專利名稱：檢測致病性大腸桿菌菌株的TaqMan的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種基于TaqManTM-PCR技術的檢測致病性大腸桿菌的快速高效分析法，和可用于該分析法中的特定的優化的寡核苷酸引物以及標記的寡核苷酸探針。
發明
背景技術：
腸出血性產志賀氏樣毒素(stl)大腸桿菌(EHEC)最近被認為是一種重要的人和動物致病原(1-7)。EHEC導致一些食品傳染病的爆發(8)。最值得注意的是在美國西部各州的與快餐鏈相關的在多州的爆發，在華盛頓600多人受影響，3人死亡(9)，在日本流行病發生，具有6000多病人和約8例死亡病例(10)。EHEC感染導致腹瀉、出血性結腸炎、血小板減少紫癜和特征在于急性腎病的溶血性尿毒癥(HUS)、血小板減少和微血管溶血性貧血。HUS在受影響的兒童和免疫損害個體中最終可導致致死的后果(3，11-17)。最近，報道了在1995年10月至1996年7月期間在德國東南部(Bavaria)EHEC病例增加，至少有45例嚴重的導致HUS的感染，伴有7人死亡(l8)。估計大約15例EHEC感染中的1例導致HUS，可推測大約600-700受影響的個體。
在大多數報道的發病中，消費被污染的切碎的牛肉是感染的來源(5，8，19-22)，而在日本懷疑為幼茶(10)。EHEC已被從牛奶(6，19，23)、水(19)、小雞、豬和蘋果汁(19，24，25)中分離，但也報道了人平行的污物感染(15)。牛看來可能是儲存庫(22，26)。交叉污染、不當的處理和不適宜的烹調均引起由EHEC導致的食品傳染感染。EHEC產生還已知為vero毒素或細胞毒素的志賀氏樣毒素(slt)(12，27)。大部分EHEC被發現屬于O157H7血清型，但值得注意的是，尤其在歐洲還報道了各種屬于其它血清型(O22，O26，O55，O111O114，O145)的EHEC(12，15，28-32)。
除開EHEC，一些大腸桿菌的其它菌株可導致腸炎或胃腸炎，并被分組在腸產毒性菌(ETEC)(33-36)、腸致病性菌株(EPEC)(37)、腸侵染性菌株(EIEC)(38，39)和腸聚集性菌株(WaggEC)(40，41)。這些菌株為重要的致病原，并且還導致嚴重的公共健康問題。由于缺乏特異和敏感程序的檢測方法，對這些致病原的診斷被極大地忽略了。ETEC合成可導致類似于霍亂弧菌的分泌性腹瀉(“旅行者腹瀉”)的熱不穩定的和/或熱穩定的腸毒素(36，42，43)。ETEC生物對腸上皮細胞的表面附著為毒素產生的先決條件。毒素產生為質粒介導的，最通常包括大腸桿菌血清型O6、O15、O124、O136、O143、O145和O147(32)。
EPEC導致主要發生在嬰兒中的腹瀉癥狀(32)。雖然致病機理不清楚，腸的上皮降解和在組織切片中觀察到的炎性反應可能是由于細菌的粘附特性的結果。EPEC的特異性附著因子為質粒編碼的(EAF＝EPEC粘附因子)(37，44)。EHEC通常包含與已知為eae的EAF極為相關的粘附因子(EHEC附著和消除基因)(45，46)。EPEC最通常屬于血清型O6、O8、O25、O111、O119和O142(32)。
EIEC菌株能穿過并侵染腸上皮細胞并產生類似于由志賀氏細菌導致的炎性腹瀉(38，47，48)。糞便/污物包含血液、粘液和破碎的嗜中性粒細胞。EIEC包含編碼另外的致病性因子的毒性質粒(48)。血清型O28、O112、O115、O124、O136、O143、O145和O147最常見于EIEC(32)。
EaggEC與幼兒持續性腹瀉和旅游者腹瀉相關。EaggEC特征在于其導致Hep-2細胞聚集的粘附能力。這種作用與毒性質粒(pCVD432)的存在相關。EaggEC被懷疑還產生熱穩定腸毒素(EAST1)(49-53)。它們可屬于血清型O44和O126(32)。
用于EHEC的常規檢測方法包括用選擇性和/或指示培養基富集和分離，如大腸桿菌培養基、硫酸月桂基酯胰蛋白
4-甲基繖形酰-b-酸肉湯、伊紅亞甲蘭瓊脂、McConkey山梨糖醇瓊脂和溶血素瓊脂(28，32，54-59)。不幸的是，所有這些分析是間接的并缺乏特異性鑒定EHEC或其它致病大腸桿菌菌株的能力。提出了一些生物化學鑒定和免疫檢測EHEC的方法(54，60-63)，然而，熟知致病性大腸桿菌菌株不具有或缺乏獨特的發酵途徑(58，64)。
由于血清型與致病大腸桿菌類型之間的絕對的相互關系不能確定，因此血清分型不是令人確信的(12，27，32，58，65)。
已建立了用于實驗研究的DNA雜交技術，但其不能適用于大規模的常規診斷方法(66，67)。報道了基于DNA擴增的使用PCR的分析法(68-72)。這些方法的局限包括麻煩的后PCR檢測方法(瓊脂糖電泳，生物素/抗生物素蛋白基ELISA檢測系統)。
為了克服這些問題，開發了能特異性測定EHEC、ETEC、EPEC、EIEC和EaggEC特有的毒性因子的基于PCR擴增的熒光原檢測法的PCR分析法。
該分析法利用Taq-DNA聚合酶5’-3’外切酶活性(73)以裂解在5’和3’末端分別與熒光報道染料(例如6-羧基-熒光素[FAM]；λem＝518nm)和熒光猝滅染料(6-羧基四甲基羅丹明[TAMRA]；λem＝582nm)共價結合的內部寡核苷酸探針。同時通過完整的探針分子TAMRA有效地猝滅來自FAM的熒光(76)。在發生關聯PCR擴增的情況下，Taq聚合酶從特定的PCR引物延伸并裂解對模板鏈退火的內部熒光原寡核苷酸探針。因此，報道染料和猝滅染料被從空間上分開。作為寡核苷酸的水解和報道染料和猝滅染料的物理分離的結果，可在518nm處觀察到可測定的熒光強度的增加。PCR循環導致PCR產物和隨后的熒光強度的指數增加。
在不打開PCR試管時能測定熒光信號的光學試管中進行TaqManTM-PCR。這大大最小化了后PCR加工時間并幾乎完全消除了交叉PCR污染問題。采用這種方法，可在18小時內半自動同時進行生物物質的大腸桿菌菌株和帶有毒性基因的其它腸細菌的毒性基因的存在的檢測。
根據本發明，提供用于檢測致病性大腸桿菌的TaqManTM-PCR，使得首次在常規細菌實驗室中實現了EHEC、ETEC、EPEC、EIEC、EaggEC和相關的帶有這些毒性基因的腸細菌的特異性、快速和高處理量的常規檢測。
發明目的本發明的一個目的是提供一種快速、高效用于檢測和鑒定生物樣品中的致病性大腸桿菌的分析法。
本發明的另一個目的是提供可用于編碼致病性大腸桿菌特有的毒性因子/毒素的序列擴增的特異性、優化引物和標記的寡核苷酸探針。
發明概述本發明尤其單獨包括下面或其組合一種檢測樣品中致病性大腸桿菌的方法，包括使用選自下面的一組特異于產毒性大腸桿菌毒性因子/毒素的寡核苷酸引物將從所述樣品分離的DNA進行PCR擴增與編碼熱不穩定毒素或熱穩定毒素的基因雜交的用于腸產毒性大腸桿菌特有的DNA序列擴增的基因雜交的引物；
與編碼熱穩定毒素的基因雜交的用于腸聚集性大腸桿菌特有的DNA序列擴增的引物；與pCVD432質粒雜交的用于腸聚集性大腸桿菌特有的DNA序列擴增的引物；與inv質粒雜交的用于在腸侵染性大腸桿菌中含有的DNA序列擴增的引物；與EAF質粒或eae基因雜交的用于腸致病性特有的DNA序列擴增的引物；和/或與編碼志賀氏樣毒素slII或sltII的基因雜交的用于腸出血性大腸桿菌特有的DNA序列擴增的引物，接著使用常規方法檢測和鑒定擴增產物；如上的方法，其中與編碼腸產毒性大腸桿菌特有的熱不穩定毒素的基因雜交的引物組為LT-15′GCG TTA CTA TCC TCT CTA TGT G3′和LT-25′AGT TTT CCA TAC TGA TTG CCG C3′；與編碼腸產毒素性大腸桿菌特有的熱穩定毒素的基因雜交的引物組為ST-15′TCC CTC AGG ATG CTA AAC CAG3′和ST-2a5′TCG ATT TAT TCA ACA AAG CAA C3′；與編碼腸聚集性大腸桿菌特有的熱穩定毒素的基因雜交的引物組為EASTI-15′AAC TGC TGG GTA TGT GGC TGG3′和EASTI-25′TGC TGA CCT GCC TCT TCC ATG3′；與pCVD432質粒雜交的引物組為EA-15′CTG GCG AAA GAC TGT ATC ATT G3′和EA-25′TAA TGT ATA GAA ATC CGC TGT T3′；與inv-質粒雜交的引物組為
EI-15′TTT CIG GAI GGI AIG GIG AGG3′和EI-25′CTT GAA CAT AAG GAA ATA AAC3′；與EAF質粒雜交的引物組為EP-15′CAG GGT AAA AGA AAG ATG ATA AG3′和EP-25′AAT ATG GGG ACC ATG TAT TAT C3′；與eae基因雜交的引物組為EPeh-15′CCC GGA CCC GGC ACA AGC ATA AG3′和EPeh-25′AGT CTC GCC AGT ATT CGC CAC C3′；與編碼志賀氏樣毒素SltI的基因雜交的引物為SltI-15′ATG AAA AAA ACA TTA TTA ATA GC3′和SltI-25′TCA CYG AGC TAT TCT GAG TCA AGC3′；和與編碼志賀氏樣毒素SltII的基因雜交的引物為SltII-15′ATG AAG AAG ATR WTT RTD GCR GYT TTA TTY G3′和SltII-25′TCA GTC ATW ATT AAA CTK CAC YTS RGC AAA KCC3′其中W為A/T，R為A/G，D為A/G/T，Y為C/T和K為G/T；如上方法，其中具有另外的5’-3’外切酶活性的聚合酶被用于DNA的擴增，并且在大多數5’堿基被熒光染料，在大多數3’堿基被熒光猝滅染料標記的在靶DNA中雜交的寡核苷酸探針包括在擴增方法中；所述標記的寡核苷酸探針易受由所述DNA聚合酶的5’-3’外切酶降解以產生可通過熒光原檢測方法檢測的片段；如上方法，其中用于檢測腸產毒性大腸桿菌特有的熱不穩定毒素的標記的寡核苷酸探針為5′AGC TCC CCA GTC TAT TAC AGA ACT ATG3′；用于檢測腸產毒素大腸桿菌特有的熱穩定毒素的標記的寡核苷酸探針為
5′ACA TAC GTT ACA GAC ATA ATC AGA ATC AG3′；用于檢測腸聚集性大腸桿菌特有的熱穩定毒素的標記的寡核苷酸探針為5′ATG AAG GGG CGA AGT TCT GGC TCA ATG TGC3′；用于檢測pCVD432質粒的標記的寡核苷酸探針為5′CTC TTT TAA CTT ATG ATA TGT AAT GTC TGG3′；用于檢測inv質粒的標記的寡核苷酸探針為5′CAA AAA CAG AAG AAC CTA TGT CTA CCT3′用于檢測EAF質粒的標記的寡核苷酸探針為5′CTT GGA GTG ATC GAA CGG GAT CCA AAT3′；用于檢測eae基因的標記的寡核苷酸探針為5′TAA ACG GGT ATT ATC AAC AGA AAA ATC C3′；用于檢測志賀氏樣毒素SltI基因的標記的寡核苷酸探針為5′TCG CTG AAT CCC CCT CCA TTA TGA CAG GCA3′；和用于檢測志賀氏樣毒素SltII基因的標記的寡核苷酸探針為5′CAG GTA CTG GAT TTG ATT GTG ACA GTC ATT3′；
上述方法，其中熒光報道染料為6-羧基熒光素(fluoroscein)、四氯-6-羧基熒光素或六氯-6-羧基熒光素，而熒光猝滅染料為6-羧基四甲基羅丹明；上述方法，其中PCR擴增方法由在MgCl2濃度為5.2mmol，55℃退火溫度和65℃延伸溫度下進行的35次PCR循環組成；可用于致病大腸桿菌的毒性因子/毒素特異性的DNA的PCR擴增的一組引物選自下面與編碼腸產毒性大腸桿菌的熱不穩定毒素或熱穩定毒素的基因雜交的一組引物；與編碼腸聚集性大腸桿菌的熱穩定毒素的基因雜交的一組引物；與編碼腸聚集性大腸桿菌的pCVD432質粒雜交的一組引物；與腸侵染性大腸桿菌的inv質粒雜交的一組引物；與腸致病性大腸桿菌的EAF質粒，或eae基因雜交的一組引物；與編碼腸出血性大腸桿菌的志賀氏樣毒素sltI或sltII的基因雜交的一組引物；上述的引物組，其中與編碼腸產毒素大腸桿菌的熱不穩定毒素的基因雜交的引物組為LT-15′GCG TTA CTA TCC TCT CTA TGT G3和LT-25′AGT TTT CCA TAC TGA TTG CCG C3′；與編碼腸產毒素大腸桿菌的熱穩定毒素的基因雜交的引物組為ST-15′TCC CTC AGG ATG CTA AAC CAG3′和ST-2a5′TCG ATT TAT TCA ACA AAG CAA C3′；與編碼腸聚集性大腸桿菌的熱穩定毒素基因雜交的引物組為EASTI-15′AAC TGC TGG GTA TGT GGC TGG3′和EASTI-2；5′TGC TGA CCT GCC TCT TCC ATG3′；與pCVD432質粒雜交的引物組為
EA-1；5′CTG GCG AAA GAC TGT ATC ATT G3′和EA-25′TAA TGT ATA GAA ATC CGC TGT T3′；與inv質粒雜交的引物組為EI-15′TTT CTG GAT GGT ATG GTG AGG3′和EI-25′CTT GAA CAT AAG GAA ATA AAC3′；與EAF質粒雜交的引物組為EP-15′CAG GGT AAA AGA AAG ATG ATA AG3′和EP-25′AAT ATG GGG ACC ATG TAT TAT C3′；與eae基因雜交的引物組為EPeh-15′CCC GGA CCC GGC ACA AGC ATA AG3′和EPeh-25′AGT CTC GCC AGT ATT CGC CAC C3′；與志賀氏樣毒素sltI基因雜交的引物組為SltI-15′ATG AAA AAA ACA TTA TTA ATA GC3′和SltI-25′TCA CYG AGC TAT TCT GAG TCA AGC3′；和與志賀氏樣毒素sltII雜交的引物組為SltII-15′ATG AAG AAG ATR WTT RTD GCR GYT TTA TTY G3′和SItII-25′TCA GTC ATW ATT AAA CTK CAC YTS RGC AAA KCC3′其中W為A/T，R為A/G，D為A/G/T，Y為C/T和K為G/T。
上述引物除開用于靶DNA擴增的引物外還包含在大多數5’堿基被熒光報道染料，如6-羧基熒光素、六氯-6-羧基熒光素、六氯-6-羧基熒光素標記，在大多數3’堿基被熒光猝滅染料，如6-羧基四甲基羅丹明標記的標記寡核苷酸探針，并具有選自下面的核苷酸序列5′AGC TCC CCA GTC TAT TAC AGA ACT ATG3′其與編碼腸產毒素大腸桿菌的熱不穩定毒素的基因雜交；5′ACA TAC GTT ACA GAC ATA ATC AGA ATC AG3′其與編碼腸產毒素大腸桿菌的熱穩定毒素的基因雜交；5′ATG AAG GGG CGA AGT TCT GGC TCA ATG TGC3′其與編碼腸聚集性大腸桿菌的熱穩定毒素的基因雜交；5′CTC TTT TAA CTT ATG ATA TGT AAT GTC TGG3′其與pCDV432質粒雜交；5′CAA AAA CAG AAG AAC CTA TGT CTA CCT3′其與inv質粒雜交；5′CTT GGA GTG ATC GAA CGG GAT CCA AAT3′其與EAF質粒雜交；5′TAA ACG GGT ATT ATC AAC AGA AAA ATC C3′其與eae基因雜交；5′TCG CTG AAT CCC CCT CCA TTA TGA CAG GCA3′其與志賀氏樣毒素SltI基因雜交；和5′CAG GTA CTG GAT TTG ATT GTG ACA GTC ATT3′
其與志賀氏樣毒素SltII基因雜交；上述方法在診斷活動物體，包括人的大腸桿菌感染中的用途，或在診斷消費品，如肉、奶和蔬菜的大腸桿菌污染中的用途。
本發明用于檢測PCR擴增的常規方法是費力的，采用可能的致癌物質(溴化乙啶凝膠電泳)，并且不適宜作為微生物常規實驗室中的常規分析法(68-72)。這提出一個嚴重的問題，尤其當由于特征性的生物化學、血清學和/或形態學標準不能將可能的致病細菌與兼性致病或非致病細菌區分時。因此，直接檢測這些種類擁有的毒性因子或毒素的特定的基于核酸的診斷方法是必須遵循的。這主要對于致病性大腸桿菌細菌的診斷是這種情況。EHEC、EPEC、EIEC、ETEC和EaggEC的生物化學特性不是獨特的，不能被用于將它們從其它大腸桿菌菌株分開中(54，60-62)。而且，也可在其它腸細菌中發現大腸桿菌的毒性質粒(38，48，83，88，89)。由于各異的血清學特性，通過血清分型鑒定致病性大腸桿菌也不是準確的鑒定方法(12，15，28-32)。使用特征性毒性因子和/或毒素基因特異性的探針的傳統的菌落雜交分析法是麻煩和費時的(66，67)。為了證實是否發生了靶基因的特異性擴增，傳統的PCR方法需要各種后PCR步驟(68-72)。TaqManTM-PCR檢測體系(74，75，90)實現了快速、特異性、敏感和高產率的用于區分致病性大腸桿菌細菌和其它大腸桿菌菌株的診斷法。該分析法具有定量起始靶序列的能力。由于在PCR循環后，PCR反應的試管不被打開，交叉PCR污染的可能的危險幾乎可以忽略。96個樣品的掃描時間約為8分鐘，可用可商購的鋪展片程序(spred sheet porgram)自動進行試驗結果的計算。因此，整個后PCR加工時間被縮至最短。
TaqManTM體系依賴于加入特定的內部熒光原寡核苷酸探針的標準的PCR技術。由于非特異性PCR擴增極不可能產生陽性熒光信號，因此常規PCR與內雜交的寡核苷酸探針的Taq聚合酶依賴性降解結合還使該檢測方法具有特異性。必須遵循選擇熒光原探針的一些規則(74，75)。標準是探針的長度、報道和猝滅染料的位置和在5’-末端不存在鳥苷(74)。而且，探針距一個特異性PCR引物的距離是非常重要的。這是由于探針必須對模板鏈退火以被Taq聚合酶裂解。由于退火至少部分依賴于探針的Tm，因此探針被設計具有如引物的較高的Tm。根據本發明，這通過設計比特異性引物長3-6個bp的探針而得以解決(除開sltII)。PCR擴增包括引物退火后的靶序列的延伸，并且延伸引物的Tm增加。對于其中3’末端被加帽以避免延長的熒光原寡核苷酸，Tm保持恒定，這使得在被Taq聚合酶降解前探針更可能解離。寡核苷酸探針的降解可通過熒光原探針和引物的空間鄰近最優化。通過將sltI的探針從距引物121bp移至距其9bp，可獲得ΔRQ值的顯著提高。第二種優化TaqManTM-PCR的方法是在65℃下進行PCR延伸，其中在Taq聚合酶到達并與其雜交之前探針也不太可能從模板上解離。ΔRQ值因此可再次增加1.2-1.5倍。ΔRQ值的增加可能是由于Taq聚合酶獲得的退火的寡核苷酸探針的比例或由于Taq聚合酶的增加的持續合成能力。
熒光原探針的濃度影響TagManTM結果的準確性。當探針濃度大于50pmol/PCR反應時，僅相對小的部分被Taq聚合酶水解。未降解探針與降解探針的比例仍然高，并且未猝滅的報道染料的熒光發射相對于仍接近猝滅報道染料的報道染料的熒光強度沒有明顯增加。因此，在高的探針濃度下，ΔRQ值比使用中間探針濃度(10-20pmol)的低。當探針濃度太低時，ΔRQ值增加，然而，PCR結果的可變性增加，因為可能吸取的小的誤差或PCR反應間的最小的差異變得為關鍵。產生最小可變性和最高RQ值的最佳探針濃度被發現為20pmol的探針濃度。
由于TaqManTM-PCR使用內部寡核苷酸探針用于模板擴增的檢測，可廣泛設計特異性引物和探針。當存在給定基因的核苷酸序列變異體時，引物和探針序列的設計尤其重要。對于sltI和sltII就是這種情況。對于sltI，對比所有公開的序列，設計引物和探針以與所有三種變異體的保守區結合。對于sltII，公開基因的僅一個區是保守的，因此，該區被選擇用于熒光原寡核苷酸探針。用于sltII擴增的引物被設計在公開的sltII變異體的不確定的位置包含所有可能的核苷酸序列(簡并引物方法)(79-83)。通過采用簡并引物，可在一個PCR反應中檢測所有公開的變異體。
模板DNA的分離方法影響PCR的進行。比較了適宜作為用于常規應用的快速純化步驟的兩種方法，即煮沸制備法或自旋(spin)制備法。煮沸制備物可能仍然包含一些可影響PCR反應的細菌成分，然而，它極為迅速。自旋制備法包括起從可能的陰性影響物質中純化DNA作用的分離步驟。與當通過自旋制備法制備模板DNA的煮沸制備法比較，來自腸細菌的毒性基因的ΔRQ值和TaqManTM-PCR的敏感性未發現明顯增加。
TaqManTM-PCR對所有引物/探針結合的總的敏感性可與通過用溴化乙啶染色的瓊脂糖凝膠電泳檢測的PCR產物的視覺值相比。在優化的條件下，每次PCR反應可在107非致病性大腸桿菌中檢測到少如103的較小的cfusltI+EHEC。
由于第一種產生slt的菌株被發現為O157H7陽性(1，2)，免疫磁檢測法在大腸桿菌O157中的使用(54，91)被提出作為通過富集這種血清型而提高EHEC診斷靈敏性的方法。然而，顯然為O157抗原陰性的EHEC被這種方法遺漏。在最近EHEC分離物的血清分型研究中，這變得很顯然，即與非O157EHEC比較，目前O157+EHEC的數目少(12，15，28，29，31)。在德國南部進行的最近的一個研究中，13種分離物中的僅2種為O157陽性(92)。目前未能獲得用于其它O血清學的免疫磁檢測方法。而且，在毒性基因分析之前，在偏磁富集方法的情況下，可帶有志賀氏樣毒素的如檸檬酸桿菌屬(83)和腸細菌屬(89)的其它腸細菌將被遺漏。因此，被設計用于所有腸細菌中的毒性基因檢測的TaqManTM-PCR基PCR看來是優良的。
大部分腹瀉疾病的感染劑是未知的。對胃腸道中的細菌致病原的常規篩選包括沙門氏菌屬、志賀氏菌屬、志賀氏菌(S.aureus)、彎曲桿菌屬、弧菌屬、耶爾森氏菌屬和(C.difficile)(32)。熟知致病性大腸桿菌，如ETEC、EHEC、EIEC和EaggEC是重要的下胃腸道致病原，并因此可能明顯影響腹瀉感染的次數(32)。然而，未進行這些細菌的常規細菌診斷方法，而且，在大多數情況下，這些致病性大腸桿菌被誤診為非致病性共生菌群類型。為了解決這個問題，開發了一組特異性引物和熒光原探針并優化用于由這些細菌帶有的毒性因子的TaqManTM-PCR基檢測(表2和3)。在標準96井微量滴定的排列中，排列病人樣品、所有8個檢測的毒性基因的陽性和無模板對照，可獲得在5小時中從樣品DNA制備至熒光測定的來回時間。因此，用于致病性大腸桿菌的TaqManTM-PCR基分析提供一種極迅速的診斷這些細菌的方法。在準確、靈敏和具特異性的同時，與常規方法相比，這種分析法需要最少的后PCR加工時間。當在光學試管中進行TaqManTM-PCR時，而且PCR反應與擴增產物的交叉反應的危險被降至最小。致病性腸細菌帶有的毒性質粒的檢測可證實這些細菌在宿主中導致疾病的能力。不清楚是否包含毒素基因或附著因子的腸細菌也通常在宿主外表達它們。這可能是為什么在許多包含EHECs的sltI和sltII可通過基于核酸的方法檢測的HUS情況下，對志賀氏樣毒素的ELISA試驗可能是陰性的的一種解釋。
接著在用于測定在7個月中從在規定的地理區域(Bavaria南部)患有腹瀉的兒童中獲得的底樣(stool samples)的常規診斷方法中檢測用于致病性大腸桿菌檢測的根據本發明的TaqManTM-PCR分析。將通過TaqManTM-PCR獲得的結果與標準的用于PCR產物檢測的方法比較(溴化乙啶染色的瓊脂糖凝膠電泳)。分析100個底樣(表4)。22％的樣品對于一種或多種毒性因子被發現檢測為陽性。具有2例EHEC、5例ETEC、8例EaggEC、1例EIEC和16例EPEC。這指1/5患有腹瀉的兒童可能患有由致病性大腸桿菌導致的腹瀉。這些數目比所有其它常規篩選的細菌胃腸道致病原組高很多。在這組中觀察到僅2例沙門氏菌并且沒有彎曲菌。
令人感興趣的是，診斷帶有EHEC的兩名兒童為嚴重患病，一名患有出血性結腸炎，另一名發展成HUS，并被在危重監護病房中治療。
總的來講，這些研究表明在兒童中以及還在成人中的大部分腹瀉疾病與在標準微生物方法中被誤診為共生菌群的致病性大腸桿菌相關。根據本發明的TaqManTM方法首次實現了對這些重要的致病原的直接、快速、特異和敏感檢測。而且，用該方法檢測的毒性基因不局限于大腸桿菌，它們還可自由地轉移至其它腸細菌中。對這些細菌中的毒性基因的檢測還通過本文公開的TaqManTM-PCR檢測。該分析法僅需要最少的后PCR檢測時間，因此可在18小時內進行，并且消除了PCR交叉污染的問題。
根據本發明，大腸桿菌毒性因子/毒素基因被用作PCR擴增的靶。根據公開的序列設計PCR引物和熒光原探針。特別選擇了用于大腸桿菌和相關腸細菌致病組檢測的八個不同的引物和探針組，參見表1。
在表2中詳細描述了引物的序列和它們的位置以及GenBank登記號。EHEC sltI的檢測是基于sltI同源基因排序后的共有引物和探針序列(GenBank登記號Z36899，Z36900和Z36901)(77，78)。sltII變異體的檢測是基于同源基因的公開的序列(GernBank登記號M76738，Z37725，L11079，X67515，M59432，M29153，M36727和M21534)(79-83)。對于sltI的擴增，降解的引物組證實是最佳的。ETEC的診斷是基于熱不穩定(LT)(84)或熱穩定毒素(ST)(36)的擴增，EaggEC基于pCVD432質粒序列(40，50)、EIEC基于inv質粒序列(38，48)、EPEC基于大腸桿菌附著和脫落基因(EAF質粒)(37，85)或對于EHEC附著和脫落蛋白為大腸桿菌基因(eae)(86)。使用大腸桿菌parC基因特異性引物進行完整DNA制備物的PCR對照擴增(拓撲異構酶IV，Genbank登記號M58408)(87)。
寡核苷酸探針和它們的Genbank參考示于表3中。將寡核苷酸探針設計成GC含量為40-60％，在5’末端沒有G核苷酸，探針長度為27至30bp。探針在大多數5’和大多數3’堿基處分別與熒光報道染料(例如6-羧基-熒光素[FAM]；λem＝518nm)和熒光猝滅染料(6-羧基四甲基乙基羅丹明[TAMRA]；λem＝582nm)共價結合。所有引物和探針從Perkin Elmer，德國獲得。
通過從帶有LT、ST、inv-質粒、pCVD342、EAF、eae、sltI和sltII基因的大腸桿菌對照菌株中分離DNA來優化TaqManTM-PCR(參見表1)。為了最大PCR產物產率(如瓊脂糖凝膠電泳所證實)和RO值(RQ＝FAM熒光強度/TAMRA熒光強度)使用上述致病性大腸桿菌對照菌株調節MgCl2濃度。在5.2mmol的MgCl2濃度、35次循環、55℃的退火溫度和65℃的延伸溫度下獲得所使用的所有引物/熒光探針的最佳PCR反應。65℃的延伸溫度被發現產生較高的RQ值，這可能是由于在Taq聚合酶降解前較低的模板/熒光探針解離速率。
大腸桿菌sltI基因被用作建立PCR和分析探針相對于PCR引物的不同位置的靶序列。引物被設計在sltI基因的保守區退火(參見上文)。比較位于引物上游132bp的sltI和位于距引物21bp的sltI-N1兩個探針。用探針sltI-N1(RQm＝6.3800)獲得的RQ值被可重復性地發現比在相同的大腸桿菌sltI對照DNA的模板濃度下用探針sltI-NO(RQm＝0.9620)產生的RQ值。通常，而且緊鄰(4-20bp)兩個PCR引物中的一個的其它靶基因特異的探針一致產生比位于聚引物更遠距離的探針更高的RQ值。
由于報道了粗的細菌裂解物可包含可能干擾PCR進行的抑制因子，因此檢測了DNA制備對進行TaqManTM-PCR的影響。因此，在McConkey平板上培養過夜后收集細菌。通過煮沸接種在0.9％NaCl溶液中的細菌或通過用商業上的自旋制備法(參見實施例，材料和方法)分離基因組DNA來制備DNA。當比較兩種制備法時，TaqManTM-PCR的RQ值和靈敏度沒有不同。從來自105包含通過煮沸或通過自旋制備法制備的EHEC的sltI或sltII的DNA的PCR擴增獲得的RQ值是可相比較的。
TaqManTM-PCR法依賴于水解后從探針釋放的游離的報道染料(FAM)的檢測。因此，探針濃度也應通過影響在PCR循環中降解的探針部分對分析的進行產生影響。在100pmol-0.1pmol范圍內滴定探針的濃度并測定ΔRQ值。取決于擴增的靶基因，最佳探針濃度在10pmol至20pmol之間變化。
為了檢測TaqManTM-PCR法的靈敏度，以對數步驟稀釋將包含sltI或sltII的EHEC稀釋在包含為107cfu的大腸桿菌菌株ATCC11775的懸液中。在最佳條件下進行PCR，將來自溴化乙啶染色的瓊脂糖凝膠的結果與TaqManTM結果比較。包含sltI的EHEC菌株的最小檢測極限在107中為103cfu。對于sltII檢測極限，發現在107腸細菌中為103.5cfu。通過瓊脂糖凝膠電泳對PCR產物的檢測和通過TaqMan方法對一個信號的測定這兩種方法產生可相比較的結果，即在瓊脂糖凝膠中可見ΔRQ值在ΔRQ閾值之上的PCR產物帶，而且也在瓊脂糖凝膠中ΔRQ值在ΔRQ閾值周圍的PCR產物在檢測極限之下。在對于所有毒性因子/毒素的最佳檢測試驗后，建立TaqManTM-PCR用于對常規生物樣品的致病性大腸桿菌的存在的檢測中。將TaqManTM-PCR結果與瓊脂糖凝膠電泳進行比較。
下面的實施例將進一步說明本發明。然而，它不被認為是限制性的。
實施例1.使用根據本發明的方法檢測來自患有腹瀉的兒童的底樣中的致病性大腸桿菌的流行為了說明TaqManTM-PCR的進行和檢測致病性大腸桿菌的出現，對100份來自0至10歲的具有臨床腹瀉癥狀的兒童的底樣進行篩選。在下面第2項中將詳細描述試驗中所采用的材料和方法。
從1996年6月至10月進行樣品的收集。本研究中的所有樣品來自Bavaria南部區。將底樣鋪在McConkey瓊脂上，保溫過夜并收集腸細菌。分離DNA并用作包含sltI、sltII、LT、ST、EAF質粒、eae基因、inv質粒和pCVD432特異性的引物和熒光探針的PCR反應中的模板。為了證實來自各制備的DNA的完整性，建立包含用于大腸桿菌parC基因擴增的引物和內熒光探針的對照PCR反應。作為陽性分析對照，在各分析中進行一個PCR反應，其中存在來自陽性對照菌株的DNA的各毒性因子/毒素。使用該可靠的方法，可獲得所有靶基因的特異和靈敏的檢測。對100個來自患有腹瀉的兒童的底樣的系統分析產生22個樣品，其中可檢測三分之一或三分之二的致病性大腸桿菌毒性因子/毒素。詳細地說，2名病人帶有EHEC(一名帶有出血性結腸炎，以名發展成HUS)。3名病人檢測為ETEC陽性，16名為EPEC陽性，1名為EIEC陽性和8名為EaggEC陽性(參見表4)。患有出血性結腸炎的病人被檢測為sltI和eae陽性，發展成HUS的病人檢測為sltI，SltII，和eae陽性。一名病人同時帶有 ETEC(LT+，ST+)，EPEC(eae+)和EaggEC(pCVD342+)，一名病人被檢測為EIEC(inv+)和EaggEC(pCVD342)陽性，兩份底樣包含EPEC(eae+)和EaggEC(pCVD342)。
將來自帶有EHEC的兩名病人的腸細菌與sltI和sltII基因探針雜交以檢測TaqManTM-PCR的準確性和特異性。在其中TaqManTM-PCR為sltI陽性的病人1的情況下，可僅發現與sltI雜交的菌落。其中TaqManTM-PCR為sltI、sltII陽性的病人2的菌落與用于sltI和sltII的探針雜交。挑取陽性菌落，生物化學定型為大腸桿菌。
抗體敏感性檢測表明EHEC菌株對廣譜青霉素、頭胞菌素和回旋酶抑制劑敏感。
2.材料和方法a)細菌菌株、培養基、培養和DNA制備為了準確的PCR擴增，許多EHEC、ETEC、EPEC、EIEC和EaggEC大腸桿菌菌株被用作對照，它們由H.Karch，Wurzburg，德國和H.Beutin，柏林，德國(參見表1)友善提供。作為不帶有這些毒性基因的菌株，使用大腸桿菌ATCC11775。為了TaqManTM-PCR的最優化，37℃下，在McConkey瓊脂上(Becton Dickinson，德國)培養陽性對照。過夜培養后，收集細菌并重新懸浮于0.9％NaCL溶液中。將濁度調至McFarland0.5。通過煮沸(95℃，10分鐘)制備或使用QiaAmp組織試劑盒自旋制備柱(Qiagen，德國)分離DNA。10ul DNA懸液被用于PCR。在將適宜量的用于鋪展在mcConkey平板上后，進行來自人或牛的底樣的致病性大腸桿菌的檢測。過夜培養后，收集來自McConkey平板的表面的所有細菌菌落并如上所詳細描述地進行處理。
b)PCR循環在薄壁的0.2ml“光學PCR試管”中，在70ul最終體積中進行PCR反應(Perkin Elmer，德國)。反應混合物包含10ul細菌裂解液，5.25ul 25mmol MgCl2，7ul 10×PCR緩沖液，40pmol引物，20pmol特異性熒光探針，150uM各種dATP，dTTp，DGTP，dCTP(Perkin Elmer)，1UAmpliTaq-聚合酶(Perkin Elmer)。Perkin Elmer 9600型熱循環儀被用于PCR循環。通過94℃下加熱5分鐘進行細菌DNA的起始變性。所有循環均包括94℃，15秒的變性步驟，55℃，30秒的退火和65℃，30秒的延伸。進行35次循環。
c)后PCR加工循環完成后，使用裝有平板計數器的Perkin Elmer LS50B發光分光光度計測定報道染料，FAM和猝滅染料，TAMRA的熒光強度并在光學試管中校正PCR反應的熒光測定值。如(74)所描述地計算ΔRQ值。根據三份無模板對照的平均值之上的99％置信區間計算ΔRQ閾值值(ΔRQ閾值＝6,95×std無模板對照的平均值)。如果給出ΔRQ樣品＞ΔRQ閾值，PCR反應被計為陽性。為了證實TaqManTM-PCR測定的靈敏度，將PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳。將15ul樣品與2ul樣品緩沖液一起上樣。在2％包含溴化乙啶的瓊脂糖凝膠中以100V，35分鐘將PCR產物分離。在紫外線下可見DNA，使用EagleEyeII系(Stratagene)獲得數字圖象資料。
d)PCR擴增的證實將從各陽性對照菌株的模板獲得的PCR產物直接亞克隆至TA克隆載體中(Invitrogen，德國)以證實PCR擴增的特異性。在用連接產物轉染(CaCl2方法)DH5α細菌后，在包含青霉素(Sigma，德國)的LB平板中選擇包含質粒分細菌。用Qiagen DNA純化柱(Quiagen，德國)純化質粒DNA。采用與4種染料結合的二脫氧核苷酸對插入物進行PCR循環測序(DNA染料終止子循環測序試劑盒，Perkin Elmer，德國)。用AppliedBiosystems373A型號(Applied BioSystems，德國)獲得序列。使用McDNAsis程序(Appligene，英國)將插入序列與如表1所參考的公開序列比較。序列比較證實PCR產物與各毒性因子或毒素相同。
e)TaqManTM技術的靈敏度為了確定TaqManTM方法的靈敏度，在包含107cfu大腸桿菌參考菌株ATCC11775的溶液中進行陽性對照菌株的系列對數步驟的稀釋。通過煮沸法(參見上文)制備或通過使用設計用于基因組細菌DNA分離的自旋制備柱(Qiagen，德國)純化DNA。純化根據制造商的方法進行。使用在107大腸桿菌中為103cfu和在107大腸桿菌中為103.5cfu檢測包含sltI的菌株和和sltIII的菌株的檢測極限。
f)菌落雜交和EHEC細菌的分離將EHEC細菌菌株和來自在sltI或sltIITaqManTM-PCR中檢測為陽性的病人的底樣進行菌落雜交。簡單地說，將細菌平板接種在McConkey瓊脂平板上以致可見單個菌落。將細菌在尼龍膜(Genescreen Plus，NEN，德國)上進行印跡，裂解(1％SDS)，變性(0.5M NaOH，1.5M NaCl)，中和(1MTRIS，1.5M NaCl)，并洗滌(20×SSC)。80℃下將膜烘焙2小時。sltI或sltII特異性DNA探針被熒光素(Gene-Images隨機引物標記模件，Amersham，德國)標記。此后，將濾器與標記的探針雜交。通過采用抗FITC過氧化物酶mAb和ECL檢測模件(Gene-Images CDP-Star檢測模件，Amersham，德國)的非放射性檢測系統證實雜交。挑取與探針和非雜交菌落雜交的細菌菌落，通過TagMan-PCR證實并檢測抗生物素敏感性。
抗生物素敏感性試驗在菌落雜交中檢測了sltI或sltII或兩者毒性基因后，從McConkey平板中挑取EHEC和非EHEC大腸桿菌，并根據腸細菌的NCCLS指南進行MIC試驗。
表1大腸桿菌菌株-毒性因子/毒性
表2用于致病性大腸桿菌檢測的引物。W為A/T，R為A/G，D為A/G/T，Y為C/T和K為G/T。
表3用于致病性大腸桿菌檢測的TaqManTM探針
表4患有腹瀉的兒童底樣中的致病性大腸桿菌的頻率。
參考文獻1.疾病控制中心1982.來自出血性結腸炎的散發病例的大腸桿菌O157H7的分離-美國MMWR Morb.Mortal.Wkly.Rep.31580，585。
2.Karmali，M.A.，M.Petric，C.Lim，P.Fleming和B.t.Steele.1983.大腸桿菌細胞毒素，溶血性尿毒綜合癥和出血性結腸炎[letter]柳葉刀21299。
3.Karmali，M.A.，M.Petric，C.Lim，P.C.Fleming.1985自發性溶血性尿毒綜合癥與產vero細胞毒素大腸桿菌感染之間的相互關系傳染病雜志151775。
4.Riley，L.W.，R.S.Remis，S.D.Helgerson，H.B.McGee，J.G.Wells，B.R.Davis，R.J.Hebert，E.S.OlCott，L.M.Johnson，N.T.Hargrett，P.A.Blake和M.L.Cohen.1983與稀有的大腸桿菌血清型相關的出血性結腸炎新英格蘭醫學雜志308681。
5.Pai，C.H.，Gordon，H.V.Sims和L.E.Bryan.1984.與大腸桿菌0157H7相關的出血性結腸炎的發散病例。臨床、流行病學和細菌學特征國際醫學年鑒101738。
6.Borczyk，A.A.，M.A.Karmali，H.Lior和L.M.Duncan.1987.用于產vero細胞毒素大腸桿菌O157H7[letter]的牛儲蓄庫柳葉刀1；98。
7.Blanco，J.E.，M.Blanco和J.Blanco1995[食物和臨床樣品中的產腸毒素、產vero毒素和產壞死毒素大腸桿菌.動物作為人致病菌儲蓄庫的作用]微生物1197。
8.Ostroff，S.M.，P.M.Griffin，R.V.Tauxe，L.D.Shipman，K.D.Greene，J.G.Wells，J.H.Lewis、P.A.Blake和J.M.Kobayashi.1990.大腸桿菌0157H7感染在華盛頓州全州性的爆發美國流行病學雜志132239。
9.疾病控制中心1993目前來自hamburgers-western United States，1992-1993.MMWR42258。
10.Nathan，R.1996.日本大腸桿菌猖獗引發恐懼和氣憤天然藥物2956。
11.Griffin，P.M.，S.M.Ostroff，R.V.Tauxe，K.D.Greene，J.G.Wells，J.H.Lewis和P.A.Blake.1988.與大腸桿菌0157H7感染相關的疾病廣泛的臨床范圍國際醫學年鑒109705。
12.Karmali，M.A.1989.產vero細胞毒素大腸桿菌的感染臨床微生物綜述2；15。
13.Kovacs，M.J.，Roddy，S.Gregoire，W.Cameron，L.Eidus和J.Drouin.1990.由于大腸桿菌0157H7的出血性結腸炎后的血栓性血小板減少性紫癜。美國醫學雜志88；177。
14.O’Brien，A.D.和R.K.Holmes.1987.志賀菌和志賀樣毒素.微生物綜述51206.
15.Karch，H.和J.Bockemuhl.1989[腸出血性大腸桿菌感染(EHEC)臨床和微生物問題和對公共健康服務的挑戰]免疫感染17206。
16.Siegler，R.L.1995.溶血性尿毒綜合癥.北美臨床兒科學421505。
17.Rowe，P.C.，W.Walop，H.Hior和A.M.Mackenzie.1991.幼年大腸桿菌O157H7感染后的溶血性貧血女性處在增加的危險中？流行病感染106523。
18.1996.Haufung von EHEC-Erkrankungen in Bayern.Munchner ArztlicheAnzeigen 2314。
19.Doyle，M.P.1991.大腸桿菌O157H7和其在食品中的重要性國際食品微生物雜志12289。
20.Belongia，E.A.，K.L.MacDonald，G.L.Parham，K.E.White，J.A.Korlath，M.N.Lobato，S.M.Strand，K.A.Casale和M.T.Osterholm.1991.與預煮肉肉餅的消費相關的大腸桿菌O157H7的爆發。傳染病雜志164338。
21.O’Brien，A.D.，A.R.Melton，C.K..Schmitt，M.L.McKee，M.L.Batts和D.E.Griffin.1993.導致出血性結腸炎和溶血性尿毒綜合癥在華盛頓州的hamburger-borne爆發的大腸桿菌O157H7病原體特征臨床微生物學雜志312799。
22.Beutin，L.D.Geier，H.Steinruck，S.Zimmermann和F.Scheutz.1993.在七種不同種健康家畜中的產vero毒素(志賀菌樣毒素)大腸桿菌的流行和一些特性臨床微生物學雜志312483。
23.Martin，M.L.，L.D.Shipman，J.G.Wells，M.E.Potter，K.Hedberg，I.K.Wachsmuth，R.V.Tauxe，J.P.Davis，J.arnoldi和J.Tilleli.1986.從乳牛分離與兩例溶血性尿毒綜合癥[letter]相關的大腸桿菌O157H7柳葉刀21043。
24.Besser，R.E.，S.M.Lett，J.T.Weber，M.P.Doyle，T.J.barrett，J.G.Wells和P.M.Griffin.1993.在新榨蘋果汁中的E.coli O157H7引起的腹瀉和溶血性尿毒癥狀的爆發[見評述]JAMA 2692217。
25.Read，S.C.，C.L.Glyes，R.C.Clarke，H.Lior和S.McEwen.1990在安達略省西南部產vero細胞毒素大腸桿菌在切碎的牛肉、豬和雞中的流行。Epidemiol.Infect.10511。
26.Gannon，V.P.，R.K.King，J.Y.Kim和E.J.Thomas.1992.使用聚合酶鏈反應檢測切碎的牛肉中的志賀氏菌樣產毒素大腸桿菌的快速靈敏的方法。實用環境微生物583809。
27.Bopp，C.A.，K.D.Greene，F.P.Downes，E.G.Sowers，J.G.Wells和I.K.Wachsmuth.1987.與出血性結腸炎相關的非尋常的產vero毒素大腸桿菌。臨床微生物學雜志251486。
28.Farmer，J.J.和B.R.Davis.1985.H7抗血清山梨糖醇發酵培養基用于檢測與出血性結腸炎相關的大腸桿菌O157H7的單試管篩選培養基。臨床微生物學雜志22620。
29.Scotland，S.M.，B.Rowe，H.R.Smith，G.A.Willshaw和R.J.Gross.1988.來自患有溶血性尿毒綜合癥的幼兒的產vero細胞毒素大腸桿菌菌株以及用特異性DNA探針的檢測。醫學微生物雜志25237。
30.Scotland，S.M.，GA.Willshaw，H.R.Smith，B.Said，N.Stockes和B.Rowe.1993.屬于血清組O26，O55，O111和O128的在英國于1991年從患有腹瀉的病人中分離的大腸桿菌菌株的毒力特性。流行病感染111429。
31.Russmann，H.，E.Kothe，H.Schmidt，S.Franke，D.Harmsen，A.Caprioli和H.karch.1995.與溶血性尿毒綜合癥相關的非O157大腸桿菌菌株中的志賀氏樣毒素基因的基因型。醫學微生物雜志42404。
32.Koneman，E.W.，S.D.Allen，W.M.Janda，P.C.Schreckenberger和C.W.j.Washington.1992.腸桿菌科診斷微生物J.B.Lippincott公司，費城132-133。
33.Edelman，R.和N.F.Pierce.1984.來自國家變態反應和傳染病研究所。第19界美國日本聯合霍亂會議總結。傳染病雜志1491014。
34.Hart，C.A.，R.M.Batt和J.R.Saunders.1993.由大腸桿菌導致的腹瀉。Ann.Trop.Paediatr.13121.
35.Chapman，P.A.和C.M.Daly.1993.對檢測產腸毒素大腸桿菌的無放射性三價體DNA探針(LT，STla，STlb)的評價。臨床病理學雜志46309。
36.Moseley，S.L.，W.Hard，M.I.Hug，P.Echeverria和S.Falkow.1983.編碼大腸桿菌的熱穩定腸毒素的基因的分離和核苷酸序列測定。感染性免疫391167。
37.Jerse，A.E.，J.Yu，B.D.Tall和J.B.Kaper.1990.導致組織培養細胞損傷的產生和消除所必需的腸致病大腸桿菌的基因座。Proc.Acad.Sci.U.S.A.877839。
38.Taylor，D.N.，P.Echeverria，O.Sethabutr，C.Pitarangsi，U.Leksomboon，N.R.Blacklow，B.Rowe，R.Gross和J.Cross.1988.志賀氏菌的臨床和微生物學特性以及由DNA雜交檢測的腸侵染性大腸桿菌感染。臨床微生物學雜志261362。
39.Prats，G.和T.Llovet.1995.[腸侵染性大腸桿菌發病機理和流行病學]微生物學1191。
40.Nataro，J.P，.Y.Maneval，A.L.German，W.C.Martin和M.M.Levine.1992.腸聚集大腸桿菌的集聚粘附菌毛介導與HEp-2細胞的粘附以及人紅細胞的凝集。感染免疫學602297。
41.Cohen，M.B.，J.A.Hawkins，L.S.Weckbach，J.L.Staneck，M.M.Levine和J.E.Heck.1993.腸集聚大腸桿菌在患有和不患有霍亂的旅游者中的集群。臨床微生物學雜志31351。
42.Chang，P.P，J.Moss，E.M.Twiddy和R.K.Holmes.1987.大腸桿菌II型熱不穩定腸毒素通過ADP核糖基化活化人成纖維細胞中的腺苷酸環化酶。感染免疫學551854。
43.Pickett，C.L.，D.L.Weinstein和R.K.Holmes.1987.大腸桿菌的IIa型熱不穩定腸毒素的遺傳學操縱子融合，核苷酸序列和雜交研究。細菌學雜志1695180。
44.Giron，J.A.，M.S.Donnenberg，W.C.Martin，K.G.Jarvis和J.B.kaper.1993.維管形成菌毛結構基因(bfpA)在腸致病性大腸桿菌中的分布。傳染性疾病1681037。
45.Karch，H.，J.Heesemann，R.laufs，A.D.O’Brien，C.O.Tacket和M.M.Levine.1987.腸出血性大腸桿菌O157H7的質粒為新的菌毛抗原的表達和粘附于水平細胞所需要。感染免疫學55455。
46.Nataro，J.P.，M.M.baldini和J.B.kaper.1985.用DNA探針對腸致病大腸桿菌的粘附因子的檢測。感染性疾病雜志152560。
47.Watanabe，H.，E.Arakawa，K.Ito，J.Kato和A.Nakamura.1990.通過使用Tn3-Lac轉座子的對侵染區的遺傳分析以及用于宋內氏志賀氏菌的細胞侵染的第二個正調節子基因，invE的鑒定invE與質粒P1的ParB的顯著的同源性。細菌學雜志172619。
48.Sasakawa，C.，K.Komatsu，T.Tobe，T.Suzuki和M.Yoshikawa.1993.形成操縱子的區5的八個基因對弗氏志賀氏侵染水平細胞是必需的。細菌學雜志1752334。
49.Echeverria，P.，O.Serichantalerg，S.Changchawalit，B.Baudru，M.M.levine，F.Orskov和I.Orskov.1992.嬰兒腹瀉中的組織培養物粘附性大腸桿菌。感染性疾病雜志165141。
50.Schmidt，H.C.Knop，S.Franke，S.Aleksic，J.Heesemann和H.Karch.1995.用于篩選腸聚集性大腸桿菌的PCR的開發。臨床微生物學雜志33701。
51.Faruque，S.M.，K.Haider，M.M.Rahman，A.R.AbdulAlim，A.H.Baqui，Q.S.Ahmad，K.M.Hossain和M.J.Albert.1992。評價DNA探針以鑒定來自孟加拉共和國的患有腹瀉的兒童的腸聚集性大腸桿菌。腹瀉疾病研究雜志1031。
52.Yamamoto，T.，P.Echeverria和T.Yokota.1992.腸聚集性大腸桿菌的藥物抗性和對人腸的粘附性。感染性疾病雜志165744。
53.Savarino，S.J.，A.Fasano，J.Watson，B.M.Martin，M.M.Levine，S.Guandalini和P.Guerry.1993.腸聚集性大腸桿菌熱穩定內毒素1代表另一亞族大腸桿菌熱穩定毒素。Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.903093。
54.Bennett，A.R.，S.MacPhee和R.P.Betts.1995.對絞碎的牛肉中的大腸桿菌O1571的分離和檢測方法的評價。應用微生物學通訊20375。
55.March，S.B.和S.Ratnam.1986.用于檢測與出血性結腸炎相關的大腸桿菌O157H7的Sorbitol-MacConkey培養基。臨床微生物雜志23869。
56.Kleanthous，H.，N.K.Fry，H.R.Smith，R.J.Gross和B.Rowe.1988.Sorbitol-MacConkey瓊脂與特定的抗血清結合在檢測大腸桿菌O157的產Vero細胞毒素菌株中的用途。流行病感染101327。
57.March，S.B.和S.Ratnam.1989.檢測大腸桿菌血清型O157的乳膠凝聚試驗。臨床微生物學雜志271675。
58.Beutin，L.，S.Aleksic，S.Zimmermann和K.Gleier.1994從德國病人分離的大腸桿菌vero細胞毒性菌株的毒性因子和表型試驗。醫學微生物與免疫學柏林18313。
59.Stroeher，U.H.，L.Bode，L.Beutin和PA.Manning.1993.與大腸桿菌蛋白相關的33kDa腸溶血素(Ehly1)的表征和序列。基因13289。
60.Johnson，R.P.，R.J.Durham，S.T.Johnson，L.A.MacDonald，S.R.Jeffrey和B.T.Butman.1995.通過酶聯免疫吸附測定，EHEC-Tek對肉中的大腸桿菌O157H7的檢測。應用環境微生物61386。
61.Padhey，N.V.和M.P.Doyle.1991.快速檢測食物中的腸出血性大腸桿菌O157H7的方法。應用環境微生物572693。
62.Clark，C.G.S.Johnson和R.P.Johnson.1995.對大腸桿菌O157H7具有活性的單克隆抗體的進一步表征。醫學微生物雜志43262。
63.Karmali，M.A.，M.Petric，M.Winkler，M.Bielaszewska，J.Brunton，N.van dekar，T.Morooka，G.B.Nair，S.E.Richardson和G.S.Arbus.1994.用于檢測大腸桿菌Vero細胞毒素的免疫球蛋白G抗體的酶聯免疫吸附測定。臨床微生物學雜志321457。
64.Gunzer，F，H.Bohm，H.Russmann，M.BItzan，S.Aleksic和H.Karch.1992.患有出血性尿毒癥的病人中的發酵山梨糖醇的大腸桿菌O157的分子檢測。臨床微生物學雜志301807。
65.Bockemuhl，J.，S.Aleksic和H.Karch.1992.來自德國病人的非O-組157的志賀氏樣產毒素(vero細胞毒素)大腸桿菌菌株的血清學和生物化學特性。國際醫學微生物與病毒寄生蟲感染性疾病雜志276189。
66.Smith，H.R.，S.M.Scotland，G.A.Willshaw，C.Wray，I.M.McLaren，T.Cheasty和B.Rowe.1988.動物來源的大腸桿菌菌株中的Vero細胞毒素的產生和VT基因的存在。普通微生物學雜志134829。
67.Karch，H.和T.Meyer.1989.對用于鑒定志賀氏樣產毒素大腸桿菌的寡核苷酸探針的評價。臨床微生物學雜志271180。
68.Jackson，M.P.1991.通過使用摻入Digixigenin-11-dUTP的聚合酶鏈反應對志賀氏產毒素志賀氏類型1痢疾和大腸桿菌的檢測。臨床微生物學雜志291910。
69.Johnson，W.M.，D.R.Pollard，H.Lior，S.D.Tyler和K.R.Rozee.1990.通過聚合酶鏈反應區分編碼大腸桿菌vero毒素2和與豬水腫病(VTe)相關的vero毒素的基因。臨床微生物學雜志282351。
70.Johnson，W.M.，S.D.Tyler，G.Wang和H.Lior.1991.通過編碼大腸桿菌vero毒素(VTe變異體)的基因中的特定的靶序列的聚合酶鏈反應的擴增。FEMS微生物學通訊68227。
71.Karch，H.和T.Meyer.1989.用于通過聚合酶鏈反應擴增獨特的志賀氏樣毒素基因片段的單藥物對。臨床微生物學雜志272751。
72.Pollard，D.和W.M.Johnson.1990.通過聚合酶鏈反應的對大腸桿菌中的vero毒素基因的快速特異性檢測。臨床微生物學雜志28540。
73.Holland，P.M.，R.D.Abramson，R.Watson和D.H.Gelfand.1991.通過使用棲熱水生菌DNA聚合酶的5’---3’外切核酸酶活性對特定的聚合酶鏈反應產物的檢測。Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.887276。
74.Bassler，H.A.，S.J.Flood，K.J.Livak，J.Marmaro，R.Knorr和C.A.Batt.1995.熒光探針在用于檢測李斯特菌屬單核細胞基因的基于PCR測定中的應用。應用環境微生物613724。
75.Livak，K.J.S.J.Flood，J.Marmaro，W.Giusti和K.Deetz.1995.在相反末端具有熒光染料的寡核苷酸提供可用于檢測PCR產物和核酸雜交的猝滅探針系統。PCR方法與應用4357。
76.Forster，V.1948.Zwischenmolekulare Energiewanderung und Fluoreszenz.物理年刊(Leipzig)255。
77.Paton，A.W.，J.C.Paton，P.N.Goldwater和P.A.Manning.1993.通過聚合酶鏈反應對原代糞便培養物中的大腸桿菌志賀氏樣毒素基因的直接檢測。臨床微生物學雜志313063。
78.Paton，A.W.，J.C.Paton，P.N.Goldwater，M.W.Heuzenroeder和P.A.Manning.1993.大腸桿菌O111的變異的的志賀氏樣毒素類型I操縱子的序列H-。基因12987。
79.Paton，A.W.，J.C.Paton和P.A.Manning.1993.變異的大腸桿菌志賀氏樣毒素類型II操縱子的聚合酶鏈反應擴增，克隆和測序。微生物學與病理學1577。
80.Gyles，C.L.，S.A.De Grandis，C.Mackenzie和J.L.Brunton.1988.決定大腸桿菌的豬水腫病分離物中的vero細胞毒素產生的基因的克隆和核苷酸序列分析。微生物學與病理學5419。
81.Gannon，V.P.，C.Teerling，S.A.Masri和C.L.Gyles.1990.大腸桿菌志賀氏樣毒素II族的另一種變異體的分子克隆和核苷酸序列。普通微生物學雜志1361125。
82.Schmitt，C.K.，M.L.McKee和A.D.O’Brien.1991。在腸溶血性大腸桿菌菌株中常見的兩拷貝的志賀氏樣毒素II相關基因導致O157H-菌株E32511的抗原異質性。感染性免疫591065。
83.Schmidt，H.，M.Montag，J.Bockemuhl，J.Heesemann和H.Karch.1993.來自人和牛樣品中的弗勞地氏檸檬桿菌菌株中的志賀氏樣毒素II相關的細胞毒素。感染性免疫61534。
84.Inoue，T.，T.Tsuji，M.Koto，S.Imamura和A.Miyama.1993.來自小雞腸毒性大腸桿菌的熱不穩定腸毒素的氨基酸序列與人菌株H10407的序列相同。FEMS微生物通訊108157。
85.Franke，J.H.Schmidt和H.Karch.1994.腸致病性大腸桿菌(EPEC)粘附因子探針的核苷酸序列分析和用于快速檢測EPEC帶有毒性的質粒的PCR的開發。臨床微生物學雜志322460。
86.Yu，J.和J.B.Kaper.1992.腸出血性大腸桿菌O157H7的族基因的克隆和表征。分子微生物學6411。
87.Kato，J.，Y.Nishimura，R.Imamura，H.Nike，S.Hiraga和H.Suzki.1990.大腸桿菌中染色體分離必需的新的拓撲異構酶[公開的erratum出血在細胞1991年6月28日；65(7)1289]。細胞63393。
88.Zhao，S.，S.E.Mitchell，J.Meng，M.P.Doyle和S.Kresovich.1995.腸溶血性大腸桿菌O157H7的eaeA基因上游基因的克隆和核苷酸序列。FEMSMicrobiol.Lett.13335。
89.Paton，A.W.和J.C.Paton.1996.產生與溶血性尿毒癥病例相關的志賀氏樣毒素II相關的細胞毒素的下水道腸細菌。臨床微生物學雜志34463。
90.Witham，P.K.，K.J.Livak，C.A.Batt和C.T.Yamashiro.1996.用于檢測切碎的牛肉中的大腸桿菌志賀氏樣毒素基因的基于PCR的分析。實用環境微生物621347。
91.Karch，H.，C.Janetzki-Mittmann，S.Aleksic和M.Datz.1996.通過使用免疫磁分離，基于DNA的方法從患有溶血性尿毒癥的病人中分離腸溶血性大腸桿菌O157菌株和直接培養物。臨床微生物學雜志34516。
92.Huppertz，H.I.，D.Busch，H.Schmidt，S.Aleksic和H.Karch.1996.與產生志賀氏樣毒素的大腸桿菌非O157生物相關的幼兒腹瀉。兒科學雜志128341。
權利要求
1.一種檢測樣品中致病性大腸桿菌的方法，包括使用一組致病性大腸桿菌的毒性因子/毒素特異性的寡核苷酸引物將從所述樣品中分離的DNA進行PCR擴增，其中引物選自與編碼熱不穩定毒素，或熱穩定毒素的基因雜交的用于腸產毒性大腸桿菌特有的DNA序列擴增的引物；與編碼熱穩定毒素的基因雜交的用于腸聚集性大腸桿菌特有的DNA序列擴增的引物；與pCVD432質粒雜交的用于腸聚集性大腸桿菌特有的DNA序列擴增的引物；與inv質粒雜交的用于腸侵染性大腸桿菌特有的DNA序列擴增的引物；與EAF質粒或eae基因雜交的用于腸致病性大腸桿菌特有的DNA序列擴增的引物；和/或與編碼志賀氏樣毒素sltI或sltII的基因雜交的用于腸出血性大腸桿菌特有的DNA序列擴增的引物，接著使用常規方法檢測和鑒定擴增的產物。
2.根據權利要求1的方法，其中與編碼腸產毒性大腸桿菌特有的熱不穩定毒素的基因雜交的引物組為LT-15′GCG TTA CTA TCC TCT CTA TGT G3′和LT-25′AGT TTT CCA TAC TGA TTG CCG C3′；與編碼腸產毒性大腸桿菌特有的熱穩定毒素的基因雜交的引物組為ST-15′TCC CTC AGG ATG CTA AAC CAG3′和ST-2a5′TCG ATT TAT TCA ACA AAG CAA C3′；與編碼腸聚集性大腸桿菌特有的熱穩定毒素的基因雜交的引物組為EASTI-15′AAC TGC TGG GTA TGT GGC TGG3′和EASTI-25′TGC TGA CCT GCC TCT TCC ATG3′；與pCVD432質粒雜交的引物組為EA-15′CTG GCG AAA GAC TGT ATC ATT G3′和EA-25′TAA TGT ATA GAA ATC CGC TGT T3′；與inv質粒雜交的引物組為EI-15′TTT CTG GAT GGT ATG GTG AGG3′和EI-25′CTT GAA CAT AAG GAA ATA AAC3′；與EAF質粒雜交的引物組為EP-15′CAG GGT AAA AGA AAG ATG ATA AG3′和EP-25′AAT ATG GGG ACC ATG TAT TAT C3′；與eae質粒雜交的引物組為EPeh-15′CCC GGA CCC GGC ACA AGC ATA AG3′和EPeh-25′AGT CTC GCC AGT ATT CGC CAC C3′；與編碼志賀氏樣毒素sltI的基因雜交的引物組為SltI-15′ATG AAA AAA ACA TTA TTA ATA GC3′和SltI-25′uTCA CYG AGC TAT TCT GAG TCA AGC3′；和與編碼志賀氏樣毒素sltII的基因雜交的引物組為SltII-15′ATG AAG AAG ATR WTT RTD GCR GYT TTA TTY G3′和SltII-25′TCA GTC ATW ATT AAA CTK CAC YTS RGC AAAKCC3′其中W為A/T，R為A/G，D為A/G/T，Y為C/T和K為G/T。
3.根據權利要求1-2的方法，其中具有另外5’-3’外切核酸酶活性的聚合酶被用于DNA擴增中，并且在大多數5’堿基處被熒光染料標記和大多數3’堿基出被熒光猝滅染料標記的在靶DNA中雜交的寡核苷酸探針包括在擴增方法中；所述標記的寡核苷酸探針對由所述聚合酶的5’-3’外切核酸酶降解敏感以產生可通過熒光原檢測法檢測的片段。
4.根據權利要求3的方法，其中用于腸產毒性大腸桿菌特有的熱不穩定毒素檢測的標記的寡核苷酸探針為5′AGC TCC CCA GTC TAT TAC AGA ACT ATG3′；用于腸產毒性大腸桿菌特有的熱穩定毒素檢測的標記的寡核苷酸探針為5′ACA TAC GTT ACA GAC ATA ATC AGA ATC AG3′；用于腸聚集性大腸桿菌特有的熱穩定毒素檢測的標記的寡核苷酸探針為5′ATG AAG GGG CGA AGT TCT GGC TCA ATG TGC3′；用于pCVD432質粒檢測的標記的寡核苷酸探針為5′CTC TTT TAA CTT ATG ATA TGT AAT GTC TGG3′；用于inv質粒檢測的標記的寡核苷酸探針為5′CAA AAA CAG AAG AAC CTA TGT CTA CCT3′用于EAF質粒檢測的標記的寡核苷酸探針為5′CTT GGA GTG ATC GAA CGG GAT CCA AAT3′；用于eae基因檢測的標記的寡核苷酸探針為5′TAA ACG GGT ATT ATC AAC AGA AAA ATC C3′；用于志賀氏樣毒素sltI基因檢測的標記的寡核苷酸探針為5′TCG CTG AAT CCC CCT CCA TTA TGA CAG GCA3′；和用于志賀氏樣毒素slt II基因檢測的標記的寡核苷酸探針為5′CAG GTA CTG GAT TTG ATT GTG ACA GTC ATT3′。
5.根據權利要求3-4的方法，其中熒光報道染料為6-羧基-熒光素、四氯-6-羧基熒光素或六氯-6-羧基熒光素和熒光猝滅染料為6-羧基四甲基羅丹明。
6.根據權利要求1-5的方法，其中PCR擴增方法由MgCl2濃度為5.2mmol，退火溫度為55℃和延伸溫度為65℃的35次PCR循環組成。
7.可用于致病性大腸桿菌的毒性因子和/或毒素特異性的DNA的PCR擴增的一組引物，選自與編碼腸產毒性大腸桿菌的熱不穩定毒素或熱穩定毒素的基因雜交的一組引物；與編碼腸聚集性大腸桿菌的熱穩定毒素的基因雜交的一組引物；與腸聚集性大腸桿菌的pCVD432質粒雜交的一組引物；與腸侵染性大腸桿菌的inv質粒雜交的一組引物；與腸致病性大腸桿菌的EAF質粒或eae基因雜交的一組引物；和與編碼腸出血性大腸桿菌的志賀氏樣毒素sltI或sltII的基因雜交的一組引物。
8.根據權利要求7的引物組，其中與編碼腸產毒性大腸桿菌的熱不穩定毒素的基因雜交的引物組為LT-15′GCG TTA CTA TCC TCT CTA TGT G3和LT-25′AGT TTT CCA TAC TGA TTG CCG C3′；與編碼腸產毒性大腸桿菌的熱穩定毒素的基因雜交的引物組為ST-15′TCC CTC AGG ATG CTA AAC CAG3′和ST-2a5′TCG ATT TAT TCA ACA AAG CAA C3′；與編碼腸聚集性大腸桿菌的熱穩定毒素的基因雜交的引物組為EASTI-15′AAC TGC TGG GTA TGT GGC TGG3′和EASTI-25′TGC TGA CCT GCC TCT TCC ATG3′；與pCVD432質粒雜交的引物組為EA-15′CTG GCG AAA GAC TGT ATC ATT G3′和EA-25′TAA TGT ATA GAA ATC CGC TGT T3′；與inv質粒雜交的引物組為EI-15′TTT CTG GAT GGT ATG GTG AGG3′和EI-25′CTT GAA CAT AAG GAA ATA AAC3′；與EAF質粒雜交的引物組為EP-15′CAG GGT AAA AGA AAG ATG ATA AG3′和EP-25′AAT ATG GGG ACC ATG TAT TAT C3′；與eae基因雜交的引物組為EPeh-15′CCC GGA CCC GGC ACA AGC ATA AG3′和EPeh-25′AGT CTC GCC AGT ATT CGC CAC C3′；與編碼志賀氏樣毒素sltI基因雜交的引物組為SltI-15′ATG AAA AAA ACA TTA TTA ATA GC3′和SltI-25′TCA CYG AGC TAT TCT GAG TCA AGC3′；與編碼志賀氏樣毒素sltII的基因雜交的引物組為SltII-15′ATG AAG AAG ATR WTT RTD GCR GYT TTA TTY G3′和SltII-25′TCA GTC ATW ATT AAA CTK CAC YTS RGC AAAKCC3′其中W為A/T，R為A/G，D為A/G/T，Y為C/T和K為G/T。
9.根據權利要求8的引物組，除開用于靶DNA的擴增的引物外，它還包含在大多數5’堿基處被熒光報告染料，如6-羧基-熒光素、四氯-6-羧基熒光素或六氯-6-羧基熒光素標記和在大多數3’堿基處被熒光猝滅染料如6-羧基四甲基羅丹明標記的標記的寡核苷酸探針，并且具有選自下面的核苷酸序列5′AGC TCC CCA GTC TAT TAC AGA ACT ATG3′其與編碼腸產毒性大腸桿菌的不穩定毒素的基因雜交；5′ACA TAC GTT ACA GAC ATA ATC AGA ATC AG3′其與編碼腸產毒性大腸桿菌的穩定毒素的基因雜交；5′ATG AAG GGG CGA AGT TCT GGC TCA ATG TGC3′其與編碼粘附性大腸桿菌的穩定毒素的基因雜交；5′CTC TTT TAA CTT ATG ATA TGT AAT GTC TGG3′其與pCVD432質粒雜交；5′CAA AAA CAG AAG AAC CTA TGT CTA CCT3′其與inv質粒雜交；5′CTT GGA GTG ATC GAA CGG GAT CCA AAT3′其與EAF質粒雜交；5′TAA ACG GGT ATT ATC AAC AGA AAA ATC C3′其與eae基因雜交；5′TCG CTG AAT CCC CCT CCA TTA TGA CAG GCA3′其與志賀氏樣毒素sltI基因雜交；和5′CAG GTA CTG GAT TTG ATT GTG ACA GTC ATT3′其與志賀氏樣毒素sltII基因雜交。
10.根據權利要求1-6的方法在診斷包括人的活動物體的大腸桿菌感染中或在檢測消費品，如肉、奶和蔬菜的大腸桿菌污染中的用途。
全文摘要
本發明涉及一種檢測樣品中致病性大腸桿菌的方法,包括使用致病性大腸桿菌特異性的寡核苷酸引物將從所述樣品中分離出的DNA進行PCR擴增。
文檔編號C12Q1/68GK1258320SQ98804409
公開日2000年6月28日 申請日期1998年4月21日 優先權日1997年4月22日
發明者克勞斯·費弗 申請人:巴法理安諾迪克研究協會有限公司