平沒有變化。在試驗最后，用過量戊巴比妥鈉殺死大鼠。在實驗全程中，大鼠表現正常，沒有凝血表現。所以，ⅦQ11E33因子不引起普遍性凝血，即使是在手術后大鼠中。ⅦQ11E33的循環壽命一般(圖7)，約40％蛋白質在約60分鐘內被清除，剩余蛋白的消失則更慢。這與牛凝血酶原從大鼠中清除的速度相似。Nelsestuen和Suttie，1971，Biochem.Biophys.Res.Commun.，45198-203。這比野生型重組Ⅶa因子好，后者在功能試驗中的循環半衰期是20-45分鐘。Thomsen，M.K.等，1993，Thromb.Haemost.，70458-464。這表明，ⅦQ11E33因子沒有被識別為異常蛋白，沒有因凝血激活而迅速破壞。它在動物體內，好象正常蛋白，具有標準循環壽命。實施例3-C蛋白膜位點和活性的增強雖然人C蛋白的膜親和力高約10倍，牛和人C蛋白的GLA區(氨基末端的44個殘基)氨基酸序列卻具有高度同源性。牛C蛋白第11位是脯氨酸，人C蛋白第11位則是組氨酸。考察了以組氨酸取代牛C蛋白第11位脯氨酸和以脯氨酸取代人C蛋白第11位組氨酸的影響。兩種蛋白中，第11位是脯氨酸的蛋白都表現出較低的膜親和力，在牛C蛋白中低約10倍，在人C蛋白中低約5倍。根據所用試驗，第11位是脯氨酸的活性人C蛋白(hAPC)活性比野生型hAPC低2.4-3.5倍。含組氨酸-11的牛APC活性比野生型APC高15倍。這表明突變能夠改善膜接觸和活性。C蛋白突變Dr.JohanStenflo提供了全長人C蛋白的cDNA克隆(臨床化學系，UniversityHospital，Malmo，Sweden)。Dr.DonaldFoster(ZymoGenetics，Inc.，USA)提供了牛C蛋白的cDNA克隆。牛C蛋白核苷酸序列的GenBank的登錄號是KO2435，NIDg163486，人C蛋白的是K02059，NIDg190322。用PCR法進行定點誘變。為了將人C蛋白內第11位組氨酸誘變成脯氨酸，合成以下寡核苷酸A，5’-AAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCCAAGCTT-3’(SEQIDNO7)(對應于載體pRc/CMV內的核苷酸860-895)，以在pRc/CMV和C蛋白之間產生一個HindIII位點；B，5’-GCACTCCCGCTCCAGGCTGCTGGGACGGAGCTCCTCCAGGAA-3’(SEQIDNO8)(對應于人C蛋白的氨基酸殘疾4-17，該序列內第8位氨基酸由人C蛋白內的誘變成牛C蛋白內的，見下劃線)。為了將牛C蛋白內第11位脯氨酸誘變成組氨酸，合成以下寡核苷酸A，(如上所述)；C，5’-ACGCTCCACGTTGCCGTGCCGCAGCTCCTCTAGGAA-3’(SEQIDNO9)(對應于牛C蛋白的氨基酸殘基4-15，第6位的氨基酸由牛C蛋白內的誘變成人C蛋白內的，以下劃線標記)；D，5’-TTCCTAGAGGAGCTGCGGCACGGCAACGTGGAGCGT-3’(SEQIDNO10)(對應于牛C蛋白的氨基酸殘基4-15，第7位的氨基酸由牛C蛋白內的誘變成人C蛋白內的，以下劃線標記)；E，5’-GCATTTAGGTGACACTATAGAATAGGGCCCTCTAGA-3’(SEQIDNO11)(對應于載體pRc/CMV中的核苷酸984-1019)，在pRc/CMV和C蛋白之間產生產生一個XbaⅠ位點。將人和牛C蛋白的cDNA克隆到表達載體pRc/CMV的HindⅢ位點和XbaⅠ位點。用完整的人C蛋白cDNA和引物A和B，PCR擴增5’末端至氨基酸-17的人C蛋白cDNA。PCR反應的體積是100μl，Tris-HCl緩沖液(10mMTris，25mMKCl，5mM(NH4)2SO4和2mMMgSO4，pH8.85)中含0.25μg模板DNA，四種三磷酸脫氧核糖核苷各200μM，引物各0.5mM和2.5UPwo-DNA聚合酶(BoehringerMannheim)。樣品PCR循環30輪，每輪94℃變性2分鐘，55℃退火2分鐘，72℃延長2分鐘。擴增后，DNA在含1mMEDTA的40mMTris-乙酸鹽緩沖液中電泳通過0.8％瓊脂糖凝膠。用JET質粒Miniprep-Kit(SaveenBiotechAB，Sweden)純化PCR產物。含相應突變的人C蛋白cDNA用HindⅢ和BsrBI剪切，然后克隆到經HindⅢ/XbaⅠ剪切并含有人C蛋白內BsrBI至3’末端片段的載體pRc/CMV中，產生帶突變的人C蛋白全長cDNA。用完整的人C蛋白cDNA和引物A和C，PCR擴增5’末端至氨基酸-11的牛C蛋白cDNA。用完整的人C蛋白cDNA和引物D和E擴增氨基酸-11至3’末端的牛C蛋白cDNA。用引物A和E，以上述兩cDNA片段作為模板，擴增含突變氨基酸的全長牛C蛋白cDNA。PCR反應條件與用于hAPC的相同。含相應突變的牛C蛋白cDNA用HindⅢ和Bsu36I剪切，將該HindⅢ/Bsu36I片段克隆到含牛C蛋白內Bsu36I至3’末端片段載體pRc/CMV中，產生含該突變的牛C蛋白全長cDNA。轉染前，通過DNA測序確認所有突變。細胞培養和表達將腺病毒轉染的人腎細胞系293培養在DMEM培養基中，其中補充了10％胎牛血清，2mML-谷胺酰胺，100U/ml青霉素，100U/ml鏈霉素和10μg/ml維生素K1。轉染用脂質轉染法進行。Felgner，P.L．等，1987，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，847413-7417。將2μgDNA稀釋在0.1ml含2mML-谷胺酰胺培養基的DMEM中。在0.1ml含2mML-谷胺酰胺培養基的DMEM中加入10μlLipofectin試劑(1mg/ml)。將DNA與Lipofectin混合，室溫下放置10-15分鐘。以含2mML-谷胺酰胺培養基的DMEM洗滌細胞單層(5cm培養皿中的鋪滿率為25-50％)兩次。將DNA/脂類混合物稀釋在1.8ml含2mML-谷胺酰胺培養基的DMEM中，加入細胞中，培養16小時。給予細胞2m含10％胎牛血清的完全培養基，恢復48-72小時，然后用胰蛋白酶處理，1∶5接種到含選擇培養基(含10％血清和400μg/ml遺傳霉素的DMEM)的10cm培養皿中。Yan，S.C.B.等，1990，Bio/Technology655-661。3-5周的選擇后，得到抗遺傳霉素的克隆。從每種DNA轉染中選取24個克隆，培養至鋪滿，用單克隆抗體HPC4(針對人C蛋白)和單克隆抗體BPC5(針對牛C蛋白)，以斑點印跡法檢測C蛋白表達。分離出產生大量蛋白的克隆，在10μg/ml維生素K1存在下培養至鋪滿。以目前的方法為基礎，加以修改，純化重組牛C蛋白及其突變體。Rezair，A.R.和Esmon，C.T.，1992，J.Biol.Chem.，26726104-26109。穩定轉化細胞的無血清條件培養基在4℃，5000rpm離心10分鐘。用0.45μm的硝酸纖維素濾膜(MicroFiltrationSysterms，Japan)過濾上清液。在293細胞的條件培養基中加入EDTA(最終濃度5mM)和PPACK(最終濃度0.2μM)，然后在室溫下用MilliporeConSepLC100(Millipore，USA)通過PharmaciaFFQ陰離子交換柱。用CaCl2梯度(起始溶液20mMTris-HCl/150mMNaCl，pH7.4；限制溶液20mMTris-HCl/150mMNaCl/30mMCaCl2，pH7.4)洗脫蛋白質。用透析和Chelex100處理去除CaCl2后，蛋白質重新吸附于第二FFQ柱，然后用NaCl梯度(起始溶液20mMTris-HCl/150mMNaCl，pH7.4；限制溶液20mMTris-HCl/500mMNaCl，pH7.4)洗脫。純化至此，根據SDS-PAGE測定，野生型和重組突變型牛C蛋白成為君質。用于純化野生型和重組突變性人C蛋白的第一柱與用于牛C蛋白的相同。采用Rezair和Esmon所述的層析法，對其進行了就S蛋白純化法所述的修改。Rezair，A.R.和Esmon，C.T.，1992，同上；He，Z.等，1995，Eur.J.Biochem.，227433-440。用斑點印跡法鑒定陰離子交換層析得到的含C蛋白組分。合并陽性組分，上樣到含Ca2+-依賴性抗體HPC-4的親和柱上。層析柱用20mMTris-HCl，150mMNaCl，pH7.4平衡，其中含5mM芐脒-HCl和2mMCaCl2。上樣后，用含1MNaCl的上述緩沖液洗柱。然后用含5mM芐脒-HCl的20mMTris-HCl，150mMNaCl和5mMEDTA，pH7.4洗脫C蛋白。純化后，先SDS-PAGE后銀染色估測所有人和牛重組C蛋白制劑的純度。用YM10濾膜(Amicon)濃縮蛋白，然后用緩沖液(50mMTris-HCl，150mMNaCl，pH7.4透析12小時，保存于-70℃。以280nm吸光度測定蛋白質的濃度。正常和突變C蛋白分子與膜的結合以實施例1所述方法制備LUV和SUV。如前文就Ⅶ因子所述，用入射光的90°光散射進行蛋白質膜結合定量(25μg/mlPS/PC(25/75)，5mM鈣(0.05Tris緩沖液-0.1MNaCl，pH7.5)。第11位是組氨酸的牛C蛋白與膜的相互作用比野生型蛋白強約10倍。代入方程2，得C-H11蛋白的KD為930±80nM，野生型C蛋白的是9200±950nM(圖8A)。親和力差異對應于25℃時的約1.4kcal/mol。實際上，牛C-H11蛋白的膜親和力與天然人C蛋白的(660nM，圖8B)幾乎相同。這說明，第11位的脯氨酸是人和牛蛋白膜結合位點之間差異的主要基礎。反向取代，即用脯氨酸取代人C蛋白的His-11，降低膜親和力(圖8B)。將以上數據代入方程2，得野生型人C蛋白的KD為660±90nM，人C-P11蛋白的為3350±110nM。引入脯氨酸的影響只略低于牛蛋白內的脯氨酸。脯氨酸-11對活性C蛋白活性的影響對野生型和突變型蛋白使用相同條件，通過凝血酶剪切產生活性C蛋白。約150μg的各種C蛋白制劑(1mg/ml)與牛凝血酶(3μg)混合，37℃培養5小時。將反應產物稀釋在0.025MTris緩沖液-0.05MNaCl中，上樣到1mlSP-SephadexC-50柱上。用1ml上述緩沖液洗柱，合并通過的洗液作為活性C蛋白。上樣到柱上的蛋白約有65-80％被回收。25℃蛋白酶水解S2366(0.1mM)測定APC的活性。將以上制劑與大規模生產得到的標準制劑比較。標準人APV由Dr.WalterKisiel提供。用于牛蛋白的標準制劑是大規模制備的凝血酶活化的APC制劑。正常和突變蛋白制劑的牛APC活性都相同(±5％)。用兩種牛APC制劑進行比較。凝血酶產生的人APC的活性是標準物的55-60％。該研究中的濃度以對S2366的活性為基礎，是標準物的相對值。根據生產商的說明，標準APTT試驗使用牛或人的血漿和標準APTT試劑(SigmaChemicalCo.)。或者，提供高度純化磷脂形成的囊泡形式磷脂。該試驗中，牛血漿(0.1ml)與高嶺土(0.1ml配制于0.05MTris緩沖液中，5mg/ml，pH7.5)或鞣花酸(0.1mM的緩沖液溶液)一起35℃培養5分鐘。加入0.1ml含磷脂和所示量APC的緩沖液啟動凝血作用，然后加入0.1ml25mM氯化鈣。所有試劑均配制在含0.05MTris緩沖液，0.1MNaCl，pH7.5的標準緩沖液中。要獲得與-H11突變體相同的影響，需要平均高14倍的野生型bAPC濃度。10nMbAPC-H11的凝血時間超過120分鐘。用此血漿，標準ATPP試劑(SigmaChemicalCo.)在35℃時的凝血時間是61秒。凝血時間是以手工技術記錄的。將磷脂量設計成試驗中的限制性成分，得到所示凝血時間。所用磷脂是SUV(最終試驗中45μg/0.4ml，PS/PC，10/90)或LUV(最終試驗中120μg/0.4ml，PS/PC，25/75)。在多個試驗中測定了活性C蛋白的抗凝血活性。圖9顯示對用限制性磷脂進行的APTT試驗的影響。在該試驗的條件下，凝血時間幾乎線性地降低，與磷脂濃度成反比。要獲得與牛APC-H11相同的效果，需要約多14倍的野生型牛APC。對PS/PC(25/75，LUV)膜重復圖9中的部分試驗。同樣，活性受磷脂限制，調節其濃度，得到360秒的對照凝血時間(120μg0.25％PS/0.4ml試驗)。要獲得與H11突變體相同的效果，需要約多15倍的野生型酶。最后，使用標準ATPP試劑((SigmaChemicalCo.，凝血時間50±2秒)。要使凝血時間倍增到102±5秒，需要約10.0±0.7nM野生型酶。2.2±0.1nM牛APC產生相同的效果。磷脂在標準試驗中不是限速成分，所以可能對膜親和力略有影響。圖8B顯示了人蛋白的結果。要將凝血時間延長到野生型APC的水平需要約2.5倍含脯氨酸-11的人APC。引入脯氨酸-11的影響較小，反映人蛋白之間膜親和力差異較小(圖9B)。Ⅴa因子的滅活用Nicolaes等，1996，ThrombosisandHaemostasis，76404-410所述方法分析Ⅴa因子的滅活。簡而言之，牛蛋白時，用0.05MTris，0.1MNaCl，1mg/ml牛血清白蛋白和5mM鈣，pH7.5將牛血漿稀釋1000倍。加入磷脂囊泡(5μ.g/0.24ml試驗)和5μl190nM凝血酶以活化Ⅴ因子。37℃培養10分鐘后，加入APC繼續培養6分鐘。加入牛凝血酶原(至最終濃度10μM)和Ⅹa因子(至最終濃度0.3nM)，37℃培養反應1分鐘。將20μl該活化反應的樣品加入含S2283底物(60μM)的0.38ml緩沖液(0.05MTris，0.1MNaCl，5nMEDTA，pH7.5)中。根據405nm吸光度改變測定凝血酶量(ε=1.0×104M-1S-1，凝血酶的kcat100/s)。人蛋白時，將缺乏S蛋白的人血漿(BiopoolCanadaInc.)稀釋100倍，加入人凝血酶活化Ⅴa因子，用研究牛蛋白所用試劑分析產生的Ⅴa因子。牛APC-H11滅活Ⅴa因子的活性比野生型強9.2倍(圖10A)。與膜結合(上文)一樣，人蛋白中脯氨酸-11的影響較小，野生型和P-11突變體之間的平均差異為2.4倍(圖10B)。用正常人血漿得到的結果與此相似。實施例4-鑒定維生素K依賴性蛋白膜接觸位點膜親和力原型多種人和牛C蛋白突變體以及其他維生素K依賴性多肽之間的比較得出一個假設的膜接觸位置原型。該靜電原型為蛋白一側表面上由結合鈣離子形成的正電核心被蛋白氨基酸的負電荷云所包圍。該蛋白質家族中成員越接近該靜電模式，其與膜的親和力就越高。磷脂囊泡，野生型牛C蛋白，蛋白質-膜相互作用研究，C蛋白的活化和定量，以及活性測定如實施例3所述。如下產生重組突變C蛋白。以PCR法進行定點誘變。合成以下寡核苷酸A，見實施例3所述。F5’-GCATTTAGGTGACACTATAGAATAGGGCCCTCTAGA-3’(SEQIDNO11)(對應于載體pRc/CMV中的氨基酸984-1019)，在pRc/CMV與C蛋白之間形成一個XbaI位點；G，5’-GAAGGCCATTGTGTCTTCCGTGTCTTCGAAAATCTCCCGAGC-3’(SEQIDNO12)(對應于牛C蛋白的氨基酸殘基40-27)；H，5’-CAGTGTGTCATCCACATCTTCGAAAATTTCCTTGGC-3’(SEQIDNO13)(對應于人C蛋白的氨基酸殘基38-27，該序列內的第6和第7氨基酸由QN突變成ED，見下劃線)；I，5’-GCCAAGGAAATTTTCGAAGATGTGGATGACACACTG-3’(SEQIDNO14)(對應于人C蛋白的氨基酸殘基27-38，該序列內的第6和第7氨基酸由QN突變成ED，見下劃線)；J，5’-CAGTGTGTCATCCACATTTTCGAAAATTTCCTTGGC-3’(SEQIDNO15)(對應于人C蛋白的氨基酸殘基38-27，該序列內的第7氨基酸由Q突變成E，見下劃線)；K，5’-GCCAAGGAAATTTTCGAAAATGTGGATGACACACTG-3’(SEQIDNO16)(對應于人C蛋白的氨基酸殘基27-38，該序列內的第6氨基酸由Q突變成E，見下劃線)。將牛和人C蛋白的全長cDNA克隆到載體pRc/CMV內HindⅢ和XbaⅠ位置。為了獲得牛突變C蛋白E33D34，如下進行靶DNA的PCR擴增。用完整牛C蛋白cDNA和引物A、C擴增含5’末端至氨基酸40的牛C蛋白cDNA。PCR反應條件與實施例3相同。對樣品進行30輪PCR，每輪94℃變性2分鐘，55℃退火2分鐘，72℃延長2分鐘。擴增后，DNA在含lmMEDTA的40nMTris-乙酸鹽緩沖液中，通過0.8％瓊脂糖凝膠電泳。用GenecleanⅢ試劑盒(BIO101，Inc.USA)純化PCR產物，用HindⅢ和BbsⅠ消化含相應突變的牛C蛋白PCR片段。將HindⅢ/BbsⅠ片段和人C蛋白片段(BbsⅠ-3’末端)克隆到載體pRc/CMV的HindⅡ與XbaⅠ位點，產生帶突變的全長牛C蛋白eDNA。以同樣方法，但以牛突變C蛋白H11作為PCR模板，產生牛C蛋白突變體H11E33D34。用完整人C蛋白cDNA和引物A，D，PCR擴增含5’末端至氨基酸38的人C蛋白cDNA。用完整人C蛋白cDNA和引物B，E，擴增含3’末端至氨基酸27的人C蛋白cDNA。以這兩段人C蛋白cDNA片段為模板，用引物A，B擴增含突變(E33D34)的全長C蛋白eDNA。由以下步驟獲得人C蛋白E33突變體用完整人C蛋白cDNA和引物A、F擴增含5’末端至氨基酸38的人C蛋白cDNA。用完整人C蛋白cDNA和引物B、G，擴增含3’末端至氨基酸27的人C蛋白cDNA。以這兩段cDNA片段為模板，用引物A、B擴增含突變(E33)的全長牛C蛋白cDNA。PCR混合物與程序如前文所述。用HindⅢ和SalⅠ剪切含相應突變的人C蛋白PCR產物，然后將該片段(HindⅢ-SalⅠ)與完整人C蛋白片段(SalⅠ-3’末端)一起克隆到載體pRc/CMV的HindⅡ與XbaⅠ位點，產生帶突變的全長人C蛋白cDNA。轉染前用DNA測序確認所有突變。如實施例3所述培養和轉染腺病毒轉染的人腎細胞系293。如實施例3所述純化人和牛的重組C蛋白。根據與標準膜的親和力，將維生素K依賴性蛋白分成4類(表4)。以下給出部分相關蛋白的氨基末端殘基作為參考，所述蛋白包括人C蛋白(hC)，牛C蛋白(bC)，牛凝血酶原(bPT)，牛Ⅹ因子(bⅩ)和人Ⅶ因子(hⅦ)，其中的Ⅹ是Gla(γ-羧基谷氨酸)或Glu。bPTANKGFLXXVRK11GNLXRXCLXX21PCSRXXAFXA31LXSLSATDAF41WAKY(SEQIDNO:17)bX:ANS-FLXXVKQ11GNLXRXCLXX21ACSLXXARXV31FXDAXQTDXF41WSKY(SEQIDNO:18)hC:ANS-FLXXLRH11SSLXRXCIXX21ICDFXXAKXI31FQNVDDTLAF41WSKH(SEQIDNO:1)bC:ANS-FLXXLRP11GNVXRXCSXX21VCXFXXARXI31FQNTXDTMAF41WSFY(SEQIDNO:2)hVII:ANA-FLXXLRP11GSLXRXCKXX21QCSFXXARXI31FKDAXRTKLF41WISY(SEQIDNO:3)表4電荷和親和力a較高的親和力值等于k解離/1×107M-1S-1；分母是其他蛋白的典型k結合。表4中，突變的維生素K依賴性多肽以粗體表示。總電荷包括7個鈣離子(+14)和氨基末端(+1)。Z蛋白因為其解離速度常數比其他蛋白慢100至1000倍，所以歸入I類。如果Z蛋白表現出一般結合速度常數(約107M-1S-1)，則KD將約為10-10M。Wei，G.J.等，1982，Biochemistry，211949-1959。后一親和力值可能是維生素K蛋白的最大親和力。Ⅳ類蛋白與Ⅲ類蛋白的區別在于脯氨酸-11，該殘基可能以非靜電方式改變親和力。雖然膜親和力與殘基1-34的凈負電荷之間沒有密切關聯，只考慮殘基5、11、29、33和34時，則發現了密切的關聯性(表4)。這幾個氨基酸位于蛋白質的表面。通過氨基酸取代將許多蛋白質塑造成凝血酶原結構，并用DelPhi程序測定了它們的靜電電勢。圖11顯示牛Z蛋白靜電電勢草圖。7，8，26，30，33，34和11位上的負電荷形成一個負電荷云，包圍著由鈣襯孔隙產生的陽離子核心(圖11)。蛋白質結構越接近于該結構，則其與膜的親和力越高。從野生型蛋白，突變蛋白和化學修飾蛋白都可以看到這一關聯性。通過檢查在其他蛋白質中所沒有的帶電基團，可以得出其他結構圖形。例如，牛凝血酶原的Lys-11和Arg-10在其附近形成高正電區；C蛋白和Ⅶ因子內的Gla-33缺乏降低這些蛋白區的負電性。所有情況中，最高親和力所對應的結構是正電核心完全被負電性蛋白表面所包圍，如Z蛋白所示。以上方式的例外是具有Pro-11和Ser-12的蛋白質(人C蛋白)，Pro-11通過結構效應降低親和力，Ser-12是獨特的不帶電殘基。為了進一步驗證靜電分布原型假設，通過定點誘變用Glu33Asp34取代牛C蛋白和人C蛋白的Gln33Asn34(SEQIDNO19)。Glu33應在蛋白合成過程中進一步修飾成Gla。上述改變將牛C蛋白的靜電電勢改變成了牛Ⅹ因子的靜電電勢。估計該突變蛋白的膜親和力將因為有脯氨酸-11而低于Ⅹ因子。實際上，牛突變C蛋白的膜親和力與牛凝血酶原的相似(圖12A)，略低于牛Ⅹ因子(表4)。更有趣的是，突變APC的凝血抑制強于野生型酶(圖12B，C)。結合實施例3牛C蛋白P11H突變體的結果顯示，改變第11，33和34位的氨基酸取代可產生各具不同膜親和力和活性的蛋白質家族。含E33和E33D34的突變人C蛋白的膜結合親和力略有升高(圖13A)。這些突變體的活性略低于野生型(圖13b)。牛C蛋白突變體的結果顯示，人蛋白內E33D34突變的無效可能是因為該蛋白內的H11和/或其他獨特氨基酸所致。圖14A顯示牛C蛋白的H11突變體與膜結合的親和力比野生型蛋白高約l0倍，E33D34突變體的親和力高約70倍，但三聯突變體H11E33D34只略強于H11突變體。以上關系也反映在由這些突變蛋白形成的APC活性上(圖14B)。以上結果說明，H11的存在降低E33D34對膜結合親和力的影響。以上結果顯示，引入E33D34并非對所有蛋白都適合。所以，要產生采用E33D34且膜親和力提高最大的人C蛋白，可能需要其他突變。牛蛋白所得結果顯示，組氨酸11可能是這一現象的主要原因。所以，在人C蛋白內，與E33D34一起，可將H11換成谷胺酰胺或其他氨基酸。可能影響親和力的另一氨基酸是第12位的絲氨酸，該氨基酸是人C蛋白獨有的氨基酸。上述其他改變應能得到膜親和力增強的蛋白質。還通過比較人和牛的Ⅹ因子檢驗了靜電原型。人Ⅹ因子內存在賴氨酸-11提示其親和力應低于牛Ⅹ因子。圖15所示結果證實了這一預計。早期研究顯示，牛和人凝血酶原片段1的三硝基苯磺酸(TNBS)修飾對膜親和力的影響較小(0-5倍)。Weber，D.J.等，1992，J.Biol.Chem.，2674564-4569；Welsch，D.J.等，1988，Biochemistry，274933-4938。反應條件造成氨基末端衍生，這一改變與膜親和力降低相關。Welsch，D.J.和NelsestuenD.L.，1988，Biochemistry，274939-4945。保護氨基末端的鈣存在下修飾蛋白質，使得TNBS修飾蛋白的膜親和力大大高于天然片段1。Z蛋白構成此原型這一提法的基礎是其解離速度常數，以及，普通結合速度產生的KD=10-10M。是否能達到該值不一定。可能，Z蛋白結合速度慢是因為不恰當的蛋白質折疊降低了膜結合構象濃度。如果能改變條件以改善蛋白質折疊，應該能提高Z蛋白的結合速度。實際上，改變pH提高Z蛋白的結合速度常數。這一現象的基礎可能與凝血酶原結構的特殊性有關，該結構使氨基末端(pH7.5時為+1)靠近鈣離子2和3。圖11中，是氨基酸末端的+1電荷形成了Ca-1正上方的弱正電區。Ca與氨基末端之間的電荷斥力使得蛋白折疊不穩定，可能對折疊穩定性低的蛋白構成嚴重問題。表5提供了上述原型的其他支持。它顯示了離子團距鍶離子1和8(對應于鈣離子1和凝血酶原SrⅩ光晶體結構中發現的另一個二價金屬離子)距離之間的關系。該圖式顯示，離子團越靠近上述金屬離子，它對膜親和力的影響越大。Arg-16例外，它為正電核心提供電荷。較高的親和力與所有其他位點上的負電荷相關。以上關聯也適用于GLA殘基。表5距Sr-1，8的距離和離子重要性<tablesid="table2"num="003"><table>距離(_)影響/離子位置原子aSr-1Sr-8對KD(KM)的作用(A.A-蛋白質)3(K-PT)ε-N22.121.7低或未知5(K-IX)對-C(F)20.120.8低或未知19(K/R-Ⅶ)C5(L)20.217.8低或未知22(K-Ⅸ)C4(P)17.018.5低或未知10(R)C6(R)16.812.9低或未知25(R-PT)C6(R)11.213.8低或未知24(Ⅹ/D-PC)0(S)8.112.0低或未知11(K-PT，hX，bS；Gla-PZ)ε-C(K)14.77.43-10倍b33(Gla)γ-C(E)11.67.53-10倍b34(D)O(S)15.312.13-10倍b29(R)對-C(F)7.58.43-10倍b16(R)C6(R)14.210.63-10倍cGla殘基d低重要性712.813.3+2(＜2)152016＜2(＜2)2019.417.8＜2(＜2)2117.2154(3)3311.67.5？e(＜2)高重要性88.710.9？e(20)263.69.5？e(50)</table></tables>a距離是從牛凝血酶原的該原子(括弧中是測定所用凝血酶原的殘基)到Sr-凝血酶原片段1結構中的鍶1和鍶8。Seshadri等，1994，Biochemistry331087-1092。b除16-R之外，陽離子都降低親和力，陰離子都增強親和力。cThariath等，1997，Biochem.J.322309-315。dGlu突變成Asp的影響，距離是γ-羧基-碳的平均值。KD(KM)來自Ratcliffe等，1993，J.Biol.Chem.26824339-45。e結合能力低，或引起凝聚，使得比較不準確。圖15C的結果顯示，pH9時Z蛋白的結合速度顯著提高，此時的一個氨基末端應該不帶電。以上數據得到的pH9時的速度常數比pH7.5時的高約12倍(圖15C)。其他實施例應該理解，雖然詳細描述了本發明，這些描述只是為了說明本發明而不是限定本發明的范圍，本發明的范圍由所附的權利要求界定。以下權利要求的范圍還包括本發明的其他內容，優點和修改。序列表<110>RegentsoftheUniversityofMinnesota<120>修飾的維生素K依賴性多肽<130>09531/002WO1<150>08/955，636<151>1997-10-23<160>35<170>Windows3.0版的FastSEQ<210>1<211>44<212>PRT<213>人<220><221>MODRES<222>(0)…(0)<223>Xaa=γ羧基谷氨酸或谷氨酸<400>1AlaAsnSerPheLeuXaaXaaLeuArgHisSerSerLeuXaaArgXaa151015CysIleXaaXaaIleCysAspPheXaaXaaAlaLysXaaIlePheGln202530AsnValAspAspThrLeuAlaPheTrpSerLysHis3540<210>2<211>44<212>PRT<213>牛<220><221>MODRES<222>(0)…(0)<223>Xaa=γ羧基谷氨酸或谷氨酸<400>2AlaAsnSerPheLeuXaaXaaLeuArgProGlyAsnValXaaArgXaa151015CysSerXaaXaaValCysXaaPheXaaXaaAlaArgXaaIlePheGln202530AsnThrXaaAspThrMetAlaPheTrpSerPheTyr3540<210>3<211>44<212>PRT<213>人<220><221>MODRES<222>(0)...(0)<223>Xaa=γ羧基谷氨酸或谷氨酸<400>3AlaAsnAlaPheLeuXaaXaaLeuArgProGlySerLeuXaaArgXaa151015CysLysXaaXaaGlnCysSerPheXaaXaaAlaArgXaaIlePheLys202530AspAlaXaaArgThrLysLeuPheTrpIleSerTyr3540<210>4<211>44<212>PRT<213>牛<220><221>MODRES<222>(0)...(0)<223>Xaa=γ羧基谷氨酸或谷氨酸<400>4AlaAsnGlyPheLeuXaaXaaLeuArgProGlySerLeuXaaArgXaa151015CysArgXaaXaaLeuCysSerPheXaaXaaAlaHisXaaIlePheArg202530AsnXaaXaaArgThrArgGlnPheTrpValSerTyr3540<210>5<211>45<212>PRT<213>人<220><221>MODRES<222>(0)...(0)<223>Xaa=γ羧基谷氨酸或谷氨酸<400>5TyrAsnSerGlyLysLeuXaaXaaPheValGlnGlyAsnLeuXaaArg151015XaaCysMetXaaXaaLysCysSerPheXaaXaaAlaArgXaaValPhe202530XaaAsnThrXaaArgThrThrXaaPheTrpLysGlnTyr354045<210>6<211>46<212>PRT<213>牛<220><221>MODRES<222>(0)...(0)<223>Xaa=γ羧基谷氨酸或谷氨酸<400>6TyrAsnSerGlyLysLeuXaaXaaPheValGlnGlyAsnLeuXaaArg151015XaaCysMetXaaXaaLysCysSerPheXaaXaaAlaArgXaaValPhe202530XaaAsnThrXaaLysArgThrThrXaaPheTrpLysGlnTyr354045<210>7<211>36<212>DNA<213>人造序列<220><223>ProteinCmutagenicoligonucleotide<400>7aaattaatacgactcactatagggagacccaagctt36<210>8<211>42<212>DNA<213>人造序列<220><223>C蛋白的誘變寡核苷酸<400>8gcactcccgctccaggctgctgggacggagctcctccaggaa42<210>9<211>36<212>DNA<213>人造序列<220><223>C蛋白的誘變寡核苷酸<400>9acgctccacgttgccgtgccgcagctcctctaggaa36<210>10<211>36<212>DNA<213>人造序列<220><223>C蛋白的誘變寡核苷酸<400>10ttcctagaggagctgcggcacggcaacgtggagcgt36<210>11<211>36<212>DNA<213>人造序列<220><223>C蛋白的誘變寡核苷酸<400>11gcatttaggtgacactatagaatagggccctctaga36<210>12<211>42<212>DNA<213>造序列<220><223>C蛋白的誘變寡核苷酸<400>12gaaggccattgtgtcttccgtgtcttcgaaaatctcccgagc42<210>13<211>36<212>DNA<213>人造序列<220><223>C蛋白的誘變寡核苷酸<400>13cagtgtgtcatccacatcttcgaaaatttccttggc36<210>14<211>36<212>DNA<213>人造序列<220><223>C蛋白的誘變寡核苷酸<400>14gccaaggaaattttcgaagatgtggatgacacactg36<210>15<211>36<212>DNA<213>人造序列<220><223>C蛋白的誘變寡核苷酸<400>15cagtgtgtcatccacattttcgaaaatttccttggc36<210>16<211>36<212>DNA<213>人造序列<220><223>C蛋白的誘變寡核苷酸<400>16gccaaggaaattttcgaaaatgtggatgacacactg36<210>17<211>45<212>PRT<213>牛<220><221>MODRES<222>(0)...(0)<223>Xaa=γ羧基谷氨酸或谷氨酸<400>17AlaAsnLysGlyPheLeuXaaXaaValArgLysGlyAsnLeuXaaArg151015XaaCysLeuXaaXaaProCysSerArgXaaXaaAlaPheXaaAlaLeu202530XaaSerLeuSerAlaThrAspAlaPheTrpAlaLysTyr354045<210>18<211>44<212>PRT<213>牛<220><221>MODRES<222>(0)...(0)<223>Xaa=γ羧基谷氨酸或谷氨酸<400>18AlaAsnSerPheLeuXaaXaaValLysGlnG1yAsnLeuXaaArgXaa151015CysLeuXaaXaaAlaCysSerLeuXaaXaaAlaArgXaaValPheXaa202530AspAlaXaaGlnThrAspXaaPheTrpSerLysTyr3540<210>19<21l>44<212>PRT<213>人<220><221>MODRES<222>(0)...(0)<223>Xaa=γ羧基谷氨酸或谷氨酸<400>19AlaAsnSerPheLeuXaaXaaLeuArgHisSerSerLeuXaaArgXaa151015CysIleXaaXaaIleCysAspPheXaaXaaAlaLysXaaIlePheGlu202530AspValAspAspThrLeuAlaPheTrpSerLysHis3540<210>20<60211>44<212>PRT<213>人<220><221>MODRES<222>(0)...(0)<223>Xaa=γ羧基谷氨酸或谷氨酸<400>20AlaAsnSerPheLeuXaaXaaLeuArgGlnSerSerLeuXaaArgXaa151015CysIleXaaXaaIleCysAspPheXaaXaaAlaLysXaaIlePheGlu202530AspValAspAspThrLeuAlaPheTrpSerLysHis3540<210>21<211>44<212>PRT<213>人<220><221>MODRES<222>(0)...(0)<223>Xaa=γ羧基谷氨酸或谷氨酸<400>21AlaAsnSerPheLeuXaaXaaLeuArgGluSerSerLeuXaaArgXaa151015CysIleXaaXaaIleCysAspPheXaaXaaAlaLysXaaIlePheGlu202530AspValAspAspThrLeuAlaPheTrpSerLysHis3540<210>22<211>44<212>PRT<213>人<220><221>MODRES<222>(0)...(0)<223>Xaa=γ羧基谷氨酸或谷氨酸<400>22AlaAsnSerPheLeuXaaXaaLeuArgAspSerSerLeuXaaArgXaa151015CysIleXaaXaaIleCysAspPheXaaXaaAlaLysXaaIlePheGlu202530AspValAspAspThrLeuAlaPheTrpSerLysHis3540<210>23<211>44<212>PRT<213>牛<220><221>MODRES<222>(0)...(0)<223>Xaa=γ羧基谷氨酸或谷氨酸<400>23AlaAsnSerPheLeuXaaXaaLeuArgHisGlyAsnValXaaArgXaa151015CysSerXaaXaaValCysXaaPheXaaXaaAlaArgXaaIlePheGln202530AsnThrXaaAspThrMetAlaPheTrpSerPheTyr3540<210>24<211>44<212>PRT<213>人<220><221>MODRES<222>(0)...(0)<223>Xaa=γ羧基谷氨酸或谷氨酸<400>24AlaAsnSerPheLeuXaaXaaLeuArgGlnGlySerLeuXaaArgXaa151015CysIleXaaXaaIleCysAspPheXaaXaaAlaLysXaaIlePheGlu202530AspValAspAspThrLeuAlaPheTrpSerLysHis3540<210>25<211>44<212>PRT<213>人<220><221>MODRES<222>(0)...(0)<223>Xaa=γ羧基谷氨酸或谷氨酸<400>25AlaAsnSerPheLeuXaaXaaLeuArgHisSerSerLeuXaaArgXaa151015CysIleXaaXaaIleCysAspPheXaaXaaAlaPheXaaIlePheGlu202530AspValAspAspThrLeuAlaPheTrpSerLysHis3540<210>26<211>44<212>PRT<213>人<220><221>MODRES<222>(0)…(0)<223>Xaa=γ羧基谷氨酸或谷氨酸<400>26AlaAsnAlaPheLeuXaaXaaLeuArgGluGlySerLeuXaaArgXaa151015CysLysXaaXaaGlnCysSerPheXaaXaaAlaArgXaaIlePheLys202530AspAlaXaaArgThrLysLeuPheTrpIleSerTyr3540<210>27<211>44<212>PRT<213>人<220><221>MODRES<222>(0)...(0)<223>Xaa=γ羧基谷氨酸或谷氨酸<400>27AlaAsnAlaPheLeuXaaXaaLeuArgAspGlySerLeuXaaArgXaa151015CysLysXaaXaaGlnCysSerPheXaaXaaAlaArgXaaIlePheLys202530AspAlaXaaArgThrLysLeuPheTrpIleSerTyr3540<210>28<211>44<212>PRT<213>人<220><221>MODRES<222>(0)...(0)<223>Xaa=γ羧基谷氨酸或谷氨酸<400>28AlaAsnAlaPheLeuXaaXaaLeuArgProGlySerLeuXaaArgXaa151015CysLysXaaXaaGlnCysSerPheXaaXaaAlaPheXaaIlePheLys202530AspAlaXaaArgThrLysLeuPheTrpIleSerTyr3540<210>29<211>44<212>PRT<213>人<220><221>MODRES<222>(0)...(0)<223>Xaa=γ羧基谷氨酸或谷氨酸<400>29AlaAsnAlaPheLeuXaaXaaLeuArgProGlySerLeuXaaArgXaa151015CysLysXaaXaaGlnCysSerPheXaaXaaAlaArgXaaIlePheAsp202530AspAlaXaaArgThrLysLeuPheTrpIleSerTyr3540<210>30<211>44<212>PRT<213>人<220><221>MODRES<222>(0)...(0)<223>Xaa=γ羧基谷氨酸或谷氨酸<400>30AlaAsnAlaPheLeuXaaXaaLeuArgGlnG1ySerLeuXaaArgXaa151015CysLysXaaXaaGlnCysSerPheXaaXaaAlaArgXaallePheGlu202530AspAlaXaaArgThrLysLeuPheTrpIleSerTyr3540<210>31<211>45<212>PRT<213>人<220><221>MODRES<222>(0)…(0)<223>Xaa=γ羧基谷氨酸或谷氨酸<400>31TyrAsnSerGlyLysLeuXaaXaaPheValAspGlyAsnLeuXaaArg151015XaaCysMetXaaXaaLysCysSerPheXaaXaaAlaArgXaaValPhe202530XaaAsnThrXaaArgThrThrXaaPheTrpLysGlnTyr354045<210>32<21l>45<212>PRT<213>人<220><221>MODRES<222>(0)...(0)<223>Xaa=γ羧基谷氨酸或谷氨酸<400>32TyrAsnSerGlyLysLeuXaaXaaPheValGluGlyAsnLeuXaaArg151015XaaCysMetXaaXaaLysCysSerPheXaaXaaAlaArgXaaValPhe202530XaaAsnThrXaaArgThrThrXaaPheTrpLysGlnTyr354045<210>33<211>45<212>PRT<213>人<220><221>MODRES<222>(0)...(0)<223>Xaa=γ羧基谷氨酸或谷氨酸<400>33TyrAsnSerGlyLysLeuXaaXaaPheValGlnGlyAsnLeuXaaArg151015XaaCysMetXaaXaaLysCysSerPheXaaXaaAlaPheXaaValPhe202530XaaAsnThrXaaArgThrThrXaaPheTrpLysGlnTyr354045<210>34<211>45<212>PRT<213>人<220><221>MODRES<222>(0)...(0)<223>Xaa=γ羧基谷氨酸或谷氨酸<400>34TyrAsnSerGlyLysLeuXaaXaaPheValGlnGlyAsnLeuXaaArg151015XaaCysMetXaaXaaLysCysSerPheXaaXaaAlaArgXaaValPhe202530XaaAspThrXaaArgThrThrXaaPheTrpLysGlnTyr354045<210>35<211>44<212>PRT<213>人<220><221>MODRES<222>(O)..．(0)<223>Xaa=γ羧基谷氨酸或谷氨酸<400>35AlaAsnSerPheLeuXaaXaaLeuArgGluGlySerLeuXaaArgXaa151015CysIleXaaXaaIleCysAspPheXaaXaaAlaLysXaaIlePheGlu202530AspValAspAspThrLeuAlaPheTrpSerLysHis3540權利要求1．一種維生素K依賴性多肽，含修飾GLA區，該修飾區增強所述多肽的膜結合親和力，使之高于對應的天然維生素K依賴性多肽，所述修飾GLA區具有至少一處氨基酸取代。2．根據權利要求1所述多肽，其中所述GLA區是氨基酸1至45。3．根據權利要求1所述多肽，其中所述氨基酸取代位于氨基酸11，12，29，33或34。4．根據權利要求3所述多肽，其中所述氨基酸取代位于氨基酸11，33或34。5．根據權利要求1所述多肽，其中所述多肽包括C蛋白或活性C蛋白。6．根據權利要求5所述多肽，其中所述氨基酸取代包括氨基酸33處的谷氨酸和氨基酸34處的天冬氨酸(SEQIDNO19)。7．根據權利要求6所述多肽，其中所述氨基酸取代還包括氨基酸11處的谷胺酰胺(SEQIDNO20)。8．根據權利要求6所述多肽，其中所述氨基酸取代還包括氨基酸11處的谷氨酸(SEQIDNO21)。9．根據權利要求7所述多肽，其中所述氨基酸取代還包括氨基酸12處的甘氨酸(SEQIDNO24或SEQIDNO35)。10．根據權利要求1所述多肽，其中所述多肽是Ⅶ因子或Ⅶa因子。11．根據權利要求10所述多肽，其中所述氨基酸取代包括氨基酸11處的谷胺酰胺和氨基酸33處的谷氨酸(SEQIDNO30)。12．根據權利要求1所述多肽，其中所述多肽是Ⅺ因子或Ⅸa因子。13．根據權利要求1所述多肽，其中所述多肽是活性位點被修飾的Ⅶa因子。14．根據權利要求13所述多肽，其中所述氨基酸取代包括氨基酸11處的谷胺酰胺和氨基酸33處的谷氨酸(SEQIDNO30)。15．根據權利要求1所述維生素K依賴性多肽，其中所述修飾GLA區包含一段如下氨基酸序列，它在鈣飽和狀態下形成的三級結構具有被負電荷云所包圍的陽離子核心。16．一種編碼維生素K依賴性多肽的分離的核酸，其中所述維生素K依賴性多肽具有修飾GLA區，該修飾區增強所述多肽的膜結合親和力，使之高于對應的天然維生素K依賴性多肽，所述修飾GLA區具有至少一處氨基酸取代。17．一種包含核酸載體的哺乳動物宿主細胞，所述載體編碼維生素K依賴性多肽，所述維生素K依賴性多肽具有修飾GLA區，該修飾區增強所述多肽的膜結合親和力，使之高于對應的天然維生素K依賴性多肽，所述修飾GLA區具有至少一處氨基酸取代。18．一種藥物組合物，包含藥學上認可的載體和抑制哺乳動物血凝塊形成有效量的維生素K依賴性多肽，其中所述維生素K依賴性多肽具有修飾GLA區，該修飾區增強所述多肽的膜結合親和力，使之高于對應的天然維生素K依賴性多肽，所述修飾GLA區具有至少一處氨基酸取代。19．一種藥物組合物，包含藥學上認可的載體和增強哺乳動物血凝塊形成有效量的維生素K依賴性多肽，其中所述維生素K依賴性多肽具有修飾GLA區，該修飾區增強所述多肽的膜結合親和力，使之高于對應的天然維生素K依賴性多肽，所述修飾GLA區具有至少一處氨基酸取代。20．一種用于治療血凝疾病的維生素K依賴性多肽，其中所述維生素K依賴性多肽具有修飾GLA區，該修飾區增強所述多肽的膜結合親和力，使之高于對應的天然維生素K依賴性多肽，所述修飾GLA區具有至少一處氨基酸取代。21．維生素K依賴性多肽在制造用于治療血凝疾病的藥物中的用途，其中所述維生素K依賴性多肽具有修飾GLA區，該修飾區增強所述多肽的膜結合親和力，使之高于對應的天然維生素K依賴性多肽，所述修飾GLA區具有至少一處氨基酸取代。22．一種減少哺乳動物血凝塊形成的方法，包括給予減少所述哺乳動物血凝塊形成有效量的維生素K依賴性多肽，其中所述維生素K依賴性多肽具有修飾GLA區，該修飾區增強所述多肽的膜結合親和力，使之高于對應的天然維生素K依賴性多肽，所述修飾GLA區具有至少一處氨基酸取代。23．一種增強哺乳動物血凝塊形成的方法，包括給予增強所述哺乳動物血凝塊形成有效量的維生素K依賴性多肽，其中所述維生素K依賴性多肽具有修飾GLA區，該修飾區增強所述多肽的膜結合親和力，使之高于對應的天然維生素K依賴性多肽，所述修飾GLA區具有至少一處氨基酸取代。全文摘要本發明提供具有增強膜結合親和力的維生素K依賴性多肽。這些多肽可用來調節哺乳動物的血凝塊形成。本發明還描述了調節哺乳動物血凝塊形成的方法。文檔編號C12N5/10GK1283231SQ98812581公開日2001年2月7日申請日期1998年10月20日優先權日1997年10月23日發明者G·L·內爾塞施圖恩申請人:明尼蘇達大學董事會