專利名稱：pta 1dhA雙重突變大腸桿菌SS373及由其生產(chǎn)琥珀酸的方法
背景技術(shù)：
發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及一種突變大腸桿菌SS373以及使用該菌株進(jìn)行琥珀酸生產(chǎn)。詳細(xì)地說(shuō)就是，利用基因工程技術(shù)構(gòu)建了一種乙酸和乳酸形成途徑缺陷的新的大腸桿菌SS373(W3110 pta∷Tn10 ldhA∷Km)。然后將好氧培養(yǎng)的SS373在琥珀酸生產(chǎn)階段轉(zhuǎn)變成厭氧條件培養(yǎng)，由此有效地提高了琥珀酸的產(chǎn)量。
現(xiàn)有技術(shù)描述琥珀酸是生物學(xué)系統(tǒng)中的一種基本代謝物和TCA循環(huán)的一種中間產(chǎn)物。在石化工業(yè)中，琥珀酸被用作1，4-丁二醇、四氫呋喃、γ-丁內(nèi)酯的前體。它還可用于食品和化妝品工業(yè)。商業(yè)上使用化學(xué)方法生產(chǎn)琥珀酸。最近，生物學(xué)方法作為環(huán)境衛(wèi)生方法開始引起大家的注意。此外，生物學(xué)方法可以利用低價(jià)、可再生的資源生產(chǎn)琥珀酸。由于上述原因，琥珀酸的生物學(xué)生產(chǎn)在最近幾年內(nèi)被廣泛研究，特別是嚴(yán)格厭氧的產(chǎn)琥珀酸厭氧螺菌(Anaerobiospirillum succiniciproducens)(US專利號(hào)5573931、5521075、5504004)。然而，該菌營(yíng)養(yǎng)需要復(fù)雜，生長(zhǎng)速率慢，而且在要求嚴(yán)格厭氧的生產(chǎn)過(guò)程中存在困難。
發(fā)明概要為了解決琥珀酸生產(chǎn)中嚴(yán)格厭氧菌的問(wèn)題，通過(guò)基因工程構(gòu)建了兼性厭氧的大腸桿菌。通過(guò)使用突變的大腸桿菌，提高了琥珀酸的產(chǎn)量。因此，本發(fā)明的目的是構(gòu)建突變大腸桿菌和通過(guò)使用該突變大腸桿菌提高琥珀酸產(chǎn)量。
圖的簡(jiǎn)要描述
圖1描繪了SS373利用各種碳源的代謝途徑。圖2顯示了SS373的琥珀酸生產(chǎn)特征曲線。
本發(fā)明的詳細(xì)描述本發(fā)明的特征是大腸桿菌SS373(W3110 pta∷Tn10 ldhA∷Km)。本發(fā)明還涉及細(xì)胞好氧生長(zhǎng)之后厭氧生產(chǎn)琥珀酸的方法。詳細(xì)的描述如下正如Bergey手冊(cè)中所描述的，大腸桿菌具有以下特征兼性厭氧，桿狀，革蘭氏陽(yáng)性，營(yíng)養(yǎng)需要簡(jiǎn)單，生長(zhǎng)速率快(倍增時(shí)間≈20分鐘)，最適溫度37℃，最適pH7.0。特別地，大腸桿菌在厭氧條件下利用葡萄糖產(chǎn)生乙酸、乳酸、甲酸、琥珀酸和乙醇的混合物。大腸桿菌的生理學(xué)和遺傳學(xué)已經(jīng)被深入研究，而且大腸桿菌的新陳代謝可以被容易地控制和評(píng)估。此外，代謝工程可以通過(guò)基因工程技術(shù)容易地應(yīng)用。琥珀酸大規(guī)模生產(chǎn)的原理為了能夠使用大腸桿菌進(jìn)行琥珀酸生產(chǎn)，將大腸桿菌W3110進(jìn)行了遺傳修飾。對(duì)修飾后的大腸桿菌進(jìn)一步優(yōu)化以利于提高產(chǎn)量。
因?yàn)榇竽c桿菌進(jìn)行混合的酸發(fā)酵，所以應(yīng)當(dāng)改變大腸桿菌的代謝途徑以有效生產(chǎn)琥珀酸。通過(guò)遺傳阻斷產(chǎn)生其它產(chǎn)物的途徑，可以提高琥珀酸的產(chǎn)量。首先，對(duì)大腸桿菌編碼乙酸和乳酸途徑第一個(gè)酶的pta和ldhA基因進(jìn)行突變。
構(gòu)建的菌株在好氧條件下快速生長(zhǎng)，然后在厭氧條件下生產(chǎn)琥珀酸。由此產(chǎn)生的琥珀酸可以穿過(guò)細(xì)胞膜在培養(yǎng)基中積累，從而避免了細(xì)胞的反饋控制。積累的琥珀酸可以通過(guò)電滲析技術(shù)高純度回收(Hongo，M.，應(yīng)用環(huán)境微生物學(xué)(Appl.Environ.Microbiol.)，52-2，314-319(1986))。雙重突變大腸桿菌的構(gòu)建使用Silhavy建議的方法構(gòu)建雙重突變的大腸桿菌。步驟1制備轉(zhuǎn)化的P1噬菌體分別制備大腸桿菌CP993(pta∷Tn10-lacZ-1)(Shin，S.A.和C.K.Park，細(xì)菌學(xué)雜志(J.Bacteriol.)，177，4696-4702(1995))和大腸桿菌NZN117(ldhA∷Km)(Bunch，P.K.等人，微生物學(xué)(Microbiology)，143，187-195(1997))的P1裂解液。步驟2將pta∷Tn10-lacZ-1經(jīng)P1轉(zhuǎn)導(dǎo)至W3110使用大腸桿菌W3110(大腸桿菌品種中心保藏編號(hào)(CGSC)4474)作為受體菌株。通過(guò)P1轉(zhuǎn)導(dǎo)，大腸桿菌CP993的插入突變基因(pta∷Tn10-lacZ-1)被轉(zhuǎn)移至大腸桿菌W3110。在四環(huán)素選擇培養(yǎng)板上篩選突變體大腸桿菌菌株，得到大腸桿菌W3110 pta∷Tn10-lacZ-1。步驟3將ldhA∷Km經(jīng)P1轉(zhuǎn)導(dǎo)至W3110 pta∷Tn10-lacZ-1為了得到乳酸生產(chǎn)缺陷型菌株，將NZN117的P1裂解液感染大腸桿菌W3110 pta∷Tn10-lacZ-1。在卡那霉素培養(yǎng)板上篩選得到的菌株就是雙重突變的W3110 pta∷Tn10-lacZ-1 ldhA∷Km。SS373利用各種碳源生產(chǎn)琥珀酸的原理雖然產(chǎn)生琥珀酸的各種途徑因碳源的不同有略微變化，但是磷酸化是一個(gè)共同步驟(圖1)。在葡萄糖(最普通的碳源)的情況中，當(dāng)葡萄糖通過(guò)磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)(PTS)轉(zhuǎn)運(yùn)時(shí)，已知主要的磷酸供體是磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)。涉及葡萄糖吸收的PEP轉(zhuǎn)變成丙酮酸，而且因?yàn)殓晁嵫苌圆蒗Ｒ宜?OAA)，所以產(chǎn)生琥珀酸的機(jī)會(huì)相對(duì)降低。然而在半乳糖、木糖和麥芽糖的情況中，磷酸基團(tuán)由ATP傳遞，與葡萄糖的情況相比PEP將被保存。在PTS中作為磷酸供體的PEP的保存，將導(dǎo)致琥珀酸產(chǎn)量的增加，以及副產(chǎn)物形成的降低。
本發(fā)明在下列實(shí)施例中將被詳細(xì)描述，但是并不因此而受限制。實(shí)施例1用于琥珀酸生產(chǎn)的雙重突變大腸桿菌的構(gòu)建步驟1.制備轉(zhuǎn)化的P1噬菌體使用Silhavy的方法進(jìn)行P1轉(zhuǎn)導(dǎo)。將pta∷Tn10-lacZ-1和ldhA∷Km的每種大腸桿菌菌株在3ml TGC培養(yǎng)基(0.1％葡萄糖，乳胰蛋白胨，10mMCaCl2)中進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)。將生長(zhǎng)過(guò)夜的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至3ml TGC培養(yǎng)基中并在搖床中于35℃培養(yǎng)1小時(shí)。當(dāng)細(xì)胞的吸收值(600nm)達(dá)到0.1時(shí)，感染P1噬菌體(30μl，濃度為1010pfu/ml)并培養(yǎng)2-3小時(shí)。細(xì)胞裂解后，加入氯仿(0.1ml)，接著離心得到上清液。稱為P1裂解液的上清液相含有pta∷Tn10-lacZ-1和ldhA∷Km經(jīng)P1噬菌體。步驟2.將pta∷Tn10-lacZ-1經(jīng)P1轉(zhuǎn)導(dǎo)至W3110離心得到生長(zhǎng)過(guò)夜的大腸桿菌W3110細(xì)胞。用0.5ml二價(jià)離子溶液(10mM MgSO4，5mM CaCl2)重懸細(xì)胞后，添加pta∷Tn10-lacZ-1(0.01-0.1ml)的P1裂解液?；旌弦河谑覝?cái)R置15分鐘。離心收集細(xì)胞，接著用1ml 1M檸檬酸鈉洗兩遍。在LB培養(yǎng)基中活化后，在含有四環(huán)素(13μg/ml)的LB-瓊脂培養(yǎng)板上篩選突變體細(xì)胞。步驟3.將ldhA∷Km經(jīng)P1轉(zhuǎn)導(dǎo)至W3110 pta∷Tn10-lacZ-1將由步驟1所得ldhA∷Km的P1裂解液感染由步驟2得到的菌株。重復(fù)步驟2的相同過(guò)程后，在含有卡那霉素(20μg/ml)的LB-瓊脂培養(yǎng)板上得到雙重突變體W3110 pta∷Tn10-lacZ-1 ldhA∷Km最終得到的大腸桿菌W3110 pta∷Tn10-lacZ-1 ldhA∷Km被命名為大腸桿菌SS373。大腸桿菌SS373于1997年7月28日保藏于韓國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(KCTC；52，Ereun-dong，Yusong-ku，Taejeon 305-333，韓國(guó))(該中心是布達(dá)佩斯條約的國(guó)際菌株保藏單位)保藏，保藏編號(hào)為KCTC8818P。為了進(jìn)行PCT國(guó)際申請(qǐng)，于1998年7月29日在布達(dá)佩斯條約下進(jìn)行了原始保藏物的轉(zhuǎn)化，并得到新的保藏編號(hào)，如KCTC 0506BP。
大腸桿菌SS373可以在葡萄糖培養(yǎng)基上在厭氧條件下培養(yǎng)，因?yàn)樗梢援a(chǎn)生乙酰輔酶A，而大腸桿菌NZN111(Clark.D.P.，F(xiàn)EMS Microbiol.Rev.，63，223-234(1989))卻不能。實(shí)施例2葡萄糖培養(yǎng)基中的琥珀酸生產(chǎn)在利用葡萄糖的培養(yǎng)基上培養(yǎng)大腸桿菌SS373。培養(yǎng)基的組分如表1所示。表1
注意pH通過(guò)滴加少量濃硫酸調(diào)至7.0。
將SS373的單菌落在15ml試管中于37℃二次培養(yǎng)12小時(shí)。將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至50ml培養(yǎng)基(250ml愛(ài)倫美氏燒瓶)中并培養(yǎng)至600nm吸收值達(dá)到0.5。將如上得到的活躍生長(zhǎng)的細(xì)胞接種至含有1升培養(yǎng)基的2.5升發(fā)酵罐中并于37℃，pH7.0，好氧條件(350rpm，1vvm)培養(yǎng)。當(dāng)吸收值(600nm)達(dá)到4.0時(shí)，停止供氧并通入混合氣(5％CO2，95％N2)。在厭氧轉(zhuǎn)變時(shí)添加葡萄糖溶液500ml(60g/l)。此后培養(yǎng)34小時(shí)，得到11g/l琥珀酸和0.8g/l丙酮酸(圖2)。
使用HPLC-UV系統(tǒng)(Gilson，法國(guó))和糖類分析柱(HPX-87H，Bio-Rad)評(píng)估琥珀酸和丙酮酸濃度。使用葡萄糖分析儀(2300STAT，Yellow SpringInstruments)測(cè)量葡萄糖濃度。實(shí)施例3利用各種糖類的琥珀酸生產(chǎn)在含有不同碳源的培養(yǎng)基(表2)中培養(yǎng)大腸桿菌SS373和W3110。使用的碳源分別為葡萄糖、半乳糖、麥芽糖和木糖。表2
注意滴加濃硫酸調(diào)pH至7.0。*碳源分別為葡萄糖、半乳糖、麥芽糖和木糖。
將SS373的單菌落在15ml試管中于37℃二次培養(yǎng)12小時(shí)。將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至10ml培養(yǎng)基(100ml愛(ài)倫美氏燒瓶)中。將生物量調(diào)整至600nm吸收值約為1.0。向燒瓶中通入5％ CO2并用硅塞封閉以達(dá)到厭氧條件。細(xì)胞于37℃培養(yǎng)8小時(shí)，并測(cè)定有機(jī)酸形成(表3)。
在野生菌株的情況中，如W3110，主要有機(jī)酸是乳酸和乙酸，而在SS373中琥珀酸和丙酮酸是主要要素。在SS373中，琥珀酸與丙酮酸的比例隨著使用的碳源而變化。葡萄糖培養(yǎng)基的琥珀酸對(duì)丙酮酸比1∶2，而麥芽糖為1∶0.8，半乳糖和木糖為1∶0.3。由半乳糖和木糖得到幾乎純的琥珀酸，濃度分別為1.9和1.6g/1。因此，在琥珀酸生產(chǎn)中為實(shí)現(xiàn)高純度和產(chǎn)量，優(yōu)選使用非PTS糖類，因?yàn)榱姿峄惺褂玫腜EP得到保存。表3碳源對(duì)大腸桿菌SS373中琥珀酸生產(chǎn)的影響
正如記錄的，在新的大腸桿菌SS373中，可以不需要嚴(yán)格控制厭氧條件并無(wú)需復(fù)雜營(yíng)養(yǎng)供給即可生產(chǎn)琥珀酸。此外，由于大腸桿菌SS373能有效產(chǎn)生琥珀酸，因而生產(chǎn)速率快。而且，使用導(dǎo)致PEP保存的碳源可以生產(chǎn)幾乎純的琥珀酸。
權(quán)利要求
1.乙酸和乳酸形成缺陷、保藏號(hào)為KCTC 0506BP的pta ldhA雙重突變體大腸桿菌SS373。
2.利用pta ldhA雙重突變體大腸桿菌SS373，通過(guò)琥珀酸生產(chǎn)的兩階段培養(yǎng)法生產(chǎn)琥珀酸的方法，包括在好氧條件(包括合適的碳源)下培養(yǎng)該大腸桿菌SS373，然后在厭氧條件下生產(chǎn)琥珀酸。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的生產(chǎn)琥珀酸的方法，其中所述合適的碳源是攝取機(jī)制和回補(bǔ)代謝與葡萄糖不同的非PTS碳源。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種突變大腸桿菌SS373以及使用該菌株進(jìn)行琥珀酸生產(chǎn)的方法。詳細(xì)地說(shuō)就是,利用基因工程技術(shù)構(gòu)建了一種乙酸和乳酸形成途徑缺陷的新的大腸桿菌SS373(W3110pta::Tn10 ldhA::Km)。然后將好氧培養(yǎng)的SS373在琥珀酸生產(chǎn)階段轉(zhuǎn)變成厭氧條件培養(yǎng),由此有效地提高了琥珀酸的產(chǎn)量。
文檔編號(hào)C12N1/21GK1268972SQ98808709
公開日2000年10月4日 申請(qǐng)日期1998年7月31日 優(yōu)先權(quán)日1997年7月31日
發(fā)明者潘在龜, 申秀安, 樸贊圭, 金泌, 張東銀, 金宰恩 申請(qǐng)人:韓國(guó)科學(xué)技術(shù)研究院