專利名稱：葡萄樹的抗細菌性的制作方法
技術領域：
本發明背景本發明涉及植物的抗病性。
葡萄是世界上廣泛種植的果樹作物，并且，用傳統方法育種很困難(Mullins等，生物技術81041-1045，1990)。為了生產轉基因葡萄栽培種，業已做出了相當大的努力。最近，用胚胎發生愈傷組織或懸浮培養物進行轉化，業已在葡萄栽培種轉化方面取得成功。業已獲得了下列植物的轉基因植物根莖栽培種Rupestris St．George(沙地葡萄(Vitis rupestris)，Mullins等，生物技術81041-1045，1990)，Richter110(沙地葡萄×冬葡萄(Vitis herlandieri)，LeGall等，植物科學102161-170，1994；Krastanova等，植物細胞報導14550-554，1995)，41B(冬葡萄×沙地葡萄，Mauro等，植物科學11297-106，1995)，以及接穗栽培種Chancellor(葡萄，Kikkert等，植物細胞報導15311-316，1996)，Thompson Seedless(歐洲葡萄，Scorza等，美國園藝科學協會雜志，121616-619，1996)，和Superior Seedless(歐洲葡萄，Perl等，植物科學104193-200，1996)。導入所述葡萄栽培種的很多基因業已包被了葡萄病毒的蛋白基因，包括葡萄樹扇葉病毒(Mauro等，1995；Krastanova等，植物細胞報導14550-554，1995)，葡萄樹色素花葉病毒(LeGall等，植物科學102161-170，1994)，和番茄環斑病毒(Scorza等，美國園藝科學協會雜志121616-619，1995)。另外，已報道了用編碼裂解肽，Shiva-1的基因進行轉化(Scorza等，美國園藝科學協會雜志，121616-619，1995)。所述技術以及其它技術的應用提供了在葡萄上通過工程方法產生抗病性的基礎；例如，培育能夠抵抗害蟲(例如，昆蟲和線蟲)侵害和病原性微生物(例如，真菌，細菌和病毒)侵害的轉基因葡萄植物。
在葡萄上發現的一種微生物誘導的病害是冠癭病。它是由農桿菌(一種土壤寄居性格蘭氏陰性細菌)引起的病害。該細菌能長時間存在于土壤中的植物碎片上，該細菌具有最廣泛的宿主范圍，可以是任何植物的病原體。這種細菌能在植物的根、冠、干、和莖上誘導冠癭或植物腫瘤。
農桿菌屬是通過拷貝并轉移腫瘤誘導(Ti)質粒的一個片段(被稱為轉移DNA(T-DNA))到植物細胞中，并整合到植物細胞基因組上而導致冠癭。T-DNA向植物細胞核中的轉移取決于各種毒力(vir)基因的表達，這些基因同樣位于Ti質粒上。一種毒力蛋白VirD2是位點專一性內切酶，它在與VirD1蛋白結合之后，能識別左側和右側T-DNA臂序列的‘底鏈’并形成缺口(Stachel等，EMBO雜志，6857-863，1987)。VirD2蛋白被共價結合在所述缺口鏈的5’末端(Ward和Warnes，科學242927-930，1988)。然后，該單鏈T-DNA(ss T-DNA)被排出植物細胞(Tinland等，Proc．Natl．Acad．Sci．918000-8004，1994，Yusibov等，Proc．Natl．Acad．Sci．912994-2998，1994)。
目前，對將T-DNA轉移到植物細胞核中的假設是，ss T-DNA是由VirE2蛋白的分子包被的，業已證實該蛋白能結合ss T-DNA。包被過的T-DNA被稱為T-復合體，該復合體被認為通過由VirB蛋白形成的一個孔輸送到植物細胞中。T-復合體可以利用植物蛋白途徑進入細胞核；包括將具有細胞核定位信號的蛋白輸送到細胞核。VirD2和VirE2都是將T-DNA適當轉移到植物細胞核中所必需的。因此，T-復合體從農桿菌屬轉移到植物細胞中，在這里T-DNA整合到植物基因組上。
農桿菌屬的T-DNA編碼多種參與生長素和細胞分裂素生物合成途徑的酶。受感染的細胞會過量產生植物激素--生長素和細胞分裂素，導致快速和失控的細胞分裂，并形成冠癭或植物腫瘤。冠癭的形成會妨礙水分和養分在植物中的流動。受感染的植物通常會變得不能結實，并且，更容易受不利環境條件的影響。這種病害對諸如葡萄的果樹作物特別有危害。
葡萄的冠癭病幾乎都是由葡萄農桿菌(A．vitis)引起的，并在很小的程度上由根瘤農桿菌(A．tumefaciens)引起。所述細菌感染葡萄樹的莖干上受傷的部位，并導致冠癭的形成。細菌能在葡萄樹的木質部中存活，并通過受感染的繁殖材料擴散。農桿菌屬感染對葡萄園形成階段幼小葡萄樹的危害特別大；快速生長的冠癭能夠在一個季節將幼小的葡萄樹環剝(Agrios，植物病理學，第3版，學術出版社，1998)。受感染的葡萄樹會降低產量和生產能力。
本發明概述一般來說，本發明的特征是一種在植物上(例如，諸如葡萄屬的葡萄樹)上產生對細菌病原體的抗性的方法。該方法一般包括以下步驟(a)用一個毒力(vir)基因或其抗病原體片段轉化植物細胞；(b)再生所述植物細胞，以便提供分化的植物；和(c)選擇表達所述vir基因或其抗病原體片段的轉化植物，其中，所述vir基因或其抗病原體片段的表達能產生對植物細菌病原體的抗性。一般來說，將T-DNA從細菌轉移到植物中的方法是通過存在于農桿菌屬的腫瘤誘導(Ti)或根瘤誘導(Ri)質粒上的vir片段編碼的基因產物介導的。可用于本發明的代表性vir基因包括，但不限于virE2和virD2。
在本發明的優選實施方案中，將vir基因或其抗病原體片段整合到植物的基因組中。所述vir基因優選為virE2、virD2或這兩者；或是突變體(例如，抗-病原體vir基因片段，如編碼諸如virE2缺失B、virE2缺失C、或virE2缺失E的Vir蛋白的缺失的基因)。能介導增強對冠癭病的抗性的vir序列被認為可用于本發明。在本文中，術語“片段”在用于表達核酸分子序列時表示至少5個連續的核苷酸，優選至少10個連續的核苷酸，更優選至少20-30個連續的核苷酸，最優選至少40-80或更多個連續的核苷酸。可以生產vir基因(例如，virE2或virD2)的天然片段或合成片段，隨后按照本領域技術人員所公知的方法將其整合到任何標準植物表達載體(例如，本文所披露的載體)上。可以按照標準方法(例如，本文所披露的方法)測定所述vir基因片段(例如，編碼virE2基因的缺失B、缺失C、缺失D或缺失E的vir基因)在植物中表達時產生對細菌性植物病原體的抗性的能力。能產生植物細菌病原體抗性的片段被稱為“抗病原體片段”。
在優選實施方案中，所述植物是葡萄樹或葡萄樹的部分(例如，體細胞胚、接穗、或根莖)；所述細菌病原體是葡萄農桿菌或根瘤農桿菌；而對葡萄農桿菌或根瘤農桿菌的抗性能減弱冠癭的形成或所述細菌在受感染的植物上的生長。在另一種優選實施方案中，所述vir基因(或其抗病原體片段)源于農桿菌屬(例如，葡萄農桿菌、根瘤農桿菌、毛根農桿菌)的腫瘤誘導(Ti)或根誘導(Ri)質粒。所述Ti質粒的例子包括，但不限于胭脂氨酸、vitopine、章魚氨酸、章魚氨酸／南瓜氨酸、leucinopine／農桿氨酸、succinamopine、或農桿氨酸型Ti質粒。所述vir基因序列或抗病原體片段是按照本領域的標準方法獲得的。
本文所披露的方法可用于在多種葡萄樹(例如，葡萄、雜交葡萄、和Euvitis和Muscadinia亞屬的所有成員)上產生對細菌病原體(例如，葡萄農桿菌或根瘤農桿菌)的抗性或耐性或這兩者，所述葡萄樹包括接穗和根莖栽培種。典型的接穗栽培種包括，但不限于被稱為鮮食葡萄或葡萄干的品種以及用于生產葡萄汁和葡萄酒的品種，如Cabernet Franc，Cabernet Sauvignon，Chardonnay(例如，CH01，CH02，CH Dijon)，Merlot，Pinot Noir(PN，PN Dijon)，Semillon，White Riesling，Lambrusco，Thompson Seedless，AutumnSeedless，Niagrara Seedless，和Seval Blanc。可用于本發明的根莖栽培種包括，但不限于沙地葡萄Constantia，沙地葡萄St．George，加州葡萄(Vitis caiifornia)，谷地葡萄(Vitisgirdiana)，圓葉葡萄(Vitis rotundifolia)，圓葉葡萄Carlos，Richter 110(冬葡萄×沙地葡萄；“11OR”)，101-14 Millarderet de Grasset(河岸葡萄(Vitis riparia)×沙地葡萄；“101-14Mgt”)，Teleki 5C(冬葡萄×河岸葡萄)，Courderc 3309(河岸葡萄×沙地葡萄；“C3309”)，Riparia Gloire de Montpellier(河岸葡萄)，5BB Teleki(選擇性Kober，冬葡萄×河岸葡萄)，S04(冬葡萄×沙地葡萄)，41B Millardet(歐洲葡萄×冬葡萄)，Ramsey(Vitis champinii)，K5140(Vitis．Champinii×河岸葡萄)，和039-16(歐洲葡萄×圓葉葡萄)。
本發明的特征還在于由本文所披露的任何轉基因葡萄樹或葡萄樹部分產生的接穗、根莖、體細胞或合子胚胎、細胞、或種子，例如，本發明的特征是用編碼Vir蛋白或其抗病原體片段的核酸分子轉化過的轉基因植物，其中，所述核酸分子的表達能產生對細菌病原體(例如葡萄農桿菌或根瘤農桿菌)的抗性。本發明還包括用能產生對細菌病原體的抗性的核酸分子(例如，virE2缺失B轉基因構建體，通過將該轉基因與植物表達控制片段可操作地連接進行定位表達)轉化過的葡萄細胞。然后用本領域技術人員公知的方法(例如本文所披露的方法)用所述葡萄細胞再生根莖、接穗、體細胞胚胎、或種子。
“定位表達”表示將所述DNA分子定位于靠近指導該序列轉錄的DNA序列處。
“表達控制區域”是指足以指導轉錄的任何序列。在本發明中包括啟動子和增強子元件，所述元件足以使得啟動子依賴型基因表達可以控制細胞、組織、或器官特異性基因表達，或者能夠用外部信號或制劑(例如，光線、病原體、創傷、應激或激素誘導型元件或組成型元件)誘導的元件；所述元件可以位于天然基因的5’或3’區域或加工進轉基因構建體。
“可操作地連接”是指一個基因和一個調控序列的連接使得當合適的分子(例如，轉錄激活蛋白)結合于該調控序列上時基因能夠表達。
“植物細胞”是指由半透性膜包圍并含有質體的任何自身繁殖的細胞。在本文中，植物細胞是從(但不限于)種子、懸浮培養物、胚胎、分生組織部位、愈傷組織、原生質體、葉片、根、芽、體細胞和合子胚胎、以及生殖或營養組織或器官的任何部分獲得的細胞。
“植物部分”是指從完整的植物或植物細胞獲得的一部分、片段、或器官。典型的植物部分包括，但不限于體細胞胚胎、葉片、果實、接穗、和根莖。
“轉基因的”是指包括一個DNA序列的任何細胞，該DNA序列通過人工方法插入一種細胞，并成為由該細胞形成的生物(整合的或染色體外的)的基因組的部分。在本文中，轉基因生物通常是指轉基因葡萄樹或葡萄樹部分，而所述DNA(例如轉基因)是通過人工方法插入所述植物細胞的細胞核或細胞質區室中。所述轉轉基因葡萄樹或葡萄樹部分優選能表達至少一個vir核酸序列(例如，vir基因或其抗病原體片段，如源于葡萄農桿菌菌株CG450的virE2缺失B)。在另一種優選實施方案中，轉基因植物可以表達一種以上的vir序列或vir序列的組合(例如，源于不同Ti質粒的vir核酸序列，如胭脂氨酸、vitopine、章魚氨酸、章魚氨酸／南瓜氨酸、leucinopine／農桿氨酸、succinamopine、或農桿氨酸型Ti或Ri質粒)。
“轉基因”是指通過人工方法插入一種細胞，并成為由該細胞形成的生物的一部分(整合到其基因組上或者保持在染色體外)的任何DNA片段。所述轉基因可以包括對轉基因生物來說為部分或完全異源(即外源)的基因，或者可以是與該生物的內源基因同源的基因。
“對植物細菌病原體的抗性”是指在轉基因葡萄(或葡萄部分或細胞、種子或其體細胞胚胎)上對病原體(例如，葡萄農桿菌或根瘤農桿菌)的抗性水平高于相對于對照葡萄(例如非轉基因葡萄樹)的抗性。在優選實施方案中，在轉基因葡萄樹上對病原體的抗性水平至少比對照葡萄樹的抗性水平高5-10％(優選20％、30％、或40％)。在其它優選實施方案中，對所述病原體的抗性比對照葡萄樹高50％、60％、更優選75％或90％；最優選比對照葡萄樹高100％的抗性。所述抗性水平是用常規方法測定的。例如，對農桿菌屬的抗性水平可以通過比較轉基因葡萄樹的物理特征(例如，植物高度和重量，或通過比較病害癥狀，例如，推遲的冠癭形成，變小的冠癭，或莖干減弱的畸形)或通過比較在所述植物上存活的病原體群體(例如，通過測定轉基因植物和對照植物上農桿菌屬的系統性群體)。
如上文所述，業已發現vir核酸序列virE2缺失B的表達使轉基因葡萄樹產生對由農桿菌屬細菌導致的冠癭病的抗性。因此，由于沒有其它能有效控制葡萄上的農桿菌的方法，本發明為葡萄種植者提供了多種重要的改進和優點。例如，通過證實所述序列能有效抗冠癭病的形成，本發明提供了一種預防所述病害的有效并且經濟的方法。所述預防能減弱或降低對傳統措施的需要，例如，化學處理，葡萄種植者通常用這種方法來控制農桿菌屬的蔓延，并在葡萄園中提供對導致這種病害的病原體的抗性的預防作用。另外，由于表達vir核酸序列或抗病原體片的葡萄植物不太容易受農桿菌屬(例如，葡萄農桿菌和根瘤農桿菌)的影響，并因此不太容易受冠癭病的影響，本發明還提供了較高的產量效率，以及改善的品質、顏色、香味、和葡萄產量。另外，由于本發明降低了對化學預防葡萄樹病原體的必要性，它有利于保護葡萄園種植的環境。
通過閱讀下面的說明書及其優選實施方案和權利要求書可以了解本發明的其它特征和優點。
詳細說明首先說明附圖。
附1是表示T-DNA片段的部分圖譜的示意圖，該片段含有受串接的CaMV35S啟動子控制的virE2缺失B轉基因。
圖2用源于根瘤農桿菌菌株A6的virE2缺失B基因轉化101-Mgt的柱形圖，所得到的若干轉基因品系與對照植物相比具有抗性。
概述用根瘤農桿菌和葡萄農桿菌進行遺傳學研究，以便鑒定可用于增強葡萄植物對病原體感染的抗性的Vir蛋白產物(例如，virE2基因的缺失突變體)。用根瘤農桿菌菌株C58(該菌株攜帶胭脂氨酸型Ti質粒)、根瘤農桿菌菌株A6(該菌株攜帶章魚氨酸型Ti質粒)、和葡萄農桿菌菌株CG450(該菌株攜帶vitopineTi質粒)制備突變型virE2缺失B轉基因構建體(Citovsky等，科學2561802-1806，1992)。virE2缺失B基因編碼缺少215個羧基末端氨基酸的VirE2蛋白。這種截短缺少了VirE2蛋白的單鏈T-DNA(ssT-DNA)結合域。然后用一個轉基因轉化葡萄根莖(例如Courderc3309(河岸葡萄×沙地葡萄；“C3309”)，101-14Millarder et DE Grasset(河岸葡萄×沙地葡萄；“101-14Mgt”，和Richter110(冬葡萄×沙地葡萄；“110R”)，以及煙草(例如，Nicotiana benthamiana)，該轉化體能表達virE2基因的缺失B(
圖1)。制備表達所述轉基因構建體的轉基因植物，隨后評價對冠癭病的抗病性。
下面的實施例只是用于說明本發明的目的的，并不構成對本發明的限定。
virE2缺失B轉基因構建體和農桿菌屬菌株按如下方法制備virE2缺失B基因構建體。virE2缺失B基因是突變型virE2基因，缺少編碼ssDNA結合基序的片段(Citovsky等，科學2561802-1805，1992)。所述基因是從根瘤農桿菌菌株C58和根瘤農桿菌菌株A6獲得的，所述菌株分別具有胭脂氨酸和章魚氨酸型Ti質粒。virE2缺失B基因還可以從攜帶vitopine型Ti質粒的葡萄農桿菌菌株CG450制備。由根瘤農桿菌菌株C58和葡萄農桿菌菌株CG450DNA擴增virE2缺失B基因，使用引物5'nop(5’-TACTTACCATGGATCCGAAGGCCAAGGC；序列1)，該引物與胭脂氨酸virE2基因的5’編碼區相同， 和3’nop(5’-TCTTGACCATGGCTATCGATTCTCGCCGGCGGAACTC；序列2)，與相同基因的1000-1020號核苷酸位置雜交。由根瘤農桿菌菌株A6擴增章魚氨酸型virE2缺失B突變型，使用寡聚體引物5’oct(與章魚氨酸型virE2基因的5’區相同)和3’oct(互補于從翻譯起始密碼子開始的927-951號核苷酸位置)。
按如下方法進行源于不同Ti質粒的virE2缺失B基因的聚合酶鏈式反應(PCR)擴增。用每一種寡聚體引物各0．5微克按照生產商的說明(Perkin-Eller Cetus)擴增virE2缺失B基因。PCR循環為在92℃下1分鐘(變性)，在50℃下1分鐘(退火)，和在72℃下2分鐘(聚合)。直接加樣，并在1．2％的瓊脂糖凝膠上分離。從凝膠中提取分離的virE2缺失B片段，乙醇沉淀，并溶解在20微升蒸餾水中。然后用限制性酶NcoI消化凝膠分離的突變型基因片段，并直接克隆到NcoI消化過的植物表達載體pEPT8上。因此，rirE2編碼序列的表達是由融合在表達載體pEPT8的苜蓿花葉病毒(AIMV)的5’非翻譯前導序列上的雙CaMV35S啟動子控制的。用HindIII從所述構建體上切除所述表達框，并連接到用相同的酶裂解過的植物轉化載體pBIN19上。按照標準方法通過電穿孔將所得到的轉化載體pBIN19-EPT8-virE2-C58(圖1)、pBIN19-EPT8-virE2-A6、和pBIN19-EPT8-virE2-CG450轉入根瘤農桿菌菌株C58sZ707中。
用virE2缺失B轉基因構建體轉化葡萄和煙草用下面的農桿菌屬共培養方法，用virE2缺失B轉基因構建體轉化C3309、101-14Mgt、和110R的胚胎發生愈傷組織。
能夠產生體細胞胚胎的胚胎發生愈傷組織是按照標準方法用培養的花藥培育的。簡單地講，通過Rajasekaran和Mullins的方法用根莖克隆C3309、101-14Mgt、和110R的花藥開始愈傷組織培養(實驗植物學雜志30399-407，1979)。在春天和夏初從大田生長的植物上在開花之前采集芽，從團塊中取出，并在70％乙醇中進行表面消毒1-2分鐘。將所述芽轉移到1％次氯酸鈉中浸泡15分鐘，然后在消毒雙蒸餾水中漂洗3次。在無菌條件下將半透明的黃色花藥從花芽中切除。在無菌條件下剝離花藥并以每個培養皿40或50個花藥的密度鋪平板在起始培養基上。在28℃下在黑暗中培養花藥。在30天內形成胚胎發生愈傷組織。
在28℃下在震蕩培養器上LB培養基中生長用于轉化的含有virE2缺失B轉基因構建體的根瘤農桿菌的過夜培養物。以3000rpm的速度離心細菌5分鐘，并重新懸浮在MS液體培養基(A600nm下OD0．4-0．5)，將具有球形或心形胚胎的愈傷組織浸泡在細菌懸浮液中15分鐘，吸水干燥，并轉移到含有乙酰丁香酮(100μM)的HMG培養基上。在28℃下在黑暗中培養胚胎發生愈傷組織和所述細菌48小時。然后在添加了頭孢噻腭(300微克／毫升)和羧卞青霉素(400微克／毫升)的MS液體中洗滌所述植物材料2-3次。將所述材料轉移到含有相同抗生素的HMG培養基中1-2次。2周之后，將胚胎發生愈傷組織從含有20或40毫克／升卡那霉素和300毫克／升頭孢噻腭，加200毫克／升羧卞青霉素的HMG培養基上，以便選擇轉基因胚胎。在選擇培養基上生長3-4個月，然后將胚胎轉移到不含卡那霉素的HMG、MGC、或MSE上。在大約4個月之后，將所有材料轉移到不含抗生素的培養基上。在下胚軸形成之后將胚胎轉移到不含抗生素的發根培養基上。
將未轉化過的愈傷組織生長在含或不含卡那霉素的相同培養基上作為對照，以便證實抗生素選擇的效率，和所述材料的再生能力。煙草的轉化用葉片轉化方法轉化煙草植物N．tabacum和N．benthamiana(Horsch等，科學2271229，1985)。二元載體pBINl9-EPT8-virE2-C58和pBINl9-EPT8-virE2-A6與葡萄轉化中所使用的相同(圖1)。從所述葉片再生芽，從原始的外殖體上切除，并讓其在含有卡那霉素的MS培養基上長根。讓煙草植物自交，并將R1代用于抗性分析。
轉基因植物的鑒定回收轉基因植物，并通過常規NPTII-ELISA鑒定。回收轉基因煙草的轉基因C3309、101-14Mgt、和110R植物和品系。按下述方法從選擇的植物的幼小葉片中提取總DNA，并通過常規聚合酶鏈式反應(PCR)檢測所述轉基因的存在。在大多數轉基因植物中觀察到相當于virE2缺失B轉基因的1．020kb PCR產物。
通過Southern印跡雜交進一步分析選擇的轉基因C3309植物的基因拷貝數，使用1．0kbvirE2缺失B基因作為探針。易感的和抗性植物具有較少的轉基因拷貝(1-4)。通過下面所述的Northern印跡分析檢測virE2缺失B基因mRNA的含量。發現轉基因抗性植物所表達的virE2缺失B mRNA的含量高于易感植物的。
對于上述分析來說，按照Krastanova等所述方法從植物中分離總DNA(植物細胞報導14550-554，1995)。按上述方法對總的植物基因組DNA進行PCR反應，使用45℃的退火溫度而不是50℃。對于Southern印跡雜交來說，用HandIII、PstI、和KpnI消化20微克的DNA，在1％的瓊脂糖TBE凝膠上對總的基因組DNA進行電泳，并吸印到Nytran濾膜上(Schleicher和Schuell，Keene，NH)，按照生產商的說明。在80℃的烘箱中干燥所述印跡1小時，然后按照Sambrook等所述方法進行預雜交和雜交(分子克隆實驗室手冊，冷泉港實驗室出版社，N．Y．1989)。用購自Gibco BRL(Gaithersburg，MD)的RadPrime DNA標記系統構建32PdCTP-標記的探針。用與提取DNA相同的方法從轉基因植物中提取RNA，在-20℃下用2M氯化鋰沉淀總核酸過夜，以便選擇總的RNA。按照Sambrook等披露的方法在變性甲醛凝膠上對RNA(20微克)進行電泳(同上)，并吸印到Nytran-N上，并用與Southern印跡相同的探針進行預雜交和雜交。
抗病性按以下方法測定葡萄植物的轉基因品系對冠癭病的抗性。按照Pu和Goodman披露的方法接種葡萄莖節間(生理學和分子植物病理學41241-254，1992)，用于該實驗的接種物是根瘤農桿菌菌株C58或根瘤農桿菌菌株A6。在28℃下在PDA培養基上生長細菌48小時，如果合適的話可以含有抗生素．對于接種來說，將細菌重新懸浮在無菌雙蒸餾水(A600nm=0．1)，對于C58來說大約為1×108cfu／ml。將5微升接種物或其稀釋液涂在切割的葡萄節間上，并在接種后(dpi)7天、14天、和21天觀察所述植物上腫瘤的形成。
用根瘤農桿菌菌株C58或A6接種的非轉基因對照一致地表現出腫瘤形成。在易感植物上，偶爾會在7dpi觀察到冠癭形成，不過，通常在大約10dpi出現，并且在14dpi容易觀察到。分析一級轉化體，并發現某些一級轉化體能抑制冠癭形成。接種過的某些芽能夠形成腫瘤。如果與未轉化的芽相比冠癭受到50％或50％以上的抑制即可將該植物統計為抗性的。
業已制備了對冠癭具有抗性的品系C3309、101-14Mgt、和110R。在圖2中示出了在用根瘤農桿菌菌株A6接種轉基因101-14Mgt(表達virE2缺失B轉基因，該轉基因是由根瘤農桿菌菌株A6制備的)之后對冠癭形成的抗性的典型結果。
另外，能表達源于根瘤農桿菌菌株C58的virE2缺失B轉基因的葡萄根莖C3309由大約45％的植物表現出對冠癭病的顯著抗性(表1，見下文)。
表1通過接種根瘤農桿菌菌株C58評價表達virE2缺失B轉基因的葡萄根莖C3309轉基因品系對冠癭的抗性
在體外用根瘤農桿菌菌株C58的細菌懸浮液(大約107cfu／ml)接種每一個植物的15-20個芽的切片。如果在接種之后6天所述芽接種物形成冠癭的比率低于40％就認為該植物是抗性的。來自非轉基因對照植物的芽100％的形成冠癭。
按如下方法分析煙草對冠癭病的抗性。讓轉基因煙草植物生長到6厘米大小，然后用10微升農桿菌屬菌株CG49或K306的過夜培養懸浮液接種所述植物。在2-3周之后檢查植物的腫瘤形成。
還評價了由農桿菌菌株C58(攜帶胭脂氨酸型Ti質粒)和根瘤農桿菌菌株A6(攜帶章魚氨酸型Ti質粒)制備的表達virE2缺失B基因的煙草品系對冠癭病的抗性。用葡萄農桿菌菌株CG49(攜帶胭脂氨酸型Ti質粒)或葡萄農桿菌菌株K306(攜帶章魚氨酸型Ti質粒)接種所述植物。該實驗的典型結果在下面的表2中示出。
表2用葡萄農桿菌菌株CG49(攜帶胭脂氨酸型Ti質粒)和葡萄農桿菌菌株K306(攜帶章魚氨酸型Ti質粒)接種能表達來自根瘤農桿菌菌株C58(攜帶胭脂氨酸型Ti質粒)和根瘤農桿菌菌株A6(攜帶章魚氨酸型Ti質粒)的virE2缺失B轉基因的轉基因N．benthamiana的典型抗性資料。
通過Northern印跡測定virE2表達，+號的個數表示所述信號的強度。用大約為107cfu／ml和大約106cfu／ml的病原體濃度接種植物。0=在接種位點無冠癭或膨脹。0．5=在接種位點有有限的小的冠癭；而3=在接種位點有很大的冠癭。所有非轉基因對照植物都能形成2-3級的冠癭。
在接種葡萄農桿菌屬菌株CG49或葡萄農桿菌菌株k306時，能表達源于根瘤農桿菌菌株A6的章魚氨酸virE2缺失B轉基因或源于根瘤農桿菌菌株C58的胭脂氨酸virE2缺失B轉基因的煙草品系表現出在冠癭病方面有大約50％的減弱(表2，出處同上)。分離vir基因或其抗病原體片段任何Ri或Ti質粒(例如，胭脂氨酸、vitopine、章魚氨酸、章魚氨酸／南瓜氨酸、leucinopine／農桿氨酸、succinamopine、或農桿氨酸型Ti質粒)均可用作vir基因或其抗病原體片的分子克隆的核酸來源。例如，vir基因(例如，virE2或virD2)的分離包括分離編碼具有vir-相關結構、特性、或活性的蛋白的DNA序列。根據所披露的有關virE2的(例如，參見GenBank保藏號2773266，138480，138481，95134，77949，737146，39124，154801和154727)和virD2核苷酸和氨基酸序列(例如，參見GenBank保藏號138464，138463，138465，95129，95128，77931，95077，737141，39000，154829和154796)，可以用本領域眾所周知的標準方法和技術分離vir編碼序列。
在一種具體實施例中，本文所披露的vir序列可以與常規核酸雜交篩選方法一起使用。所述雜交技術和篩選方法為本領域技術人員所熟知，例如，參見Benton和Davis，科學196180，1977；Grunstein和Hogness，Proc．Natl．Acad．Sci．USA72396l，1975；Ausubel等，當代分子生物學方法，Wiley Interscience，紐約；Berger和Kimmel，分子克隆技術指南，1987，學術出版社，紐約；和Sambrook等，分子克隆，實驗室手冊，冷泉港實驗室出版，紐約，1989。在一種具體實施例中，可將virE2或virD2核苷酸序列的全部或部分(由Citovsky披露，見下文)用作探針篩選重組Ti質粒DNA文庫中具有與virE2或virD2基因相同的序列的基因。通過噬斑或菌落雜交用標準方法檢測雜交序列，例如，下文所披露的方法。
另外，使用vir基因的氨基酸序列的全部或一部分及其遺傳密碼，人們可以方便地設計vir-專一性寡核苷酸探針，包括vir簡并寡核苷酸探針(即，特定氨基酸序列的所有可能編碼序列的混合物)。所述寡核苷酸可以基于DNA鏈的序列和vir序列的任何合適部分。提供了設計和制備所述探針的一般方法，例如，參見Ausubel等，1996，當代分子生物學方法，Wiley Interscience，紐約和Berger和Kimmel，分子克隆技術指南，1987，學術出版社，紐約。所述寡核苷酸可用于vir基因分離，將其用作探針能夠與vir互補序列雜交，或者用作引物用于各種擴增技術，例如，聚合酶鏈式反應(PCR)克隆方法(例如，本文所披露的方法)，如果需要，可將不同寡核苷酸探針的組合用于篩選重組DNA文庫。所述寡核苷酸可以用本領域已知的方法進行可檢測的標記，并用于檢測來自重組DNA文庫的濾膜復制體。按照本領域已知方法制備重組DNA文庫，例如，參見Ausubel等(同上)，或可以從商業渠道獲得。一旦鑒定了vir核苷酸序列，就按照標準方法進行克隆和操作，并用于構建本文所披露的植物表達載體。
植物轉基因的構建除了用virE2缺失B基因轉基因構建體轉化葡萄植物之外，還可以通過用野生型virE2基因或其它virE2突變型基因，例如，缺失C(減弱多肽ssT-DNA和NSE1結合活性，例如，通過缺失virE2基因的228-244號氨基酸)或缺失D(減弱多肽ssT-DNA和NSE2結合活性)轉化所述植物還可以獲得對農桿菌屬感染的抗性。VirE2缺失C突變的一個例子包括生產編碼缺少228-244號氨基酸的VirE2蛋白的轉基因(Citovsky等，科學2561802-1806，1992)。VirE2缺失D突變的一個例子包括生產編碼缺少296-3lO號氨基酸的VirE2蛋白的轉基因(Citovsky等，同上)。還可以用virD2野生型或virD2突變型基因轉化葡萄植物，以便產生對農桿菌屬腫瘤形成能力的抗性。VirD2基因上的突變還能減弱農桿菌屬ssT-DNA的細胞核轉運(例如，能夠抑制T-DNA鏈輸入植物細胞核的突變，能夠增強細胞核定位信號的活性的突變，或能防止VirD2蛋白與T-鏈結合的突變)。
當獲得了編碼所需要的野生型或突變型vir基因的DNA序列時，將所述序列插入合適的植物轉化載體上，用于轉化葡萄植物。公眾可以獲得多種適于穩定或染色體外感染植物細胞或建立轉基因植物的載體；如披露于下列文獻中的載體Pouwels等(同上)，Weissbach和Weissbach(同上)和Gelvin等(同上)。用于構建所述細胞系的方法披露于諸如Weissbach和Weissbach(同上)和Gelvin等(同上)的文獻中。可用于在葡萄樹中表達轉基因的載體的例子還披露于以下文獻中Scorza等(植物細胞報導14589-592，1995)，Baribault等(實驗植物學雜志411045-1049，1990)，Mullins等(生物技術81041-1045，1990)，Nakano等(實驗植物學雜志45649-656，1994)，Kikker等(植物細胞報導15311-316，1995)，Krastanova等(植物細胞報導1550-554，1995)，Scorza等(植物細胞報導14589-592，1994)，Scorza等(美國園藝科學協會雜志121616-619，1996)，Martinelli等(理論應用遺傳學88621-628，1994)和Legall等(植物科學102161-170，1994)。
通常，植物表達載體包括(1)一個受5’和3’表達控制序列的轉錄控制的克隆基因(例如，野生型或突變型vir基因)和(2)一個顯性選擇標記。如果需要，所述植物表達載體還可以包括一個啟動子調控序列(例如，能產生誘導型或組成型、病原體或創傷誘導、環境或發育調控、或細胞或組織專一性表達的序列)，一個轉錄起始位點，一個核糖體結合位點，一個RNA加工信號，一個轉錄終止位點，和／或一個聚腺苷酸化信號。
在其組成部分中，將編碼野生型或突變型vir基因的DNA序列與具有能夠在宿主葡萄樹細胞中啟動轉錄的轉錄起始控制片段的DNA構建體結合。一般來說，該構建體通常包括能夠在植物中起作用的調控區，該調控區能夠改變野生型或突變型Vir蛋白的產生，如本文所披露的。所述序列、突變序列、或其片段的5’末端可以與一個轉錄起始調控區接合，例如，天然存在于植物結構基因的5’上游區的序列。有多種轉錄起始區可供使用，這些轉錄起始區可以提供組成型或誘導型調控。
對于需要發育、細胞、組織、激素、或環境表達的應用來說，合適的5’上游非編碼區是從其它基因獲得的，例如，從在分生組織發育、種子發育、胚胎發育、葉片發育、莖發育、和蔓發育期間調節的基因獲得。
還可以在本發明DNA構建體上提供轉錄終止調控區。轉錄終止區可以從常規的基因來源(例如，NOS或35S CaMV終止子)任何常見轉錄終止區提供。所述轉錄終止區優選還包括至少1-3kb的獲得該終止區的結構基因的3’序列。具有野生型或突變型vir基因，如用于表達的感興趣的DNA序列的植物表達構建體可用于多種葡萄樹上。所述遺傳工程植物可用于多種商業和農業目的。重要的是，本發明可應用于所有葡萄樹或葡萄樹部分，并可方便地應用于任何新的或改進的葡萄轉化或再生方法。
所述表達結構至少包括一個可操作地連接于至少一個野生型或突變型vir基因序列上的啟動子。根據本發明，一種有用的植物啟動子的例子是花葉病毒啟動子，例如，花椰菜花葉病毒(CaMV)啟動子。所述啟動子能夠在大多數植物組織中進行高水平表達，并且所述啟動子的活性不取決于由病毒編碼的蛋白。CaMV是35S和19S啟動子的來源。在轉基因植物的大多數組織中，CaMV35S啟動子是強啟動子(例如，參見Odell等，自然313810，1985)。CaMV啟動子在單子葉植物中也具有高度活性(例如，參見Dekeyser等，植物細胞2591，1990；Terada和Shimamoto，分子基因遺傳學220389，1990)。另外，通過CaMV35S啟動子的重復還可以進一步加強該啟動子的活性(即提高2-10倍)(例如，參見Kay等，科學2361299，1987；Ow等，Proc．Natl．Acad．Sci．USA844870，1987；和Fang等，植物細胞1141，1989，和McPherson和Kay，US5，378，142)。
其它有用的植物啟動子包括，但不限于胭脂氨酸合成酶(NOS)啟動子(An等，植物生理學88547，1988)，章魚氨酸合酶啟動子(Fromm等，植物細胞1977，1989)，水稻肌動蛋白啟動子(Wu和McElroy，WO91／09948)，環化酶啟動子(Chappell等，WO96／36697)和木薯脈花葉病毒啟動子(Verdaguer等，植物分子生物學311129-1139，1996)。可用于本發明的進一步的代表性啟動子包括，但不限于鴨柘草黃斑病毒(commelina yellow mettle virus7)啟動子，甘蔗badna病毒啟動子，稻tungro Bacilliform病毒啟元件，玉米條紋病毒元件，和小麥矮化病毒啟動子。
對某些用途來說，可能需要在合適的組織中，在合適的水平上或在合適的發育時間生產野生型或突變型vir序列。為此，有一類基因啟動子各自具有其自身的體現在其調節序列上的獨特特征，被證實能調節對諸如環境、激素和／或發育因素的誘導信號的反應。所述啟動子包括，但不限于決定熱調控基因表達的基因啟動子(例如，參見Callis等，植物生理學88965，1988；Takahashi和Komeda，分子基因遺傳學219365，1989；和Takahashi等，植物雜志2751，1992，光調控的基因表達(例如，豌豆rbcS-3A，由Kuhlemeier等披露，植物細胞1471，1989；玉米rbcS啟動子，由Schaffner和Sheen披露，植物細胞3997，1991；存在于豌豆中的葉綠素a／b-結合蛋白基因，由Simpson等披露，EMBO雜志42723，1985；Arabssu啟動子；或稻rbs啟動子)，激素調控的基因表達(例如，源于小麥Em基因的脫落酸(ABA)效應序列，由Marcotte等披露，植物細胞969，1989；ABA誘導型HVA1和HVA22，和rd29A啟動子，由Straub等在大麥和擬南芥屬上披露，植物細胞6617，1994和Shen等，植物細胞7295，1995；和創傷誘導的基因表達(例如，由Siebertz等披露的wunI，植物細胞1961，1989)，器官特異性基因表達(例如，塊莖特異性儲存蛋白基因，由Roshal等披露，EMBO雜志61155，1987；和源于玉米的23-kDa玉米醇溶蛋白基因，由Schernthaner等披露，EMBO雜志71249，1988；或法國菜豆β-菜豆蛋白基因，由Bustos等披露，植物細胞1839，1989)，或病原體誘導型啟動子(例如，PR-1，prp-1或β-1，3葡糖醛酸酶啟動子，真菌誘導型小麥wirla啟動子和線蟲誘導型啟動子，TobRB7-5A和Hmg-1，分別來源于煙草和歐芹)。
還可以選擇性地包括RNA加工信號，例如，內含子，業已證實內含子對于有效的RNA合成和積累來說是重要的(Callis，基因和發育，1∶1183，1987)。RNA剪接序列的定位對植物中的轉基因表達水平有很大影響。另一方面，一個內含子可以位于轉基因上vir基因序列(或其片段)的上游或下游，以便調節基因表達水平。
除了上述5’調控序列之外，所述表達載體還可以包括一般位于植物基因的3’區域的調控區(Thornburg等，Proc．Natl．Acad．Sci．USA84744，1987；An等，植物細胞1115，1989)。例如，在所述表達載體上可以包括3’終止子區，以便增強mRNA的穩定性。所述終止子區之一可以源于馬鈴薯的PⅠ-Ⅱ終止子區。另外，其它常用的終止子源于章魚氨酸或胭脂氨酸合酶信號。
所述植物表達載體通常還含有一個顯性選擇標記基因，用于識別被轉化過的細胞。可用于植物系統的選擇基因包括編碼抗生素抗性基因的基因，例如，編碼對潮霉素、卡那霉素、博萊霉素、G418、鏈霉素、壯觀霉素的抗性的基因。還可將光合作用所需要的基因在光合缺陷型品系中用作篩選標記。最后，還可將編碼除草劑抗性的基因用作選擇標記；有用的除草劑抗性基因包括編碼膦絲菌素乙酰轉移酶的bar基因，該基因能產生對廣譜性除草劑BASTA(Hoechst AG，法蘭克福，德國)的抗性。
另外，如果需要所述植物表達構建體可以含有一種修飾過的或完全合成的可翻譯的vir基因序列(或其片段)該基因序列已經被改變以便增強該基因在植物中的性能。
分子生物學領域，特別是植物分子生物學領域的技術人員可以理解的是，基因表達水平不僅取決于啟動子、RNA加工信號、和終止子元件的組合，而且取決于這些元件是如何被用于提高選擇標記基因表達水平的。
葡萄樹轉化和再生在構建所述植物表達載體時，可以用若干標準方法將所述載體導入植物宿主，以便產生轉基因植物。所述方法包括(1)農桿菌屬介導的轉化(根瘤農桿菌或毛根農桿菌)(例如，參見Lichtenstein和Fuller遺傳工程，第6卷，PWJRigby著，倫敦，學術出版社，1987；和Lichtenstein，C．P．，和Draper，J，參見DNA克隆，第2卷，D．M．Glover著，牛津，IRI出版社，1985))，(2)粒子輸送系統(例如，參見Gordon-Kamm等，植物細胞2603(1990)；或Biorad技術公報1687，同上)，(3)顯微注射方法(例如，參見Green等，同上)，(4)聚乙二醇(PEG)方法(例如，參見Draper等，植物細胞生理學，23；451，1982；或例如，Zhang和Wu，理論應用遺傳學76835，1988)，(5)脂質體介導的DNA攝入(例如，參(例如，參見Freeman等，植物細生理學，251353，1984)，(6)電穿孔方法(例如，參見Gelvin等，同上；Dekeyser等，同上；Fromm等，自然31979l，1986；Sheen植物細胞21027，1990；或Jang和Sheen植物細胞61665，1994)，和(7)渦旋方法(例如，參見Kindle同上)。轉化方法對本發明來說并不重要。能進行有效轉化的任何方法都可以使用。用于轉化葡萄的某些典型方法披露于以下文獻中Scorza等(植物細胞報導14589-592，1995，Baribault等，(實驗植物雜志411045-1049，1990)，Mullins等(生物技術81041-1045，1990)，Nakano等(實驗植物雜志45649-656，1994)，Kikkert等(植物細胞報導15311-316，1996)，Krastanova等(植物細胞報導1550-554，1995)，Scorza等(植物細胞報導14589-592，1994)，Scorza等(美國園藝科學協會雜志121616-619，1996)，Martinelli等(理論應用遺傳學88621-628，1994)，和Leqall等(植物科學102161-170，1994)。如果有比較新的方法可用于轉化葡萄的話，可以直接使用。
用于實施本發明的合適的植物包括，但不限于葡萄樹(例如，葡萄，雜交葡萄，和Euvitis和Muscadinia亞屬的所有成員)，包括接穗栽培種或根莖栽培種。接穗栽培種的例子包括，但不限于被稱作鮮食葡萄或葡萄干的品種，以及用于釀酒的葡萄，如CabernetFranc，Cabernet Sauvignon，Chardonnay(例如，CH01，CH02，CHDijon)，Merlot，Pinot Noir(PN，PN Dijon)，Semillon，WhiteRiesling，Lambrusco，Thompson Seedless，Autumn Seedless，Niagrara Seedless，和Seval Blanc．可以使用的其它接穗栽培種包括通常被稱作鮮食葡萄或葡萄干的栽培種，如Alden，Almeria，AnabE-Shahi，Autumn Black，Beauty Seedless，Black Corinth，Black Damascus，Black Malvoisie，Black Prince，Blackrose，Bronx Seedless，Burgrave，Calmeria，Campbell Early，Canner，Cardinal，Catawba，Christmas，Concord，Dattier，Delight，Diamond，Dizmar，Duchess，Early Muscat，Emerald Seedless，Emperor，Exotic，Ferdinand de Lesseps，Fiesta，Flame Seedless，Flame Tokay，Gasconade，Gold Himrod，Hunisa，Hussiene，Isabella，Italia，July Muscat，Khandahar，Katta，Kourgane，Kishmishi，Loose Perlette，Malaga，Monukka，Muscat ofAlexandria，Muscat Flame，Muscat Hamburg，New York Muscat，Niabell，Niagara，Olivette Blanche，Ontario，Pierce，Queen，Red Malaga，Ribier，Rish Baba，Romulus，Ruby Seedless，Schuyler，Seneca，Suavis(IP 365) ，Thompson Seedless， 和Thomuscat。它們還包括被用于葡萄酒生產的品種，如Aleatico，Alicante Bouschet，Aligote，Alvarelhao，Aramon，Baco blanc(22A)，Burger，Cabernet Franc，Cabernet，Sauvignon，Calzin，Carignane，Charbono，Chardonnay，Chasselas dore，Chenin blanc，Clairette blanche，Early Burgundy，Emerald Riesling，FeherSzagos，Fernao Pires，Flora，French Colombard，Fresia，Furmint，Gamay，Gewurztraminer，Grand noir，Gray Riesling，GreenHungarian，Green Veltliner，Grenache，Grillo，Helena，Inzolia，Lagrein，Lambrusco de Salamino，Malbec，Malvasia bianca，Mataro，Melon，Merlot，Meunier，Mission，Montua de Pilas，Muscadelle du Bordelais，Muscat blanc，Muscat Ottonel，MuscatSaint-Vallier，Nebbiolo，Nebbiolo fino，Nebbiolo Lampia，OrangeMuscat，Palomino，Pedro Ximenes，Petit Bouschet，Petite Sirah，Peverella，Pinot noir，Pinot Saint-George，Primitivo di Gioa，Red Veltliner，Refosco，Rkatsiteli，Royalty，Rubired，RubyCabernet，Saint-Emilion，Saint Macaire，Salvador，Sangiovese，Sauvignon blanc，Sauvignon gris，Sauvignon vert，Scarlet，Seibel 5279，Seibel 9110，Seibel 13053，Semillon，Servant，Shiraz，Souzao，Sultana Crimson，Sylvaner，Tannat，Teroldico，Tinta Madeira，Tinto cao，Tourega，Tramier，Trebbiano Toscano，Trousseau，Valdepenas，Viognier，Walschriesling，WhiteRiesling，和Zinfandel。
可用于本發明的根莖栽培種包括，但不限于，沙地葡萄Constantia，沙地葡萄St．George，加州葡萄，谷地葡萄，圓葉葡萄，圓葉葡萄Carlos，Richter 11O(冬葡萄×沙地葡萄)，101-14 Millarder et de Grasset(河岸葡萄×沙地葡萄)，Teleki 5C(冬葡萄×河岸葡萄)，3309 Courderc(河岸葡萄×沙地葡萄)，Riparia Gloire de Montpellier(河岸葡萄)，5BB Teleki(選擇性Kober，冬葡萄×河岸葡萄)，SO4(冬葡萄×沙地葡萄)，41BMillardet(歐洲葡萄×冬葡萄)，和039-16(歐洲葡萄×圓葉葡萄)。可以使用的其它根莖栽培種包括Couderc1202，Couderc 1613，Couderc 1616，Dog Ridge，Foex 33EM，Freedom，Ganzin 1(A x R#1)，Harmony，Kober 5BB，LN33，Millardet＆de Grasset 41B，Millardet& de Grasset 420A，Millardet & de Grasset 101-14，Oppenheim4(SO4)，Paulsen 775，Paulsen 1045，Pualsen 1103，Richter 99，Richter 110，Riparia Gloire，Ruggeri 225，Saint-George，SaltCreek，Teleki 5A，沙地葡萄Constantia，加州葡萄，和谷地葡萄。
一般來說，在植物細胞中轉移和表達轉基因的方法對本領域技術人員來說是常規方法，并且，業已成為在植物中進行基因表達研究和生產農業上或商業上感興趣的改進的植物品種的主要工具。
用植物表達載體轉化的植物細胞可以按照標準植物組織培養技術從單細胞、愈傷組織、或葉片再生。本領域眾所周知，幾乎來自任何植物的各種細胞、組織、和器官均能成功地培養再生完整植株；所述技術披露于以下文獻中Vasil同上；Green等，同上；Weissbach和Weissbach，同上；和Gelvin等，同上。用于由轉化的材料再生葡萄植物的典型方法披露于以下文獻中。Scorza等(植物細胞報導14589-592，1995，Baribault等，(實驗植物雜志411045-1049，1990)，Mullins等(生物技術81041-1045，1990)，Nakano等(實驗植物雜志45649-656，1994)，Kikkert等(植物細胞報導15311-316，1996)，Krastanova等(植物細胞報導1550-554，1995)，Scorza等(植物細胞報導14589-592，1994)，Scorza等(美國園藝科學協會雜志121616-619，1996)，Martinelli等(理論應用遺傳學88621-628，1994)，和Leeall等(植物科學102161-170，1994)。
在一種具體實施方案中，將受35S CaMV啟動子和胭脂氨酸合酶終止子控制并攜帶選擇標記(例如，卡那霉素抗性)的克隆的vir轉基因構建體(例如，基于胭脂氨酸、vitopine、章魚氨酸、章魚氨酸／南瓜氨酸、leucinopine／農桿氨酸、succinamopine、或農桿氨酸型Ti質粒的virE2編碼序列或基于存在于Ri質粒上的該編碼序列的virE2、virD2、virE2缺失B、virE2缺失C、或virE2缺失E突變)轉入農桿菌屬。用含有載體的農桿菌屬轉化葡萄樹是按照Scorza等所述方法進行的(美國園藝科學協會雜志121616-619，1996)。在含有卡那霉素的植物組織培養基上培養數周之后選擇推測的轉化體。然后將卡那霉素抗性植物材料放置在不含激素的植物組織培養基上進行發根。
然后按照標準檢測技術篩選表達所述選擇標記的轉基因植物對所述轉基因DNA的遺傳。與相同的轉基因形成的其它轉基因植物相比，每一個陽性轉基因植物及其轉基因后代是統一的。在大多數情況下，轉基因DNA整合導植物基因組DNA中是偶然的。并且其整合位點能顯著影響轉基因表達的水平和組織和發育模式。因此，通常將多個轉基因品系用于篩選每一個轉基因，以便鑒定并選擇具有最合適的表達形式的植物。
評價轉基因品系的轉基因表達水平。首先測定RNA水平上的表達，以便鑒定并定量陽性表達植株。使用RNA分析的標準技術，所述技術包括PCR擴增分析，使用為了僅僅擴增轉基因RNA模板而設計的寡核苷酸引物，以及使用轉基因專一性探針的溶液雜交分析(例如，參見Ausubel等，同上)。然后用上述方法分析陽性RNA植株對農桿菌感染和冠癭形成的抗性。收集能表達virE2基因(或virD2基因)或其片段并相對于對照植物具有對冠癭病抗性的轉化的葡萄樹，并將其用于本發明。
在本說明書中所提到的所有文獻和專利申請都以相同的程度收作本文的參考文獻，就如同每一件獨立的文件或專利申請被專門和分別指明收作參考文獻一樣。
序列表&#60110&#62康乃爾研究基金公司&#60120&#62葡萄樹的抗細菌性&#60130&#6207678／030WO2&#60150&#6260／062，246&#60151&#621997-10-17&#60160&#622&#60170&#62FastSEQ for windows Version3．0&#60210&#621&#60211&#6229&#60212&#62DNA&#60213&#62人工序列&#60220&#62&#60223&#62合成引物&#60400&#621tacttaccat ggatccgaag gccgaaggc
&#60210&#622&#60211&#6237&#60212&#62DNA&#60213&#62人工序列&#60220&#62&#60223&#62合成引物&#60400&#622tcttgaccat ggctatcgat tctcgccggc ggaactc
權利要求
1．一種提供對能感染葡萄樹或葡萄樹部分的植物細菌病原體的抗性的方法，該方法包括以下步驟(a)用一個能在葡萄植物細胞中表達的vir基因或其抗病原體片段轉化葡萄植物細胞；(b)由所述葡萄植物細胞再生轉基因葡萄樹或轉基因葡萄樹部分；和(c)選擇表達所述vir基因或其抗病原體片段的轉基因葡萄樹或轉基因葡萄樹部分，其中，所述vir基因或其抗病原體片段的表達能產生對植物細菌病原體的抗性。
2．如權利要求1的方法，其中，所述vir基因或其抗病原體片段被整合到轉基因葡萄樹或轉基因葡萄樹部分的基因組中。
3．如權利要求1的方法，其中，所述vir基因是virE2。
4．如權利要求1的方法，其中，所述vir基因是virD2。
5．如權利要求1的方法，其中，所述抗病原體基因片段是virE2缺失B。
6．如權利要求1的方法，其中，所述轉基因葡萄樹或轉基因葡萄樹部分是葡萄屬的一員。
7．如權利要求1的方法，其中，所述轉基因葡萄樹部分是體細胞胚胎，接穗、或根狀莖。
8．如權利要求1的方法，其中，所述細菌病原體是農桿菌屬。
9．如權利要求8的方法，其中，所述農桿菌屬是葡萄農桿菌。
10．如權利要求8的方法，其中，所述農桿菌屬是根瘤農桿菌。
11．如權利要求1的方法，其中，所述vir基因或其抗病原體片段的表達能減弱在所述轉基因葡萄樹或轉基因葡萄樹部分上形成冠癭。
12．如權利要求1的方法，其中，所述vir基因或其抗病原體片段源于Ti質粒。
13．一種用vir基因或其抗病原體片段轉化的轉基因葡萄樹或轉基因葡萄樹部分，其中，所述vir基因或其抗病原體片段在所述轉基因葡萄樹或轉基因葡萄樹部分中的表達提供了對植物細菌病原體的抗性。
14．如權利要求13的轉基因葡萄樹或轉基因葡萄樹部分，其中，所述vir基因或其抗病原體片段被整合到所述轉基因葡萄樹或轉基因葡萄樹部分的基因組中。
15．如權利要求13的轉基因葡萄樹或轉基因葡萄樹部分，其中，所述vir基因是virE2。
16．如權利要求13的轉基因葡萄樹或轉基因葡萄樹部分，其中，所述vir基因是virD2。
17．如權利要求13的轉基因葡萄樹或轉基因葡萄樹部分，其中，所述抗病原體基因片段是virE2缺失B。
18．如權利要求13的轉基因葡萄樹或轉基因葡萄樹部分，其中，所述葡萄樹或葡萄樹部分是葡萄屬的一員。
19．如權利要求13的轉基因葡萄樹或轉基因葡萄樹部分，其中，所述葡萄樹部分是體細胞胚胎、接穗、或根莖。
20．如權利要求13的轉基因葡萄樹或轉基因葡萄樹部分，其中，所述細菌病原體是農桿菌屬。
21．如權利要求20的轉基因葡萄樹或轉基因葡萄樹部分，其中，所述農桿菌屬是葡萄農桿菌。
22．如權利要求20的轉基因葡萄樹或轉基因葡萄樹部分，其中，所述農桿菌屬是根瘤農桿菌。
23．如權利要求13的轉基因葡萄樹或轉基因葡萄樹部分，其中，所述vir基因或其抗病原體片段的表達能減弱冠癭在所述轉基因葡萄樹或葡萄樹部分上的形成。
24．如權利要求13的轉基因葡萄樹或轉基因葡萄樹部分，其中，所述vir基因或其抗病原體片段源于Ti質粒。
全文摘要
本發明涉及用vir基因或其抗病原體片段轉化過的轉基因葡萄樹或轉基因葡萄樹部分,其中,所述vir基因或其抗病原體片段在轉基因葡萄樹或轉基因葡萄樹部分中的表達,可以產生對植物細菌病原體(例如,葡萄農桿菌)的抗性。
文檔編號C12N15/84GK1282374SQ98812278
公開日2001年1月31日 申請日期1998年10月15日 優先權日1997年10月17日
發明者T·J·布爾, D·貢薩爾維斯, S·Z·龐 申請人:康乃爾研究基金會有限公司