硫化物產生抑制劑的制作方法

專利名稱：硫化物產生抑制劑的制作方法
技術領域：
本發明涉及硫化物產生抑制劑，這種抑制劑能減少污染物質和惡臭物質的產生，例如在養魚類和甲殼類(如對蝦、小虹鲹、鰨類)的池塘內、高層建筑的地下排水槽等內含硫化物的淤泥，本發明還涉及將所述抑制劑用于魚類和甲殼類養殖、防止地下排水槽散發惡臭以及凈化環境的方法。
背景技術：
在日本Inland Sea(內陸海)的沿海地區(Kyushu、Okinawa等海岸)迄今為止養殖著各種魚類和甲殼類。其中有大量的對蝦、小虹鲹、鰨類等的養殖場，在這里養殖的魚類和甲殼類被大量運往市場。
養殖魚類和甲殼類需要注意環境因素(例如水溫和飼料量)，因為當這些因素惡化時，魚類和甲殼類的存活率就會下降。目前在眾多因素中，養殖場產生的硫化物正成為一個嚴重的問題。這些硫化物主要包含金屬硫化物和硫化氫。前一種硫化物是沉積在養殖場底部沙地上的淤泥狀黑色物質，構成魚類和甲殼類減產的原因。后一種硫化物導致池塘散發異味，并且對生物呼吸有抑制作用，并造成水中溶解氧的消耗。
一般認為硫化物的產生機制如下首先，通過兩個形成途徑形成了硫化氫。更具體地說，一種情況中，在由飼料和/或類似物質中溶解出來的蛋白質中包含的含硫氨基酸發生脫硫反應，形成硫化氫，一種情況是硫酸根離子通過同化性還原形成硫化氫。有多種細菌參與這些反應。然后，已形成的硫化氫與底部沉積物中的鐵鹽等反應。由此形成的金屬硫化物以淤泥的形式累積。為了阻止這些硫化物的累積采取了各種措施。
例如，實行的做法有用沙泵將水底淤泥泵出并進行處理，散布過氧化鈣(每年至少300噸)，等等。但是，不能說這些方法就是適用的方法，因為人們認為這些方法不具有抑制污染進展的效果，而從成本角度來說，也是一個沉重的負擔。另外，目前市場上有一些能分解水底淤泥的微生物制品。但是使用這些微生物制品被認為效果不理想。
另一方面，可能在某些情況中，不僅是養殖場，多層建筑的地下排水槽等處也會產生硫化物。這些硫化物還構成從建筑物散發的氣體中的惡臭成分。市場上出售微生物制品等作為抑制惡臭散發的措施。但它們沒有公認的顯著效果。
因此，本發明的一個目的是提供一種硫化物發生的抑制劑，它能抑制容易產生硫化物的環境(如養殖場和高層建筑的排水槽)產生硫化物，凈化這些環境，防止散發惡臭，并使魚類和甲殼類的產量提高等等。
發明公開針對上述情況，本發明人進行了大量研究。結果驚奇地發現，能夠同化水溶性肽或水溶性蛋白質的芽孢桿菌屬細菌，能抑制淤泥之類的地方中硫化物的產生，自然抑制異味的散發和改善上述環境，從而實現了本發明。
根據本發明，提供了一種硫化物產生的抑制劑，其中包含有同化水溶性肽或水溶性蛋白質能力的芽孢桿菌屬細菌。
根據本發明，還提供了一種含硫化物淤泥的凈化劑，其中包含有同化水溶性肽或水溶性蛋白質能力的芽孢桿菌屬細菌。
根據本發明，進一步提供了一種改善魚類和甲殼類養殖場水底沉積物的試劑，其中包含有同化水溶性肽或水溶性蛋白質能力的芽孢桿菌屬細菌。
根據本發明，再進一步提供了魚類和甲殼類的一種養殖方法，它包括將上述硫化物產生抑制劑施加到魚類和甲殼類養殖場中實行養殖。
根據本發明，還提供了一種抑制異味散發的方法，它包括將上述硫化物產生抑制劑施加到地下排水槽中。
根據本發明，還提供了一種凈化環境的方法，它包括將上述硫化物產生抑制劑用于該環境。
實施本發明的最佳方式對可用于本發明的芽孢桿菌屬的細菌，可以使用任何細菌而不必具體限定，只要它們有同化水溶性肽或水溶性蛋白質的能力即可。
在芽孢桿菌屬的這種細菌中，優選用短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus)或遲緩芽孢桿菌(B.lentus)抑制硫化物產生。更優選選自短小芽孢桿菌A-1株系、遲緩芽孢桿菌A-2株系、遲緩芽孢桿菌A-3株系和短小芽孢桿菌A-4株系中的一或多種細菌。這四種芽孢桿菌屬細菌是從大約30種分離自Oita的Beppu灣海底淤泥和東京灣Yokohama海岸海水的微生物中篩選得到的。以它們在培養基上的生長度作為篩選的指標，該培養基是通過從對蝦的混合飼料(Ebian，Kyowa Hakko Kogyo Co.，Ltd.產品)提取水溶性蛋白質并用瓊脂使其凝固得到的。從由此得到的一組細菌中挑選病原性低的屬，得到了上述4株菌。又及，根據布達佩斯條約，將A-1株系、A-4株系、A-2株系和A-3株系保藏在國立生命科學和人體技術研究所、工業科學和技術局(1-3，Higashi 1 chome Tsukuba-shi Ibaraki-ken，305-8566，Japan)，保藏號分別為FERM BP-6280(原保藏日1997年3月21日)、FERM BP-6281(原保藏日1997年3月21日)、FERM BP-6278(原保藏日1998年3月3日)和FERM BP-6279(原保藏日1998年3月3日)。
按照以下方法檢測了這四株菌的真菌學特性。結果示于表1、2和3。
(檢測方法)
(1)首先按照“醫學細菌鑒定手冊”(第三版，Cowan和Steels，57頁，Kindai Shuppan)作革蘭氏染色等，并按照“新編細菌培養教程，末卷”(第二版，156頁，Kindai Shuppan)做嗜鹽性檢測。(表1)(2)用研究細菌生物化學特性的試劑盒(Api 20 NE，NipponBiomeryu Bitec產品)研究四株菌的生物化學特性(表2)。
(3)再用研究細菌生物化學特性的試劑盒(Api 50 CHB，NipponBiomeryu Bitec產品)進一步研究四株菌的生物化學特性。首先將每株菌培養在瓊脂培養基上，隨后刮下一個菌落，懸浮在1ml無菌生理鹽水溶液中來制備細菌的濃懸液。再用無菌生理鹽水溶液將該懸液稀釋，并接種到Api 50 CHB培養液(其成分后面有描述)中。將接種了細菌的培養液分裝含有碳源(50種)的小試管中，并于30℃培養。培養開始后過24小時和48小時，根據每支試管的顏色變化判定為陽性或陰性。結果示于表3。
(Api 50 CHB培養液)硫酸銨 2g酵母提取物 0.50g胰蛋白胨 1g酚紅 0.18ml礦物堿M/100 10ml磷酸鹽緩沖液(pH7.8)1000mlpH(滅菌后)7.5檢測結果表1

<p>表2

<p>表3

使用Api 50 CHB判定的結果A-1短小芽孢桿菌(鑒定概率*＝99.9％)A-2遲緩芽孢桿菌(24小時培養物的鑒定概率*＝95.6％)A-3遲緩芽孢桿菌(鑒定概率*＝56.8％)側孢芽孢桿菌(鑒定概率*＝22.0％)蜂房芽孢桿菌(鑒定概率*＝9.4％)A-4短小芽孢桿菌(鑒定概率*＝99.9％)鑒定概率概率表示選自分布圖中的一個分類學組相對數據庫中另一個分離組被鑒定出來的程度。
當以上描述過的任何菌株被用于抑制硫化物的產生這一目的時，可以將培養后的細菌原樣施加。但是，在許多情況中，優選在施加前將細菌固定在載體上。例如，由于養殖場的硫化物積聚在水底的沙上，所以必須使細菌沉到水底。通過使用載體可以容易地實現這一點。
對本文中使用的載體沒有特別的限定。但是，考慮到細菌的保持性，優選沸石、石英prophyry(Bakuhanseki)、活性碳、火成巖、珊瑚石等。從經濟角度來說，特別優選火成巖。可以考慮所用的環境、成本和效果來合適地確定載體中的細菌數。但是，優選的菌數通常為大約106到109cfu/g，特別優選大約108cfu/g。
施加到養殖場、地下排水槽等處的芽孢桿菌屬細菌的濃度也可以合適地確定。但是，優選施加細菌至濃度通常大約107cfu/m2到2×1011cfu/m2，特別優選大約109cfu/m2到2×1010cfu/m2。
另一方面，在將細菌施加到養殖場、排水槽等處前將其固定在載體的情況中，為了取得好的效果，載體用量優選大約0.1到2×103g/m2，特別優選大約10到200g/m2(假設載體中的細菌數是108cfu/g)。由于固定化菌株的活性在大約30天后喪失，優選以大約30天的間隔重復施加這種載體。
由于在本發明中用芽孢桿菌屬細菌作硫化物產生抑制劑，因此要考慮到微生物所加入的水池等處的水溫會改變細菌的活性。更具體地說，養殖魚類和甲殼類的水池等通常安置在露天的開放體系中，其水溫取決于戶外的氣溫。因此，本發明菌株的活性在夏季(水溫大約30℃)更高，冬季更低。但是，這并不帶來特別的問題，因為參與硫化物產生過程的細菌組的活性在冬季也降低，因此硫化物的產生程度也低，另外，養殖魚類和甲殼類通常是在水溫高的季節進行。
根據本發明的硫化物產生抑制劑可以被用作含硫化物淤泥的凈化劑。例如，它不僅可以用在養殖場和地下排水槽中，還可以用于各種環境中來改善環境。更具體地說，可以將該抑制劑用于從湖泊、池塘和下水道系統到家庭養魚缸的多種環境。
實施例通過以下實施例對本發明進行更詳細地描述。但是，本發明并不僅限于以下實施例。
實施例1菌株篩選(1)分離水底淤泥同化細菌從Oita的Beppu海灣采集的海底淤泥于20℃放置18天后，將它涂布在平板培養基[通過向牛肉湯干粉(Nissui PharmaceuticalCo.，Ltd產品)加入氯化鈉(3％)和瓊脂(1.5％)制得，pH8.0]，于28℃培養3天，從而分離出10個優勢菌株。另外，從東京海灣Yokohama海岸的海水中分離到有同化特殊化合物能力的19個株系細菌。
將養殖對蝦的飼料(Ebian，Kyowa Hakko Kogyo有限公司產品)研磨并懸浮在人工海水中后，分別用前面得到的29個株系接種一份懸浮液。將識別出能生長的每個株系再涂布到平板培養基(其成分隨后描述)上以便觀察生長情況，該培養基是通過從養殖對蝦的飼料(Ebian，Kyowa Kakko Kogyo有限公司產品)中提取出水溶性蛋白質、再用瓊脂使該提取物凝固而得到的。
(培養基成分)
瓊脂 15g水溶性蛋白質 1g用人工海水調至1000ml由以上結果，挑選出以下4個株系；短小芽孢桿菌A-1株系；遲緩芽孢桿菌A-2株系；遲緩芽孢桿菌A-3株系，以及短小芽孢桿菌A-4株系。
實施例2硫化氫分解能力實驗將A-1和A-4株系按1×108cfu/g比例、A-2和A-3株系按1×107cfu/g比例固定在火成巖上得到的組合物(100g)、3％NaCl(90ml)和得自對蝦飼料的水溶性組分提取物(5w/v％，10ml)加入1L燒瓶，將燒瓶于28℃靜置2小時。然后，向燒瓶上部注入硫化氫氣體，并將燒瓶密封塞好，隨時間用檢測管確定上部硫化氫濃度的變化。又及，將與上述組合物相同的組合物預先高壓蒸氣滅菌用來作為對照。
結果發現，如表4所示，實驗組的硫化氫氣體濃度較之對照組明顯降低，因此A-1到A-4株系具有分解硫化氫的能力。
表4硫化氫氣體濃度(括號內的數字表示液相的pH)<

實施例3用其上固定有微生物的載體分解養蝦池塘沉積物的實驗(實驗的具體方法)在Yamaguchi的Ube對蝦養殖場的培養池中，將其上固定了微生物的載體混合到培養池的底沙中養殖對蝦，觀察對蝦的生長情況。這時，仍用檢測管測量培養池中的硫化氫氣體量。
(1)培養池2m×2m×1m，4-t露天池塘。
(2)對蝦大約1000只對蝦/池。
(3)選擇固定微生物的載體選用火成巖(Palsand，2.5-3.5mm)是因為它適合作為載體，并且比較便宜。
(4)微生物將A-1和A-2株系以大約107cfu/g的比例固定在載體上。
(5)散布載體的方法在對照組中，以1kg/池的量散布其上未固定微生物的載體。實驗組中，開始以1kg/池的量散布其上固定有微生物的載體，過29天散布同樣的量，過45天再散布同樣的量。
(實驗結果)測試開始后過55天，對照組中幾乎所有的底部沉積物均變黑，可聞到惡臭味。
另一方面，在散布了其上固定有微生物的載體的實驗組中，只有部分底部沉積物變黑，也可稍微聞到惡臭味。在排水之前，采集培養池中的水作為分析樣品，然后排水至可見到底部的淤泥。結果，對照組中，整個池塘底沙表面由于硫化物而變黑，在底沙表面看到對蝦(它們有在白天鉆到底沙里面的特性)。經過55天的時間仍存活的對蝦數和在相同時期內收集的培養池底部沉積物的分析結果分別示于表5和表6。用檢測管測量到的硫化氫氣體量見表7。又及，在使用A-2和A-3株系的實驗中得到了相似的結果。
表5存活對蝦的數量等

>*兩組間重量沒有差別，但對照組中個體間的差別較大。
表6對底部沉積物的分析結果

備注1對照組和實驗組的樣品采集自底部沉積物沒有發生顏色變化的區域[如樣品(1)]，和底部沉積物變黑的區域[樣品(2)]。
表7

實施例4抑制地下排水槽惡臭散發的實驗將微生物加入中央研究院(KABUSHIKE KAISHA YAKULTO HONSHA，Kunitachi-shi，Tokyo)的地下排水槽來考察微生物對異味散發的抑制效果。
(1)排水槽3.75×1.5×1m(2)加入的微生物將A-1和A-4株系加入排水槽至終濃度為大約104cfu/ml。
(3)異味散發情況的測評方法排水槽在加入微生物之前作為對照，根據感覺每周測評異味散發情況一次。然后每周將微生物加入同一個排水槽至前述的濃度，并每次根據感覺測評異味散發情況。按照以下6級氣味強度進行感官測評。
表8

4)實驗結果異味散發情況如表9所示。與對照組相比，實驗組中異味的散發被抑制到一定程度。用A-2和A-3株系進行實驗也得到了相似的結果。
表9

實施例5微生物對魚的急性毒性實驗(1)實驗概況通過參照JIS K 0102 71的方法，用himedaka確定24小時和48小時后微生物的LC50*，進行該實驗。
*LC50(半數致死濃度)在該濃度下有50％實驗用魚被殺死，與TLM含義相同。
(2)樣品A-1或A-4株系(3)實驗過程以使被檢測微生物的濃度達到103、105和107cfu/ml的方式準備三種實驗用水后，在這些實驗用水中養殖被檢測的魚48小時，隨時間計數每種實驗水體中被殺死的魚的數量。
(4)實驗用魚himedaka(平均長度2.5cm，平均體重0.25g，得自Yoshida養魚場(Hachiojishi，Tokyo))。
(5)實驗條件①實驗方法靜止水系統②實驗用魚的數量每種實驗用水中有7條魚③實驗用水量3升④實驗用水溫度22℃±2℃⑤光照10小時/天⑥養魚池圓形玻璃池⑦稀釋水自來水(脫氯水)(6)實驗結果①LC50用himedaka在24小時和48小時后得到的被測微生物的LC50數值都大于107cfu/ml。
②濃度和死亡率各個實驗濃度隨時間的死亡率示于表10。用A-2和A-3株系進行的實驗得到了相似的結果。
表10

工業應用通過使用本發明所述硫化物產生抑制劑，可以減少各種魚類和甲殼類培養過程中所用的水池里和地下排水槽中污染物和惡臭物質(例如含有硫化物的淤泥)的產生。
權利要求
1.一種硫化物產生抑制劑，其中包含具有水溶性肽或水溶性蛋白質同化能力的芽孢桿菌屬細菌。
2.根據權利要求1的硫化物產生抑制劑，其中所述芽孢桿菌屬細菌被固定在載體之上。
3.根據權利要求1或2的硫化物產生抑制劑，其中所述芽孢桿菌屬細菌是短小芽孢桿菌或遲緩芽孢桿菌。
4.根據權利要求3的硫化物產生抑制劑，其中所述芽孢桿菌屬細菌是短小芽孢桿菌A-1株、遲緩芽孢桿菌A-2株、遲緩芽孢桿菌A-3株或短小芽孢桿菌A-4株。
5.根據權利要求2、3或4的硫化物產生抑制劑，其中所述載體是火成巖。
6.一種用于凈化含硫化物的淤泥的試劑，其中包含具有水溶性肽或水溶性蛋白質同化能力的芽孢桿菌屬的細菌。
7.根據權利要求6的用于凈化含硫化物的淤泥的試劑，其中所述芽孢桿菌屬細菌被固定于載體之上。
8.根據權利要求6或7的用于凈化含硫化物的淤泥的試劑，其中所述芽孢桿菌屬細菌是短小芽孢桿菌或遲緩芽孢桿菌。
9.一種改善魚類和甲殼類養殖場底部沉積物的試劑，其中包含具有水溶性肽或水溶性蛋白質同化能力的芽孢桿菌屬細菌。
10.根據權利要求9的用于改善魚類和甲殼類養殖場底部沉積物的試劑，其中所述芽孢桿菌屬細菌被固定于載體之上。
11根據權利要求9或10的用于改善魚類和甲殼類養殖場底部沉積物的試劑，其中所述芽孢桿菌屬細菌是短小芽孢桿菌或遲緩芽孢桿菌。
12.魚類和甲殼類的養殖方法，包括將權利要求1到5任何一項所述的硫化物產生抑制劑施放到魚類和甲殼類的養殖場中進行養殖。
13.一種防止散發惡臭的方法，包括將權利要求1到5任何一項所述的硫化物產生抑制劑施放到地下排水槽中。
14.一種凈化環境的方法，包括將權利要求1到5任何一項所述的硫化物產生抑制劑用于該環境中。
全文摘要
硫化物產生抑制劑,其特征在于含有芽孢桿菌屬細菌,能代謝水溶性肽或水溶性蛋白質;以及含有相同細菌的含硫化物淤泥處理劑。這些產品不僅能控制異味,還能抑制淤泥變質。
文檔編號C12N1/20GK1251563SQ98803849
公開日2000年4月26日 申請日期1998年3月24日 優先權日1997年4月4日
發明者赤川健一, 中尾真澄, 大村浩, 兼光明男 申請人:株式會社益力多本社, 美雅克化學株式會社