Ifnar2/1fn復合物的制作方法

專利名稱：Ifnar2/1fn復合物的制作方法
技術領域：
本發明涉及I型干擾素復合物，該復合物由人干擾素α/β受體(IFNAR2)胞外結構域和I型干擾素(IFNα，IFNβ和IFNω)的多肽序列組成。該復合物提高了穩定性，增強了效力，并延長了游離IFN在體內抗病毒、抗癌和免疫調節活性的藥物動力學。更具體地說，該復合物是一種融合蛋白，或是一種共價復合物或非共價復合物，它含有IFNAR2整個胞外結構域的多肽序列，或其任何能結合干擾素的亞基部分(subfraction)，該多肽序列與I型干擾素(IFNα、IFNβ、IFNω)或其生物活性亞基部分復合。
背景技術：
干擾素被分類成白細胞和成纖維細胞衍生的I型干擾素，或是促有絲分裂素誘導的或“免疫”II型干擾素(Pestka等人，1987)。通過分析序列身份和共同的生物學活性，I型干擾素包括干擾素α(IFNα)、干擾素β(干擾素β)和干擾素ω(IFNω)，而II型干擾素包括干擾素γ(IFNγ)。IFNα、IFNβ和IFNω基因簇集在9號染色體的短臂上(Lengyl，1982)。其上有至少25個非等位性IFNα基因，6個非等位性IFNω基因和一個IFNβ基因。認為所有這些基因均從一個共同的祖先基因進化而來。在不同的動物種類之間，IFNα基因相互間具有至少80％的序列相同性。IFNβ基因與IFNα有大約50％的序列相同性；IFNω基因與IFNα有70％同源(Weissman等人，1986；Dron等人，1992)。IFNα的分子量在17-23kDa之間(165-166氨基酸)，IFNβ在23kDa左右(166個氨基酸)，IFNω在24kDa左右(172個氨基酸)。
I型干擾素是多效細胞因子，它在宿主抵抗病毒和寄生蟲感染的防御機制中有活性，可作為抗癌細胞因子和免疫調節劑(Baron等人，1994；Baron等人，1991)。I型干擾素的生理性反應包括對正常的以及轉化的細胞有抗增殖活性；刺激淋巴細胞、天然殺傷細胞和吞噬細胞的細胞毒性活性；調節細胞分化；刺激I類MHC抗原的表達；抑制II類MHC；和調節各種細胞表面受體。在正常的生理條件下，IFNα和IFNβ(IFNα/β)由大多數人細胞低水平組成型分泌，加入各種誘導劑后可以上調其表達，這些誘導劑包括感染性因子(病毒、細菌、支原體和原生動物)、dsRNA和細胞因子(M-CSF、IL-1α、IL-2、TNFα)。I型干擾素的體內活性可用替代標記，新蝶呤，2′，5′寡腺苷合成酶以及β2微球蛋白監測(Alam等人，1997；Fierlbeck等人，1996；Salmon等人，1996)。
I型干擾素(IFNcα/β/ω)是通過一種細胞表面受體復合物來誘導特異性的生物學效應(如抗病毒，抗腫瘤和免疫調節活性)。I型IFN受體(IFNAR)是一種異質多聚受體復合物，由至少兩種不同的多肽鏈組成(Colamonici等人，1992；Colamonici等人，1993；Platanias等人，1993)。發現這些鏈的基因在第21號染色體上，其蛋白表達在大多數細胞表面(Tan等人，1973)。受體鏈最初命名為α和β，因為它們能分別被IFNαR3和IFNaRβ1單抗識別。最近，它們被重新命名，α亞基為IFNAR1，β亞基命名為IFNAR2。在大多數細胞中，IFNAR1(α鏈，Uze亞基)(Uze等人，1990)的分子量為100-130kDa，而IFNAR2(β鏈，βL，IFNα/βR)的分子量為100kDa。在某些類型的細胞(單核細胞系以及正常的骨髓細胞)中，已經鑒定出另一種受體復合物，即IFNAR2亞基(βS)被表達成分子量為51kDa的截短的受體。IFNAR1和IFNAR2 βS和βL亞基已經被克隆(Novick等人，1994；Domanski等人，1995)。IFNAR2 βS和βL亞基具有相同的胞外和跨膜結構域；然而，在細胞質區域它們只有前15個氨基酸有相同性。IFNAR2亞基單獨能結合IFNα/β，而IFNAR1亞基不能結合IFNα/β。當人IFNAR1受體亞基單獨轉染到鼠L-929成纖維細胞中后，除IFNα8/IFNαB外沒有人IFNα能結合細胞(Uze等人，1990)。人IFNAR2亞基在人IFNAR1亞基不存在下轉染到L細胞中后，能結合人IFNα2，結合的Kd約為0.45nM。當人IFNAR2亞基在人IFNAR1亞基存在下轉染時，可顯示出高親和性結合，其Kd為0.026-0.114nM(Novick等人，1994；Domanski等人，1995)。估計大多數細胞上存在500-20000個高親和力和2000-100000個低親和力IFN結合位點。盡管IFNAR1/2復合物(α/βS或α/βL)亞基能以高親和力結合IFNα，但是只有α/βL對看來是功能性信號傳遞受體。
將IFNARI和IFNAR2 βL亞基轉染到小鼠L-929細胞中，然后和IFNα2一起培育，這誘導了抗病毒狀態，啟動胞內蛋白磷酸化，并引起胞內激酶(Jak1和Tyk2)和轉錄因子(STAT1、2和3)激活(Novick等人，1994；Domanski等人，1995)。在相應的實驗中，IFNAR2 βS亞基的轉染不能啟動相似的反應。因此，IFNAR2 βL是在結合IFNAR2亞基時產生最大誘導作用的功能性活性(抗病毒反應)所需要的亞基。
除了膜結合細胞表面IFNAR形式外，在人尿和血清中也鑒定出一種可溶的IFNAR(Novick等人，1994；Novick等人，1995；Novick等人，1992；Lutfalla等人，1995)。從血清中分離出的可溶性IFNAR在SDS-PAGE上的表觀分子量為55kDa，而來自尿液的可溶性IFNAR的表觀分子量為40-45kDa(p40)。可溶性p40 IFNAR2的轉錄物以mRNA水平存在，包括IFNAR2亞基的幾乎整個胞外結構域，且羧基端有兩個新的氨基酸。在可溶性IFNAR2受體上有5個潛在的糖基化位點。可溶性p40IFNAR2顯示出結合IFNα2和IFNβ，并在體外抑制IFNα種類(“白細胞IFN”)和個別I型IFN之混合物的抗病毒活性(Novick等人，1995)。重組的IFNAR2亞基Ig融合蛋白顯示出能抑制各種I型IFN(IFNαA、IFNαB、IFNαD、IFNβ、IFNα Conl和IFNω)與Daudi細胞以及與α/βS亞基雙轉染的COS細胞的結合。
I型IFN信號傳導通道最近已被鑒定(Platanias等人，1996；Yan等人，1996；Qureshi等人，1996；Duncan等人，1996；Sharf等人，1995；Yang等人，1996)。導致信號傳導的最初行為認為是由于IFNα/βω與IFNAR2亞基結合，然后與IFNAR1亞基結合形成IFNAR1/2復合物所致(Platanias等人，1994)。IFNα/β/ω與IFNAR1/2復合物的結合導致激活兩種Janus激酶(Jak1和Tyk2)，認為這兩種酶使IFNAR1和IFNAR2亞基上的特異性酪氨酸磷酸化。一旦這些亞基磷酸化，STAT分子(STAT1、2和3)即磷酸化，從而導致STAT轉錄復合物發生二聚反應，然后該轉錄復合物定位于胞核，激活特異的IFN可誘導基因。
已經評價了I型IFN在人體內的藥物動力學和藥效學(Alan等人，1997；Fierlbeck等人，1996；Salmon等人，1996)。IFNβ的清除相當快，IFNβ的生物利用率比大多數細胞因子預計的要低。盡管已經在人體內評價了IFNβ的藥效學，但是還未建立起IFNβ的生物利用率與臨床效果之間的明確關系。在正常的健康志愿者中，單劑靜脈內(iv)快速注射重組CHO衍生的IFNβ(6 MIU)，結果導致在5分鐘內迅速分配，最終的半衰期約為5小時(Alam等人，1997)。隨后皮下(sc)或肌內(im)給予IFNβ，血清水平較平，只占全身劑量的大約15％。靜脈內、肌內或皮下給予IFNβ后的藥效學(通過PBMC中的2′5′-寡腺苷合成酶(2′，5′-AS)活性的變化來測定)在前24小時內升高，在隨后的4天內緩緩降低至基線水平。不論是何給藥途徑，其生物效應的程度和持續時間是相同的。
已經檢查了在肌內注射單劑6 MIU重組IFNβ后，兩個不同公司生產的IFNβ(REBIF-Serono和AVONEX-Biogen)的藥物動力學(PK)和藥效學(PD)(Salmon，1996)。監測IFNβ以及IFNβ替代標記新蝶呤的血清濃度隨時間而變的情況。兩種IFNβ制劑表現出相似的PK曲線，在12-15小時到達IFNβ的峰值血清水平，但是REBIF最大水平較低。在肌內注射后至少前36小時內，REBIF和AVONEX兩者的IFNβ水平維持升高，然后到第48小時降低至稍高于基線水平。新蝶呤的水平與RENBIF和AVONEX的曲線非常相似，在注射后44-50小時達到最大的新蝶呤水平，并維持升高直至注射后72小時，然后逐漸降低，144小時時降低至基線水平。
在人黑色素瘤患者中進行了IFNβ的多劑藥效學研究(Fierlbeck等人，1996)，IFNβ通過皮下途徑給予，每周以每劑3MIU給予3次，持續6個月。藥效學標記，2′，5′-AS合成酶、β2-微球蛋白、新蝶呤和NK細胞的激活在第二次注射(第4天)時達到峰值，在28天內降低并維持稍稍高于6個月時的水平。
總之，人體內I型干擾素的清除是迅速的。一種長期作用的干擾素制劑可能將導致臨床效果有所改善。
發明概述現在已經發現，由可溶性IFNAR與I型干擾素(IFN)復合所組成的I型干擾素復合物表現出比游離IFN穩定性提高，效力增強，以及延長的抗病毒、抗癌和免疫調節活性的體內藥物動力學。
因此，本發明提供了一種I型干擾素(IFN)復合物，它由人干擾素α/β受體(IFNAR)亞基胞外結構域以及I型干擾素的多肽序列組成，該復合物表現出比游離IFN穩定性提高，效力增強，和/或延長的抗病毒、抗癌和免疫調節活性的體內藥物動力學。較佳的，該復合物是IFNAR2亞基胞外結構域與任何I型干擾素或IFNAR1亞基和IFNα的復合物。
更具體地說，該復合物是一種融合蛋白、或一種共價復合物或非共價復合物，它含有IFNAR(尤其是IFNAR2)的整個胞外結構域、或是其任何結合干擾素的亞組分(subfraction)的多肽序列，該多肽序列與IFNα、IFNβ或IFNω或是其任何生物活性亞組分復合。
IFNAR應理解成任何如上所述的已知的胞外IFNAR受體，及其任何活性片段。IFNAR可以任選地與其它蛋白(例如免疫球蛋白如IgG)融合。IFN、IFNα、IFNβ和IFNω指目前確定的20種以上的I型干擾素中的一種，或是將來鑒定的其它任何I型干擾素。
在本發明的一個實施方案中，該復合物由IFNα或IFNβ以及通過化學鍵與其共價連接的IFNAR2組成。
另一個實施方案包含一種復合物，它由與IFNAR2非共價復合的IFNα或IFNβ組成。另一個實施方案還包括一種組合物，該組合物含有以任何比例存在的I型IFN和IFNAR2。如上所述的I型IFN與過量IFNAR2的制劑也包括在本申請的“復合物”之定義內。這兩個組分也可分開給予，從而在體內形成復合物。因此，在另一個實施方案中，該復合物是IFNAR2與IFN的混合物，它通過同時或先后共同給予IFNα或IFNβ以及可溶性IFNAR2來獲得。另外，可以給予IFNAR而不伴隨給予IFN，這樣IFNAR可能會在體內與體源性循環IFN形成復合物，從而增強了內源IFN的效果。
一個具體的實施方案是，該復合物由IFNα或IFNβ或IFNω與IFNAR2融合組成一個重組融合蛋白，IFN和IFNAR2部分可任選地通過一個靈活可屈曲的肽接頭分子來融合。該肽接頭在體內能斷裂或不能斷裂。
本發明還涉及編碼這種蛋白質的DNA，含有該DNA的載體，被這些載體轉化從而表達該融合蛋白的宿主細胞，以及通過培育這些宿主細胞然后分離其表達的融合蛋白來產生這些融合蛋白的方法。
本發明的另一個方面是用本發明的復合物來延長IFN的體內效果的方法，該方法可用來治療任何IFN能治療的疾病或狀況。
本發明的另一方面涉及IFNAR用作IFN制劑中的穩定劑。游離的IFNβ具有寡聚化的趨勢。當其與IFNAR、尤其是IFNAR2復合時，這種趨勢被阻止。目前的重組IFNβ制劑必須為酸性pH，這可能會在給藥時引起一些局部刺激。如果用IFNAR作為穩定劑的話，則可以配制成非酸性的組合物。
附圖簡述結合下列附圖將能更好地了解本發明，其中

圖1顯示了sIFNAR2或IFNAR2Ig(由hIFNAR2的胞外結構域與人IgGl鉸鏈區、CH2和CH3結構域融合組成)在IFNβ存在下依賴于劑量的抗病毒活性。
圖2顯示了在亞適劑量的IFNβ下sIFNAR2和IFNβ的抗病毒活性。在中等IFNβ劑量下揭示了IFNβ和sIFNAR2預先培育1小時后的協同增效的抗病毒活性。
圖3顯示了sIFNAR2和亞有效劑量的IFNβ(0.95IU/毫升)的抗病毒活性隨預先培育時間變化的情況。使WISH細胞接觸IFNβ(0.95IU/毫升亞有效劑量)和sIFNAR2，然后預先培育指定的時間。僅僅在預先培育4小時后就觀察到有協同增效的抗病毒活性。抗病毒活性通過VSV攻擊48小時后MTT轉變來確定。在亞治療水平的IFNβ下，IFNAR2/IFN復合物的形成導致了增強的抗病毒活性。
圖4顯示了人IFNβ預先和sIFNAR2培育后增強的抗病毒活性。
圖5顯示了人IFNβ與sIFNAR結合后增強的抗病毒活性對IFNAR2是特異的，對其它蛋白質沒有特異性。
圖6顯示了經ELISA測得的人IFNβ和IFNβ/IFNAR2復合物在小鼠中的藥物動力學比較結果。
圖7顯示了經生物試驗測得的人IFNβ和IFNβ/IFNAR2復合物在小鼠中的藥物動力學比較結果。
圖8顯示了經ELISA測得的人IFNα和IFNα/IFNAR2復合物在小鼠中的藥物動力學比較結果。
圖9顯示了經生物試驗測得的人IFNα和IFNα/IFNAR2復合物在小鼠中的藥物動力學比較結果。
圖10顯示了n＝2 IFNAR2/IFNβ融合蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO14)。(GGGGS)2(SEQ ID NO14的殘基240-249)接頭用下劃線表示。
圖11的凝膠顯示了pCMV-IFNAR2/IFNβ的限制性酶切分析；10％PAG，泳道3-7BamHI/XhoI消化物；泳道2SmaI/XhoI消化物；泳道1pBR322 DNA-MspI消化物標記；泳道2pCMV-IFNAR2/IFNβ，0GS；泳道31GS；泳道42GS；泳道53GS；泳道64GS；泳道75GS；泳道8φX174 RFDNA HaeIII消化物標記。
圖12是IFNAR2/IFNβ表達載體的限制性內切核酸酶圖譜。
圖13是IFNAR2/IFNβ融合蛋白的Western印跡分析。泳道1，不含接頭的IFNAR2/IFNβ構建物；泳道2，含有一個Gly4Ser(SEQ ID NO1)接頭的IFNAR2/IFNβ構建物；泳道3，含有兩個Gly4Ser(SEQ ID NO1)接頭的IFNAR2/IFNβ構建物；泳道4，含有三個Gly4Ser(SEQ ID NO1)接頭的IFNAR/IFNβ構建物；泳道5，含有四個Gly4Ser(SEQ ID NO1)接頭的IFNAR/IFNβ構建物；泳道6，含有五個Gly4Ser(SEQID NO1)接頭的IFNAR/IFNβ構建物；圖14顯示了CHO細胞上清液中表達的內部融合(interfusion)分子的抗病毒活性，并標準化成IFNβ標準活性。
圖15A-B顯示了靜脈內注射IFNAR2后所給予的IFNβ的藥物動力學。IFNβ單獨注射，或作為IFNAR復合物注射，或在分開靜脈內注射sIFNAR2后立即注射。在感染后指定時間用IFNβ特異性ELISA(圖15A)和WISH抗病毒試驗中的生物活性(圖15B)來評價血清半衰期。
圖16顯示了與單獨給予通用IFN或對照相比的保護作用，表示成各種劑量的“通用”IFN(人IFNα/D)與sIFNAR2的復合物的細胞毒性百分數。
圖17顯示了在靜脈內快速注射單劑內部融合物GS5或單獨的hIFNβ后，IFNβ的血清濃度隨時間的變化情況。
較佳實施方案詳述下面將詳細描述本發明的IFNAR/IFN復合物以及產生該復合物所需的技術。對于大多數結果而言，選擇IFNβ作為非限制性實施例。
融合蛋白。將IFNAR2的C端或其任何與干擾素結合的亞序列與IFNβ的N端或其生物活性片段融合，要求兩個分子之間的橋連距離最短。還可制備反構建物，使IFNβ的C端或其片段與IFNAR2的N端或其亞序列融合。
從IFNAR2/IFNβ復合物的分子模型來看，估計在活性復合物模型中受束縛的IFNAR2 C端胞外結構域與IFNβN-端之間的距離約為80埃。為了工程改造一個能維持活性的IFNAR2/IFNβ復合物，可以采用一個柔性的肽接頭，例如Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(GGGGS)(SEQ ID NO1)重復序列。或者，接頭可以是可屈曲的，是血清、膜結合和/或細胞蛋白酶蛋白水解的靶。血清蛋白酶斷裂位點的一個例子是，經工程改造的IFNAR2/IFNβ復合融合物可以具有Xa因子斷裂位點。Xa因子切割凝血酶原的Arg273和Arg322位，它具有四肽識別信號Ile-Glu-Glu-Arg(SEQ ID NO2)(Nagai等人，1984)。因子Xa本身是由各種激活劑從內在和外在途徑產生的，包括組織因子，它由血管內皮細胞、巨噬細胞和中性粒細胞釋放。
因子Xa可作用于接頭區域中含有Xa因子識別序列的sIFNAR2/IFN融合蛋白，并釋放IFNAR2/IFN復合物，使該復合物起非共價復合物的作用。
或者，IFNAR2/IFNβ復合融合物可以具有一個細胞膜蛋白酶(如肝蛋白酶hepsin)斷裂位點。肝蛋白酶是一種51kDa的膜結合絲氨酸蛋白酶酶原，在肝組織中高水平表達，但也發現存在腎、胰、肺、甲狀腺、垂體和睪丸中。已知被肝蛋白酶斷裂的序列是VII因子中的Arg152-Ile153肽鍵。肝蛋白酶涉及腫瘤細胞上凝血酶的形成(Kazam等人，1995)。
肝蛋白酶可作用于接頭區域中含有肝蛋白酶識別序列的sIFNAR2/IFN融合蛋白，并釋放IFNAR2/IFN復合物，從而使該復合物能以非共價的方式起作用。
或者，IFNAR2/IFNβ融合復合物也可具有胞內蛋白酶切割位點。壞死和凋亡細胞釋放出各種蛋白酶。其中包括蛋白酶類(caspases)(白介素1β轉化酶樣蛋白酶)、金屬蛋白酶、溶酶體蛋白酶(如組織蛋白酶B)和彈性蛋白酶。彈性蛋白酶由粒細胞在疾病狀態(如敗血癥)期間釋放，對于氨基酸斷裂序列具有寬的特異性，與胰蛋白酶同族(Ertel等人，1994；Szilagyi等人，1995)。
胞內蛋白酶可作用于接頭區域內含有胞內蛋白酶識別序列的sIFNAR2/IFN融合蛋白并釋放該IFNAR2/IFN復合物，從而使該復合物作為非共價復合物起作用。
實際上，已經制得了融合蛋白構建物的幾個例子，其中sIFNAR2(P40-ESEFS)的C端與IFNβ(MSY)的N端通過柔性的接頭連接。肽接頭的例子如下ESEFS(GGGGS)nMSY，其中n＝5(SEQ ID NO3)，4(SEQ ID NO4)，3(SEQ ID NO5)，2(SEQ ID NO6)，或1(SEQ ID NO7)；ESEFS(hCG-CTP)MSY，其中hCG-CTP＝SSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ(SEQ ID NO8)；ESEFS(EFM)nMSY，其中n＝5(SEQ ID NO9)，4(SEQ ID NO10)，或3(SEQ ID NO11)；ESEFS(EFGAGLVLGGQFM)nMSY，其中n＝I(SEQ ID NO12)，或2(SEQ ID NO13)，以及使復合物模型中IFNAR2結合位點和IFNβ之間有一定距離且在干擾素和受體部分之間不形成免疫原性表位的其它接頭。較佳的，這些接頭的長度可高達約30個氨基酸。
共價復合物。產生化學交聯分子的一個例子是使可生物降解的接頭(如聚乙二醇(PEG))與IFNAR2中存在的或工程改造入(利用氨基酸替換，例如將Ser210替換成Cys，或將Asn89替換成Cys(定點誘變))的半胱氨酸反應，從而定點修飾該IFNAR2。可以工程改造下列構建物IFNAR(S210C)-PEGn-IFNβ(Cys17)，其中n＝2000，5000或10000道爾頓，或是IFNAR(N89C)-PEGn-IFNβ(Cys17)。
在兩個不同(任選地工程改造)部分的Cys之間形成共價二硫鍵也在本發明的范圍內。
非共價復合物。使人IFNAR2在使活性復合物產生最大化的條件下與IFNβ復合。如實施例中所報道的，在體外，需要2.5毫微克IFNAR2與1個國際單位(IU)的IFNβ的最適比例來產生最大活性的復合物。使具有體內活性的活性復合物產生最大化的IFNAR2與IFNβ的最適比例目前正在確定，但是看來該最適比例取決于IFNβ的濃度。因此，例如，在每天每只小鼠2×104IU IFNβ的濃度下，增強抗腫瘤活性的IFNAR2IFNβ的最適比例為每皮克IFNβ2.5毫微克IFNAR2，而在每天每只小鼠5×104IUIFNβ的濃度下，每皮克IFNβ0.3毫微克IFNAR2是最適的。用來使體外產生活性復合物最大的同一比例可導致IFN在體內的藥物動力學延長。
較佳的，用來產生復合物的IFNAR2和IFNβ是重組分子。在體外抗病毒試驗中，與單用IFNβ的活性相比，干擾素/受體復合物表現出增強的活性。使恒定濃度的IFNβ與各種濃度的重組sIFNAR2混合，將該混合物(IFNAR2/IFN復合物)加入WISH細胞(人羊膜細胞)中。然后用皰疹性口腔炎病毒(VSV)攻擊這些WISH細胞，監測培育48小時后的細胞存活程度，作為IFN的抗病毒活性。在每個實驗中，在恒定量的IFNβ中加入IFNAR2導致在IFNAR2與IFN最適比下對VSV攻擊時細胞存活以劑量依賴方式增加。這些結果證實IFNAR2和IFNβ的復合物在抗病毒試驗中表現出比游離IFNβ增強的活性。該結果的實踐含義是，對于IFN本身具有活性的各種治療適應癥，IFNAR2/IFNβ復合物比游離的IFN具有更高的效力和更強的活性。這些適應癥包括游離的IFN能在其中顯示出某些治療活性(如抗病毒、抗癌和免疫調節活性)的適應癥。預計IFNAR2/IFN復合物將憑借其更高的效力、增強的活性和/或改進的藥物動力學(即半衰期)而在治療病毒、腫瘤和免疫疾病中更為有效。
在體內給予時，干擾素受體復合物增強了IFN的生物利用率、藥物動力學和/或藥效學，從而提高了IFN的抗病毒、抗癌和免疫調節性能。
通過預先形成IFN/IFNAR非共價復合物，同時給予游離的IFN和IFNAR，按次序給予IFN或IFNAR組分，給予IFN/IFNAR共價復合物或給予IFNAR/IFN融合蛋白，可以獲得由復合物介導的增強的IFN生物利用率。
在另一個實施方案中，還可通過單獨給予IFNAR組分而不加任何IFN來增強生物利用率。IFNAR將在體內與內源IFN形成“復合物”，從而增強內源IFN的生物利用率、藥物動力學和/或藥效學。這特別適合用來治療患有天然誘導產生天然IFN的疾病或癥狀的患者，因為IFN早已處于循環中并發揮著其抵抗這些疾病或病癥的天然作用。加入的IFNAR將增強該天然IFN的效果。
用于本發明的較佳的分子具有天然IFN和IFNAR的序列。該天然序列是天然存在的人IFN或IFNAR的序列。這些序列是已知的，很容易在文獻中找到。天然存在的等位變化也被認為是天然的序列。
本發明還涉及本發明上述IFNAR2/IFN復合物的類似物，這些類似物基本上保留了與該復合物相同的生物活性，基本上具有天然IFNAR2和IFN的序列。這些類似物可以這樣制得，除去、加入多達約30個氨基酸殘基或用復合物中IFNAR2和/或IFN部分中的其它殘基替換，此類修飾基本上沒有改變嵌合蛋白類似物相對于復合物本身的生物活性。各種類似物相互之間以及和基礎的復合物分子(基本上只具有天然存在的IFNAR2和IFN序列)之間最為不同之處是連接復合物中兩個部分的接頭肽位點處。如上所述，這種接頭的長度宜多達約30個氨基酸，其作用是使復合物中的IFNAR2和IFN部分相互分開。對于這種接頭，應當仔細選擇其序列(也要在適當的標準試驗中用生物學方法測試該類似物)，從而使其(例如)不會導致復合物發生不正確的折疊，這種不正確的折疊會使其滅活或沒有增強的活性，或使復合物類似物具有免疫原性，從而在受治療的患者體內產生針對該接頭序列的抗體，結果使該類似物至少在中期或長期藥劑治療中無效。至于本發明復合物的上述類似物，它們是這樣一些類似物在本發明的基礎復合物中有一個或多個、最多約30個氨基酸殘基被不同的氨基酸殘基替代，或缺失，或者，在本發明復合物(基本上只具有天然的IFNAR2/IFN序列)的原始序列中加入一個或多個、最多約30個氨基酸殘基而沒有顯著改變所得產物活性(與本發明的基礎復合物相比)。這些類似物可用已知的合成方法和/或定點誘變技術或適用于此的其它任何已知技術來制得。
任何此類類似物所具有的氨基酸序列應足以復制IFNAR2/IFN基礎復合物的序列，從而具有與其基本上相似的活性。因此，可以用常規實驗來確定任何給定的類似物是否具有與本發明的基礎復合物基本相同的活性和/或穩定性，這些實驗方法包括對各種此類類似物進行下文實施例2-7所述的生物活性和穩定性測試。
可用于本發明的復合物的類似物或其核酸編碼序列，包括一組有限的基本對應的序列作為替換的肽或多核苷酸，它們可由本領域普通技術人員根據本文的指導無需過多實驗即可通過常規手段獲得。關于蛋白質化學性質和結構的詳細描述參見Schulz.等人，《蛋白質結構原理》Springer-Verlag，New York(1978)；和Creighton，T.E.，《蛋白質結構和分子性質》，W.H.Freeman & Co，San Francisco(1983)，這些文獻均納入本文作參考。關于核苷酸序列替換的描述，例如密碼子偏好，參見Ausubel等人(1987，1992)§§A.1.I-A.1.24，和Sambrook等人(1987，1992)，§§6.3和6.4，附錄C和D。
本發明的類似物中較佳的變化是稱為“保守”替換的那些變化。在具有基本上天然存在的IFNAR2和IFN序列的復合物中，保守性氨基酸替換可包括一組內的同義氨基酸，它們具有足夠相似的理化性能，組員之間的替換將保留該分子的生物功能(Grantham，1974)。顯然，在上述序列中還可進行氨基酸的插入或缺失而不改變其功能，特別是如果插入和缺失只涉及幾個氨基酸(例如低于30個，較佳的低于10個)，且沒有除去或替換對功能構象關鍵的氨基酸(如半胱氨酸殘基)(Anfinsen，1973)。這種缺失或插入所產生的類似物也在本發明的范圍內。
較佳的，同義氨基酸組是表I中所定義的那些。更佳的，同義氨基酸組是表II中所定義的那些；最佳的，同義氨基酸組是表III中所定義的那些。
表I較佳的同義氨基酸組
表II更佳的同義氨基酸組
表III最佳的同義氨基酸組
在蛋白質中產生氨基酸替換用來獲得用于本發明的IFNAR2/IFN復合物之類似物的例子包括任何已知的方法步驟，如美國專利RE 33,653；4,959,314；4,588,585和4,737,462(授予Mark等人)；5，116,943(授予Koths等人)；4,965,195(授予Namen等人)和5,017,691(授予Lee等人)中描述的步驟，以及美國專利4,904,584(Shaw等人)中描述的賴氨酸替換的蛋白質。
在本發明的另一個較佳的實施方案中，用于本發明的復合物的任何類似物所具有的氨基酸序列基本上對應于本發明上述的基礎復合物的氨基酸序列。術語“基本上對應于”包括相對于基礎復合物的序列有少量變化、但不影響其基礎性質(尤其是抑制癌細胞增殖或促進骨髓移植能力)的類似物。通常認為在“基本上對應”該術語范圍內的變化類型是可用常規誘變技術對編碼本發明復合物的DNA產生的那些變化，該技術產生了少量的變化，并以上述方式篩選所需的活性。
較佳的，復合物的IFNAR2部分將具有一個核心序列，該序列與天然序列或其生物活性片段的序列相同，或是其變體，該變體的氨基酸序列與天然氨基酸序列至少有70％相同性、且保留了天然氨基酸序列的生物活性。更佳的，該序列與天然序列的相同性至少為85％，至少為90％，或最佳的，至少為95％。
關于復合物的IFN部分，可采用的核心序列是天然序列、或其生物活性片段，或其變體，該變體的氨基酸序列與其的相同性至少為70％，更佳的至少為85％或至少為90％，最佳的為至少95％。這些類似物必須保留天然IFN序列或其片段的生物活性，或具有下述的拮抗劑活性。
本文所用的術語“序列相同性”指按照以下的方式比較序列。采用GeneticComputing Group′s GAP(全球序列對比程序)第9版進行序列對比，采用默認(BLOSUM62)的矩陣(數值為-4到+11)，敞開空隙罰分為-12(空隙的第一個零值)，延伸空隙罰分為-4(空隙中每個附加連續零值)。序列對比后，將匹配的數目表示成所要求序列中的氨基酸數目的百分數，計算出相同性百分數。
本發明的類似物還可按照下列步驟來測定。對于復合物的IFNAR部分或復合物的IFN部分，其天然序列的DNA是現有技術中已知的，這可在本說明書的背景技術章節中所引用的文獻中找到，或很容易由本領域普通技術人員確定。在高度嚴謹或中度嚴謹條件下與天然DNA或RNA之互補序列雜交的任何核酸(如DNA或RNA)所編碼的多肽也被認為包括在本發明的范圍內，只要該多肽保留了天然序列的生物活性，或在IFN情況下保留了生物活性或具有拮抗劑活性。
嚴謹條件與雜交實驗中所用的溫度、一價陽離子的摩爾濃度以及雜交溶液中甲酰胺的百分數呈函數關系。為了測定任何一組給定條件涉及的嚴謹度，首先采用Meinkoth等人，(1984)的方程式來測定100％相同性的雜交物的穩定性，該穩定性表示成DNA-DNA雜交物的解鏈溫度TmTm＝81.5℃+16.6(LogM)+0.41(％GC)-0.61(％form)-500/L，其中M是一價陽離子的摩爾濃度，％GC是DNA中G和C核苷酸的百分數，％form是雜交溶液中甲酰胺的百分數，L是雜交物中堿基對的長度。對于Tm從100％相同性的雜交物的計算值每下降1℃，允許錯配的量增加約1％。因此，如果對于任何給定雜交實驗，在指定的鹽和甲酰胺濃度下所用的Tm比根據Meinkoth方程式計算出的100％雜交的Tm低10％，則即使有高達約10％的錯配，仍會發生雜交。
在這里，高度嚴謹的條件能耐受約15％的序列差異，而中等嚴謹條件能耐受約20％的序列差異。高度嚴謹(比雜交物計算出的Tm低12-15℃)和中等嚴謹(比雜交計算出的Tm低15-20℃)條件的非限制性例子是，在低于雜交所計算出的Tm的合適溫度下采用2X SSC(標準檸檬酸鹽溶液)和0.5％ SDS的洗液。該條件的極限嚴謹度主要取決于洗滌條件，尤其當所用的雜交條件是允許較不穩定的雜交和穩定的雜交一起形成的雜交條件。然后用較高嚴謹度的洗滌條件除去較不穩定的雜交物。可以和上述的高度嚴謹至中等嚴謹洗滌條件一起使用的常用雜交條件是在6X SSC(或6XSSPE)、5X Denhardt′s試劑、0.5％SDS、100微克/毫升變性的片段化鮭精DNA的溶液中、低于Tm約20-25℃的溫度下進行雜交。如果采用混合的探針，則宜采用四甲基氯化銨(TMAC)來代替SSC(Ausubel，1987，1998)。
本文所用的術語“功能性衍生物”包括用本領域已知的方法從殘基側鏈上的官能團或N-或C-端基團制得的衍生物，它們均包括在本發明的范圍內，只要它們是藥學上可接受的，即它們如本文所述的那樣不破壞復合物相應蛋白的生物活性，且沒有賦予含有該衍生物的組合物或由其制得的復合物毒性。衍生物可以具有化學基團，如糖類或磷酸殘基，只要這種片段具有相同的生物活性并且是藥學上可接受的。
例如，衍生物可包括羧基基團的羧基脂肪族酯，羧基的酰胺(通過與氨或伯氨或仲胺反應獲得)，氨基酸殘基的游離氨基與酰基部分(例如烷酰基或碳環芳酰基)形成的N-酰基衍生物，或游離的羥基(例如絲氨酰或蘇氨酰殘基)與酰基部分形成的O-酰基衍生物。這些衍生物還包括，例如，聚乙二醇側鏈，它可遮蔽抗原性位點，并延長復合物或其部分在體液中的停留時間。
術語“衍生物”只包括那些沒有一個氨基酸變成20種常見的天然氨基酸中的某一種氨基酸的衍生物。
本文的術語“鹽”指本發明復合物或其類似物的羧基鹽以及氨基的酸加成鹽。羧基基團的鹽可用本領域已知的技術制得，其包括無機鹽，例如鈉、鈣、銨、鐵或鋅鹽等，以及和有機堿(如胺(三乙醇胺)、精氨酸或賴氨酸、哌啶、普羅卡因等)形成的鹽。酸加成鹽例如包括與無機酸(如鹽酸或硫酸)形成的鹽，以及和有機酸(例如乙酸或草酸)形成的鹽。當然，任何這些鹽必須具有與本發明的復合物或其類似物基本相似的生物活性。
本文所用的術語“生物活性”的解釋如下。就復合物的IFNAR2部分而言，其重要的生物活性是能結合I型干擾素。因此，必須選擇那些類似物或變體、鹽和功能性衍生物，使它們具有這種結合干擾素的能力。這可通過常規的結合測定實驗來測試。另外，也可使用IFNAR2的片段或其類似物，只要它們具有結合干擾素的活性。片段很容易這樣制得除去結合干擾素的多肽之任一端的氨基酸，測試產物結合干擾素的性能。一次從多肽的N端或C端除去一個氨基酸的蛋白酶是已知的，因此測定保留結合干擾素能力的片段只涉及常規實驗。
另外，具有這種結合干擾素活性的多肽，無論它是IFNAR2、sIFNAR2、其類似物、變體、鹽、功能性衍生物還是片段，均可具有附加的氨基酸殘基連接在結合干擾素之多肽的側面。只要所得的分子保留了核心多態結合干擾素的能力，就可以用常規實驗來確定這些側接的殘基是否影響核心肽的基本的新特性(即結合干擾素的特性)。術語“基本上由組成”在指特定序列時，指可以存在而不影響指定序列的基本新特性的附加側接殘基。該術語不包括指定序列內的替代、缺失或添加。
盡管在整篇描述和實施例中使用的是IFNAR2或sIFNAR2，但應理解，這只是較佳的實施例，IFNAR1亞基、尤其是它的胞外結構域可代替IFNAR2，無論在本公開中是否稱IFNAR2。IFNAR1只能和與其結合的干擾素聯合使用。已知IFNAR1結合IFNα。采用IFNAR1的任何復合物必須是一種干擾素、較佳的是一種與IFNAR1結合的IFNα。
對于本發明復合物的干擾素部分，在其任何類似物或變體、鹽、功能性衍生物或片段中必須保留的生物活性是取決于預期用途的干擾素的活性。在大多數情況下，該生物活性是結合天然細胞表面受體并由受體產生介導信號的能力。因此，任何這些類似物、衍生物或片段應保留這種受體拮抗活性，以便在本發明中用于這種用途。另一方面，有時需要對受體具有拮抗活性的分子，以阻止天然干擾素的生物活性。利用本發明的復合物，這種拮抗劑也可用來獲得延長的有益效應。對于希望消除干擾素不利影響的這些用途，仍與受體結合以及與復合物的IFNAR部分結合、但不介導信號傳遞并阻斷天然干擾素產生信號的類似物可能也被認為具有生物活性，可用于本發明的目的，并且當其以本發明復合物形式使用時，也包括在術語干擾素的范圍內。直接的試驗能夠確定任何此類類似物是否保留了這種受體拮抗活性或具有受體拮抗活性，從而可用于本發明的一種用途。
本發明還涉及編碼本發明的上述復合物及其類似物的DNA序列，以及用于在合適的原核或真核宿主細胞中表達、攜帶這些DNA序列的DNA載體。用重組蛋白表達系統產生大量異源蛋白的能力導致開發出各種治療劑，例如t-PA和EPO(Edington，1995)。可產生重組蛋白的各種表達宿主范圍包括原核生物來源(例如細菌)(Olins，1993)，從低等真核生物(例如酵母)(Ratner，1989)到高等真核動物(如昆蟲和哺乳動物細胞)(Reuveny，1993；Reff，1993)。所有這些系統依靠的是相同的原理—將感興趣蛋白的DNA序列導入所選類型的細胞中(以瞬時或穩定的方式，作為整合的元件或附加的元件)，利用宿主轉錄、翻譯和轉運機制將導入的DNA序列過度表達成異源蛋白(Keown，1990)。
除了表達天然的基因序列外，在核苷酸水平上操縱DNA的能力加速了新的工程改造序列的開發，這些序列盡管根據的是天然的蛋白，卻因蛋白質一級結構變化而具有新的活性(Grazia，1997)。
而且，可將所選的DNA序列物理連接來產生轉錄物，該轉錄物形成新的融合蛋白，現在該獨立蛋白可以一個多肽單位表達(Ibanez，1991)。這些融合蛋白的活性可以不同，例如比任何一個單獨的蛋白質都更有效(Curtis，1991)。
人IFNβ從采用哺乳動物中國倉鼠卵巢細胞(CHO)的生產過程衍生獲得。I型干擾素可以在各種宿主細胞中表達，這些宿主包括細菌(Utsumi，1987)、昆蟲(Smith，1983)和人(Christofinis，1981)。人sIFNAR2也用CHO宿主細胞來表達。另外，可溶性受體如sIFNAR2也可在細菌表達系統中成功表達(Terlizzese，1996)。用導致表達載體重組和整合的轉染步驟將各基因的DNA導入CHO基因組中。然后，分離表達感興趣蛋白質的細胞，培育，用本領域熟知的標準工業實踐方法回收和純化蛋白質。
本發明還涉及一種藥物組合物，該組合物包含IFNAR2/IFN復合物、或其類似物、或其混合物、或其鹽作為活性組分，以及一種藥學上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。本發明的藥物組合物的一個例子包括在病毒性疾病治療、抗癌治療、免疫調節治療以及干擾素及其相關細胞因子的其它適應癥中用來增強IFN作用的藥物組合物。
本發明的藥物組合物可通過將復合物或其類似物與生理上可接受的載體和/或穩定劑和/或賦形劑混合而配制用于給藥，并制成劑型，例如在藥劑瓶中凍干。給藥方法可以是類似試劑的任何可接受的給藥方式，這取決于要治療的病癥，例如靜脈內、肌內、皮下、局部注射或外用或連續灌輸等。活性化合物所給予的量取決于給藥途徑、待治療的疾病以及患者的疾病狀況。例如，局部注射需要的蛋白質劑量(以體重計)低于靜脈內灌輸。
游離的IFNβ有寡聚化的趨勢。為了阻抑該趨勢，目前的IFNβ制劑具有酸性的pH，這可能會在給藥時產生一些局部的刺激。由于IFNAR可作為IFNβ的穩定化因素從而阻止寡聚，因此在IFNβ制劑中使用IFNAR能使IFNβ穩定，從而無需使用酸性制劑。因此，本發明的另一部分是一種非酸性的藥物組合物，該組合物含有IFNβ和IFNAR，以及其它常規的藥學上可接受的賦形劑。
本發明還涉及本發明的復合物或其類似物或其混合物在抗病毒、抗癌以及免疫調節治療中的應用。具體地說，本發明的干擾素受體-干擾素復合物可用于抗病毒治療，用于以下這些治療適應癥慢性肉芽腫疾病、尖銳濕疣、青春期喉乳頭狀瘤病、甲型肝炎和乙型和丙型肝炎病毒的慢性感染。
具體地說，本發明的干擾素受體-干擾素復合物可在以下這些治療性適應癥中用于抗癌治療毛細胞白血病、Kaposi肉瘤、多發性骨髓瘤、慢性骨髓性白血病、非Hodgkin淋巴瘤和黑色素瘤。
本發明的干擾素受體-干擾素復合物還可用于免疫調節治療例如多發性硬化、類風濕性關節炎、重癥肌無力、糖尿病、AIDS、狼瘡等。
同樣，本發明還涉及該復合物或其類似物或混合物在制備用于治療上述疾病或用于上述適應癥的藥劑中的應用。
現在將在下列非限制性實施例和附圖中更詳細地描述本發明。
實施例材料和方法抗病毒WISH生物試驗和復合物的制備根據Novick等人(1982)的方法設計WISH試驗。
材料●WISH細胞(ATCC CCL25)●皰疹性口腔炎病毒原種(ATCC V-520-001-522)，-70℃保藏●IFNβ，人重組體，InterPharm Laboratories LTD 90×106IU/毫升，比活264.5×106IU/毫克。
●可溶性人IFNAR2，373微克/毫升貯存液濃度，PBS配●WISH生長培養基(高葡萄糖含量的MEM，含有Earls鹽+10％FBS+1.0％L-谷氨酰胺+青霉素/鏈霉素(100U/毫升，100微克/毫升))●WISH試驗培養基(高葡萄糖含量的MEM，含有Earls鹽+5％FBS+1.0％L-
谷氨酰胺+青霉素/鏈霉素(100U/毫升，100微克/毫升)，MTT 5毫克/毫升，PBS配)，-70℃保藏。
方法●將重組人IFNβ用WISH試驗培養基稀釋至19IU/毫升(4倍于預定的EC50劑量)。
●從90微克/毫升起，在Eppindorf管中用WISH試驗培養基3倍稀釋人重組sIFNAR2 11次。第12個管只含有WISH試驗培養基。
●在平底96孔板的每個孔中加入25微升IFNβ(在一個3×12孔區域中單獨加入25微升WISH試驗培養基，作為沒有IFNβ存在時IFNAR2之效果的對照)。
●在96孔板的后面12排一式三份加入25微升各稀釋度的sIFNAR2(或在第12排只加入試驗培養基)。
●在加入WISH細胞前，在37℃培育箱中預先培育IFNβ和sIFNAR2 1-4小時。
●用胰蛋白酶/EDTA溶液收獲對數生長階段的WISH細胞，用WISH試驗培養基洗滌，至最終濃度為0.8×106細胞/毫升。
●在每個孔中加入50微升WISH細胞懸液(每個孔有4×104細胞)。接觸細胞的IFNβ和IFNAR2的最終濃度是，IFNβ的最終濃度為4.75IU/毫升(1X)，第1排中sIFNAR2的最終濃度為22.5微克/毫升。
●在5％CO2潮濕的培育箱中培育24小時后，將50微升VSV原液的1∶10稀釋液(該劑量預定能在48小時內裂解100％的WISH細胞)加入除沒有病毒的對照孔(這些對照孔只加入等體積的試驗培養基)之外的所有孔中。
●再過48小時后，將25微升MTT溶液加入所有孔中，然后在培育箱中培育平板2小時。
●將板倒置，除去孔中物質，在孔中加入200微升100％乙醇。
●1小時后，用Soft max Pro軟件包和Spectramax分光光度計系統(MolecularDevices)在595納米下讀取平板的數值。
所有測序反應用ThermoSequenaseTM放射標記的終止循環測序試劑盒(AmershamLife Science；Cleveland，OH)來進行。采用由生產商提供的步驟。所有測序反應物在含有6％聚丙烯酰胺和7M尿素的CastAwayTMPrecast測序凝膠(Stratagene；LaJolla，CA)上進行。測序反應物以A-C-G-T的次序上樣。人工讀取測序凝膠的放射自顯影。用Genetics Computer Group Sequence Analysis Software Package和UNIX工作站進行DNA序列分析。
實施例1為了評價人IFNAR2/IFNβ復合物和人IFNAR2Ig-IFNβ復合物的抗病毒活性，使固定濃度的IFNβ(4.75IU/毫升)和濃度變化(0.25-30000毫微克/毫升)的人sIFNAR2(重組p40)或人IFNAR2Ig 37C預先培育3小時，然后在WISH-VSV致細胞病變試驗中測試。在沒有IFN時，沒有檢測到抗病毒保護作用(數據未顯示)。
I型干擾素(在預定的EC50濃度下使用)在約30毫微克/毫升sIFNAR2存在下的抗病毒活性顯示出和IFNβ一起時有最優的拮抗活性，但是單獨使用時沒有。通過VSV攻擊48小時后的MTT轉變來測定抗病毒活性。
當IFN以預計的EC50濃度存在時，觀察到有保護作用(見圖1；吸收值等于0.45，沒有保護的吸收值約等于0.0，完全保護的吸收值約等于1.8)。當在不同濃度下滴定IFNAR2或IFNAR2Ig時，在IFNAR2和IFNAR2Ig升高至32毫微克/毫升期間，IFNβ的活性增強約4倍(另見實施例2和圖2)。當IFNAR或IFNAR2Ig高于32毫微克/毫升時，IFNβ活性如所預計的那樣降低，這估計是由于sIFNAR與膜結合的IFNAR競爭結合IFNβ而致。因此，本實驗為IFNβ在IFNAR2/IFNβ復合物中效力提高、活性增強提供了支持。
實施例2在除ED50外的不同IFNβ濃度下，測定改變IFNβ濃度對sIFNAR2/IFN復合物活性的影響。從圖2可以看出，在4.75IU/毫升的IFNβ下，預先培育IFNAR2 1小時使得IFNβ的活性在約32毫微克/毫升的最大濃度下增高約2倍。在各種IFNβ濃度更高的情況下，不可能檢測到IFNβ抗病毒活性的增強，因為此時活性已經是最高的了。這些結果還支持這樣一個觀點，即IFNAR2/IFNβ復合物具有增強的IFN活性。
實施例3通過評價亞有效濃度IFNβ(0.95IU/毫升)和不同濃度的IFNAR2預培育不同時間下的抗病毒活性，測定IFNAR2/IFNβ復合物形成的動力學。如圖3所示，4小時的預培育時間是在此亞有效劑量下提供增強的IFNβ抗病毒活性所必需的。因此，在本身無活性的IFNβ水平下，加入IFNAR2產生一復合物會產生顯著的IFN抗病毒活性。本實驗為IFNAR2/IFNβ復合物增強IFN活性提供了另一個證據。
實施例4已經知道，IFNβ生物活性在體外37℃重建(生理性緩沖鹽溶液，pH7.4)后迅速下降。這至少部分是由于形成IFNβ寡聚結構而降低了活性。為了測試IFNAR2是否增強了IFNβ在生理性pH下穩定性，進行一個實驗，單獨培育不同濃度的IFNβ(在RPMI 1640培養基(Gibco)中)，或在相同培養基中在IFNAR2存在下培育IFNβ(IFNAR2與IFNβ之比恒定(2.5毫微克/IU))。
使IFNβ(500IU/毫升)與等體積的sIFNAR2(1.25微克/毫升)或單獨的RPMI 37℃培育3小時。在加入WISH細胞前，在96孔板中WISH試驗培養基中進行兩種IFNβ溶液的滴定。24小時后加入VSV，再培育48小時后通過測定MTT轉變來進行評價。
從圖4可以看出，單用IFNβ的ED50約為104IU/毫升，而IFNβ與可溶性IFNAR2預培育后導致ED50明顯增強，約為7IU/毫升。單用IFNβ的高ED50可能是由于溶液中IFNβ的寡聚作用。上述結果再次顯示了IFNβ與IFNAR2復合后穩定性增強。
實施例5為了評價IFNβ在有IFNAR2存在時的活性增強是否是受到sIFNAR的特異性保護，在與IFNAR2或其它濃度相同的不相關蛋白(人IgG，牛血清白蛋白(BSA))復合后評價IFNβ的活性。
如圖5所示，使IFNβ(500IU/毫升)與等體積的指定蛋白(1.25微克/毫升)或單單RPMI 37℃預先培育4小時。在加入WISH細胞前，在96孔板WISH試驗培養基中滴定這些IFNβ溶液。其中還包括新鮮制備的IFNβ，以確定預先培育對IFNβ活性的影響。24小時后加入VSV，再培育48小時后通過測定MTT轉變來評價CPE。
2.5毫微克/IU IFNβ與非特異性蛋白質(即BSA或人IgG)的預培育在重建后不保護IFNβ的活性。在該試驗中，IFNAR2/IFNβ復合物的活性與新鮮加入的IFNβ相似，這支持了sIFNAR2使IFNβ活性穩定的這樣一個發現。
實施例6根據ELISA和生物試驗分析(圖6和7)，IFNAR2/IFNβ復合物在小鼠體內顯示出大大延長的藥物動力學曲線。
對B6D2F1株小鼠靜脈內快速注射單劑人IFNβ(2.5×106IU/千克)或與人IFNAR2(2.5毫微克/IU IFN)4℃預培育1小時的相同濃度的IFNβ。在給藥后0.05-48小時，從眼眶后血管叢收集血清，分別用ELISA(圖6)或WISH生物試驗(圖7)測定IFNβ濃度和IFNβ抗病毒活性。沒有繪出在ELISA試驗中低于試驗靈敏度(7.55IU/毫升)的IFNβ血清濃度。
該復合物既沒有顯示出延長的藥物動力學曲線，WISH抗病毒試驗也沒有顯示出小鼠體內生物活性IFNβ的水平隨時間大大增加，因此顯示本發明的IFNAR2/IFNβ復合物相對于單獨的IFNβ而言，具有增強的穩定性和延長的血漿半衰期。
實施例7根據ELISA和生物試驗測試(圖8和9)，IFNAR2/IFNα2a復合物顯示出IFNα2a在小鼠體內具有大大延長的藥物動力學曲線。
使B6D2F1株小鼠接受靜脈內快速注射單劑人IFNα(1.25×105IU/千克)或與人IFNAR2(14.9毫微克/IU IFN)4℃預培育1小時的相同濃度的IFNα。在指定時間從眼眶后血管叢收集血清，分別用ELISA(圖8)或WISH生物試驗(圖9)測定IFNα2a濃度和IFNα抗病毒活性。
用對人IFNα特異性的ELISA測定IFNα。沒有繪出在ELISA試驗中低于試驗靈敏度(30IU/毫升)的IFNα血清濃度。
該復合物既沒有顯示出IFNα有延長的藥物動力學曲線，WISH抗病毒試驗也沒有顯示出小鼠體內生物活性IFNα的水平隨時間大大增加，因此顯示本發明的IFNAR2/IFN復合物相對于單獨的IFNα而言，具有增強的穩定性和延長的血漿半衰期。
實施例8IFNAR2/IFN融合蛋白的工程改造工程改造出構建物，用下列肽接頭使IFNAR2胞外結構域的C端與成熟IFN的N端融合，其中G和S分別代表氨基酸甘氨酸和絲氨酸IFNAR2胞外域(接頭)成熟的IFNβ…ESEFS(GGGGS)nMSY...，其中n＝0(SEQ ID NO5)、1(SEQ ID NO7)、2(SEQ IDNO6)、3(SEQ ID NO5)、4(SEQ ID NO4)和5(SEQ ID NO3)圖10中顯示了n＝2的IFNAR2/IFNβ融合物的全部氨基酸序列(SEQ ID NO14)。
用含有基因表達人重組IFN的表達載體pSVEIF作為PCR的模板。設計合成引物，使得只能從模板上擴增出人IFN的成熟蛋白編碼區(MSY...)。5′引物包括消化的SmaI位點的序列，IFNAR2的最后7個氨基酸(GQESEFS)(SEQ ID NO14的殘基344-349)以及(GGGGS)1(SEQ ID NO1)接頭。在5′PCR引物中還導入BamHI和XhoI位點，以便其它彈夾的克隆。3′引物含有一個AvrII位點，其緊跟在hIFNβ的TGA終止密碼子后。PCR含有約1克模板DNA，PCR引物各1克，dATP，dCTP，dGTP和dTTP各0.2mM，1X ThermoPol反應緩沖液(10毫摩爾KCI，20毫摩爾Tris-HCl，(25℃時pH8.8)，10毫摩爾硫酸銨，2毫摩爾硫酸鎂，0.1％Triton X-100New EnglandBiolabs；Beverly，MA)和3毫摩爾硫酸鎂(硫酸鎂最終濃度為5毫摩爾)，反應體積為100微升。在99.9℃下進行VENTR初始培育30秒后，在反應物中加入2單位的VEMTRDNA聚合酶。PCR包括下列20個循環(a)99.9℃ 30秒，(b)65℃-55℃ 30秒，每一輪循環降低0.5℃，和(c)75℃ 40秒。用上述過程再進行15輪循環，只是退火溫度保持在55℃。用WizardTMPCR Preps DNA純化系統(Promega；Madison，WI)純化PCR反應物。在用AvrII消化PCR產物后，在低熔點瓊脂糖凝膠上純化反應物。將含有hIFNβ成熟蛋白序列以及1GS接頭的凝膠純化的片段連接到(SmaI+AvrII)消化的表達載體pCMV-p40中，該載體含有編碼人重組IFNAR2可溶形式的基因。用標準方法(Sambrook等人，1989)用連接反應物轉化感受態大腸桿菌XL-1 Blue細胞。通過PCR產生的“內部融合”區域的限制性內切酶消化和測序來確認稱為pCMV-IFNAR2/IFNAβ GS的正確的構建組裝件。隨后用各自含BamHI突出端、合適的(GGGGS)n接頭(SEQ ID NO1，其中n＝1)和XhoI突出端的寡核苷酸彈夾工程改造構建物。0 GS彈夾含有SmaI和XhoI突出端。在確認了pCMV-IFNAR2/IFNAβ1 GS載體后，用BamHI和XhoI對其進行消化，然后將合適的彈夾連接到該載體中。對于0GS構建物，用SmaI和XhoI消化載體來連接該彈夾。
共產生6個載體，pCMV-IFNAR2/IFNβn(GS)，其中n代表0、1、2、3、4或5個GGGGS(SEQ ID NO1)接頭單元。這些限制性消化結果顯示在圖11中。設計測序引物，以便能對每個構建物的彈夾全部測序。用商用試劑盒和生產商描述的步驟(Qiagen；Chatsworth，CA)制備每個經確認的構建物的大規模質粒DNA培養物。
圖12是pCMV-IFNAR2/IFNβ“內部融合”表達載體的代表性質粒圖譜。IFNAR2/IFNβ融合蛋白的轉錄受人立即早期CMV啟動子指導。用載體提供的人生長激素(hGH)聚腺苷酸化信號序列來加工IFNAR2/IFNβ轉錄物的3′端。
載體清單編號名稱 載體例子 GGGGS(SEQ IDNO1)接頭1 pCMV-IFNAR2-IFNβ，0GSpCMV.PA4 N/A2 pCMV-IFNAR2-IFNβ，1GSpCMV.PA4 1個3 pCMV-IFNAR2-IFNβ，2GSpCMV.PA4 2個4 pCMV-IFNAR2-IFNβ，3GSpCMV.PA4 3個5 pCMV-IFNAR2-IFNβ，4GSpCMV.PA5 4個6 pCMV-IFNAR2-IFNβ，5GSpCMV.PA4 5個獲得IFNAR2/IFNβ 1GS融合物的PCR產生區域的序列信息；該信息表明序列如預計的那樣。獲得其它構建物的肽接頭區域的序列信息；此序列也如預計的那樣。
在經各構建物轉染的細胞上進行Northern印跡分析。對于IFNAR2探針和IFNβ探針，在含有IFNAR2/IFNβn GS樣品的所有泳道中均存在約1.4kb的條帶。對于IFNβ探針，還發現另一條約0.9kb的條帶。如此大小的條帶對應于交替剪接的轉錄物，該轉錄物含有IFNAR2的最后6個氨基酸，(n)GS肽接頭，以及hIFN成熟蛋白編碼序列。這可通過對cDNA進行測序來加以確認，該cDNA從分離自實施例9中瞬時轉染的CHO細胞的總RNA制得。
實施例9瞬時轉染。CHO-DUKX是中國倉鼠卵巢細胞缺少二氫葉酸還原酶活性的克隆突變株(Urlaub等人(1980)；Graff等人(1982))。該細胞維持在α最低必需培養基(αMEM)加上核糖核苷和脫氧核糖核苷中，還添加了10％胎牛血清(FBS)和1％L-谷氨酰胺(完全培養基)。用Lipofectamine PLUSTM試劑(GibcoBRL Life Technologies；Gaithersburg，MD)和生產商提供的方法進行瞬時轉染。轉染前約24小時，將細胞以每平皿2×106細胞的密度接種到直徑100毫米的平皿中。轉染采用4微克超螺旋載體質粒DNA(pCMV-IFNAR2/IFN nGS，其中n＝0、1、2、3、4、或5)。用生產商提供的無血清培養基來稀釋DNA和作為PLUS試劑。在完全培養基中37℃培育48小時后，收集細胞上清進行ELISA(IFNAR2、IFNβ)和Western凝膠試驗。
RNA抽提和Northern分析。從瞬時轉染的CHO-DUKX細胞中抽提出細胞總RNA(Chomczynski等人，1987)。使每條泳道10克總RNA在含有甲醛作為變性劑的瓊脂糖凝膠中按大小分級。樣品一式兩份上樣。RNA通過10X SSC(1.5M氯化鈉，0.15M檸檬酸鈉)中的毛細管印跡轉移到GeneScreen Plus尼龍膜(DuPont/NEM MedicalProducts；Boston，MA)上。使固定的RNA在Church和Gilbert(1984)改進的溶液中與32P-標記的hIFNAR2和hIFNβ PCR片段雜交。緩沖液含有0.25M磷酸鈉，pH7.2，0.25M氯化鈉，7％十二烷基硫酸鈉(SDS)，1毫摩爾乙二胺四乙酸和100微克/毫升大腸桿菌tRNA。用商用試劑盒(“High Prime”Boehringer Mannheim；Indianapolis，IN)和其中描述的步驟產生32P標記的探針。在Sephadex G-50柱上層析除去未摻入的放射活性。雜交后，洗去印跡。所用的最嚴謹的條件為0.2X SSC，0.1SDS，65℃。使印跡進行放射自顯影。
內部融合蛋白的表達。分別用IFNAR2特異性ELISA和IFNβ ELISA(Toray)分析瞬時轉染入XHO細胞的各內部融合構建物的上清液的IFNAR2和IFNβ表達水平。該分析的結果顯示在下表IV中。
表IV瞬時轉染入CHO細胞的內部構建物
*-用TORAY試劑盒測定-用hIFNAR2 ELISA測定-根據比活為2.0×105U/毫克(2×108/毫克)#-根據質量為22,200道爾頓(用MALDI-TOF分析hINFβ的平均質量)§-根據質量為34,400道爾頓(用MALDI-TOF分析平均質量)可以看出，隨著接頭長度的增加，觀察到IFNAR2和IFNβ的可檢測量減少。這時，不可能確定這是由于內部融合蛋白表達的量隨接頭長度的增加而減少，還是隨著接頭長度的增加，IFNβ能結合到IFNAR2結合位點中，從而不能被ELISA試驗完全檢測到。已知INFβ試驗只檢測不復合的IFNβ。
IFNAR2/IFNβ融合蛋白的Western印跡分析。為了確認內部融合蛋白以合適的分子量表達且沒有游離的IFNβ表達，通過Western印跡，用抗IFNβ抗體來檢測內部融合物，分析轉染細胞的上清液。該分析的結果顯示在圖13中。
使15微升瞬時轉染了IFNAR2/IFNβ構建物(泳道1-6)、或IFNAR2構建物(泳道7)的CHO細胞培養上清液、培養基(泳道8)或IFNβ(泳道9)在非還原性條件下進行SDS-PAGE，然后電泳轉移到PVDF膜上。用家兔抗IFNβ抗體探測此膜，用堿性磷酸酶偶聯的山羊抗家兔抗體通過Western-Star發光檢測試劑盒來顯影。
在任何內部融合構建物的上清液中均未檢測到游離的IFNβ。同樣，經Western印跡分析，每個構建物表達的蛋白具有每個內部融合構建物的適當分子量。
實施例10內部融合分子的抗病毒活性。在致細胞病變試驗中測試了每個含有內部融合物的培養物上清液的抗病毒活性，其中使WISH細胞(人羊膜細胞)接觸VSV，然后加入IFNβ(對照)或內部融合物。結果顯示在圖14中。
將含有表達的重組蛋白的CHO細胞上清液(經ELISA和Western印跡測得)、或單用CHO培養基一式兩份加入96孔平底組織培養板的頂排，每個孔中加入75微升。在板的其余孔內加入50微升WISH細胞試驗培養基。從含有上清液(頂排)的孔中取出25微升加入含有50微升WISH試驗培養基的下排孔中，如此對各樣品作三倍系列稀釋。在陽性對照孔中，用含有1000IU/毫升人IFNβ的WISH試驗培養基代替頂排中的上清液，同樣也沿板長度方向向下作三倍系列稀釋。然后在每個孔中加入50微升WISH細胞懸液(0.6×106細胞/毫升，以WISH試驗培養基配)，使得含有REBIF的頂排中的最終濃度為500IU/毫升，CHO細胞上清液的起始稀釋度為1∶2。在5％CO2下37℃培育24小時后，在每個孔(除了標為未感染的對照孔外)中加入50微升含有皰疹性口腔炎病毒(1∶10的原種液)的WISH試驗培養基。再培育48小時后，根據MTT轉變測定WISH細胞的存活。
將達到EC50所需的上清液稀釋倍數標準化成純化的人IFNβ標準品所測得的EC50，測定內部融合分子所介導的抗病毒活性。隨著接頭長度的增加，內部融合構建物的抗病毒活性也隨之增加。
實施例11本實施例是在靜脈內給藥時小鼠體內的人IFNβ/sIFNAR2復合物的藥物動力學研究。在預先進行的和分開注射的復合物組分之間進行比較。將36只D2F1株小鼠(6-8周齡)(每只約20克)分成下列4組組1有9只小鼠，靜脈內快速注射單劑200微升50000IU/毫升人IFNβ的溶液(最終劑量為10,000IU/小鼠)。
組2(9只小鼠)接受5000IU/毫升人IFNβ和125毫克/毫升sIFNAR2(2.5毫微克/IU比)的200微升溶液。
組3(9只小鼠)接受(1)200微升125毫克/毫升的sIFNAR2溶液，然后接受(2)200毫升50000IU/毫升的人IFNβ(2.5毫微克/IU比)溶液。
組4(9只小鼠)接受(1)200微升的625毫克/毫升sIFNAR2溶液，然后接受(2)200毫升50000IU/毫升人的IFNβ(10毫微克/IU比)溶液。
在指定時間用毛細管破壞眼眶后靜脈血管叢，收集血樣(每份樣品約200微升)。每組3只小鼠在給藥后0.05、2和12小時時取血樣。每組的3只小鼠在給藥后0.54和24小時后取血樣，每組的3只小鼠在給藥后1、8和48小時后取血樣。使血樣在室溫下凝集1小時，顯出邊緣(rimmed)并微量離心。將從中取出的血清-70C保藏，直至收集了所有的樣品。用Toray人IFNβ ELISA試劑盒(TFB，Inc.)，通過IFNβ特異性ELISA測定血清中人IFNβ的存在，用WISH抗病毒試驗測定生物活性。
IFNβ特異性ELISA試驗的結果顯示在圖15A中，WISH抗病毒試驗的結果顯示在圖15B中。
可以看出，以IFNAR2復合物形式注射入的IFNβ的血清半衰期與在分開注射IFNAR后注射IFNβ的血清半衰期相似。這些結果與半衰期增加的IFNβ/IFNAR2復合物的體內形成相符。
實施例12用“通用”IFN(人IFNαA/D)和sIFNAR2的復合物處理C57BL/6小鼠。與單獨給予各種劑量的通用IFN或對照相比，測定細胞毒性方面的保護作用。第1組接受5×103IU通用IFN，其與5/毫微克IU sIFNAR2復合。第2組接受5×103IU通用IFN。第3組接受5×104IU通用IFN，第4組接受PBS/2％NMS。對于每一只小鼠，測定脾細胞對抗NK靶細胞YAC-1的細胞毒性作為NK活性。結果顯示在圖16中。與單用通用IFN處理的小鼠相比，經通用IFN/sIFNAR2復合物處理的小鼠中的NK活性明顯較高。
實施例13如上所述，藥物動力學研究已經證實，當I型IFN以與sIFNAR2(IFN受體亞基的可溶形式)的復合物形式給藥時，顯著增加了其血清半衰期。體外結果提示，與IFNAR2的物理結合導致通常不穩定的IFN穩定化。為了確定增加的PK曲線和IFNAR2的穩定化作用是否在體內增加和延長了IFN介導的效果，開發了一個模型，系采用致死劑量的IFN-敏感型Daudi人B細胞淋巴瘤細胞系(Ghetie，1991；Ghetie，1990)攻擊重度聯合免疫缺陷(scid/scid)的小鼠。這些小鼠在注射腫瘤細胞后14-20天之間產生癱瘓，并伴隨有擴散性淋巴瘤的組織學證據。值得注意的是，通過每天皮下給予人IFNβ，這些小鼠的存活可以依賴于劑量的方式延長。用該模型來評價IFNAR2作為體內I型IFN相關生物活性的增效劑。
為了確定在Daudi scid模型中癱瘓平均時間與IFNβ劑量之間的關系，使5組5只4-5周齡的BALB/cByJSmn-scid/scid株小鼠接受人IFNβ的皮下給藥，每只小鼠每天接受200微升，從第0天到第30天。從冷凍原種擴大的標準Daudi細胞劑量為第0天每只小鼠頸背皮下注射PBS配的5×106個細胞。各組小鼠接受下列量的IFN組1每只小鼠135×104IU(675×104IU/毫升)。
組2每只小鼠45×104IU(225×104IU/毫升)。
組3每只小鼠15×104IU(75×104IU/毫升)。
組4每只小鼠5×104IU(25×104IU/毫升)。
癱瘓時間個體值和平均值顯示在表V中。
表V癱瘓天數 平均值(±SD)組126，31，35，37，40，33.8(5.4)組220，23，23，23，26，23.0(2.1)組320，20，22，22，23，21.4(1.3)組417，18，18，18，18，17.8(0.5)組514，14，15，15，15，14.6(0.6)因此可以看出，在Daudi/scid異體移植模型中，通過每天皮下給予人IFNβ而以依賴于劑量的方式延長了癱瘓的平均時間。
實施例14為了確定IFNβ的抗腫瘤效果是否能通過和IFNAR2(比例為2.5毫微克/IU)復合來增強，用實施例13討論的相同程序處理七組每組5只小鼠，給予各組的試驗材料如下單用IFNβ/小鼠 IFNβ加上sIFNAR2/小鼠組12×102IU 組42×102IU加上0.5微克組22×103IU 組52×103IU加上5.0微克組32×104IU 組62×104IU加上50.0微克組7接受Daudi細胞，只用稀釋劑處理下表中顯示了癱瘓時間的個體值和平均值表VI癱瘓天數 平均值(±SD)組116， 16， 17， 18， 19 17.2(1.3)組217， 18， 18， 19， 19 18.2(0.8)
組317， 17， 17， 18， 1817.6(0.9)組417， 17， 18， 18， 1917.8(0.8)組517， 18， 19， 20， 2018.8(1.3)組621， 22， 22， 23， 2622.8(1.9)*組716， 16， 17， 17， 1716.6(0.6)*在配對組比較中，經單向ANVOA測得，與相同濃度的未復合形式的IFNβ明顯不同(p值小于等于0.05)。
可以看出，低劑量(2×104IU/小鼠/天)的IFNβ以及Daudi/scid異體移植模型的抗腫瘤活性經與IFNAR2復合后明顯增強。
在另一個實驗(未顯示)中，研究了注射頻率對癱瘓時間平均值的影響。結果確定，在Daudi/scid異體移植模型中，與每天一次的經常性注射游離IFNβ相比，每周注射一次IFNβ/IFNAR G2復合物的治療可以獲得明顯增強的抗腫瘤活性。另外，在另一個實驗(未顯示)中，測試了IFNAR與IFNβ的最優比例。發現在單一的IFNβ濃度下(2×104/IU/小鼠/天)增強抗腫瘤活性的IFNAR2IFNβ最適比為每皮克IFNβ2.5毫微克IFNAR2。
在第二個實驗中，發現在IFNβ濃度為5×104IU/小鼠/天時，增強抗腫瘤活性的IFNAR2IFNβ最適比為每皮克IFNβ0.3毫微克IFNAR2。這兩個實驗表明最適比取決于IFNβ的濃度，并似乎表明IFNβ的濃度越高，需要的比例越低。
在采用相同模型的另一個實驗中，確認在該研究中單獨給予IFNAR2不會提高小鼠的存活率。
實施例15本實施例是在靜脈內快速注射單劑后測定小鼠血清中內部融合物5GS分子之血清半衰期的藥物動力學研究。將21只雌性B6D2F1株小鼠(6-8周)(每只約20克)分成下列三組組1有9只小鼠，靜脈內快速注射單劑200微升的100000IU/毫升內部融合物5GS溶液(最終劑量為20,000IU/小鼠或5×106IU/千克)。
組2(9只小鼠)接受200微升100000IU/毫升的人IFNβ溶液。
組3含有三只未經注射的小鼠作為陰性對照。
假定每只小鼠的血液體積約為2毫升，則組1和組2的Cmax和Tmax理論值為10000IU/毫升。在給藥后0.05、2和12小時，取組1和組2的三只小鼠的血樣。在給藥后0.5、4和24小時，取組1和組2的三只小鼠的血樣，在給藥后1、8和48小時，取組1和組2的三只小鼠的血樣。用WISH試驗測定血清中生物活性人IFNβ的存在。
結果顯示在圖17中。盡管IFNβ幾乎被立即清除，但是內部融合分子仍在注射后長時間保留在血清中。這表明融合蛋白具有所需的穩定化作用。
前文關于具體實施方案的描述非常全面地揭示了本發明的總體特征，其它人很容易在不脫離本文一般內容下利用現有的知識無需過多試驗來修改和/或使這些具體的實施方案適應各種應用，因此，這些修改和適應應包括在本發明所公開實施方案之等效方案的范圍和意義內。應理解，本文所用的措辭或術語是為了描述，而不是限制。實施本文公開的各種功能的手段、材料和步驟可以在不脫離本發明的情況下有各種替換形式。因此，在上文的說明書和/或下文的權利要求中可以找到的表述“指”和“意味著”或其后有功能性描述的任何方法步驟的表述定義并涵蓋了現在或將來可能存在來實施所述功能的任何結構性、物理、化學或電子元件或結構或任何方法步驟，無論其是否確切地與上文說明書所公開的實施方案等效，即，可采用實現相同功能的其它方法或步驟；這些表述的目的是給出其最寬的解釋。
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序列表<110>TEPPER，MarkCUNNINGHAM，MarkSHERRIS，DavidEL TAYAR，NabilMcKENNA，Sean<120>IFNAR2/IFN復合物<130>TEPPER1A.SEQ<140>未收到<141>1998-12-18<150>60/068，295<151>1997-12-19<160>14<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>5<212>PRT<213>未知<220><223>未知生物體的描述肽<400>lGly Gly Gly Gly Ser1 5<210>2<211>4<212>PRT<213>未知<220><223>未知生物體的描述肽<400>2Ile Glu Glu Arg1<210>3<211>33<212>PRT<213>未知<220><223>未知生物體的描述肽<400>3Glu Ser Glu Phe Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly1 5 10 15Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Met Ser20 25 30Tyr<210>4<211>28<212>PRT<213>未知<220><223>未知生物體的描述肽<400>4Glu Ser Glu Phe Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly1 5 10 15Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Met Ser Tyr20 25<210>5<211>23<212>PRT<213>未知<220><223>未知生物體的描述肽<400>5Glu Ser Glu Phe Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly1 5 10 15Gly Gly Gly Ser Met Ser Tyr<210>6<211>18<212>PRT<213>未知<220><223>未知生物體的描述肽<400>6Glu Ser Glu Phe Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Met1 5 10 15Ser Tyr<210>7<211>13<212>PRT<213>未知<220><223>未知生物體的描述肽<400>7Glu Ser Glu Phe Ser Gly Gly Gly Gly Ser Met Ser Tyr1 5 10<210>8<211>36<212>PRT<213>未知<220><223>未知生物體的描述肽<400>8Glu Ser Glu Phe Ser Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu1 5 10 15Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro20 25 30Gln Met Ser Tyr<210>9<211>23<212>PRT<213>未知<220><223>未知生物體的描述肽<400>9Glu Ser Glu Phe Ser Glu Phe Met Glu Phe Met Glu Phe Met Glu phe1 5 10 15Met Glu phe Met Met Ser Tyr20<210>10<211>20<212>PRT<213>未知<220><223>未知生物體的描述肽<400>10Glu Ser Glu Phe Ser Glu Phe Met Glu Phe Met Glu Phe Met Glu Phe1 5 10 15Met Met Ser Tyr20<210>11<211>17<212>PRT<213>未知<220><223>未知生物體的描述肽<400>11Glu Ser Glu Phe Ser Glu Phe Met Glu Phe Met Glu phe Met Met Ser1 5 10 15Tyr<210>12<211>21<212>PRT<213>未知<220><223>未知生物體的描述肽<400>12Glu Ser Glu Phe Ser Glu Phe Gly Ala Gly Leu Val Leu Gly Gly Gln1 5 10 15Phe Met Met Ser Tyr20<210>13<211>34<212>PRT<213>未知<220><223>未知生物體的描述肽<400>13Glu Ser Glu Phe Ser Glu Phe Gly Ala Gly Leu Val Leu Gly Gly Gln1 5 10 15Phe Met Glu Phe Gly Ala Gly Leu Val Leu Gly Gly Gln Phe Met Met20 25 30Ser Tyr<210>14<211>400<212>PRT<213>未知<220><223>未知生物體的描述肽400>14Met Leu Leu Ser Gln Asn Ala Phe Ile Val Arg Ser Leu Asn Leu Val1 5 10 15Leu Met Val Tyr Ile Ser Leu Val Phe Gly Ile Ser Tyr Asp Ser Pro20 25 30Asp Tyr Thr Asp Glu Ser Cys Thr Phe Lys Ile Ser Leu Arg Asn Phe35 40 45Arg Ser Ile Leu Ser Trp Glu Leu Lys Asn His Ser Ile Val Pro Thr50 55 60His Tyr Thr Leu Leu Tyr Thr Ile Met Ser Lys Pro Glu Asp Leu Lys65 70 75 80Val Val Lys Asn Cys Ala Asn Thr Thr Arg Ser Phe Cys Asp Leu Thr85 90 95Asp Glu TrP Arg Ser Thr His Glu Ala Tyr Val Thr Val Leu Glu Gly100 105 110Phe Ser Gly Asn Thr Thr Leu Phe Ser Cys Ser His Asn Phe Trp Leu115 120 125Ala Ile Asp Met Ser Phe Glu Pro Pro Glu Phe Glu Ile Val Gly Phe130 135 140Thr Asn His Ile Asn Val Met Val Lys phe Pro Ser Ile Val Glu Glu145 150 155 160Glu Leu Gln Phe AsP Leu Ser Leu Val Ile Glu Glu Gln Ser Glu Gly165 170 175Ile Val Lys Lys His Lys pro Glu Ile Lys Gly Asn Met Ser Gly Asn180 185 190Phe Thr Tyr Ile Ile Asp Lys Leu Ile Pro Asn Thr Asn Tyr Cys Val195 200 205Ser Val Tyr Leu Glu His Ser Asp Glu Gln Ala Val Ile Lys Ser Pro210 215 220Leu Lys Cys Thr Leu Leu Pro Pro Gly Gln Glu Ser Glu Phe Ser Gly225 230 235 240Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Met Ser Tyr Asn Leu Leu Gly245 250 255Phe Leu Gln Arg Ser Ser Asn Phe Gln Cys Gln Lys Leu Leu Trp Gln
260 265 270Leu Asn Gly Arg Leu Glu Tyr Cys Leu Lys Asp Arg Met Asn Phe Asp275 280 285Ile Pro Glu Glu Ile Lys Gln Leu Gln Gln Phe Gln Lys Glu Asp Ala290 295 300Ala Leu Thr Ile Tyr Glu Met Leu Gln Asn Ile Phe Ala Ile Phe Arg305 310 315 320Gln Asp Ser Ser Ser Thr Gly Trp Asn Glu Thr Ile Val Glu Asn Leu325 330 335Leu Ala Asn Val Tyr His Gln Ile Asn His Leu Lys Thr Val Leu Glu340 345 350Glu Lys Leu Glu Lys Glu Asp Phe Thr Arg Gly Lys Leu Met Ser Ser355 360 365Leu His Leu Lys Arg Tyr Tyr Gly Arg Ile Leu His Tyr Leu Lys Ala370 375 380Lys Glu Tyr Ser His Cys Ala Trp Thr Ile Val Arg Val Glu Ile Leu385 390 395 400
權利要求
1.一種延長I型干擾素IFN體內作用的方法，該方法包括給予需要I型IFN治療的患者I型IFN和人干擾素α/β受體IFNAR之亞基的復合物，其中所述受體亞基能與復合物中的I型IFN結合，復合物給予的量能有效地提供這種IFN治療，其中所述I型IFN具有的序列基本上由以下物質的序列組成a)天然的I型IFN；b)具有I型IFN生物活性的a)的片段；c)a)或b)的變體，它們與a)或b)有至少70％的序列相同性，且具有I型IFN的生物活性；d)a)或b)的變體，它們由一DNA序列編碼，該DNA序列在中等嚴謹條件下與編碼a)或b)的天然DNA序列的互補序列雜交，且該變體具有I型IFN的生物活性；或e)a)，b)，c)或d)的功能性衍生物的鹽，它具有I型IFN的生物活性；和其中所述IFNAR的序列基本上由下列物質的序列組成f)天然人IFNAR多肽鏈；g)具有IFNAR生物活性的f)的片段；h)f)或g)的變體，它們與f)或g)有至少70％的序列相同性，且具有IFNAR的生物活性；i)f)或g)的變體，它們由一DNA序列編碼，該DNA序列在中等嚴謹條件下與編碼f)或g)的天然DNA序列的互補序列雜交，且該變體具有IFNAR的生物活性；或j)f)，g)，h)或i)的功能性衍生物的鹽，它具有IFNAR的生物活性。
2.根據權利要求1所述的方法，其中所述復合物包含所述I型IFN和所述IFNAR的非共價復合物。
3.根據權利要求2所述的方法，其中所述I型IFN和所述IFNAR是分開給予的，所述復合物在體內形成。
4.根據權利要求1所述的方法，其中所述復合物包含一種復合物，在該復合物中所述I型IFN通過共價鍵與所述IFNAR連接。
5.根據權利要求1所述的方法，其中所述復合物包含一種融合蛋白，在該融合蛋白中所述I型IFN通過肽鍵與所述IFNAR連接。
6.根據權利要求5所述的方法，其中所述I型IFN通過肽接頭與所述IFNAR連接。
7.根據權利要求1所述的方法，其中所述I型IFN是IFNα、IFNβ或IFNω。
8.根據權利要求7所述的方法，其中所述I型IFN是IFNβ。
9.根據權利要求1所述的方法，其中所述IFNAR是人干擾素α/β受體的β亞基IFNAR2。
10.一種分子，它包含I型干擾素IFN與人干擾素α/β受體IFNAR之亞基的復合物，所述受體亞基能結合復合物中的I型IFN，其中所述I型IFN通過共價鍵或肽鍵與所述IFNAR連接，其中所述I型IFN具有的序列基本上由以下物質的序列組成a)天然的I型IFN；b)具有I型IFN生物活性的a)的片段；c)a)或b)的變體，它們與a)或b)有至少70％的序列相同性，且具有I型IFN的生物活性；d)a)或b)的變體，它們由一DNA序列編碼，該DNA序列在中等嚴謹條件下與編碼a)或b)的天然DNA序列的互補序列雜交，且該變體具有I型IFN的生物活性；或e)a)，b)，c)或d)的功能性衍生物的鹽，它具有I型IFN的生物活性；和其中所述IFNAR的序列基本上由下列物質的序列組成；f)天然人IFNAR多肽鏈；g)具有IFNAR生物活性的f)的片段；h)f)或g)的變體，它們與f)或g)有至少70％的序列相同性，且具有IFNAR的生物活性；i)f)或g)的變體，它們由一DNA序列編碼，該DNA序列在中等嚴謹條件下與編碼f)或g)的天然DNA序列的互補序列雜交，且該變體具有IFNAR的生物活性；或j)f)，g)，h)或i)的功能性衍生物的鹽，它具有IFNAR的生物活性。
11.根據權利要求10所述的分子，其中所述I型IFN通過共價鍵與所述IFNAR連接。
12.根據權利要求10所述的分子，其中所述I型IFN通過肽鍵與所述IFNAR連接。
13.根據權利要求12所述的分子，其中所述I型IFN通過肽接頭與所述IFNAR連接。
14.根據權利要求13所述的分子，其中所述肽接頭是(GGGGS)n，其中n＝1-5。
15.根據權利要求10所述的分子，其中所述I型IFN是IFNα、IFNβ或IFNω。
16.根據權利要求15所述的分子，其中所述I型IFN是IFNβ。
17.根據權利要求10所述的分子，其中所述IFNAR是人干擾素α/β受體的β亞基IFNAR2。
18.一種編碼權利要求12所述分子的融合蛋白的DNA。
19.一種宿主細胞，其被攜帶權利要求18所述的DNA的載體轉化，該轉化方式允許所述融合蛋白表達。
20.一種制備融合蛋白的方法，該方法包括培育權利要求19所述的宿主細胞，并回收其表達的融合蛋白。
21.一種增加I型干擾素半衰期的方法，該方法包括以權利要求10所述的復合物形式或所述IFN與所述IFNAR通過非共價鍵結合形成的復合物形式保藏所述干擾素。
22.一種藥物組合物，它包含藥學上可接受的載體以及I型干擾素IFN與人干擾素α/β受體IFNAR之亞基的復合物，所述受體亞基能結合復合物中的I型IFN，其中所述I型IFN具有的序列基本上由以下物質的序列組成a)天然的I型IFN；b)具有I型IFN生物活性的a)的片段；c)a)或b)的變體，它們與a)或b)有至少70％的序列相同性，且具有I型IFN的生物活性；d)a)或b)的變體，它們由一DNA序列編碼，該DNA序列在中等嚴謹條件下與編碼a)或b)的天然DNA序列的互補序列雜交，且該變體具有I型IFN的生物活性；或e)a)，b)，c)或d)的功能性衍生物的鹽，它具有I型IFN的生物活性；和其中所述IFNAR的序列基本上由下列物質的序列組成f)天然人IFNAR多肽鏈；g)具有IFNAR生物活性的f)的片段；h)f)或g)的變體，它們與f)或g)有至少70％的序列相同性，且具有IFNAR的生物活性；i)f)或g)的變體，它們由一DNA序列編碼，該DNA序列在中等嚴謹條件下與編碼f)或g)的天然DNA序列的互補序列雜交，且該變體具有IFNAR的生物活性；或j)f)，g)，h)或i)的功能性衍生物的鹽，它具有IFNAR的生物活性。
23.人干擾素α/β受體IFNAR在生產用于增強I型干擾素IFN之生物作用的藥劑中的應用，其中所述IFNAR的序列基本上由下列物質的序列組成a)天然人IFNAR多肽鏈；b)具有IFNAR生物活性的a)的片段；c)a)或b)的變體，它們與a)或b)有至少70％的序列相同性，且具有IFNAR的生物活性；d)a)或b)的變體，它們由一DNA序列編碼，該DNA序列在中等嚴謹條件下與編碼a)或b)的天然DNA序列的互補序列雜交，且該變體具有IFNAR的生物活性；或e)a)，b)，c)或d)的功能性衍生物的鹽，它具有IFNAR的生物活性。
24.I型干擾素IFN和人干擾素α/β受體IFNAR之亞基的復合物在生產用于延長I型IFN之體內效果的藥劑中的應用，其中所述受體的亞基能結合復合物中的I型IFN，其中所述I型IFN具有的序列基本上由以下物質的序列組成a)天然的I型IFN；b)具有I型IFN生物活性的a)的片段；c)a)或b)的變體，它們與a)或b)有至少70％的序列相同性，且具有I型IFN的生物活性；d)a)或b)的變體，它們由一DNA序列編碼，該DNA序列在中等嚴謹條件下與編碼a)或b)的天然DNA序列的互補序列雜交，且該變體具有I型IFN的生物活性；或e)a)，b)，c)或d)的功能性衍生物的鹽，它具有I型IFN的生物活性；和其中所述IFNAR的序列基本上由下列物質的序列組成f)天然人IFNAR多肽鏈；g)具有IFNAR生物活性的f)的片段；h)f)或g)的變體，它們與f)或g)有至少70％的序列相同性，且具有IFNAR的生物活性；i)f)或g)的變體，它們由一DNA序列編碼，該DNA序列在中等嚴謹條件下與編碼f)或g)的天然DNA序列的互補序列雜交，且該變體具有IFNAR的生物活性；或j)f)，g)，h)或i)的功能性衍生物的鹽，它具有IFNAR的生物活性。
25.權利要求10所述的分子作為藥劑的應用。
26.根據權利要求24所述的應用，其中所述復合物包含所述I型IFN和所述IFNAR的非共價復合物。
27.根據權利要求25所述的應用，其中所述I型IFN和所述IFNAR是分開給予的，所述復合物在體內形成。
28.根據權利要求24所述的應用，其中所述復合物包含一種復合物，該復合物中所述I型IFN通過共價鍵與所述IFNAR連接。
29.根據權利要求24所述的應用，其中所述復合物包含一種融合蛋白，在該融合蛋白中所述I型IFN通過肽鍵與所述IFNAR連接。
30.根據權利要求29所述的應用，其中所述I型IFN通過肽接頭與所述IFNAR連接。
31.根據權利要求24所述的應用，其中所述I型IFN是IFNα、IFNβ或IFNω。
32.根據權利要求31所述的應用，其中所述I型IFN是IFNβ。
33.根據權利要求24所述的應用，其中所述IFNAR是人干擾素α/β受體的β亞基IFNAR2。
全文摘要
通過給予與人干擾素α/β受體(IFNAR)的IFN結合鏈之復合物形式的干擾素,可以延長Ⅰ型干擾素(IFN)的體內效果。該復合物還提高了IFN的穩定性,增強了IFN的效力。該復合物可以是非共價的復合物,或是IFN通過共價鍵或肽鍵與IFNAR結合形成的復合物。當以融合蛋白形式靠肽鍵結合時,IFN可以靠肽接頭和IFNAR分開。這種融合蛋白可用重組DNA技術產生。以這種復合物的形式保藏IFN可增加IFN的保藏時間,并使得在更溫和的條件下保藏成為可能。
文檔編號C12P21/04GK1282255SQ9881239
公開日2001年1月31日 申請日期1998年12月18日 優先權日1997年12月19日
發明者M·泰珀, M·坎寧安, D·謝里斯, N·埃爾塔亞, S·麥克肯納 申請人:應用研究系統Ars股份公司