人sel－10多肽及編碼其的多核苷酸的制作方法

專利名稱：人sel－10多肽及編碼其的多核苷酸的制作方法
技術領域：
本發明提供了包含編碼人sel-10的兩個可選擇剪接變異體中的任何一個的多核苷酸的分離的核酸分子，這兩個變異體中的一個在海馬細胞中表達，另一個在乳腺細胞中表達。本發明也提供了分離的sel-10多肽。
背景技術：
早老性癡呆(AD)是在中老年階段引起進行性記憶和識別衰退的中樞神經系統變性疾病。此病伴隨廣泛的神經病理學特征，包括細胞外淀粉樣空斑和神經元內神經纖維纏結(Sherrington,R.,等；自然(Nature)375754-60(1995))。盡管并不完全了解導致AD的致病途徑，但已知幾個遺傳位點與此病的發展有關。
通過使用在早期發病的AD家族中的圖譜研究，已鑒定了與早期發病的早老性癡呆(AD)有關的基因。這些研究表明，在染色體1和14上的遺傳位點可能與AD有關。染色體14位點的定位克隆鑒定了編碼8跨膜結構域蛋白質的一種新的突變基因，此基因后來被命名為早老素(presenilin)-1(PS-1)(Sherrington,R.等，自然375754-60(1995))。人EST數據庫的blast搜尋揭示了與PS-1顯示同源性的單個EST，稱之為早老素-2(PS-2)，經證明其是染色體1上與AD有關的基因。(Levy-Lahad,E.等，科學(Science)269937-977(1995)；Rogaev,E.I.,等，自然376775-8(1995)；Li,J.等，美國國家科學院院報(Proc.Natl.Acad.Sci.U.SA.)9212180-12184(1995))。
在PS-1和PS-2上與早老性癡呆有關的突變主要是錯義突變。PS-1和PS-2都經歷了蛋白酶解加工，其能通過在家族性早老性癡呆中發現的點突變而被改[Perez-Tur,J.等，神經報告(Neuroreport)7297-301(1995)；Mercken,M.等，FEBS Lett.389297-303(1996)]。PS-1基因表達廣泛分布在組織中，而在胰和骨骼肌中發現PS-2 mRNA的水平最高。(Li,J.等，美國國家科學院院報9212180-12184(1995)；Jinhe Li，私人通信)。然而，在腦中發現了PS-2蛋白質的水平最高(Jinhe Li，私人通信)。PS-1和PS-2蛋白質都局限于內質網、高爾基體和核膜。(Jinhe Li，私人通信；Kovacs,D.M.等，自然雜志醫藥分冊(Nat.Med.)2224-229(1996)；Doan,A.等，神經元(Neuron)171023-1030(1996))。在PS-1基因或PS-2基因任一個中的突變改變了淀粉樣蛋白質前體(APP)的加工，以至增加了Aβ1-42相應于Aβ1-40的比例(Scheuner,D，等，自然雜志醫藥分冊2864-870(1996))。當在轉基因小鼠中與人APP協同表達，相對于Aβ1-40觀察到Aβ1-42比例的類似增加(Borchelt,D.R.等，神經元171005-1013(1996)；Citron,M.等，自然雜志醫藥分冊367-72(1997)；Duff.K.等，自然383710-713(1996))，以及在淀粉樣斑中Aβ沉淀的加速(Borchelt等，神經元19939(1997))。
盡管有關于在AD中PS-1和PS-2所扮演的角色的上述資料，仍不知道它們的生物學功能，它們與大量人類疾病基因一樣也具有未知的生物學功能。在對于基因或其產物的功能未知的情況下，模式生物體中的遺傳分析可能用于把這些基因置于已知的生化或遺傳途徑中。通過篩選抑制或增強所分析基因中的突變效應的外源突變可以達此目的。例如，在疾病基因中，喪失功能型突變的基因外抑制基因可以打開受影響突變基因下游的遺傳或生化途徑，而獲得功能型突變的抑制基因可能關閉此途徑。
可以用于闡明早老素基因功能的模式生物體是秀麗新桿線蟲(C.elegans)，其包含與PS-1和PS-2具有同源性的三個基因，其中sel-12與編碼人早老素的基因具有最高程度的同源性。在篩選激活的缺刻受體lin-12(d)的遺傳抑制基因的過程中發現了sel-12(Levitan,D.等，自然377351-354(1995))。lin-12在模式細胞譜系的發展中起作用。增加lin-12活性的超效等位基因突變，例如lin-12(d)，引起“多陰門”表型，而降低活性的減效基因突變引起外陰外翻，以及在另外幾個細胞譜系中的同源異型改變(Greenwald,I.等，自然346197-199(1990)；Sundram,M.等，遺傳學(Genetics)135755-763(1993))。sel-12突變抑制超效等位基因的lin-12(d)突變，但僅在lin-12(d)突變通過完整的lin-12(d)受體激活信號傳遞時起作用(Levitan,D.等，自然377351-354(1995))。切斷受體胞漿結構域的lin-12突變也激活信號傳遞(Greenwald,L.,等，自然346197-199(1990))，但不被sel-12突變所抑制(Levitan,D.等，自然377351-354(1995))。這提示sel-12突變可能通過降低出現在質膜上的功能性lin-12受體數目，在lin-12信號傳遞途徑上游區起作用。除了抑制一些lin-12超效等位基因突變外，sel-12突變還引起產卵功能喪失，并因此導致卵的體內蓄積，盡管此變異體在其他方面看起來是解剖學正常的(Levitan,D.等，自然377351-354(1995))。sel-12突變體能被人PS-1或PS-2之一營救，表明sel-12、PS-1和PS-2是功能上的同系物(Levitan,D.等，美國國家科學院院報9314940-14944(1996))。
在lin-12減效基因突變之抑制基因的獨立遺傳篩選中已鑒定了另一種基因，sel-10。在sel-10中的喪失功能型突變通過lin-12減效基因突變體恢復信號傳遞。由于sel-10活性的降低提高了lin-12活性，可以推斷sel-10充當lin-12信號傳遞的負調節基因。sel-10也可充當秀麗新桿線蟲早老素同系物sel-12的負調節基因(Levy-Lahad,E等，科學269937-977(1995))。sel-10活性的喪失抑制了與sel-12中的減效基因突變有關的產卵缺陷(Iva Greenwald，私人通信)。sel-10的喪失功能型突變對lin-12突變和sel-12突變的作用表明，sel-10充當lin-12/缺刻和早老素活性的負調節基因。因此，可以預期秀麗新桿線蟲sel-10的人同系物以與早老性癡呆發病機理有關的方式，可以同人早老素基因發生遺傳學和/或生理學相互作用。
綜上所述，顯然始終需要鑒定與AD有關的基因，以及需要發展鑒定能干擾導致AD的生物學途徑的因子的測定法。信息公開Hubbard EJA,Wu G,Kitajewski J和Greenwald I(1997)秀麗新桿線蟲(Caenorhabditis elegans)中lin-12活性的一種負調節基因Sel-10，其編碼蛋白質CDC4家族的成員。基因和發育(Genes&Dev)113182-3193。Greenwald-I;Seydoux-G(1990)秀麗新桿線蟲的lin-12基因的獲得功能型突變的分析。自然。346197-9。Kim T-W,Pettingell WH,Hallmark OG,Moir RD,Wasco W,Tanzi R(1997)在轉染細胞中早老素2的內切蛋白酶解切割和蛋白酶體降解。生物化學雜志(J Biol Chem)27211006-11010。Levitan-D;Greenwald-I(1995)通過sel-12(秀麗新桿線蟲S182早老性癡呆基因)促進lin-12介導的信號傳遞。自然。377351-4。Levitan-D;Doyle-TG;Brousseau-D;Le-MK;Thinakaran-G;Slunt-HH;Sisodia-SS;Greenwald-I(1996)在秀麗新桿線蟲中正常的和突變的人早老素功能的評定。美國國家科學院院報9314940-4。Sundaram-M;Greenwald-I(1993)lin-12減效基因的抑制基因限定與秀麗新桿線蟲中lin-12和glp-1兩者都相互作用的基因。遺傳學。135765-83。Sundaram-M;Greenwald-I(1993)在秀麗新桿線蟲中減效基因lin-12突變體的遺傳和表型研究。遺傳學。135755-63。F55B12.3 GenPep報告(WMBL位點CEF55B12，載入號z79757)。WO 97/11956發明概述本發明提供了包含編碼在海馬區和乳腺細胞中表達的人sel-10的多核苷酸之分離的核酸分子。除非另外特別提到，任何此處提及的sel-10應理解為指人sel-10，并且既包括海馬區sel-10，也包括乳腺sel-10。也提供了海馬區(hippocampal)sel-10和乳腺sel-10的片段。
在一個優選的實施方案中，本發明提供了一種分離的核酸分子，其包含的多核苷酸序列與選自以下序列的序列有至少95％的相同(a)編碼人sel-10多肽的核苷酸序列，sel-10多肽具有選自SEQ ID NO3、SEQ ID NO4、SEQ ID NO5、SEQ ID NO6和SEQ IDNO7的或由包含在ATCC保藏物第98978號中的cDNA克隆編碼的完整氨基酸序列；(b)編碼人sel-10多肽的核苷酸序列，sel-10多肽具有選自SEQ ID NO8、SEQ ID NO9和SEQ ID NO10的或由包含在ATCC保藏物第98979號中的cDNA克隆編碼的完整氨基酸序列；和(c)與(a)或(b)的核苷酸序列互補的核苷酸序列。
另一方面，本發明提供了包含在嚴格條件下可與編碼sel-10的多核苷酸或其片段雜交的多核苷酸之分離的核酸分子。
本發明也提供了包含本發明分離的核酸分子的載體、導入了此類載體的宿主細胞和獲得sel-10多肽的重組方法，其包括培養所述的宿主細胞和分離sel-10多肽。
另一方面，本發明提供了分離的sel-10多肽及其片段。在一個優選的實施方案中，sel-10多肽具有選自SEQ ID NO3、4、5、6、7、8、9及10的氨基酸序列。也提供了可特異性結合sel-10多肽的分離的抗體，包括多克隆抗體和單克隆抗體。
附圖簡述

圖1A和1B圖1A和1B是Western印跡，顯示了在用PS1-C-FLAG、6-myc-N-sel-10和APP695NL-KK cDNA轉染的HEK293細胞中的蛋白質表達。
發明詳述本發明提供了包含編碼人sel-10的多核苷酸之分離的核酸分子。在SEQ ID NO1中給出的人海馬區sel-10(hhsel-10)的核苷酸序列編碼5種hhsel-10多肽(hhsel-10-(1)、hhsel-10(2)、hhsel-10(3)、hhsel-10(4)和hhsel-10(5)，此處共同稱作hhsel-10)。在SEQ IDNO2中給出的人乳腺sel-10(hmsel-10)的核苷酸序列編碼3種hmsel-10多肽(hmsel-10-(1)、hmsel-10(2)及hmsel-10(3)，此處共同稱作hmsel-10)。hhsel-10多肽的核苷酸序列在SEQ ID NO1中給出，其中SEQ ID NO1的核苷酸殘基45-1928相當于hhsel-10-(1)，SEQ ID NO1的核苷酸殘基150-1928相當于hhsel-10-(2)，SEQ ID NO1的核苷酸殘基267-1928相當于hhsel-10-(3)，SEQ IDNO1的核苷酸殘基291-1928相當于hhsel-10-(4)，以及SEQ ID NO1的核苷酸殘基306-1928相當于hhsel-10-(5)。hmsel-10多肽的核苷酸序列在SEQ ID NO2中給出，其中SEQ ID NO2的核苷酸殘基180-1949相當于hmsel-10-(1)，SEQ ID NO2的核苷酸殘基270-1949相當于hmsel-10-(2)，以及SEQ ID NO2的核苷酸殘基327-1949相當于hmsel-10-(3)。由hhsel-10和hmsel-10核酸分子編碼的多肽的氨基酸序列如下SEQ ID NO3、4、5、6和7分別相應于hhsel-10-(1)、hhsel-10(2)、hhsel-10(3)、hhsel-10(4)和hhsel-10(5)多肽，而SEQ ID NO8、9和10分別相應于hmsel-10-(1)、hmsel-10(2)和hmsel-10(3)。除非另外特殊提到，任何此處提及的sel-10應理解為指人sel-10，并且包括所有海馬區和乳腺sel-10核酸分子(就涉及sel-10核酸、多核苷酸、DNA、RNA或基因而言)或多肽(就涉及sel-10蛋白質、多肽、氨基酸序列而言)。也提供了海馬區sel-10及乳腺sel-10的核酸分子和多肽的片段。
如實施例1所述獲得了SEQ ID NO1的核苷酸序列，且其包含在cDNA克隆PNV 102-1中，后者于1998年11月9日保藏在美國典型培養物保藏中心，10801University Blvd,Manassas,VA20110中，保藏號為98978。如實施例2所述獲得了SEQ ID NO2的核苷酸序列，且其包含在cDNA克隆PNV 108-2中，后者于1998年11月9日保藏在美國典型培養保藏中心，10801 University Blvd,Manassas,VA20110中，保藏號為98979。
本發明的人sel-10多肽同秀麗新桿線蟲sel-10以及同包括酵母CDC4和人LIS-1在內的β-轉導素蛋白質家族的成員具有同源性。此家族以存在F-盒和多重WD-40重復體為特征(Li,J.,等，美國國家科學院院報9212180-12184(1995))。此重復體長度為20至40個氨基酸，并同甘氨酸-組氨酸(GH)和色氨酸-天冬氨酸(WD)殘基結合。β-轉導素的三維結構表明，WD40重復體組成七葉螺旋槳樣結構的臂(Sondek,J.,等。自然379369-374(1996))。每一葉由具有一對在蛋白質基元中形成一個內部β鏈界限的保守天冬氨酸殘基的β-片層四個交替的折疊構成。在代表多樣化功能類別的27種以上不同的蛋白質中發現了WD40重復體(Neer,E.J.,等，自然371297-300(1994))。這些重復體調節包括細胞分裂、細胞命運決定、基因轉錄、信號轉導、蛋白質降解、mRNA修飾和囊泡融合在內的細胞功能。在功能上的多樣性得出了如下假設β-轉導素家族成員提供能在其上裝配多蛋白質復合體的共同支架。
SEQ ID NO1中給出的核苷酸序列相當于編碼hhsel-10的核苷酸序列，而SEQ ID NO2中給出的核苷酸序列相當于編碼hmsel-10的核苷酸序列。編碼sel-10的DNA的分離和測序在以下的實施例1和2中有所描述。
如實施例1和2所述，應用自動測序方法獲得sel-10的核苷酸序列。獲得了本發明sel-10核苷酸序列的兩條DNA鏈，且據信為100％精確。然而，眾所周知，通過此類自動化方法獲得的核苷酸序列可能包含一些錯誤。通過自動化確定的核苷酸序列一般至少大約90％，至少大約95％至99.9％與給定核酸分子的實際核苷酸序列相同。實際的序列可以應用本領域眾所周知的手工測序方法更精確地測定。導致一個或更多的核苷酸插入或缺失的序列中的錯誤可能導致翻譯中的讀框移位，使得推定的氨基酸序列自突變點開始不同于由核酸分子的實際核苷酸序列推定的核苷酸序列。本發明的sel-10 DNA包括cDNA、化學合成DNA、通過PCR分離的DNA、基因組DNA及其組合。應用本領域眾所周知的方法，通過篩選具有此處所述的sel-10 cDNA的基因組文庫，可以獲得基因組sel-10 DNA。由sel-10 DNA轉錄的RNA也包括在本發明中。
由于遺傳密碼的簡并性，兩個DNA序列可以不同但編碼相同的氨基酸序列。本發明因此提供了具有編碼任一本發明sel-10多肽的多核苷酸序列之分離的核酸分子，其中所述的多核苷酸序列編碼具有SEQID NO3-10的完整氨基酸序列的sel-10多肽或其片段。
此處也提供了純化的sel-10多肽，包括重組的及非重組的。保留任何sel-10生物學活性的天然sel-10蛋白質的變異體和衍生物也在本發明的范圍內。如上所述，本發明的sel-10多肽同酵母CDC4有同源性。由于已知CDC4催化特定細胞蛋白質的遍在蛋白化作用(Feldman等，細胞(Cell)91221(1997))，可以推斷sel-10也具有此活性。證明此類生物活性的測定方法是眾所周知的，包括應用純化人sel-10蛋白質連同酵母蛋白質Cdc4p、Cdc53p和Skp1p(或它們的人類直向同源基因)和E1酶、E2酶Cdc34p(或它們的人類直向同源基因)、遍在蛋白、一種靶蛋白質以及一種ATP再生系統重構遍在蛋白化系統(Feldman等，1997)。Skp1p通過一個稱作F-盒的蛋白質結構域同Cdc4p結合(Bai等，細胞86263(1996))。在酵母CDC4、秀麗新桿線蟲sel-10、小鼠sel-10及人sel-10中發現了F-盒蛋白質基元。可以用酵母成分的秀麗新桿線蟲對應物，如代替Cdc53p的cul-1(也稱作lin-19)蛋白質(Kipreos等，細胞85829(1996))和代替Skp1p的蛋白質F46A9，或用它們的哺乳動物對應物，如代替Cdc53p的cul-2蛋白質(Kipreos等，1996)和代替酵母Skp1p的哺乳動物Skp1p重構sel-10遍在蛋白化系統。由蛋白激酶提供的磷酸化系統也包括在由Feldman等于1997年創立的測定系統中。
例如，可以通過天然sel-10編碼核苷酸序列的突變獲得sel-10變異體。此處所述sel-10變異體是同天然sel-10基本同源的多肽，但由于在其氨基酸序列中一個或更多的缺失、插入或替換，其具有不同于天然sel-10的氨基酸序列。變異體的氨基酸或核苷酸序列與天然sel-10序列優選至少大約80％相同，更優選地至少大約90％相同，而最優選地至少大約95％相同。因此，例如同天然sel-10基因相比，每一百個核苷酸含有5個點突變的變異核苷酸序列與天然蛋白質95％相同。在天然和變異的sel-10序列之間的序列相同性的百分比，也稱為同源性，其可以例如通過應用任一常用于此目的的計算機程序比較兩個序列而確定，諸如此類的程序有應用Smith和Waterman算法(應用數學進展(Adv.Appl.Math.)2482-489(1981))的Gap程序(Wisconsin序列分析包(Wisconsin Sequence Analysis Package)，Unix第8版，遺傳學計算機組，大學科研園，Madison Wisconsin)。
可以通過大量已知技術中的任一種完成天然氨基酸序列的改變。例如，通過熟練技術人員所周知的方法，如由Walder等(基因(Gene)42133(1986))；Bauer等(基因3773(1985))；Craik(生物技術(BioTechniques)，1985年1月，第12-19頁)；Smith等(遺傳工程原理和方法，Plenum出版社(1981))；和美國專利第4，518，584和4，737，462所描述的寡核苷酸介導的誘變，可以在特定位點引入突變。
在本發明范圍內sel-10變異體可以包括保守替換的序列，意思是sel-10多肽的一個或多個氨基酸可被不同的殘基替換，而這種替換不改變sel-10多肽的二級和/或三級結構。此類替換可以包括一個氨基酸被具有相似物理化學性質的殘基置換，例如替換一個脂肪族殘基(異亮氨酸、纈氨酸、亮氨酸或丙氨酸)為另一個脂肪族殘基，或在堿性殘基賴氨酸和精氨酸之間、酸性殘基谷氨酸和天冬氨酸之間、酰胺殘基谷氨酰胺和天冬酰胺之間、羥基殘基絲氨酸和酪氨酸之間或芳香族殘基苯丙氨酸和酪氨酸之間替換。關于進行表型沉默的氨基酸交換的進一步資料可以在Bowie等，科學2471306-1310(1990)中發現。其它可能基本保留sel-10生物學活性的sel-10變異體是那些在蛋白質的功能區域以外的區域進行氨基酸替換的變異體。
另一方面，本發明提供了包含在嚴格條件下可與上述核酸分子的一部分雜交的多核苷酸之分離的核酸分子，例如，可與前述的核酸分子之一的至少大約15個核苷酸，優選至少大約20個核苷酸，更優選至少大約30個核苷酸，而最優選至少大約從30個到至少大約100個核苷酸雜交。具有上述長度的核酸分子的該部分涉及，例如，對照核酸分子的至少大約15個連續的核苷酸。嚴格雜交條件，預期是在6XSSC/0.1％SDS中在大約42/C過夜孵育大約2.5小時，接著在65/C1.0XSSC、0.1％SDS中洗滌濾膜。
在此所述的sel-10編碼核酸分子的片段以及能同該核酸分子雜交的多核苷酸可以在聚合酶鏈反應(PCR)中用作探針或引物。該探針可以用于，例如，在體外測定以及Southern和Northern印跡中檢測sel-10核酸的存在與否。通過此類探針的使用，也可以鑒定表達sel-10的細胞類型。該方法是眾所周知的，且熟練的技術人員將能選擇一個長度適于具體應用的探針。對于PCR，應用對應于期望的sel-10核酸分子末端的5′和3′引物應用常規技術以分離和擴增該序列。
sel-10核酸分子的其他有用的片段是包含能同目標sel-10 mRMA(使用有義鏈)或sel-10 DNA(使用反義鏈)序列結合的單鏈核酸序列的反義或有義寡核苷酸。
另一方面，本發明包括具有或不具有相關天然模式糖基化的sel-10多肽。在酵母或哺乳動物表達系統表達的sel-10(下面討論)可以在分子量和糖基化模式上與天然sel-10多肽相似或明顯不同。在細菌表達系統中sel-10的表達將提供非糖基化的sel-10。
本發明的多肽優選以分離的形式提供，并優選為基本上純的。通過眾所周知的方法，包括硫酸銨或乙醇沉淀反應、陰離子或陽離子交換層析法、磷酸纖維素層析法、疏水相互作用層析法、親和層析法、羥基磷灰石層析法及植物凝集素層析法可以從重組細胞培養物中回收和純化sel-10多肽。在一個優選的實施方案中，應用高效液相層析法(HPLC)純化。
本發明也涉及包含本發明的多核苷酸分子的載體，以及用此載體轉化的宿主細胞。任一本發明的多核苷酸分子可與一種載體連接，其通常包括一種可選擇標志和一個用于在宿主中繁殖的復制起點。因為本發明也提供由上述多核苷酸分子表達的sel-10多肽，所以優選用于sel-10表達的載體。此類載體包括編碼任一上述或下面描述的sel-10多肽的DNA，該DNA有效連接到合適的轉錄或翻譯調節序列，諸如源自哺乳動物、微生物、病毒或昆蟲基因的調節序列。調節序列的實例包括轉錄啟動子、操縱基因或增強子、mRNA核糖體結合位點以及控制轉錄和翻譯的合適序列。當調節序列在功能上與編碼sel-10的DNA相關時，核苷酸序列為有效連接。因此，如果啟動子核苷酸序列指導sel-10序列的轉錄，則啟動子核苷酸序列為有效連接到sel-10 DNA上。
用于克隆編碼sel-10的多核苷酸分子或用于表達sel-10多肽的適合載體的選擇當然取決于載體轉化的宿主細胞以及待表達sel-10多肽的宿主細胞。用于表達sel-10多肽的合適的宿主細胞包括原核生物、酵母及高等真核生物細胞，其中的每一個都將在以下討論。
在此類宿主細胞中表達的sel-10多肽也可以是包含來自異源蛋白質區域的融合蛋白質。可包括此類區域以使，例如，多肽的分泌、穩定性改善或促進多肽純化。例如，編碼適當的信號肽序列能整合入表達載體。用作信號肽(分泌性前導物)的DNA序列可以符合讀框地融合到sel-10序列中，以使sel-10以包含信號肽的融合蛋白質形式得到翻譯。在預期的宿主細胞中起作用的信號肽促進了sel-10多肽的細胞外分泌。優選sel-10一旦從細胞分泌，則由sel-10多肽上切除信號序列。能用于實施本發明的信號序列的非限制性實例包括酵母I-因子和在sf9昆蟲細胞中的蜜蜂melatin前導區。
在優選的實施方案中，sel-10多肽是包括用于促進多肽純化的異源區域的融合蛋白質。很多可得到的用于此功能的多肽允許融合蛋白質同結合配體的選擇性結合。例如，sel-10多肽可以被修飾為包含一種肽，從而形成可同結合配體或肽標記物特異性結合的融合蛋白質。此類肽標記物的非限制性實例包括6-組氨酸標記物、硫氧還蛋白標記物、FLAG標記物、血凝素標記物、GST標記物以及OmpA信號序列標記物。正如本領域技術人員理解的那樣，可識別并同肽結合的結合配體可以是如下任何分子或化合物，包括金屬離子(例如金屬親和柱)、抗體或其片段及可同肽結合的任何蛋白質或肽在內。可以通過可同每種類型標記物特異性反應的熒光素或若丹明標記的抗體識別這些標記物。
用于表達sel-10多肽的適合的宿主細胞包括原核生物、酵母及高等真核生物細胞。用于表達sel-10的適合的原核生物宿主包括埃希桿菌屬(Escherichia)、芽孢桿菌屬(Bacillus)和沙門菌屬(Salmonella)的細菌以及假單孢菌屬(Pseudomonas)、鏈霉菌屬(Streptomyces)和葡萄球菌屬(Staphylococcus)的成員。對于在例如大腸桿菌中的表達，sel-10多肽可以包括一個N-端蛋氨酸殘基以促進原核生物宿主中重組多肽的表達。之后，可以任選地從表達的sel-10多肽上切除N-端蛋氨酸。
用在原核生物宿主中的表達載體通常包括一個或更多的表型可選擇性標志基因。此類基因通常編碼，例如賦予抗生素抗性或供給營養缺陷需要的蛋白質。廣泛種類的此類載體易于由商業來源得到。實例包括pSPORT載體、pGEM載體(Promega公司)、pPROEX載體(LTI,Bethesda,MD)、Bluescript載體(Stratagene)及pQE載體(Qiagen公司)。
sel-10也可表達在來自包括酵母屬(Saccharomyces)、畢赤酵母母屬(Pichia)和克魯維酵母屬(Kluveromyces)在內的屬的酵母宿主細胞內。優選的酵母宿主是啤酒酵母(S.cerevisiae)和巴斯德畢赤酵母(P.pastoris)。酵母載體常包括來自2T酵母質粒的復制序列起點、自主性復制序列(ARS)、啟動子區域、用于多腺苷酸化的序列、用于轉錄終止的序列及可選擇的標志基因。
也可以應用既可在酵母也可在大腸桿菌中復制的載體(稱為穿梭載體)。除了上面提到的酵母載體的特征，穿梭載體還包括用于在大腸桿菌中復制和篩選的序列。在酵母宿主中表達的sel-10多肽的直接分泌，可以通過在sel-10編碼核苷酸序列5′端插入編碼酵母I-因子前導區序列來完成。
昆蟲宿主細胞培養系統也可以用于Sel-10多肽的表達。在一個優選的實施方案中，應用桿狀病毒表達系統表達本發明的sel-10多肽。關于用于昆蟲細胞中異源蛋白質表達的桿狀病毒系統的用途之進一步資料由Luckow和Summers，生物工藝學(Bio/Techndogy)647(1998)綜述。
在另一個優選的實施方案中，sel-10多肽在哺乳動物宿主細胞中表達。適合的哺乳動物細胞系的非限制性實例包括猴腎細胞的COS-7系(Gluzman等，細胞23175(1981)和中華倉鼠卵巢(CHO)細胞。
用于表達本發明sel-10多肽的合適表達載體的選擇，當然取決于應用的特定哺乳動物宿主細胞，且應在普遍技術人員的技能范圍內。合適的表達載體的實例包括pcDNA3(Invitrogen公司)和pSVL(Parmacia Biotech公司)。用在哺乳動物宿主細胞中的表達載體包括源自病毒基因組的轉錄和翻譯控制序列。可以用在本發明中的常用啟動子序列和增強子序列包括但不限于，源自人巨細胞病毒(CMV)、腺病毒2、多瘤病毒及猿猴病毒40(SV40)的那些序列。例如在OKayama和Berg(分子細胞生物學(Mol.Cell.Biol)3280(1983))；Cosman等(分子免疫學(Mol Immunol)23935(1986)；Cosman等(自然312768(1984))；EP-A-O367566和WO91/18982中公開了用于構建哺乳動物表達載體的方法。
本發明的多肽也可以來培養多克隆和單克隆抗體，其可用于檢測sel-10多肽表達的診斷測定。此類抗體可以通過常規方法制備。參見，例如，抗體實驗室手冊，Harlow和Land(編)，Cold Spring Harbor實驗室出版社，Cold Spring Harbor，紐約(1988)；單克隆抗體，雜交瘤在生物學分析中的新領域，Kennet等(編)，Plenum出版社，紐約(1980)。
由于其能同人類染色體上的特定位點雜交，本發明的sel-10核酸分子對染色體鑒定也是有價值的。由于目前幾乎沒有可得的基于實際序列資料(重復多態性)的染色體標記試劑用于標記染色體位點，因此需要鑒定染色體上的特定部位。一旦把一個序列繪圖定位在精確的染色體位置上，此序列在染色體上的物理位置可同遺傳圖譜資料相互關聯。可通過連鎖分析鑒定在基因和已被繪圖定位到同一染色體區域的疾病之間的關系，其中確定了物理上相鄰的基因的共同遺傳。能通過比較患病的和未患病的個體之間的核酸序列，來確定看起來與特定疾病有關的基因實際上是否為疾病的病因。
本發明的sel-10多肽及編碼它們的DNA，也可以用于進一步闡明AD的生物學機制，并可最終導致能用于改變該機制的化合物的鑒定。本發明的sel-10多肽與秀麗新桿線蟲sel-10有47.6％相同和56.7％相似。如上所述，已知秀麗新桿線蟲sel-10的突變抑制了導致sel-12的產卵功能喪失型突變，并也抑制lin-12的某些減效基因突變。也能通過人類早老性癡呆連鎖基因PS-1(與sel-12有42.7％相同)或者PS-2(與sel-12有43.4％相同)挽救秀麗新桿線蟲sel-12的突變。然而，具有家族性AD-連鎖突變體的人PS-1挽救sel-12突變體的能力降低(Levitan,D.等，美國國家科學院院報9314940-14944(1996))。
這表明，人類和秀麗新桿線蟲基因在缺刻信號傳遞途徑的互換性使之可以合理地預言，人sel-10突變將抑制導致AD的PS-1或PS-2突變，尤其是根據sel-10的推定結構。如上所述，導致早老性癡呆的PS-l和PS-2突變是干擾PS-1或PS-2的蛋白分解加工的突變。本發明的sel-10多肽是β-轉導素蛋白質家族的成員，該家族中包括酵母CDC4，后者是能在遍在蛋白依賴性蛋白質降解途徑起作用的一種酶的成分。因此，人sel-10可以通過遍在蛋白-蛋白酶體途徑調節早老素降解。替代地或另外，人sel-10可以改變早老素的功能，方法是通過靶定經過遍在蛋白質化作用降解一種早老素活性的抑制劑，如負調控子。因此，sel-10突變可以逆轉作為PS-1或PS-2突變的結果而造成的PS-1或PS-2錯誤的蛋白酶解加工，或者增加早老素功能。由于相同的原因，sel-10活性的抑制也可以起逆轉PS-1或PS-2突變的作用。因此，可以假定，抑制本發明的人sel-10多肽表達或活性的化合物可以逆轉PS-l或PS-2突變作用，因此對于AD的預防或治療有作用。
因此，秀麗新桿線蟲可用作鑒定能抑制本發明的人sel-10多肽活性或表達的因子之遺傳系統。用在此類測定中的合適的秀麗新桿線蟲種系缺乏編碼活性秀麗新桿線蟲sel-10的基因，并顯示了由于sel-10基因失活而產生的產卵功能喪失。sel-12序列(Genebank保藏號U35660)和導致產卵功能喪失的sel-12突變都是已知的(參見Levitan等，自然377351-354(1995)，其描述了秀麗新桿線蟲sel-12(ar171)的構建)，因此，由于sel-10突變而喪失產卵功能的秀麗新桿線蟲種系的構建可以應用常規方法完成。如何制備這樣一個種系的實例由Levitan等給出(自然377351-354(1995))。在秀麗新桿線蟲sel-12(ar171)中的野生型秀麗新桿線蟲sel-10也用常規方法誘變，例如在Levitan等，出處同上中用于sel-12誘變的技術。
為鑒定抑制人sel-10活性的化合物，將包含編碼任一本發明野生型人sel-10蛋白質的人sel-10基因之DNA載體引入上述秀麗新桿線蟲種系。在一個優選的實施方案中，將異源人sel-10基因整合入秀麗新桿線蟲基因組。之后用Levitan等(美國國家科學院院報9314940-14944(1996))所述的方法表達此基因。然后把試驗化合物施予此種系，以便確定一個給定的因子能否抑制sel-10活性，從而抑制導致產卵缺陷的sel-12或lin-12突變。之后，例如通過Levitan等(美國國家科學院院報9314940-14944(1996))描述的測定法，確定的此種系中的產卵功能。為進一步證實此化合物對于產卵功能的作用是由于sel-10活性的抑制，可以在已知被sel-10中的喪失功能型突變影響的第二生化或遺傳途徑中檢驗此化合物的作用(例如，在lin-12(d)減效基因種系中lin-12活性的進一步提高)。可以如Sundarem和Greenwald(遺傳學135765-783(1993))所述施行該測定法。
另外，檢測了化合物抑制E3遍在蛋白質連接酶的能力。證明該活性的測定方法是眾所周知的，包括應用純化的人sel-10蛋白質連同酵母蛋白質Cdc4p、Cdc53p及Skp1p和一種E1酶、E2酶Cdc34p、遍在蛋白質、一種目標蛋白質及一種ATP再生系統重構遍在蛋白化系統(Feldman等，1997)。sel-10遍在蛋白化系統也可以用酵母元件的秀麗新桿線蟲對應物重構，例如，用cul-1(也稱為lin-19)蛋白質替換Cdc53p(Kipreos等，細胞85829(1996))及蛋白質F46A9替換Skp1p，或它們的哺乳動物對應物重構，例如，用Cul-2蛋白質替換Cdc53p(Kipreos等，出處同上)及哺乳動物Skp1p替換酵母Skp1p。由蛋白質激酶提供的磷酸化系統也包括在如Feldman等，1997所述的測定系統中。
另外，由于用人sel-10 cDNA轉化而表達人sel-10，并因此具有APP加工增加和Aβ1-40或Aβ1-42形成的細胞系，也可以用于如實施例3描述的此類測定法中。可以檢測化合物是否具有對于降低見于sel-10轉化細胞系中的Aβ加工增加的能力。
然后，篩選挽救產卵缺陷或抑制E3遍在蛋白質連接酶的化合物是否有引起人細胞系中Aβ1-40或Aβ1-42的產生減低的能力。用試驗化合物接觸已知產生Aβ1-40或Aβ1-42的IMR-32或其它人細胞系(Asami-okada等，生物化學(Biochemistry 3410272-10278(1995))，或接觸經工程化以高水平表達人APP的人細胞系。在這些測定法中，通過本領域已知的ELISA或其他測定法測定細胞提取物中(或在釋放入培養基后)的Aβ1-40或Aβ1-42(Borchelt等，神經元171005-1013(1996)；Citron等，自然雜志醫藥分冊367-72(1997))。
全面描述了本發明后，參考以下的實施例將更容易理解之，但這些實施例只供例證，并不意在限制。
用028971 DNA序列對EMBL EST數據庫的Blastn探查揭示了，除了W85144，與028971的編碼序列匹配的3個人EST及與028971序列的3′未翻譯區匹配的六個EST。蛋白質基元在酵母cdc4、小鼠W85144和人028971共有的F55B12.3中，兩個蛋白質基元得到鑒別。這些基元在N-端結構域有一個F-盒，在C-端結構域有7個β-轉導素重復體。討論sel-10基因編碼β-轉導素蛋白質家族成員，其以多重WD40重復體的存在為特征[Neer,E.J.等，自然371297-300(1994)]。該重復體長度為20-40個氨基酸，并同甘氨酸-組氨酸(GH)和色氨酸-天冬氨酸(WD)殘基結合。β-轉導素的三維結構溶液顯示WD40重復體形成七葉螺旋漿樣結構的臂(Sondek,J，自然379369-374(1996)。在形成一個內部β鏈界限的蛋白質基元中，每一個葉片由具有一對保守天冬氨酸殘基的β片層的四個交替的折疊形成。WD40重復體見于代表多樣化功能類別的超過27種不同的蛋白質中[Near,E,J等，自然371297-300(1994)]，這些重復體調控包括細胞分裂、細胞命運決定、基因轉錄、信號轉導、蛋白質降解、mRNA修改和囊泡融合在內的細胞功能。這種功能上的多樣性導致了β-轉導素家族成員提供了多蛋白質復合體能在其上裝配的共同支架的假設。
sel-10，28971和W85144與酵母cdc4基因的同源性提示了，在用于細胞內蛋白質降解的遍在蛋白-蛋白酶體途徑中起作用的一個角色。通過阻斷Sic1(S期細胞周期蛋白/cdk復合物的抑制劑)的降解，酵母cdc4的突變導致細胞周期的停滯[King,R.W.等，科學2741652-9(1996)]。Sci1的磷酸化作用以通過遍在蛋白-蛋白酶體途徑破壞為目標。該途徑包括三個由多蛋白復合物催化的連接酶反應[Ciechanover,A.,細胞7913-21(1994)；Ciechanover,A.和A.L.Schwartz,FASEB J.,8182-91(1994)]。最初，遍在蛋白的C-端甘氨酸被ATP激活，以在由遍在蛋白激活酶，E1催化的反應中形成高能硫基酯中間物。激活后，E2酶(遍在蛋白偶聯酶)將遍在蛋白從E1轉移到蛋白質目標。在某些情況下，E2單獨起作用。在其它情況下，它與結合蛋白質底物的E3遍在蛋白連接酶一同起作用，重新招募E2以催化遍在蛋白化作用。E2遍在蛋白偶聯酶包括一個相當保守的基因家族，而E3酶在序列上是多種多樣的[Ciechanover,A.,細胞7913-21(1994)；Ciechanover,A.和A.L.Schwartz,FASEBJ，8182-91(1994)]。
在酵母中，E2遍在蛋白偶聯酶cdc34的突變，通過不能降解S-期細胞周期蛋白/cdk復合物的Sic1抑制劑，而導致細胞周期停滯[King,R.W.等，科學2741652-9(1996)]。Sic1通常在細胞進入G1-S期過渡時期降解，但在cdc34缺乏的情況下，Sic1避免了降解，且它的蓄積導致細胞周期停滯。除了cdc34，cdc4是G1-S期過渡所需的另外三個蛋白質之一。另外兩個是cdc53和Skp1。如上所述，cdc4含有兩個結構基元、7個WD40重復體(這提示著該蛋白質形成β-螺旋)和一個與作為SKP1相互作用結構域的細胞周期蛋白F共有的結構基元。[Bai,C.等，細胞86263-74(1996)]。包括cdc53、cdc4和Skp1(還有遍在蛋白、cdc34和E1)在內的昆蟲細胞裂解產物能夠將遍在蛋白轉移到Sic1，這提示這些成分中的一種或多種作為E3遍在蛋白連接酶起作用[King,R.W.等，科學2741652-9(1996)]。不論cdc4還是Skp1的表達增加都部分補償了另外一個的損失。
在秀麗新桿線蟲中，sel-10的突變沒有可見的表型，這說明sel-10在細胞周期的調節中不起作用。一個密切相關的秀麗新桿線蟲及β-轉導素家族成員K10B2.6可具有這種作用，這是因為它可與來自爪蟾的基因TRCP XEN成簇，該基因可拯救由于不能降解細胞周期蛋白B而在分裂后期階段停滯的酵母細胞周期突變體。如果sel-10確實編碼E3-遍在蛋白連接酶的一種成分，它怎樣能抑制sel-12而增強lin12突變呢？。
簡單的假設是sel-10通過遍在蛋白-蛋白酶體途徑調控這兩種蛋白質的降解。sel-12和lin-12都是跨膜蛋白質。sel-12跨膜8次，以至于它的N-端和C-端都面向細胞溶膠[Kim,T.W.等，生物化學雜志(J.Biol.Chem)27211006-10(1997)]，而lin-12是I型跨膜蛋白質(Greenwald,I.和G.Seydoux，自然346197-9(1990))。兩者都是遍在蛋白化的，并且就人類PS2來說，在用蛋白酶體抑制劑N-乙酰-L-亮氨酸-L-正亮氨酸和乳胱氨酸處理過的細胞中穩態水平增高(Li,X.和I.Greenwald，神經元171015-21(1996))。或者，sel-10可能以早老素功能的負調節物的降解為目標。
遺傳分析和由與cdc4的同源性提示的蛋白質功能暗示，人sel-10的藥物抑制劑可能提高人早老素的穩態水平。這能增強早老素途徑的潛在活性，并提供了一種治療性干預早老性癡呆的方法。實施例2編碼秀麗新桿線蟲中早老素突變的外源基因抑制基因sel-10的人cDNA的5′RACE克隆材料和方法基于F55B12.3序列，制備用于從來源于秀麗新桿線蟲cDNA的sel-10編碼序列之擴增的寡核苷酸引物，該F55B12.3序列在實施例2中鑒定為秀麗新桿線蟲sel-10的編碼序列。制備的引物是5′-CGGGATCCACCATGGATGATGGATCGATGACACC-3′(SEQ ID NO11)和5′-GGAATTCCTTAAGGGTATACAGCATCAAAGTCG-3′(SEQ ID NO12)。用BALSuperscriptⅡ預擴增試劑盒將秀麗新桿線蟲mRNA轉變為cDNA。用限制酶BamHⅠ和EcoRⅠ(LTI,Gaithersberg,MD)消化pCR產物，并將其克隆入pcDNA3.1(Invitrogen)。將兩個分離物測序(ABI,Perkin-Elmer Corp)。
用Incyte克隆028971的序列(編碼秀麗新桿線蟲sel-10的人同系物的部分)設計四種反義寡核苷酸引物5′-TCACTTCATGTCCACATCAAAGTCC-3′(SEQ ID NO13)、5′-GGTAATTACAAGTTCTTGTTGAACTG-3′(SEQ ID NO14)、5′-CCCTGCAACGTGTGTAGACAGG-3′(SEQ ID NO15)和5′-CCAGTCTCTGCATTCCAC-ACTTTG-3′(SEQ IDNO16)，以擴增人sel-10缺失的5′端。用Incyte LifeSeq“ElectronicNorthern”分析法鑒別在其中表達sel-10的組織。選擇這其中的兩個，海馬區和乳腺，用于應用CloneTech Marathon試劑盒的5′RACE克隆形成，并從海馬區和乳腺制備Marathon-ready的cDNA。將PCR產物克隆入TA載體pCR3.1(Invitrogen公司)，并且將分離物測序。在具有基于不同于海馬區sel-10序列5′-CTCAGACAGGTCAGGACATTTGG-3′(SEQ ID NO17)的5′端的Incyte克隆，也設計出另外的5′寡核苷酸引物。
用Blastn探查Incyte數據庫LifeSeq和LifeSeqFL。用GCG程序進行序列比較排列和翻譯(Wisconsin序列分析包，Unix第8版，遺傳學和計算機組，大學研究所公園，Madison Wisconsin)。結果秀麗新桿線蟲sel-10的編碼序列秀麗新桿線蟲Sel-10預期的編碼序列，F55B12.3最先在圣路易斯華盛頓大學的基因組測序中心得到確定，其是通過應用計算機程序GeneFinder，預測基因組粘粒F55B12中的內含子和外顯子。通過擴增來自秀麗新桿線蟲cDNA的該區域，并將其克隆、測序，進一步證實了假設的cDNA序列。人sel-10基因同系物的編碼序列所有的028971反義寡核苷酸擴增了來源于人海馬區和乳腺cDNA的5′RACE產物。克隆并測序來自于海馬區反應物的最長的PCR產物。設計該PCR反應以產生在預期的終止密碼子上截止的產物。兩分離物包含完全相同的序列，其開始于028971序始起始處之前的880堿基。通過與跨越Incyte cDNA克隆的比較進一步證實了該序列。沒有將跨越人sel-10同系物的5′端的Incyte克隆命名為F55B12.3，因為在人和秀麗新桿線蟲基因之間該區域中的同源性低，且因為這些基因與命名的克隆之間的重疊對它們來講恰巧非常小，以至于Incyte數據庫中不能成簇，或被我們用028971序列Blast探查Incyte數據庫所揭露。
人sel-10的預期蛋白質序列與秀麗新桿線蟲sel-10有47.6％相同和56.7％相似。人sel-10序列的N-端以4個符合讀框的甲硫氨酸起始。除了上述的WD40重復體，人序列也包括與用于結合Skp1(預期為sel-10同系物)的CDC4 F-盒同源的區域。在乳腺和海馬區組織中表達的不同人sel-10 mRNA不同于海馬區序列的另外幾種人sel-10 EST得到鑒定。存在精確的匹配，說明另外可選擇的轉錄本可能是真實的。這些序列與人海馬區sel-10序列的比較顯示了在第4個符合讀框的蛋氨酸之前的差異，從那之后顯示出精確的序列匹配。發現了對該選擇性轉錄本的5′端有特異性的寡核苷酸引物，以擴增來源于乳腺而不是海馬區cDNA的產物。這說明了人sel-10轉錄以組織特異性方式經歷了不同的剪接，或說明基因包含多種組織特異性的啟動子。
討論用5′RACE和PCR擴增克隆編碼秀麗新桿線蟲基因sel-10之人同系物的全長cDNA。序列分析進一步證實了先前的預想，即sel-10是包含F-盒和WD40重復體結構域的蛋白質CDC4家族的成員。人sel-10 cDNA的兩種變異體從海馬區和乳腺得到克隆，它們在翻譯起始位置的表觀位點之前的5′序列上不同。這提示該基因也許有兩個或更多的轉錄起始位點，其為組織特異性的，或外顯子剪接模式為組織特異性的。實施例3人細胞中抗原決定簇標記的sel-10的表達，和由人sel-10產生的淀粉樣β肽加工紊亂材料和方法抗原決定簇標記的sel-10的構建亞克隆、細胞生長和轉染應用經寡核苷酸237(5′-GGAATTCCATGAAAAGATTGGACCATGGTTCTG-3′)(SEQ ID NO18)和206(5′-GGAATTCCTCACTTCATGTCACATCAAAGTCCAG-3′)(SEQID NO19)引發的聚合酶鏈反應(PCR)，將EcoR1位點符合讀框地引入人sel-10 cDNA。將產生的PCR產物克隆入載體pCS2+MT的EcoR1位點。這將5′6-myc抗原決定簇標記符合讀框地融合入海馬區sel-10 cDNA的第5蛋氨酸，即，SEQ ID NO1中所示序列的核苷酸306的上游區。該構建體的核苷酸序列命名為6-myc-N-sel-10，示于SEQ ID NO20中，而其編碼的多肽的氨基酸序列示于SEQ ID NO21中。海馬區和乳腺sel-10 cDNA在該蛋氨酸上游區不同。將具有3′-FLAG標記的PS1cDNA(PS1-C-FLAG)亞克隆入pcDNA3.1載體。將包含瑞典NL突變的APP cDNA以及含有APP695 C-端的雙賴氨酰基元附加物(APP695NL-KK)之稀釋的ER保留序列亞克隆入載體pIRES-EGFP(Mullan等，自然遺傳學(NatGenet)1992年8月；1(5)345-7)。HEK293和IMR32細胞在帶10％FBS的DMEM中生長為80％鋪滿，并用上述的cDNA轉染。10mg總DNA/6×106細胞總數用于由單一質粒轉染。為了多種質粒的共轉染，每種質粒采用均等數量，利用LipofectAmine(BKL)，總量為10mg DNA。
為了構建C-端V5組氨酸標記的sel-10和C-端mychis標記的sel-10，用5′引物5′-GGGTACCCCTCATTATTCCCTCGAGTTCTTC-3′(SEQ ID NO22)上包含有KPNI限制位點和3′引物5′-GGAATTCCTTCATGTCCACATCAAAGTCC-3′(SEQ IDNO23)上包含有EcoRⅠ位點的寡核苷酸作引物，用最初的人sel-10RACE PCR產物作模板，擴增人海馬區sel-10的編碼序列。產物用KpnⅠ和EcoRⅠ兩者消化，并克隆入載體pcDNA6/V5-His A或pcDNA3.1/myc-His(+)A(Invitrogen公司)。通過雙脫氧測序法進一步證實了獨立的分離物的核苷酸序列。C-端V5組氨酸標記的sel-10的核苷酸序列示于SEQ ID NO24中，而其編碼的多肽的氨基酸序列示于SEQ ID NO25中。通過雙脫氧測序法進一步證實獨立的分離物的核苷酸序列。C-端mychis組氨酸標記的sel-10的核苷酸序列示于SEQ ID NO26中，而其編碼的多肽的氨基酸序列示于SEQID NO27中。經FACS對轉化的細胞的克隆選擇在裝備有由空氣冷卻的氬激光提供的488nm激發線的EPICSElite ESP流式細胞計數器(Coulter,Hialeah,FL)上分析細胞樣本。通過525nm譜帶透過濾片測量EGFP發射，并在由前方和右側角光散射決定的存活細胞上選通后，在4-decade對數坐標上顯示熒光強度。單個的綠色細胞經分離進入96孔平板的任一個孔中，其中包含不帶G481的生長培養基。四天的恢復期后，將G418加入該培養基中至最終濃度為400mg/ml。具有克隆的孔從96孔平板擴展至24孔平板上生長，然后擴展到6孔平板上生長，其中在每一個階段選擇生長最快的克隆用于擴增。免疫熒光在冰上用溶于PBS中的4％甲醛和0.1％TritonX-100轉染30分鐘后，在載玻片上固定細胞48小時，并用溶于PBS中的10％山羊血清(封閉液)室溫下(即25℃)封閉1小時，接著用小鼠anti-myc(10mg/ml)或兔抗FLAG(0.5mg/ml)抗體在4℃條件下培育過夜，然后在封閉液中用熒光素標記的山羊抗-小鼠或抗-兔抗體(5mg/ml)，在25℃條件下封閉1小時。Western印跡法在冰上用100ml TENT(50mM Tris-HClpH8.0、2mM EDTA、150mM NaCl、1％Triton X-100、1x蛋白酶抑制劑混合物)孵育105個細胞10分鐘，接著以14000g離心，轉染后48小時制備細胞裂解產物。將上清液置于4-12％NuPage凝膠(50mg蛋白質/泳道)上電泳，并用X室Ⅱ微室系統(Novex)進行轉移。用在PBS中的5％牛奶在室溫下封閉此斑點印跡1小時，并在4℃條件下用anti-myc或抗FLAG抗體(如上面的“免疫熒光”所述)培育過夜，然后，在室溫下用綿羊抗小鼠或抗兔抗體-HRP(0.1mg/ml)培育1小時，接著用Supersignal(Pierce)檢測。酶聯免疫吸附測定(ELISA)在下述的能夠探查培養物上清液中的Aβ1-40和Aβ1-42肽水平的雙抗體夾心ELISA中，分析細胞培養物上清液或細胞裂解產物(100ml甲酸/106個細胞)。
在雙抗體夾心ELISA中，用單克隆抗體(mAb)6E10(Senetek，st.Louis,MO)和生物素化的兔抗血清162或164(NYS基礎研究院，Staten島，紐約)測量人Aβ1-40和Aβ1-42。捕獲抗體6E10對存在于人Aβ的N-端氨基酸殘基1-16的抗原決定簇是特異的。偶聯的探測抗體162和164分別對hAβ1-40和1-42是特異的。根據Pirttila等的方法實施夾心ELISA(衰老的神經生物學(Neurobiology ofAging)18121-7(1997))。簡而言之，將Nunc Maxisorp 96孔免疫平板用稀釋于0.1M碳酸鹽-磷酸氫鹽緩沖液、pH9.6的mAb 6E10(5μg/ml)覆蓋(100μl/孔)，并在4℃條件下培育過夜。用含有0.05％吐溫-20的0.01M DPBS(Pierce,Rockford，Ⅱ生產的ModifiedDulbecco′s磷酸緩沖鹽液(0.008M磷酸鈉、0.002M磷酸鉀、0.14M氯化鈉、0.01M氯化鉀、pH7.4))(DPBST)沖洗該板3次，用溶于0.01M DPBS的10％標準綿羊血清(Sigma公司)200微升封閉該板60分鐘，以避免非特異性結合。從1mg/mlDMSO貯存溶液中以非轉染條件的細胞培養液稀釋人Aβ1-40或Aβ1-42標準(Bachem,Torrance,CA)，洗滌平板后加入上述標準100μl/孔以及100μl/孔樣品，即轉染細胞的經過濾的條件培養基。該平板在室溫下培養2小時，并在4℃培養過夜。第二天，清洗該平板后，加入稀釋于DPBST+0.5％BSA的100μl/孔生物素化的免抗血清162(1∶400)或164((1∶50)，并在室溫孵育的1小時15分鐘。清洗后，加入在DPBST中以1∶10000稀釋的100μl/孔neutravidin-辣根過氧化酶(Pierce,Rockford,Ⅱ)，并在室溫下孵育1小時。在最后一次清洗后，加入溶于50mM枸櫞酸/100mM磷酸鈉緩沖液(Sigma Chemicals,st.louis,MO)，pH5.0的鄰-苯二胺二鹽酸鹽100μl/孔(Sigma Chemicals,st.louis,MO)作為底物，并用Soft max Pro軟件在動力學微孔板讀數儀中于450nm處監控顏色發生20分鐘。結果HEK293細胞的轉染通過應用表達綠色熒光蛋白質(GFP)或者通過用抗原決定簇標記的sel-10或PS1免疫熒光探測檢驗轉染效率。N-端6-myc抗原決定簇用于標記人sel-10(6myc-N-sel-10)，而PS1用C-端FLAG抗原決定簇(PS1-C-FLAG)標記。通過包含提高Aβ加工能力的瑞典NL突變以及包含帶有C-端雙賴氨酸基元(APP695NL-KK)的稀釋的內質網(ER)保留信號，修飾APP695。該雙賴氨酸基元提高了Aβ加工能力約2倍。將APP695NL-KK構建體插入包括GFP的雙順反子載體(pIRES-EGFP,Invitrogen)的第一個順反子，以允許我們監測轉染效率。對于用單種質粒DNA的轉染，HEK293細胞中的轉染效率約為50％。對于用兩種質粒轉染，當用雙免疫熒光檢測時，約30-40％的細胞表達兩種蛋白質。
通過用于閘明PS-1-C-FLAG和6myc-N-Sel-10(圖1A)的Western印跡法，證實了在轉染的HEK293細胞中重組蛋白質的表達。在三種質粒(PS1-C-FLAG+6myc-N-sel-10+APP)共同轉染的情況中，應用合適的抗體通過Western印跡法在同一細胞溶裂產物中探測到全部的三種蛋白質。6myc-N-sel-10和PS1-C-FLAG對Aβ加工的作用用6myc-N-sel-10或PS1-C-FLAG與APP695NL-KK共轉染HEK293細胞，與僅用APP695NL-KK的轉染相比，增加了2到3倍釋放入培養物上清液中的Aβ1-40和Aβ1-42肽(表1)。用6myc-N-sel-10和PS1-C-FLAG兩者共轉染APP695NL-KK又進一步增加了Aβ的釋放(即，增加4-6倍)。相反，釋放入上清液的Aβ1-42/(Aβ1-40+Aβ1-42)的比例降低了約50％。Aβ1-42/(Aβ1-40+Aβ1-42)比例的微妙降低，反映了Aβ1-40相對于Aβ1-42增加得更大。6myc-N-sel-10和PS1-C-FLAG都不影響HEK293細胞中的內源性Aβ的生成。在IMR32細胞中也獲得了相似的觀察結果(表2)。然而，IMR32細胞的轉染不如HEK293細胞，所以通過與6myc-N-sel-10或PS1-C-FLAG共轉染對APP695NL-KK加工的刺激作用較低。
在用APP695NL-KK轉染的HEK293細胞中表達的Aβ1-40的水平足夠在培養物上清液和細胞沉淀中都測量到Aβ肽。僅用APP695NL-KK轉染的細胞中，HEK293細胞沉淀中檢測到的Aβ1-40比上清液中多得多。用6myc-N-sel-10或PS1-C-FLAG共轉染成比例地降低在細胞沉淀的Aβ1-40，并增加培養物上清液中Aβ。這提示了6myc-N-sel-10和PS1-C-FLAG改變了APP的加工或運輸，以至更多的Aβ成比例地從細胞釋放。6mycN-sel-10和PS1-C-FLAG表達對內源性Aβ加工作用6myc-N-sel-10對人細胞中的內源性Aβ的加工作用，通過創建表達這些蛋白的穩定轉化的HEK293細胞系評估。產生了兩種表達6myc-N-sel-10細胞系(sel-10/2和sel-10/6)及用pcDAN3.1載體DNA轉化的控制細胞系。如由Western印跡分析法顯示兩種6myc-N-sel-10細胞系都表達該蛋白質。在兩個6myc-N-sel-10細胞系中Aβ1-40內源性產物同載體DNA轉化的細胞相比都有增加(表3)。此外，在用APP695NL-KK質粒DNA轉染后，6myc-N-sel-10的穩定表達大大增加了Aβ產生。表達PS1-C-FLAG的6個穩定的細胞系獲得了相似的結果。在用APP695NL-KK轉染后，6個細胞系全部顯示了內源性Aβ加工能力顯著提高，還全部顯示了Aβ加工能力的增強(表3)。另外，見于利用6myc-N-sel-10轉染的Aβ加工的增高也見于C-端用mychis或V5組氨酸標記的sel-10(見圖4)。C-端和N-端標記都導致Aβ加工能力的增高。討論這些資料表明，當過度表達時，6myc-N-sel-10以及PS1-C-FLAG在短暫的和穩定的表達系統中都改變了Aβ加工能力，在這些實驗中應用6-myc抗原決定簇標記，以允許用Western印跡分析法探測sel-10蛋白質的表達。如果象它的酵母CDC4的序列同系物提示的那樣，sel-10是E2-E3遍在蛋白連接酶，應該可能鑒定以遍在蛋白化為目標的蛋白質。由于早老素經遍在蛋白-蛋白酶體路徑降解，PS1和PS2是sel-10催化的遍在蛋白化作用的符合邏輯的目標[Kim等，生物化學雜志27211006-11010(1997)]。在此處sel-10如何影響Aβ加工仍不清楚。今后，需要確定sel-10和PS1是否通過改變APP產生、加工、轉運或轉化數提高Aβ加工能力，以及PS1的作用是否由sel-10介導或調控。
這些實驗表明，sel-10是AD治療中以降低Aβ水平為目標的潛在藥物。它們還顯示秀麗新桿線蟲是于其中調查AD中早老素生物學的完美模式系統。因此，如由共轉染實驗顯示以及在穩定的轉化物中所示，6myc-N-sel-10或PS1-C-FLAG的表達提高了Aβ加工能力。用APP695NL-KK與6myc-N-sel-10或PS1-C-FLAG共轉染后，在HEK293細胞和IMR32細胞中都可見Aβ加工能力的提高。在表達6myc-sel-10或PS1-C-FLAG的HEK293細胞的穩定轉化物中，觀察到內源性Aβ加工能力的提高，以及用APP695NL-KK轉染后的Aβ加工能力的提高。這表明sel-10和/或PS1的抑制劑可以降低Aβ加工能力，并可能具有早老性癡呆的治療潛力。
顯而易見，本發明也許會用不同于上述的敘述和實施例中所述的方式實施。
參照上述教導，本發明的大量修飾和變體是有可能的，因此，它們落入本發明的范圍內。
在此處引用的所有出版物的全部內容在此處引入作為參考。表1.6myc-N-sel-10和PS1-C-FLAG瞬時轉染對HEK293細胞上清液中的Ab水平的影響
表2.6myc-N-sel-10和PS1-C-FLAG瞬時轉染對IMR32細胞上清液中的Ab水平的影響
表3．來源于HEK293細胞的穩定轉化物的上清液中的內源和外源Ab1-40和Ab1-42
表4．在N-端或C-端具有抗原決定簇標記的sel-10構建體提高了Aβ1-40和Aβ1-42構建體 Aβ1-40 ％增加P-值 Aβ1-42％增加P-值pcDNA 4240±102 614±106myc-N-sel-10 7631±46580％3.7×10-61136±7346％7.9×10-6sel-10-C-mychis5485±32929％1.8×10-4795±50 29％4.0×10-4sel-10-C-V5his 6210±49846％1.2×10-4906±73 48％2.1×10-4SEQUENCE LISTING&#60110&#62 Gurney,Mark E.
Li,JinhePauley,Adele M.
Pharmacia&Upjohn公司&#60120&#62人Sel-10多肽及編碼其的多核苷酸&#60130&#626142&#60140&#626142&#60141&#621997-12-19&#60160&#6227&#60170&#62PatentIn Ver.2.0&#60210&#621&#60211&#623550&#60212&#62DNA&#60213&#62人&#60400&#621ctcattattc cctcgagttc ttctcagtca agctgcatgt atgtatgtgt gtcccgagaa 60gcggtttgat actgagctgc atttgccttt actgtggagt tttgttgccg gttctgctcc 120ctaatcttcc ttttctgacg tgcctgagca tgtccacatt agaatctgtg acatacctac 180ctgaaaaagg tttatattgt cagagactgc caagcagccg gacacacggg ggcacagaat 240cactgaaggg gaaaaataca gaaaatatgg gtttctacgg cacattaaaa atgatttttt 300acaaaatgaa aagaaagttg gaccatggtt ctgaggtccg ctctttttct ttgggaaaga 360aaccatgcaa agtctcagaa tatacaagta ccactgggct tgtaccatgt tcagcaacac 420caacaacttt tggggacctc agagcagcca atggccaagg gcaacaacga cgccgaatta 480catctgtcca gccacctaca ggcctccagg aatggctaaa aatgtttcag agctggagtg 540gaccagagaa attgcttgct ttagatgaac tcattgatag ttgtgaacca acacaagtaa 600aacatatgat gcaagtgata gaaccccagt ttcaacgaga cttcatttca ttgctcccta 660aagagttggc actctatgtg ctttcattcc 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寡核苷酸引物&#60400&#6216ccagtctctg cattccacac tttg 24&#60210&#6217&#60211&#6223&#60212&#62DNA&#60213&#62人工序列&#60220&#62&#60223&#62人工序列描述寡核苷酸引物&#60400&#6217ctcagacagg tcaggacatt tgg 23&#60210&#6218&#60211&#6233&#60212&#62DNA&#60213&#62人工序列&#60220&#62&#60223&#62人工序列描述寡核苷酸引物&#60400&#6218ggaattccat gaaaagattg gaccatggtt ctg 33&#60210&#6219&#60211&#6234&#60212&#62DNA&#60213&#62人工序列&#60220&#62&#60223&#62人工序列描述寡核苷酸引物&#60400&#6219ggaattcctc acttcatgtc acatcaaagt ccag 34&#60210&#6220&#60211&#621881&#60212&#62DNA&#60213&#62人工序列&#60220&#62&#60223&#62人工序列描述6myc標記的人&#60400&#6220atggagcaaa agctcatttc tgaagaggac ttgaatgaaa tggagcaaaa gctcatttct 60gaagaggact tgaatgaaat ggagcaaaag ctcatttctg aagaggactt gaatgaaatg 120gagcaaaagc tcatttctga agaggacttg aatgaaatgg agcaaaagct catttctgaa 180gaggacttga atgaaatgga gagcttgggc gacctcacca tggagcaaaa gctcatttct 240gaagaggact tgaattccat gaaaagaaag ttggaccatg gttctgaggt ccgctctttt 300tctttgggaa agaaaccatg caaagtctca gaatatacaa gtaccactgg gcttgtacca 360tgttcagcaa 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85 90 95Glu Val Arg Ser Phe Ser Leu Gly Lys Lys Pro Cys Lys Val Ser Glu100 105 110Tyr Thr Ser Thr Thr Gly Leu Val Pro Cys Ser Ala Thr Pro Thr Thr115 120 125Phe Gly Asp Leu Arg Ala Ala Asn Gly Gln Gly Gln Gln Arg Arg Arg130 135 140Ile Thr Ser Val Gln Pro Pro Thr Gly Leu Gln Glu Trp Leu Lys Met145 150 155 160Phe Gln Ser Trp Ser Gly Pro Glu Lys Leu Leu Ala Leu Asp Glu Leu165 170 175Ile Asp Ser Cys Glu Pro Thr Gln Val Lys His Met Met Gln Val Ile180 185 190Glu Pro Gln Phe Gln Arg Asp Phe Ile Ser Leu Leu Pro Lys Glu Leu195 200 205Ala Leu Tyr Val Leu Ser Phe Leu Glu Pro Lys Asp Leu Leu Gln Ala210 215 220Ala Gln Thr Cys Arg Tyr Trp Arg Ile Leu Ala Glu Asp Asn Leu Leu225 230 235 240Trp Arg Glu Lys Cys Lys Glu Glu Gly Ile Asp Glu Pro Leu His Ile245 250 255Lys Arg Arg Lys Val Ile Lys Pro Gly Phe Ile His Ser Pro Trp Lys260 265 270Ser Ala Tyr Ile Arg Gln His Arg Ile Asp Thr Asn Trp Arg Arg Gly275 280 285Glu Leu Lys Ser Pro Lys Val Leu Lys Gly His Asp Asp His Val Ile290 295 300Thr Cys Leu Gln Phe Cys Gly Asn Arg Ile Val Ser Gly Ser Asp Asp305 310 315 320Asn Thr Leu Lys Val Trp Ser Ala Val Thr Gly Lys Cys Leu Arg Thr325 330 335Leu Val Gly His Thr Gly Gly Val Trp Ser Ser Gln Met Arg Asp Asn340 345 350Ile Ile Ile Ser Gly Ser Thr Asp Arg Thr Leu Lys Val Trp Asn Ala355 360 365Glu Thr Gly Glu Cys Ile His Thr Leu Tyr Gly His Thr Ser Thr Val370 375 380Arg Cys Met His Leu His Glu Lys Arg Val Val Ser Gly Ser Arg Asp385 390 395 400Ala Thr Leu Arg Val Trp Asp Ile Glu Thr Gly Gln Cys Leu His Val405 410 415Leu Met Gly His Val Ala Ala Val Arg Cys Val Gln Tyr Asp Gly Arg420 425 430Arg Val Val Ser Gly Ala Tyr Asp Phe Met Val Lys Val Trp Asp Pro435 440 445Glu Thr Glu Thr Cys Leu His Thr Leu Gln Gly His Thr Asn Arg Val
450 455 460Tyr Ser Leu Gln Phe Asp Gly Ile His Val Val Ser Gly Ser Leu Asp465 470 475 480Thr Ser Ile Arg Val Trp Asp Val Glu Thr Gly Asn Cys Ile His Thr485 490 495Leu Thr Gly His Gln Ser Leu Thr Ser Gly Met Glu Leu Lys Asp Asn500 505 510Ile Leu Val Ser Gly Asn Ala Asp Ser Thr Val Lys Ile Trp Asp Ile515 520 525Lys Thr Gly Gln Cys Leu Gln Thr Leu Gln Gly Pro Asn Lys His Gln530 535 540Ser Ala Val Thr Cys Leu Gln Phe Asn Lys Asn Phe Val Ile Thr Ser545 550 555 560Ser Asp Asp Gly Thr Val Lys Leu Trp Asp Leu Lys Thr Gly Glu Phe565 570 575Ile Arg Asn Leu Val Thr Leu Glu Ser Gly Gly Ser Gly Gly Val Val580 585 590Trp Arg Ile Arg Ala Ser Asn Thr Lys Leu Val Cys Ala Val Gly Ser595 600 605Arg Asn Gly Thr Glu Glu Thr Lys Leu Leu Val Leu Asp Phe Asp Val610 615 620Asp Met Lys Glu Phe Cys Arg Tyr Pro Ala Gln Trp Arg Pro Leu Glu625 630 635 640Ser Arg Gly Pro Phe Glu Gly Lys Pro Ile Pro Asn Pro Leu Leu Gly645 650 655Leu Asp Ser Thr Arg Thr Gly His His His His His His660 665&#60210&#6226&#6021l&#622001&#60212&#62DNA&#60213&#62人工序列&#60220&#62&#60223&#62人工序列描述MYCHIS標記的人&#60400&#6226atgtgtgtcc cgagaagcgg tttgatactg agctgcattt gcctttactg tggagttttg 60ttgccggttc tgctccctaa tcttcctttt ctgacgtgcc tgagcatgtc cacattagaa 120tctgtgacat acctacctga aaaaggttta tattgtcaga gactgccaag cagccggaca 180cacgggggca cagaatcact gaaggggaaa aatacagaaa atatgggttt ctacggcaca 240ttaaaaatga ttttttacaa aatgaaaaga aagttggacc atggttctga ggtccgctct 300ttttctttgg gaaagaaacc atgcaaagtc tcagaatata caagtaccac tgggcttgta 360ccatgttcag caacaccaac aacttttggg gacctcagag cagccaatgg ccaagggcaa 420caacgacgcc gaattacatc tgtccagcca cctacaggcc tccaggaatg gctaaaaatg 480tttcagagct ggagtggacc agagaaattg cttgctttag atgaactcat tgatagttgt 540gaaccaacac aagtaaaaca tatgatgcaa gtgatagaac cccagtttca acgagacttc 600atttcattgc tccctaaaga gttggcactc tatgtgcttt cattcctgga acccaaagac 660ctgctacaag cagctcagac atgtcgctac tggagaattt tggctgaaga caaccttctc 720tggagagaga aatgcaaaga agaggggatt gatgaaccat tgcacatcaa gagaagaaaa 780gtaataaaac caggtttcat acacagtcca tggaaaagtg catacatcag acagcacaga 840attgatacta actggaggcg aggagaactc aaatctccta aggtgctgaa aggacatgat 900gatcatgtga tcacatgctt acagttttgt ggtaaccgaa tagttagtgg ttctgatgac 960aacactttaa aagtttggtc agcagtcaca ggcaaatgtc tgagaacatt agtgggacat 1020acaggtggag tatggtcatc acaaatgaga gacaacatca tcattagtgg atctacagat 1080cggacactca aagtgtggaa tgcagagact ggagaatgta tacacacctt atatgggcat 1140acttccactg tgcgttgtat gcatcttcat gaaaaaagag ttgttagcgg ttctcgagat 1200gccactctta gggtttggga tattgagaca ggccagtgtt tacatgtttt gatgggtcat 1260gttgcagcag tccgctgtgt tcaatatgat ggcaggaggg ttgttagtgg agcatatgat 1320tttatggtaa aggtgtggga tccagagact gaaacctgtc tacacacgtt gcaggggcat 1380actaatagag tctattcatt acagtttgat ggtatccatg tggtgagtgg atctcttgat 1440acatcaatcc gtgtttggga tgtggagaca gggaattgca ttcacacgtt aacagggcac 1500cagtcgttaa caagtggaat ggaactcaaa gacaatattc ttgtctctgg gaatgcagat 1560tctacagtta aaatctggga tatcaaaaca ggacagtgtt tacaaacatt gcaaggtccc 1620aacaagcatc agagtgctgt gacctgttta cagttcaaca agaactttgt aattaccagc 1680tcagatgatg gaactgtaaa actatgggac ttgaaaacgg gtgaatttat tcgaaaccta 1740gtcacattgg agagtggggg gagtggggga gttgtgtggc ggatcagagc ctcaaacaca 1800aagctggtgt gtgcagttgg gagtcggaat gggactgaag aaaccaagct gctggtgctg 1860gactttgatg tggacatgaa ggaattctgc agatatccag cacagtggcg gccgctcgag 1920tctagagggc ccttcgaaca aaaactcatc tcagaagagg atctgaatat gcataccggt 1980catcatcacc atcaccattg a 2001&#60210&#6227&#60211&#62666&#60212&#62PRT&#60213&#62人工序列&#60220&#62&#60223&#62人工序列描述MYCHIS標記的人&#60400&#6227Met Cys Val Pro Arg Ser Gly Leu Ile Leu Ser Cys Ile Cys Leu Tyr1 5 10 15Cys Gly Val Leu Leu Pro Val Leu Leu Pro Asn Leu Pro Phe Leu Thr20 25 30Cys Leu Ser Met Ser Thr Leu Glu Ser Val Thr Tyr Leu Pro Glu Lys
35 40 45Gly Leu Tyr Cys Gln Arg Leu Pro Ser Ser Arg Thr His Gly Gly Thr50 55 60Glu Ser Leu Lys Gly Lys Asn Thr Glu Asn Met Gly Phe Tyr Gly Thr65 70 75 80Leu Lys Met Ile Phe Tyr Lys Met Lys Arg Lys Leu Asp His Gly Ser85 90 95Glu Val Arg Ser Phe Ser Leu Gly Lys Lys Pro Cys Lys Val Ser Glu100 105 110Tyr Thr Ser Thr Thr Gly Leu Val Pro Cys Ser Ala Thr Pro Thr Thr115 120 125Phe Gly Asp Leu Arg Ala Ala Asn Gly Gln Gly Gln Gln Arg Arg Arg130 135 140Ile Thr Ser Val Gln Pro Pro Thr Gly Leu Gln Glu Trp Leu Lys Met145 150 155 160Phe Gln Ser Trp Set Gly Pro Glu Lys Leu Leu Ala Leu Asp Glu Leu165 170 175Ile Asp Ser Cys Glu Pro Thr Gln Val Lys His Met Met Gln Val Ile180 185 190Glu Pro Gln Phe Gln Arg Asp Phe Ile Ser Leu Leu Pro Lys Glu Leu195 200 205Ala Leu Tyr Val Leu Ser Phe Leu Glu Pro Lys Asp Leu Leu Gln Ala210 215 220Ala Gln Thr Cys Arg Tyr Trp Arg Ile Leu Ala Glu Asp Asn Leu Leu225 230 235 240Trp Arg Glu Lys Cys Lys Glu Glu Gly Ile Asp Glu Pro Leu His Ile245 250 255Lys Arg Arg Lys Val Ile Lys Pro Gly Phe Ile His Sar Pro Trp Lys260 265 270Ser Ala Tyr Ile Arg Gln His Arg Ile Asp Thr Asn Trp Arg Arg Gly275 280 285Glu Leu Lys Ser Pro Lys Val Leu Lys Gly His Asp Asp His Val Ile290 295 300Thr Cys Leu Gln Phe Cys Gly Asn Arg Ile Val Ser Gly Ser Asp Asp305 310 315 320Asn Thr Leu Lys Val Trp Ser Ala Val Thr Gly Lys Cys Leu Arg Thr325 330 335Leu Val Gly His Thr Gly Gly Val Trp Ser Ser Gln Met Arg Asp Asn340 345 350Ile Ile Ile Ser Gly Ser Thr Asp Arg Thr Leu Lys Val Trp Asn Ala355360 365Glu Thr Gly Glu Cys Ile His Thr Leu Tyr Gly His Thr Ser Thr Val370 375 380Arg Cys Met His Leu His Glu Lys Arg Val Val Ser Gly Ser Arg Asp385 390 395 400Ala Thr Leu Arg Val Trp Asp Ile Glu Thr Gly Gln Cys Leu His Val
405 410 415Leu Met Gly His Val Ala Ala Val Arg Cys Val Gln Tyr Asp Gly Arg420 425 430Arg Val Val Ser Gly Ala Tyr Asp Phe Met Val Lys Val Trp Asp Pro435 440 445Glu Thr Glu Thr Cys Leu His Thr Leu Gln Gly His Thr Asn Arg Val450 455 460Tyr Ser Leu Gln Phe Asp Gly Ile His Val Val Ser Gly Set Leu Asp465 470 475 480Thr Set Ile Arg Val Trp Asp Val Glu Thr Gly Asn Cys Ile His Thr485 490 495Leu Thr Gly His Gln Ser Leu Thr Ser Gly Met Glu Leu Lys Asp Asn500 505 510Ile Leu Val Ser Gly Asn Ala Asp Ser Thr Val Lys Ile Trp Asp Ile515 520 525Lys Thr Gly Gln Cys Leu Gln Thr Leu Gln Gly Pro Asn Lys His Gln530 535 540Ser Ala Val Thr Cys Leu Gln Phe Asn Lys Asn Phe Val Ile Thr Ser545 550 555 560Ser Asp Asp Gly Thr Val Lys Leu Trp Asp Leu Lys Thr Gly Glu Phe565 570 575Ile Arg Asn Leu Val Thr Leu Glu Ser Gly Gly Ser Gly Gly Val Val580 585 590Trp Arg Ile Arg Ala Ser Asn Thr Lys Leu Val Cys Ala Val Gly Ser595 600 605Arg Asn Gly Thr Glu Glu Thr Lys Leu Leu Val Leu Asp Phe Asp Val610 615 620Asp Met Lys Glu Phe Cys Arg Tyr Pro Ala Gln Trp Arg Pro Leu Glu625 630 635 640Ser Arg Gly Pro Phe Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn645 650 655Met His Thr Gly His His His His His His660 66權利要求
1．一種分離的核酸分子，其包含的多核苷酸具有與選自下列各組的序列至少有95％相同的序列(a)編碼人sel-10多肽的核苷酸序列，人sel-10多肽具有選自SEQ ID NO3、SEQ ID NO4、SEQ ID NO5、SEQ ID NO6及SEQ ID NO7或由包含在ATCC保藏物第98978號中的cDNA克隆所編碼的完整氨基酸序列；(b)編碼人sel-10多肽的核苷酸序列，人sel-10多肽具有選自SEQ ID NO8、SEQ ID NO9及SEQ ID NO10或由包含在ATCC保藏物第98979號中的cDNA克隆所編碼的完整氨基酸序列；和(c)與(a)或(b)中的核苷酸序列互補的核苷酸序列。
2．一種分離的核酸分子，其包含在嚴格的條件下可同具有權利要求1的(a)、(b)或(c)中所述的核苷酸序列的多核苷酸雜交的多核苷酸。
3．權利要求1的核酸分子，其中所述的1(a)多核苷酸編碼具有SEQ ID NO3的完整氨基酸序列的人sel-10多肽。
4．權利要求3的核酸分子，其中所述的1(a)多核苷酸分子包含SEQ ID NO1的殘基45-1928的核苷酸序列。
5．權利要求1的核酸分子，其中所述的1(a)多核苷酸編碼具有SEQ ID NO4的完整氨基酸序列的人sel-10多肽。
6．權利要求5的核酸分子，其中所述的1(a)多核苷酸分子包含SEQ ID NO1的殘基150-1928的核苷酸序列。
7．權利要求1的核酸分子，其中所述的1(a)多核苷酸編碼具有SEQ ID NO5的完整氨基酸序列的人sel-10多肽。
8．權利要求7的核酸分子，其中所述的1(a)多核苷酸分子包含SEQ ID NO1的殘基267-1928的核苷酸序列。
9．權利要求1的核酸分子，其中所述的1(a)多核苷酸編碼具有SEQ ID NO6的完整氨基酸序列的人sel-10多肽。
10．權利要求9的核酸分子，其中所述的1(a)多核苷酸分子包含SEQ ID NO1的殘基291-1928的核苷酸序列。
11．權利要求1的核酸分子，其中所述的1(a)多核苷酸編碼具有SEQ ID NO7的完整氨基酸序列的人sel-10多肽。
12．權利要求11的核酸分子，其中所述的1(a)多核苷酸分子包含SEQ ID NO1的殘基306-1928的核苷酸序列。
13．權利要求1的核酸分子，其中所述的1(b)多核苷酸編碼具有SEQ ID NO8的完整氨基酸序列的人sel-10多肽。
14．權利要求13的核酸分子，其中所述的1(b)多核苷酸分子包含SEQ ID NO2的殘基180-1949的核苷酸序列。
15．權利要求1的核酸分子，其中所述的1(b)多核苷酸編碼具有SEQ ID NO9的完整氨基酸序列的人sel-10多肽。
16．權利要求15的核酸分子，其中所述的1(b)多核苷酸分子包含SEQ ID NO2的殘基270-1949的核苷酸序列。
17．權利要求1的核酸分子，其中所述的1(b)多核苷酸編碼具有SEQ ID NO10的完整氨基酸序列的人sel-10多肽。
18．權利要求17的核酸分子，其中所述的1(b)多核苷酸分子包含SEQ ID NO2的殘基327-1949的核苷酸序列。
19．一種包含權利要求1的核酸分子的載體。
20．權利要求19的載體，其中為了表達sel-10多肽所述的權利要求1的核酸分子有效連接到啟動子上。
21．一種包含權利要求19的載體的宿主細胞。
22．權利要求21的宿主細胞，其中所述的宿主是真核生物宿主。
23．一種獲得sel-10多肽的方法，包括培養權利要求22的宿主細胞并分離所述的sel-10多肽。
24．一種分離的sel-10多肽，其包含(a)選自SEQ ID NO3、SEQ ID NO4、SEQ ID NO5、SEQ ID NO6和SEQ ID NO7或如由包含于ATCC保藏物第98978號中的cDNA克隆編碼的氨基酸序列；(b)選自SEQ ID NO8、SEQ ID NO9和SEQ ID NO10或由包含于ATCC保藏物第98979號中的cDNA克隆編碼的氨基酸序列。
25．權利要求24的分離的sel-10多肽，其中所述的多肽包含SEQID NO3的氨基酸序列。
26．權利要求24的分離的sel-10多肽，其中所述的多肽包含SEQID NO4的氨基酸序列。
27．權利要求24的分離的sel-10多肽，其中所述的多肽包含SEQID NO5的氨基酸序列。
28．權利要求24的分離的sel-10多肽，其中所述的多肽包含SEQID NO6的氨基酸序列。
29．權利要求24的分離的sel-10多肽，其中所述的多肽包含SEQID NO7的氨基酸序列。
30．權利要求24的分離的sel-10多肽，其中所述的多肽包含SEQID NO8的氨基酸序列。
31．權利要求24的分離的sel-10多肽，其中所述的多肽包含SEQID NO9的氨基酸序列。
32．權利要求24的分離的sel-10多肽，其中所述的多肽包含SEQID NO10的氨基酸序列。
33．一種可與權利要求24的sel-10多肽特異性結合的分離的抗體。
34．一種具有改變了的Aβ加工的、表達權利要求1之sel-10分離的核酸分子中的任何一個的細胞系。
35．權利要求34的細胞系，其中所述的Aβ加工得到提高。
36．權利要求34的細胞系，其中所述的Aβ加工得到降低。
37．權利要求34的細胞系，其中所述的細胞系是6myc-N-sel10/2。
38．權利要求34的細胞系，其中所述的細胞系是6myc-N-sel10/6。
39．一種用于鑒定能改變權利要求34、37和38的任一細胞系中產生的Aβ1-40/Aβ1-40+Aβ1-42比例的試劑的方法，其包括以下步驟(a)獲得所述細胞系的測試培養物和對照培養物；(b)將所述的測試培養物與測試試劑接觸；(c)測定步驟(b)所述測試培養物和所述對照培養物產生的Aβ1-40和Aβ1-42的水平；(d)從步驟(c)中測量的Aβ1-40和Aβ1-42水平，計算出對于所述測試培養物和所述對照培養物之Aβ1-40/Aβ1-40+Aβ1-42的比例；和(e)比較步驟(d)中測量的對于所述測試培養物和所述對照培養物之Aβ1-40/Aβ1-40+Aβ1-42的比例；由此，確定所述測試培養物的Aβ1-40/Aβ1-40+Aβ1-42的比例高于或低于所述對照培養物的Aβ1-40/Aβ1-40+Aβ1-42的比例，提示所述的測試試劑改變了Aβ1-40/Aβ1-40+Aβ1-42的比例。
40．權利要求39的方法，其中所述的Aβ1-40/Aβ1-40+Aβ1-42的比例被所述的測試試劑增大。
41．權利要求39的方法，其中所述的Aβ1-40/Aβ1-40+Aβ1-42的比例被所述的測試試劑減小。
全文摘要
本發明提供了包含編碼人sel－10的兩種可選擇剪接變異體中任意一個的多核苷酸之分離的核酸分子,這兩種變異體中的一個在海馬區中表達,一個在乳腺細胞中表達。本發明還提供了分離的sel－10多肽和其中Aβ加工被改變的表達所述多肽的細胞系。
文檔編號C12N5/02GK1281508SQ98811913
公開日2001年1月24日 申請日期1998年12月17日 優先權日1997年12月19日
發明者M·E·古尼, 李金河, A·M·保利 申請人:法瑪西雅厄普約翰美國公司